Approccio critico alla diagnosi di laboratorio:

ANA screening: ANA screening: un test storico e con recenti un test storico e con recenti

rivisitazionirivisitazioni

Angela Tincani e Nice CarabelleseSpedali Civili e Università degli Studi di Brescia

Le due solitudiniLe due solitudini

• I medici che vedono i pazienti & interpretano il risultato degli autoAb nell’ambito della malattia sono concentrati sul:

-fare una diagnosi corretta

-iniziare il trattamento

• I laboratoristi che ricevono il siero & interpretano i risultati nell’ambito di coorti sierologiche si sforzano di:

-dare il risultato giusto

Detection and quantification of

autoantibodies are vital tests in the diagnosis and management of

autoimmune diseases

Fritzler et al. Arthritis Res Ther 2003;5:192-201.Wiik et al. Lupus 2006;15:391-96

Una storia Una storia vecchiavecchia •Aumento del numero

delle richieste

•I tests non sono più confinati a laboratori

specialistici•Introduzione di nuove tecniche di indagine

•Test automatizzati

Aspetti nuoviAspetti nuovi

Il problema della riproducibilità Il problema della riproducibilità diventa il problema centrale !!diventa il problema centrale !!

Ulteriori problemiUlteriori problemi• Le manifestazioni cliniche all’esordio di una

malattia autoimmune sistemica sono spesso modeste e non caratteristiche

• La diagnosi precoce è requisito essenziale per il successo del trattamento

• Un test sbagliato può ritardare la diagnosi o• Può essere responsabile di costi aggiuntivi

dovuti alla ripetizione di tests di conferma e/o alla esecuzione di altre procedure diagnostiche magari inutili.

• Aspetti etici (Bossuyt et al. Ann Rheum Dis 2008;67:1061-63).

Un esempio paradigmatico del

problema sono i test di screening per gli anticorpi

antinucleo (ANA)

• Dagli anni 70 le sezioni di tessuto usate come substrato sono state sostituite da cellule da coltura(Cellule HEp2, cellule epiteliali di carcinoma di laringe umana)- alta sensibilità: > 80%

- alta specificità: NHS 5-15% +ve

* Importante la diluizione di partenza: raccomandata 1/160 (Tan et al A&R ‘97)

HEp2 IIF ANA screening HEp2 IIF ANA screening testtest

•Sempre più usato negli ultimi 25 anniSempre più usato negli ultimi 25 anni -

Utilizzatori: reumatologi, nefrologi, dermatologi, internisti, ginecologi, epatologi, neurologi, pediatri, oculisti, otorinolaringoiatri, endocrinologi, pneumologi, medici di medicina generale.

1:160

Gli ANA in IIFGli ANA in IIF

Limiti degli ANA testati in Limiti degli ANA testati in IIFIIF

• Le cellule Hep-2 cells hanno circa “150 Ags diversi”

• Ma il metodo IIF non riesce a rilevare tutti gli anticorpi utili dal punto di vista clinico; talvolta difficile è rilevare:

- Jo-1, Ag P Ribosomiale, PCNA, CENP, Ro/SS-A

• La presenza di multiple positività può “mascherare”

• Grande variazione tra ditta e ditta • Possibilità di “falsi positivi”• La lettura è oggi operatore dipendente

ANA HEp-2 pattern is a critical parameter for discriminating ANA-

positive healthy individuals & patients with autoimmune rheumatic diseases

(Mariz Ha et al A&R ’11)

Dense Fine Speckled (DSF70)

Nuclear homogeneous, nuclear coarse speckled, and nuclear centromeric patterns appeared exclusively in patients with ARDs.

The nuclear dense fine speckled pattern occurred only in healthy individuals.

The most frequent ANA pattern in both groups was the nuclear fine speckled pattern, which occurred at lower titer in healthy individuals than in patients with ARDs (P<0.001).

(Observed at 1:80 dilution in 2 distinct commercial HEp-2 slides by 2 blinded independent observers).

Siamo di fronte a un problema

• Gli ANA screening che utilizzano ELISA o altre fasi solide (beads) sono metodiche più economiche e veloci e hanno iniziato a sostuire la IIF in molte realtà.

• Un piccolo ma significativo numero di pazienti con LES o altre ARD possono risultare positivi alla IIF ma negativi nei tests in fase solida (che studiano un numero di Ag limitato).

….e alle sue conseguenze

• Negli USA nel 2008 sono stati segnalati numerosi casi di falsi risultati negativi di ANA nella pratica clinica con conseguenti problemi anche assicurativi !!

Volume 360:711-720 February 12, 2009 Number 7

Case 5-2009 — A 47-Year-Old Woman with a Rash and Numbness and Pain in the Legs

Daniela Kroshinsky, M.D., John H. Stone, M.D., M.P.H., Donald B. Bloch, M.D., and Alireza Sepehr, M.D.

Il risultato negativo degli ANA eseguiti all’inizio della storia clinica ha ritardato per mesi la diagnosi di LES.

ACR Annual MeetingBoston 2008

ACR Study GroupAutoantibodies in Diagnosis and Follow-up of Rheumatic Diseases

Coordinators:  Angela Tincani, MD, and Edward K.L. Chan, PhD

Moderator: Pier Luigi Meroni, MD

Session Objectives: …………………………………….. Discuss the current ACR topic of ‘inaccurate results for antinuclear antibody’ when using ANA Enzyme-linked Immuno-Sorbent Assay or coated beads for screening

Inaccurate Results for ANA by John A. Goldman, MD, Atlanta, GA

ACR Annual MeetingS. Francisco 2009ACR Study Group

Autoantibodies in Diagnosis and Follow-up of Rheumatic Diseases

Coordinators:  Angela Tincani, MD, and Edward K.L. Chan, PhD

Moderator: Pier Luigi Meroni, MD

Session Objectives: • identify the common clinical problems associated with inaccurate ANA results • describe the current technologies that clinical laboratories are using and how physicians should be engaged with the clinical laboratory• outline the proper use and interpretation of autoantibody testing in a clinical rheumatology setting• state the role and ethical obligations of the manufacturer, diagnostic laboratory and the clinician in the production, sale and use of autoantibody diagnostic kits Cases of Inaccurate ANA by Merlin R. Wilson, MD, New Orleans, LA

Screening ANA Assays: Immunofluorescence on HEp-2 cells vs Enzyme Immunoassays and Multiplex Bead Assaysby Eng M. Tan, MD, La Jolla, CA

Role of FDA on ANA Testingby Marilyn Lightfoote, PhD, FDA, Rockville, M

COMMITTEE OF AUTOANTIBODY COMMITTEE OF AUTOANTIBODY STANDARDIZATION INTERNATIONAL STANDARDIZATION INTERNATIONAL

UNION OF IMMUNOLOGICAL SOCIETIES UNION OF IMMUNOLOGICAL SOCIETIES (AutoAb.org)(AutoAb.org)

ANA Task Force• Negli USA nel 2008 sono stati segnalati numerosi casi

di falsi risultati negativi di ANA nella pratica clinica• Questi dati sono stati riportati ai membri del’ACR e

discussi in diversi gruppi di studio (in presenza anche dell’industria).

ed è stato costituito un gruppo per analizzare il problema ed arrivare ad una opinione comune

• I metodi in fase solida possono rilevare Abs soltanto verso gli antigeni che vengono copulati alla fase solida.

• Le cellule Hep-2 contengono un numero infinito di Ag.

Le possibili ragioni del problema

• In caso venga copulato in fase solida il così detto estratto nucleare da Hep-2, non siamo in grado di dire quali antigeni siano disponibili. Si potrebbero perdere importanti epitopi durante il processo di estrazione o durante quello di copulazione.

Standardizzazione dei tests diagnostici per le Standardizzazione dei tests diagnostici per le malattie autoimmunimalattie autoimmuni

alcuni degli aspetti su cui alcuni degli aspetti su cui lavorarelavorare

• Valutazione della variabilità dei metodi;

• Interpretazione dei tests e impostazione algoritmi;

• Caratterizzazione degli Ag utilizzati come bersaglio per gli autoanticorpi presenti nel siero dei pazienti;

• Disponibilità di materiale di riferimento;• Lettura computerizzata immagini digitali.