Analisi delle correnti di Na

secondo Hodgkin e Huxley Prof. Mauro Toselli

Dip. Biologia e Biotecnologie

Università di Pavia

Scuola di Fisiologia e Biofisica 2015

Società Italiana di Fisiologia

Pavia, 30/6/2015

La corrente di Na

ENa=+52 mV

Lo scopo di misurare le correnti di Na è quello di poter ottenere da esse

informazioni circa la permeabilità della membrana allo ione Na+ (ovvero circa il

comportamento dei canali ionici del Na).

RTVzF

RTVzFCC

RT

VFPzI ei

/exp1

/exp22

DOMANDA:

È lecito assumere che per la corrente di Na valga la legge di Ohm e che quindi INa

possa essere messa in rapporto con la conduttanza gNa secondo la relazione

INa = gNa(Vm-ENa)

anziché con la permeabilità PNa, secondo l’assai più complicata equazione di GHK

per la corrente?

Perché misurare le correnti di Na?

La misura della corrente istantanea permette di stabilire se l’utilizzo della

legge di Ohm è lecito per lo studio della corrente di Na

INa = gNa(V-ENa)

La relazione I/V istantanea per il Na è approssimativamente lineare, come previsto

dalla legge di Ohm

Pertanto gNa può essere utilizzata come misura della permeabilità della membrana

al sodio ovvero della frazione di canali del Na aperti.

INa = gNa(V-ENa) gNa = INa/(V-ENa)

Il modello delle gates secondo Hodgkin e Huxley

Diagramma schematico di un canale voltaggio-dipendente rappresentato come

una proteina transmembranaria con un poro acquoso. Sono indicate le regioni

funzionali essenziali: la gate, il sensore del voltaggio e il filtro di selettività.

La proteina-canale va incontro a cambiamenti conformazionali in risposta ad una

variazione del campo elettrico a cavallo della membrana.

In conseguenza di tali cambiamenti conformazionali la proteina-canale passerà da

uno stato chiuso, impervio agli ioni, ad uno stato aperto pervio agli ioni, o vice

versa.

Qualora la transizione tra i due stati chiuso e aperto sia regolata da un’unica gate,

ovvero la transizione avvenga tramite un unico cambiamento conformazionale

della proteina-canale, lo stato di apertura (o chiusura) del canale si identifica

con lo stato in cui si trovano la gate e la particella di gating (sensore del

voltaggio) in quell’istante.

Ciò significa che per un canale che possiede un’unica gate di attivazione la

reazione tra stato chiuso e aperto del canale è esprimibile nel seguente modo:

Assunzioni di base per il modello delle gates

1

p(V)

p1 -(V)

p(V)

p1 -(V)

C O ovvero

Assunzioni di base per il modello delle gates

2

La reazione tra stato non permissivo (chiuso) e permissivo (aperto) della

singola gate segue una cinetica del primo ordine,

ed è quindi descrivibile dalla seguente equazione differenziale:

ppdt

dp)1(

Basato su queste assunzioni, il modello delle gates fornisce una

descrizione sia della voltaggio-dipendenza che della tempo-dipendenza

dei canali ionici.

C O

Quando il potenziale di membrana verrà mantenuto ad un certo valore per un

tempo sufficientemente lungo, la reazione cinetica raggiungerà l’equilibrio (o

stato stazionario). Allo stato stazionario sarà:

0)1( ppdt

dp

)()(

)()(

VV

Vtpe quindi:

Invece, l’andamento temporale con cui lo stato stazionario verrà raggiunto sarà

descritto dalla seguente funzione esponenziale, che è una soluzione

dell’equazione differenziale di partenza t

ppptp o exp)()(

Dove p∞ è il valore di p allo stato stazionario e po è il valore di p a t=0 e in cui la

costante di tempo è in relazione con le due costanti di velocità e nel

seguente modo:

)()(

1

VV

LA REAZIONE ALL’EQUILIBRIO

CINETICA DELLA REAZIONE

po

p∞

Pertanto, ricavando sperimentalmente i valori di p∞(V) e di (V), è possibile ottenere le

costanti di velocità (V) e (V), che ci permettono di descrivere quantitativamente le

caratteristiche di tempo-dipendenza e voltaggio-dipendenza del canale.

RIASSUMENDO:

)()(

)(

VV

Vp

)()(

1

VV

/p /)1( p

OVVERO:

C O

I concetti appena espressi verranno ora utilizzati per

una analisi quantitativa del canale del Na da un punto

di vista biofisico

Separazione dell’attivazione dall’inattivazione

Agenti che eliminano l’inattivazione dei canali del Na

Sostanza Azione

Pronasi Intracell.

Tripsina Intracell.

N-bromoacetamide (NBA) Intracell.

Acido sulfonico 2,4,6-trinitrobenzene (TNBS) Intracell.

2-2’-acido disulfonico 4-acetamide-4-isotiocianostilbene (SITS) Intracell.

tossine di scorpione e celenterato extracell-.

pH<<7 – pH>>7 Intracell.

h

h

m

m

C O I

-80 mV

0 mV

L’inattivazione del canale del Na

Meccanismo “ball and chain”

Studio dell’attivazione allo stato stazionario delle correnti di Na

Rimozione dell’inattivazione per trattamento con pronasi

m

m

C O

Ciascuna porta di attivazione del canale del Na segue una cinetica del primo ordine

mm(V)

m1 -m(V)

mm(V)

m1 -m(V)

descrivibile dalla seguente equazione differenziale:

mmdt

dmmm )1(

Secondo il modello proposto da H&H l’attivazione dei canali del Na sarebbe

mediata dall’apertura di tre porte (“particelle di gating” secondo la terminologia

utilizzata dai due autori) uguali e indipendenti

m

m

C O

Dove m∞ è il valore di m allo stato stazionario e mo è il valore di m a t=0 e in cui

la costante di tempo m sono in relazione con le due costanti di velocità m e m

nel seguente modo:

)()(

1

VV mm

m

Mentre, l’andamento temporale con cui lo stato stazionario verrà raggiunto

sarà descritto dalla seguente funzione esponenziale, che rappresenta una

soluzione dell’equazione differenziale

m

o

tmmmtm exp)()(

La soluzione di tale equazione allo stato stazionario (t→∞) è:

)()(

)(

VV

Vm

mm

m

Calcolo di m∞ in assenza di inattivazione (pronasi)

Rimuovendo l’inattivazione è possibile calcolare i valori di INa e quindi anche di

gNa allo stato stazionario

INa=gNa(V-ENa) e gNa=INa/(V-ENa)

dove gNa = GNam∞3 ,essendo GNa è il valore massimo della conduttanza allo

stato stazionario, che viene raggiunto a valori molto depolarizzanti di

potenziale, quando praticamente tutti i canali del Na presenti in membrana

sono aperti, e m∞3 è la probabilità di avere tutte e tre le gates dell’attivazione

contemporaneamente aperte allo stato stazionario

Quindi: m∞3=gNa/GNa da cui si ricava che: m∞=3√(gNa/GNa)

)()(

)(

VV

Vm

mm

m

Calcolo di m in assenza di inattivazione (pronasi)

Si parte da un potenziale di holding piuttosto negativo, ad es. -70 mV, e si

depolarizza la membrana a vari potenziali per diversi ms, come nell’esempio

in figura;

Per la corrente di Na, m è calcolabile interpolando l’andamento temporale di gNa,

ottenuto ai vari potenziali in depolarizzazione, con una funzione esponenziale

elevata alla terza potenza del tipo

3/exp tBAACy /exp tBAACy

L’andamento della

conduttanza

rispecchia

l’andamento della

probabilità di

apertura del canale

Calcolo di m in assenza di inattivazione (pronasi)

Protocollo alternativo per calcolare m a quei valori di potenziale molto negativi ai quali la

corrente di Na attivabile con il protocollo visto prima sarebbe molto piccola. Prima si

depolarizza la membrana ad un potenziale fisso (V1) piuttosto positivo e per un

tempo sufficientemente lungo da attivare un numero cospicuo di canali del Na, e poi

si porta il potenziale di membrana a vari livelli (V2) che, se sono più negativi di V1

causeranno una ripolarizzazione e quindi una deattivazione dei canali stessi aperti a

V1, come nell’esempio di figura B.

m è calcolabile interpolando l’andamento

temporale di gNa attivata a V2 con una

funzione esponenziale elevata alla terza

potenza, anch’essa del tipo:

3/exp tBAACy

Calcolo di m in assenza di inattivazione (pronasi)

Utilizzando entrambi i metodi è possibile ottenere sperimentalmente i valori di

m per un ampio range di potenziali

Studio dell’inattivazionedel canale del Na

La porta di inattivazione del canale del Na segue una cinetica del primo ordine

descrivibile dalla seguente equazione differenziale:

hh(V)

h1 -h(V)

hh(V)

h1 -h(V)

hhdt

dhhh )1(

Secondo il modello proposto da H&H l’inattivazione dei canali del Na sarebbe

mediata dall’apertura di un’unica porta

h

h

O I

Dove h∞ è il valore di h allo stato stazionario e ho è il valore di h a t=0 e in cui

la costante di tempo h è in relazione con le due costanti di velocità h e h nel

seguente modo:

Mentre, l’andamento temporale con cui lo stato stazionario verrà raggiunto

sarà descritto dalla seguente funzione esponenziale, che rappresenta una

soluzione dell’equazione differenziale

h

o

thhhth exp)()(

)()(

1

VV hh

h

La soluzione di tale equazione allo stato stazionario (t→∞) è:

)()(

)(

VV

Vh

hh

h

Studio dell’inattivazione allo stato stazionario

delle correnti di Na: calcolo di h∞

h

h

O I

)()(

)(

VV

Vh

hh

h

/exp tBAACy

Calcolo di h

Nel range di potenziali depolarizzanti a partire da -50 mV, dove il fenomeno

dell’inattivazione è chiaramente manifesto, come in figura, una misura della

cinetica dell’inattivazione la si può ottenere interpolando la componente

inattivante della corrente di Na con una funzione monoesponenziale decrescente,

dalla quale è calcolabile direttamente la costante di tempo dell’inattivazione ( h

secondo la terminologia di Hodgkin e Huxley).

Velocità del recupero dall’inattivazione (de-inattivazione) della corrente

di Na

La corrente viene evocata in successione a due potenziali test (V1 e V2) aventi la

stessa ampiezza ma separati da un ritorno al potenziale di holding di durata variabile.

V1 evoca una corrente sufficientemente ampia, utilizzata come controllo, la cui durata

è tale da permettere l’inattivazione pressoché completa dei canali. V2 partirà dopo che

la membrana verrà ripolarizzata al potenziale di holding per un numero crescente di

ms, permettendo ad una frazione di canali sempre più ampia di rimuovere

l’inattivazione. Il confronto tra le correnti evocate durante V2 e V1 permetterà di

stimare la frazione di canali che hanno recuperato dall’inattivazione.

Il recupero

dall’inattivazione sarà

approssimativamente

descrivibile da una

funzione

monoesponenziale del

tipo y=1-exp(-t/ h), dove

h è la costante di tempo

dell’inattivazione.

Utilizzando entrambi i metodi è possibile ottenere sperimentalmente i valori di

h per un ampio range di potenziali

Calcolo di h

)()(

1

VV hh

h

Le costanti di velocità m, m e h, h

Quindi, dai dati sperimentali è possibile ricavare i valori di m e m∞, e di h e h∞

Le corrispettive costanti di velocità m e m e h e h sono in relazione con essi

nel seguente modo:

mm m /

mm m /)1(hh h /

hh h /)1(

h

h

m

m

C O I

O C C C

3 1

2

2

2

3

3 I

h

h

Pertanto, la corrente ionica INa può essere rappresentata dalla seguente

equazione

NaNa EVgtVhtVmI ),(),( 3

dove m3·h rappresenta la probabilità composta che le tre gates m e la gate h

siano contemporaneamente aperte e ḡ è una costante.

0 10 20 30 40

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Pro

b. di apert

ura

(P

o)

Tempo (ms)

m3(t) h(t)

m3*h

THAT’S ALL FOLKS!

Studio della cinetica di attivazione/deattivazione senza eliminare l’inattivazione