“El diagnóstico en humanos”

Edward J. Young, M.D

El antígeno mas frecuentemente usado para detectar

anticuerpos anti- brucella es el S-LPS, que es el

epitope inmunodominante de la membrana

citoplasmática de la bacteria

Otros antígenos que han demostrado ser

promisorios tanto para el diagnóstico como para

Preparation of CP antigen

Brucella

cytoplasmic

fraction

Anti-LPS mAb coupled

to gel matrix

LPS-free cytoplasmic

proteins

ser usados como potenciales vacunas incluyen a

proteínas citosólicas y de membrana externa.

GRUPO ΙΙΙΙ

0 5 10 15 20 25 300

100

200

300

400

500

Meses post - diagnóstico

Tít

ulo

de

l te

st

ST

A(I

U/m

L)

GROUP ΙΙΙΙΙΙΙΙ

0 5 10 15 20 25 300

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Meses post - diagnóstico

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GRUPO ΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙ

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GRUPO ΙΙΙΙ

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Meses post - diagnóstico

Tít

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)

GRUPO ΙΙΙΙΙΙΙΙ

0 5 10 15 20 25 300

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Meses post - diagnóstico

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GRUPO ΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙ

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Meses post - diagnóstico

Tít

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E-S

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)

Figura 7: evolución de los niveles de anticuerpos aglutinantes en pacientes que se recuperaron de una brucelosis (grupo I),en pacientes que persistieron con síntomas (grupo II) y en pacientes con recaídas (grupo III).

GRUPO ΙΙΙΙ

0 5 10 15 20 25 30100

101

102

103

104

105

106

Meses post - diagnóstico

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S

GRUPO ΙΙΙΙΙΙΙΙ

0 5 10 15 20 25 30100

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106

Meses post - diagnóstico

Títu

lo d

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PS

GRUPO ΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙ

0 5 10 15 20 25 30100

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Meses post - diagnóstico

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GRUPO ΙΙΙΙ GRUPO ΙΙΙΙΙΙΙΙ GRUPO ΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙGRUPO ΙΙΙΙ

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Meses post - diagnóstico

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GRUPO ΙΙΙΙΙΙΙΙ

0 5 10 15 20 25 30100

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Meses post - diagnóstico

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GRUPO ΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙ

0 5 10 15 20 25 30100

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Meses post - diagnóstico

Títu

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rote

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s

Evolución de los niveles de IgG anti-LPS y anti-PC en pacientes que se recuperaron de una brucelosis (grupo I),en pacientes que persistieron con síntomas (grupo II) y en pacientes con recaídas (grupo III).

PCR en el diagnóstico de Brucelosis

�Aplicable a la tipificación bacteriológica y al análisis de muestras clínicas.

�A pesar de ser pruebas más sensibles que las tradicionales, aun no han sido bien estandarizados.

�El desafío es simplificar los procedimientos para los laboratorios no

especializados y cuantificar la carga de ADN bacteriano con fines pronósticos.

Navarro et al., Expert. Rev. Mol. Diagn. 2004

especializados y cuantificar la carga de ADN bacteriano con fines pronósticos.

““El diagnóstico en humanos”

Se han aplicado técnicas moleculares (PCR) en los casos

con serología negativa Con estas técnicas se detectó

DNA de B. melitensis en muestras de pacientes

con Brucelosis al momento de diagnóstico

y en los controles pos tratamiento,.

Edward J. Young, M.D

An Eternal Microbe: Brucella DNA Load Persists for Years after Clinical Cure

Georgia Vrioni,a , Georgios Pappas,a Efthalia Priavali, Constantina Gartzonika, and Stamatina LevidiotouDepartment of Microbiology, Medical School, University of Ioannina, Ioannina, Greece

Background. Despite the continuing high incidence of brucellosis, vague aspects of pathophysiology, diagnosis, and treatment continue to exist, particularly with regard to the ability of Brucella species to survive inside the host.

Methods. A quantitative real-time polymerase chain reaction assay was used for monitoring bacterial DNAload in brucellosis-affected patients throughout different disease stages. Three or more specimens per patient were obtained (1 at diagnosis, 1 at the end of treatment, and at least 1 during the follow-up period) from 39 were obtained (1 at diagnosis, 1 at the end of treatment, and at least 1 during the follow-up period) from 39 patients with acute brucellosis.

Results. The majority of patients (87% at the end of treatment, 77% at 6 months after treatment completion, and 70% at 12 years after treatment) exhibited persistent detectable microbiological load despite being asymptomatic.The 3 patients who experienced relapse did not exhibit any statistically significant difference in their bacterial load at any stage of disease or during follow-up.Conclusion. Brucella melitensis DNA persists despite appropriate treatment and apparent recovery. This finding offers a new insight into the pathophysiology of the disease: B. melitensis is a noneradicable, persisting pathogen.

Clinical Infectious Diseases 2008; 46:e131–6

“Desafios en el tratamiento de la Brucelosis Humana”

Solera J. MD, PhD,Hospital General Universitario de Albacete, Facultad de Medicina, Universidad de Castilla - La Mancha, Spain.

•La antibioticoterapia acorta el curso natural de la enfermedad, disminuye la incidencia de complicaciones ypreviene las recaidas.

•El regimen de elección y la duración del mismo depende de la presencia de focalizaciones o de condicionessubyacentes que limiten el uso de ciertos antibióticos.

•En los estudios randomizados se demostró que las tetraciclinas, en general combinadas con otros antibióticos(aminoglucosidos, rifampicina, trimetoprim-sulfametoxazol) han probado ser seguros y eficientes, no obstante lasrecaídas pueden presentarse entre 5-20 % a pesar de la buena adherencia y duración al tratamiento.

•Afortunadamente los episodios de recaídas suelen ser menos severos que las primoinfecciones.La cepa aislada en la recaída suele presentar la misma sensibilidad a los antibióticos que la cepa aislada en laprimoinfección. Por tal motivo puede repetirse el mismo esquema antibiótico.

“Desafios en el tratamiento de la Brucelosis Humana”Solera J. MD, PhD,

Hospital General Universitario de Albacete, Facultad de Medicina, Universidad de Castilla - La Mancha, Spain.

• Por otra parte, los pacientes con síntomas persistentes después de un tratamiento apropiado sonde dificil manejo y deben tratarse con medicación sintomática. .

• Los pacientes con enfermedad focal ( espondilitis, endocarditis) requieren antibióticos en formaprolongadaprolongada

• La Brucelosis en el embarazo y en niños < de 8 años ofrecen dificultades en el tratamiento dadoque en estos pacientes está contraindicada la tetraciclina.

• Los aspectos controversiales incluyen el uso de otros antibióticos (quinolones, cefalosporinas de3ª generación o tigeciclina), la monoterapia , el uso de mas de dos antibióticos y la duraciónóptima del tratamiento.

Recomendado Alternativo

Doxiciclina 100mg c/12 hs oral por 45 días + Estreptomicina 15 mg/kg I M c/24 hs por 14–21 días o gentamicina 3–5 mg/kg IV por día por 7–14 días

Rifampicina 600mg oral por día por 42 días + quinolonas (ofloxacina 400 mg oral cada 12 hs o ciprofloxacina750mg oral cada 12

Tratamiento de la brucelosisEnfermedad aguda (adultos y niños > 8 años)

IV por día por 7–14 días

o

Doxiciclina 100mg c/12 hs oral por 45 días + rifampicina 600–900mg oral por día durante 45 días

ciprofloxacina750mg oral cada 12 hs) 42 días

o

Doxiciclina 100mg c/12 hs oral + TMPSMZ doble dosis oral por 2 meses

Solera J 2011

Results of treatment with co-trimoxazole plus doxycycline and

doxycycline plus rifampicin (8w)

Outcome of treatment Regimen DC Regimen DR P-valueNo and % No and %

Successful treatment 47 (92.15) 40 (78.43) 0.05

Failure of treatment 1 (1.94) 5 (9.81) 0.20

11

Failure of treatment 1 (1.94) 5 (9.81) 0.20

Relapse 3 (5.88) 6 (11.76) 0.48

Failure plus relapse 4 (7.84) 11 (21.56) 0.05

Total 51(100) 51(100) .

Regimen DC; Co-trimoxazole plus Doxycycline, Regimen DR; Doxycycline plus Rifampicin.

Pak J Med Sci 2007; 23: 889-892

Tratamiento de las formas focales (endocarditis,

espondilitis, meningitis, abscesos para espinales, etc.)

• Los pacientes con formas focales requieren antibioticos en forma prolongada.

• Debe considerarse la cirugía en pacientes con endocarditis, abscesos en SNC, esplénicos, hepáticos u otros cuando el tratamiento ATB sólo fracasa.

• Doxiciclina 100mg oral 2 veces por día y rifampicina 600 mg oral diariamente 6–52 • Doxiciclina 100mg oral 2 veces por día y rifampicina 600 mg oral diariamente 6–52 semanas + Estreptomicina 1 g IM por día o gentamicina 3–5 mg/kg IV por día 14–21 días.

• Considerar TMP-SMZ, ciprofloxacina u ofloxacina como sustitutos de doxiciclina o rifampicina.

Solera J 2011

Tratamiento en niños < 8 años

• No se recomienda el uso de doxiciclina

• TMP-SMZ 5 mg/kg oral dos veces por día por 45 días + gentamicina 5 mg/kg IV diariamente por 5-7 days

• Rifampin 15 mg/ kg PO daily 45 days plus gentamicin 5 mg/kg • Rifampin 15 mg/ kg PO daily 45 days plus gentamicin 5 mg/kg IV daily 5-7 days

• Monotherapy with rifampin 3- 8 weeks (Lubani PIDJ 1989)

13

“Brucellosis and Pregnancy”

Prof. Ziad A. Memish

Assistant Deputy. Minister of Health for Preventive Medicine, Ministry of Health. College Of Medicine Alfaisal

University Riyadh, Kingdom of Saudi Arabia. zmemish@yahoo.com

• La Brucelosis puede causar aborto espontáneo confirmado por el aislamiento de la bacteria en los tejidos

fetales y/o placentarios.

•.Se cree que Brucella causa menos aborto en el humano que en los animales por la ausencia de eritritol en

el tejido placentario humano .el tejido placentario humano .

• Eritritol es un componente normal en el tejido fetal y la placenta de los ungulados, que en los bovinos,

promueve una infección masiva. Una explicación adicional de la < frecuencia de aborto humano es la

actividad anti-Brucella presente en el líquido amniótico humano.

•La incidencia de aborto espontáneo y muerte fetal intrauterina en las embarazadas con Brucelosis oscila

entre 31-46%, (significativamente > a la de la población general de mujeres embarazadas).

“Brucellosis and Pregnancy”

Prof. Ziad A. MemishAssistant Deputy. Minister of Health for Preventive Medicine, Ministry of Health. College Of Medicine AlfaisalUniversity Riyadh, Kingdom of Saudi Arabia. zmemish@yahoo.com

• La frecuencia de aborto es similar en el primer y segundo trimestre de la pero mas el evada que la muerte fetal intrauterina en el tercer trimestre.

• A pesar de la escasos de datos comparativos , la incidencia de aborto def 10% -42% en pacientes conbrucelosis excede a la observada en pacientes infectadas con otros microorganisms.

• La historia natural de la brucelosis en las embarazadas puede modificarse con la administración temprana de. • La historia natural de la brucelosis en las embarazadas puede modificarse con la administración temprana de.

• El sangrado vaginal es un signo de mal pronóstico.

• Cotrimoxazol y rifampicina se pueden utilizar en el embarazo .

• La utilización de estos antibióticos sólos o combinados protegen efectivamente contra el aborto

•Sinembargo se necesitan estudios que permitan verificar mas claramente el impacto de la bacteriemia en la producción de aborto .

•No obstante los studios de caso-control son difíciles de implementar.

Occurrence of spontaneous abortion and intrauterine death, according to trimester of pregnancy, in 92 women with acute brucellosis in Saudi Arabia.

Khan M Y et al. Clin Infect Dis. 2001;32:1172-1177

© 2001 by the Infectious Diseases Society of America

Incidence of spontaneous abortion and intrauterine death, according to pregnancy trimester and clinical presentation, among 92 pregnant women with acute brucellosis in Saudi Arabia.

Khan M Y et al. Clin Infect Dis. 2001;32:1172-1177

© 2001 by the Infectious Diseases Society of America

Aspectos de la Brucelosis en pacientes asistidos en el Hospital Muñiz

en el período 2008 - 2011

• Se detectaron 57 casos.

• Una amplia mayoría de los pacientes eran varones ( 85%)

• En el 90% se presentó como infección ocupacional (70% de la industria de

la carne)

• La mayoría de los pacientes (75%) presentaron síntomas de < de un año de

evolución y 20% eran asintomáticos

• El diagnóstico se confirmó por cultivo en el 37% de los casos.

• B. suis fue la especie mas frecuentemente aislada ( + del 50%)

Meta…

Se desarrolló un inmunoensayo rápido y accesible para un

diagnóstico fácil y preciso de la brucelosis en animales y humanos.

Inmunoensayo indirecto basado en perlas magnéticas y utilizando un

Conjugado de polisacarido O -proteína obtenido en forma

recombinante como antígeno novedoso.

Diseño y Producción de Glicoconjugados obtenidos en forma Recombinante

Brucella abortus conjugado Polisacarido O-proteína (AcrA-OAg)

Glico conjugación in vivo en E. coli

Excitación

Principios del ensayo

11) Incubación con la ) Incubación con la muestra (5 min a TA).muestra (5 min a TA).

2) Lavados2) Lavados

3) Incubación con el 3) Incubación con el conjugado (5 min a TA).conjugado (5 min a TA).

4) Lavado.4) Lavado.

5) Lectura por 5) Lectura por Excitación

Emisión

5) Lectura por 5) Lectura por fluorescenciafluorescencia

10

0

12

0

14

0

16

0

Percentage of reactivity

Dia

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20

40

60

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positive

negative

1497

1213

1548

1143

1624

1149

1023

1380

1097

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15A

39A

63A

64A

1026

1084

1212

1042

1252

1428

1140

1248

1402

1416

1162

1401

1065

1239

1243

1216

1144

1448

1159

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120

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160

180

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Diagnóstico de brucelosis en humanos

Sueros de pacientes con Brucelosis diagnosticada por serología y cultivo negativos

0

20

40

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80

100

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11

11

12

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16

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12

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10

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12

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11

10

13

64

15

88

10

26

10

84

12

12

10

42

12

52

14

28

11

40

12

48

14

02

14

16

11

62

14

01

10

65

12

39

12

43

12

16

11

44

14

48

11

59

Controls Culture-negative, serologically-positive Negatives

Pe

rce

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ge

of

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ctiv

ity

Conclusions

� Se desarrolló un novedoso inmunoensayo ustilizando como antígeno un glicoconjugado

recombinante que se acopla a perlas magnéticas.

� Este inmunoensayo se utilizó en sueros bovinos y permitió diferenciar animales infectados

de no infectados y de vacunados

� Este ensayo permite diferenciar pacientes infectados de no infectados. � Este ensayo permite diferenciar pacientes infectados de no infectados.

� Debido a su simplicidad y bajo costo este ensayo parece ser muy promisorio en el

diagnóstico de la enfermedad

� Los resultados presentados demuestran la utilidad de la obtención de glicoconjugados

recombinantes con diferente composición, los que podrían aplicarse al diagnóstico de multiples

enfermedades infecciosas.

Prevención

• Existen vacunas con cepas atenuadas paraB. abortus (strain 19) y B. melitensis (strain Rev-1), pero no se dispone de vacunas para for B. suis y B. canis. Ocasionalmente los, accidentes con cepa 19 y Rev-1 han causado enfermedad humana.

Anonymous: Human exposure to Brucella abortus strain RB51--Kansas, 1997. Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, Ga. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 1998;47:172-175.

B. abortus cepa RB51, es una mutante rugosa estable, ha reemplasado a la cepa 19 en los programas de vacunación de EEUU la cepa 19 en los programas de vacunación de EEUU

• Hasta el presente no se han desarrollado vacunas seguras para uso humano

Bioterrorismo• Brucella es un agente de categoría biológica B

Los agentes de categoría B pueden diseminarse ampliamente aunque causando enfermedad pero con baja mortalidad

Erradicación de la brucelosis

Erradicación

en animales

Erradicación

en humanos

Prevención en humanos

Vacunación

Detección

(decomiso)

Prevención en animales

+

Epidemiología:efectos de un programa de control

From Centers for Disease Control and Prevention. Summary of notifiable diseases, United States, 1996. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 1996; 45:26

Mientras tanto……

A pesar de contar con antibióticos apropiados y con adecuados instrumentos para controlar erradicar la enfermedad, La Brucelosis continua ocasionando un problema económico y sanitario en mas de 150 países

Muchas

Gracias!!