Applicazione della tecnologia Chip ad analisi di interesse biologico e

forense

CHIP/Q-TOF

Impostare la pompa 21

Il sistema è prontoSelezionare “Operate”

43

Analisi di Apolipoproteine estratte da plasma umano di soggetti sani e pazienti

con cardiopatie e diabete

Le lipoproteine ad alta densità (HDL) proteggono lepareti delle arterie dal progredire dell’arteriosclerosi.

Questo effetto protettivo è da attribuirsi principalmenteall’abilità delle HDL di rimuovere l’eccesso di colesterolodai macrofagi presenti nelle arterie.

L’apolipoproteina A-I (Apo A-I) è la più abbondante tratutte le HDL (circa 70%) ed è stata dimostrata la suacapacità nel rimuovere il colesterolo e i fosfolipidicellulari attraverso processi di trasporto mediati da unaproteina di membrana chiamata “ ATP-binding cassettetransporter A1 (ABCA1)”.

Stress ossidativo e altri stati patologici possonomodificare la struttura dell’Apo A-I con conseguente suadiversa attività.

Lo scopo di questo lavoro preliminare è mettere inevidenza modificazioni proteiche legate soprattutto afenomeni ossidativi.

Sono state analizzate le frazioni di apolipoproteineottenute da plasmi di :

- 1 soggetto sano con elevati valori di HDL;

- 3 soggetti sani con valori normali di HDL;

- 3 pazienti diabetici;

- 3 pazienti infartuati di età inferiore a 40 anni.

La separazione della frazione di apolipropoteine è stata effettuatatramite ultracentifugazione sequenziale.

L’ottenimento della frazione di HDL, purificata dalle altre proteineplasmatiche, è stata controllata con la spettrometria di massa MALDI.

28087.79

6686.40

9484.00

campioni APOA1 29_01_08\Bertazzo1a10 H2O 01%TFA _1\1SLin

0

250

500

750

1000

1250

1500

Inte

ns. [a

.u.]

10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000

m/z

Analisi del digerito triptico della frazione plasmatica contenente Apo A-I

Preparazione del campione:

Iniezione: 1 ml in

HPLC-CHIP MS

5 mg di proteina

estratta liofilizzata

Diluizione in 60 di

mL NH4CO3 (pH

8.5) + Tripsina

(1:40)

Metodica cromatografica:

Minuti %B

0 5

4 5

12 40

16 70

20 70

20.5 5

Condizioni ESI:

VCap: 1900 VFragmentor: 170 VGas temperature: 325°CDrying gas: 5 L/min

Enrichment column: Zorbax 300SB-C18, 40 nL, 5 mmAnalytical column: Zorbax 300SB-C18, 75mm x 43 mm, 5 mmLoading flow rate: 4 mL/minLoading mobile phase: H2O + 3% acetonitrileInjection volume: 1 mLCHIP flow rate: 400 nL/minMobile phase: A: H2O + 0.1% HCOOH

B: CH3CN + 0.1 % HCOOH

Separazione cromatografica del digerito triptico di APO A-1standard

Iniettato 1ul di digerito

triptico 8,3ng di APO A1

cioè <300 fentomoli

Esempio di cromatogramma ottenuto del digerito triptico dellafrazione di apolipoproteine di plasma di un paziente diabetico

m/z Rt1 Rt2 Rt3 Rt4 Rt5 Rt medio STD dev479.488 8.528 8.525 8.49 8.538 8.525 8.521 0.018666.343 8.802 8.802 8.767 8.837 8.835 8.809 0.029572.246 9.13 9.107 9.069 9.149 9.144 9.120 0.033626.824 9.185 9.214 9.178 9.226 9.226 9.206 0.023570.260 9.514 9.532 9.48 9.524 9.522 9.514 0.020574.292 9.706 9.672 9.699 9.728 9.729 9.707 0.024700.850 9.843 9.835 9.809 9.86 9.839 9.837 0.018838.906 9.898 9.89 9.891 9.915 9.894 9.898 0.010564.248 10.089 10.101 10.083 10.101 10.108 10.096 0.010658.314 10.254 10.211 10.247 10.266 10.272 10.338 0.014802.454 10.336 10.321 10.329 10.348 10.354 10.573 0.019853.922 10.582 10.547 10.576 10.563 10.596 10.717 0.020869.902 10.719 10.685 10.74 10.723 10.72 10.942 0.014667.312 10.939 10.923 10.96 10.939 10.949 10.942 0.014966.988 11.377 11.378 11.411 11.403 11.413 11.396 0.018615.873 11.569 11.662 11.657 11.676 11.624 11.638 0.043722.643 12.254 12.239 12.232 12.304 12.291 12.264 0.032551.819 12.391 12.381 12.39 12.376 12.393 12.386 0.007607.356 12.555 12.641 12.553 12.576 12.575 12.580 0.036543.304 13.088 13.181 13.082 13.097 13.098 13.109 0.041416.346 15.008 15.011 14.97 15.004 15.009 15.000 0.017533.342 16.254 16.253 16.217 16.222 16.253 16.240 0.019579.298 16.162 16.116 16.131 16.14 16.125 16.135 0.018496.344 16.464 16.46 16.469 16.455 16.4 16.450 0.028377.293 16.601 16.582 16.569 16.606 16.564 16.584 0.019458.352 16.874 16.856 16.872 16.88 16.866 16.870 0.009524.376 17.45 17.422 17.419 17.455 17.431 17.435 0.016439.361 17.808 17.778 17.747 17.784 17.76 17.775 0.023

Deviazionestandard<0.05 pertutti ipeptidi

1) Peptide [132-140] WQEEMELYR Modificato M [136] 15.9949

% peptide ossidato nel paziente diabetico: 70%

% peptide ossidato nel soggetto sano: 0%

Esempio di modificazioni proteiche osservate nei pazienti diabetici

WQEEM(Ox)ELYR

b2 –NH3

b2

y3

y8 –HH3y6y5

y7

y9

[M+2H -H2O –O]2+

2) Peptide [131-142]: KWQEEM(Ox)ELY(NO2)RQK

% peptide ossidato nel paziente diabetico: 60%

% peptide ossidato nel soggetto sano: 0%

1) Peptide [37-47]: DLATVY(NO2)DVLK

% peptide nitrato nel

paziente infartuato: 100%

%peptide nitrato nel

soggetto sano: 0%

Esempio di modificazioni proteiche osservate nei pazienti infartuati

2) Peptide [121-131]: VQPY(NO2)LDDFQKK

% peptide nitrato nel

paziente infartuato:

100%

%peptide nitrato nel

soggetto sano: 0%

Tabella preliminare riassuntiva delle modificazioni osservate nei pazienti analizzati

Peptide m/z of

[M+2H]2+

Healthy

subjects

Diabetic

patients

Heart stroke

Patients Ipo-

Patients

WQEEM(Ox)ELYR

[132-140]

650.6434 / 2/3 / /

DLATVY(NO2)DVLK

[37-47]

591.6020 / / 3/3 /

VQPY(NO2)LDDFQKK

[121-131]

713.7298 / / 2/3 /

KWQEEM(Ox)ELY(NO2)RQK

[131-142]

864.3199 / 2/3 3/3 /

QEM(Ox)SKDLEEVK

[108-118]

676.6789 / / 3/3 /

QEM(Ox)SKDLEEVKAK

[108-120]

775.3061 / 3/3 1/3 /

Table 2: Modified peptides found in tryptic digest of lipoprotein plasma fractions.

Peptide m/z of

[M+2H]2+

Healthy

subjects

Diabetic

patients

Heart stroke

Patients Ipo-

Patients

WQEEM(Ox)ELYR

[132-140]

650.6434 / 2/3 / /

DLATVY(NO2)DVLK

[37-47]

591.6020 / / 3/3 /

VQPY(NO2)LDDFQKK

[121-131]

713.7298 / / 2/3 /

KWQEEM(Ox)ELY(NO2)RQK

[131-142]

864.3199 / 2/3 3/3 /

QEM(Ox)SKDLEEVK

[108-118]

676.6789 / / 3/3 /

QEM(Ox)SKDLEEVKAK

[108-120]

775.3061 / 3/3 1/3 /

Table 2: Modified peptides found in tryptic digest of lipoprotein plasma fractions.

Conclusioni

I risultati preliminari ottenuti mostrano come nel casodi pazienti diabetici ed infartuati (con età inferiore ai40 anni) siano presenti delle modificazioni dell’Apo A-I.In particolare sono state notate l’ossidazione dellametionina e la nitrazione delle tirosina.

Lo studio proseguirà con l’aumento della numerosità deipazienti e sulla separazione tramite cromatografia diimmunoaffinità delle nitroapolipoproteine.

Metodo preliminare LC-CHIP/Q-TOF per la determinazione di xenobiotici in

campioni di saliva

Compound

Class Analyte Formula MH

+

benzoylecgonine (BZE) C16H19O4N 290.13868 Cocaine

cocaine (COC) C17H21O4N 304.15433

6-Acetylmorphine (6MAM) C19H21O4N 328.15433

morphine (MOR) C17H19O3N 286.14377

codeine (COD) C18H21O3N 300.15942

norbuprenorphine (NBUP) C25H35O4N 414.26389

buprenorphine (BUP) C29H41O4N 468.31084

Opiates

methadone (MTD) C21H27O1N 310.21654

amphetamine (AMP) C9H13N1 136.11208

methylendioxyamphetamine (MDA) C10H13O2N 180.10191

metamphetamine (MAMP) C10H15N 150.12773

methylendioxymetamphetamine (MDMA) C11H15O2N 194.11756

Amphetamines

methylendioxyethylamphetamine (MDEA) C12H17O2N 208.13321

Anesthetics fluoxetine (FLU) C17H18ONF3 310.14133

olanzapine (OLZ) C17H20N4S 313.14814

zopiclone (ZPC) C17H17O3N6Cl 389.11234

7-aminoclonazepam (7-ACLZP) C15H12ON3Cl 286.07417

zolpidem (ZPD) C19H21O1N3 308.17574

7-aminoflunitrazepam (7-AFNTZ) C16H14ON3F 284.11937

bromazepam (BRZP) C14H10ON3Br 316.00800

oxazepam (OXZ) C15H11O2N2Cl 287.05818

lorazepam (LRZP) C15H10O2N2Cl2 321.01921

alprazolam (ALPZ) C17H13N4Cl 309.09015

clonazepam (CLZP) C15H10O3N3Cl 316.04835

flunitrazepam (FNTZ) C16H12O3N3F 314.09355

nordiazepam (NDZ) C15H11ON2Cl 271.06327

Benzodiazepines

diazepam (DIAZ) C16H13ON2Cl 285.07892

ketamine (K) C13H16ONCl 238.09932

venlafaxine (VEN) C17H27O2N 278.21146 Antidepressants

amitriptyline (AMI) C20H23O 278.19033

Table 1: Drugs and their metabolites under study

Compound

Class Analyte Formula MH

+

benzoylecgonine (BZE) C16H19O4N 290.13868 Cocaine

cocaine (COC) C17H21O4N 304.15433

6-Acetylmorphine (6MAM) C19H21O4N 328.15433

morphine (MOR) C17H19O3N 286.14377

codeine (COD) C18H21O3N 300.15942

norbuprenorphine (NBUP) C25H35O4N 414.26389

buprenorphine (BUP) C29H41O4N 468.31084

Opiates

methadone (MTD) C21H27O1N 310.21654

amphetamine (AMP) C9H13N1 136.11208

methylendioxyamphetamine (MDA) C10H13O2N 180.10191

metamphetamine (MAMP) C10H15N 150.12773

methylendioxymetamphetamine (MDMA) C11H15O2N 194.11756

Amphetamines

methylendioxyethylamphetamine (MDEA) C12H17O2N 208.13321

Anesthetics fluoxetine (FLU) C17H18ONF3 310.14133

olanzapine (OLZ) C17H20N4S 313.14814

zopiclone (ZPC) C17H17O3N6Cl 389.11234

7-aminoclonazepam (7-ACLZP) C15H12ON3Cl 286.07417

zolpidem (ZPD) C19H21O1N3 308.17574

7-aminoflunitrazepam (7-AFNTZ) C16H14ON3F 284.11937

bromazepam (BRZP) C14H10ON3Br 316.00800

oxazepam (OXZ) C15H11O2N2Cl 287.05818

lorazepam (LRZP) C15H10O2N2Cl2 321.01921

alprazolam (ALPZ) C17H13N4Cl 309.09015

clonazepam (CLZP) C15H10O3N3Cl 316.04835

flunitrazepam (FNTZ) C16H12O3N3F 314.09355

nordiazepam (NDZ) C15H11ON2Cl 271.06327

Benzodiazepines

diazepam (DIAZ) C16H13ON2Cl 285.07892

ketamine (K) C13H16ONCl 238.09932

venlafaxine (VEN) C17H27O2N 278.21146 Antidepressants

amitriptyline (AMI) C20H23O 278.19033

Table 1: Drugs and their metabolites under study

The collected OF (20 ml) were fortified with four solutions containing the 30 analytes (Table 1) at different concentrations (10 ng/mL, 20 ng/mL, 50 ng/mL and 100 ng/mL) and with Internal Standards (ISs). The OF fortified samples were extracted by SPE technique.1 mL of the final solutions has been analyzed by LC-Chip/Q-TOF technique.

Enrichment column: Zorbax 300SB-C18, 40 nL, 5 mmAnalytical column: Zorbax 300SB-C18, 75mm x 43 mm, 5 mmLoading flow rate: 4 ml/minLoading mobile phase: H2O + 3% acetonitrileInjection volume: 1 mLCHIP flow rate: 400 nL/minMobile phase: A: H2O + Ammonium acetate 5 mM

B: CH3CN + 0.1 % HCOOH

Min. %B

0 10

4 10

12 60

16 60

18 60

18.5 10

Min. %B

0 10

4 10

12 60

16 60

18 60

18.5 10

ESI conditions:VCap: 1750 VFragmentor: 120 VGas temperature: 325°CDrying gas: 5 L/min

Reference masses:m/z 149.02332m/z 1221.02332

Metodica cromatografica:

AMP

MDA

MAMP

MDMA

MDEA

MDPA (IS)

VEN

COC

7-ACLZP

7-AFNTZ

BZE

K

MOR

COD

6MAM

ZPD

BRZP

NBUP

BUP

LRPZ

BZE

K

MOR

COD

6MAM

ZPD

BRZP

NBUP

BUP

LRPZ

OXZ

CLZP

FNTZ

ALPZ

NDZ

AMI

FLU

DIAZ

MTD

ZPC

OXZ

CLZP

FNTZ

ALPZ

NDZ

AMI

FLU

DIAZ

MTD

ZPC

BZE

K

MOR

COD

6MAM

ZPD

BRZP

NBUP

BUP

LRPZ

BZE

K

MOR

COD

6MAM

ZPD

BRZP

NBUP

BUP

LRPZ

OXZ

CLZP

FNTZ

ALPZ

NDZ

AMI

FLU

DIAZ

MTD

ZPC

OXZ

CLZP

FNTZ

ALPZ

NDZ

AMI

FLU

DIAZ

MTD

ZPC

y = 0.7412x

R2 = 0.9944

y = 0.6664x

R2 = 0.9989

y = 0.6139x

R2 = 0.9986

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0.14

0.16

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25

[Analyte]/[IS]

Are

a r

ati

o

BUP

NDZ

BZE

Lineare (BZE)

Lineare (NDZ)

Lineare (BUP)

THC

THC-d3

THC-COOH-d3

THC-COOH

Conclusioni

Dai risultati preliminari ottenuti la tecnologia LC-Chip/Q-TOF può essere applicata all’analisi dixenobiotici, considerando che possono essere disponibiliChip con fase stazionaria specifica.

Gli aspetti positivi di questa tecnica sono: piccola quantità di soluzione di analita (1 mL); tempo di analisi breve (18 min.); minimo consumo di solvente (4nL/min).