Pseudomonas syringae pv. actinidiae: Pseudomonas syringae pv. actinidiae:biologia e comportamento

Davide SpadaroDavide Spadaro

AGROINNOVA – Università di TorinoAGROINNOVA  Università di Torino

8 novembre 2011

Diffusione PSA: prima ondataGiappone: 1984 (segnalato nel 1989)Giappone: 1984 (segnalato nel 1989)Corea del Sud: 1992 (segnalato nel 1994)Cina (Shaanxi): 1990 (segnalato nel 2000)Ci (Si h ) 1989 ( l t l 1992)Cina (Sichuan): 1989, (segnalato nel 1992)Cina (Anhui): 2004 (segnalato nel 2004)

Italia (Roma): 1992( )(segnalato nel 1994)

Diffusione PSA: seconda ondata

Italia (2008-2011), segnalato nel 2008

Francia (2010), segnalato nel 2010( ) g

Nuova Zelanda (2010), segnalato nel 2010

Portogallo (2010), segnalato nel 2010Portogallo (2010), segnalato nel 2010

Cile (2011), segnalato nel 2011

Spagna (2011) segnalato nel 2011Spagna (2011), segnalato nel 2011

o A. chinensis (Hort16A, JinTao e Soreli), > densità stomi( , ),o A. deliciosa (Hayward)o A. arguta,

A k l ikto A. kolomikta

Diffusione PSA in ItaliaLazio 2008Lazio 2008Partito dalla cv neozelandese Hort16A(70% LT, 20%RM, 10%VT)

Veneto (2009)Emilia Romagna (2010)Piemonte (2010)Piemonte (2010)Calabria (2010)

Movimento materiale vegetativog

Lazio 2009 (10% frutteti Hort16A)Lazio 2010 (40% frutteti Hort16A)Lazio 2011 (100% frutteti Hort16A)85% estirpati

Lazio 2011 (100% frutteti Jin Tao)Lazio 2011 (15-30% frutteti altre cv)

Diffusione PSA in Francia

80 casi Molte regioni e molte cv

26% dell’area coltivata a Hort16A

Importazione di materiale vivaistico dall’Italia.

Diffusione PSA in Nuova Zelanda5 novembre 20105 novembre 2010Due ceppi di PSA, uno più virulento PSA-V (principalmente regione di Te Puke)e uno meno virulento PSA-LV (less virulent, tutta la NZ)e uno meno virulento PSA LV (less virulent, tutta la NZ)

Al 2 novembre 2011:689 actinidieti positivi a Psa-Vp(28% degli ettari)

PZ Priority zones (raggio 3-5 km intorno a un frutteto colpito da PSA, contenimento)(73% degli impianti)

HRA High risk areas (circondano le PZ, presentano frutteti)

Diffusione PSA in Nuova Zelanda

Fonte: KVH, 2 novembre 2011

Pseudomonas syringaeB tt iBatterioA bastoncelloGram negativoAerobio obbligatoAerobio obbligatoPresenta uno o più flagelli polari

Pseudomonas syringaeC l i di GColorazione di Gram

Gram negativo Gram positivo(LPS) (PG)(LPS) (PG)

FlagelliFlagelli

Patovar di Pseudomonas syringae50 patovar50 patovar Differenziazione a livello infrasubspecifico per patogenicità su determinate specie di piante ospiti

• pv tomato

pomodoropomodoro

• pv phaseolicola

fagiolofagiolo

• pv tabaci

tabaccotabacco

Patogenicità di Pseudomonas syringae

Sistema di secrezione di tipo 3 (TTSS), include:

Geni hrp (risposta ipersensibile e patogenicità)p ( p p p g )

Geni hop (hrp out proteins)

hrp/hop codificano per effettori

ApoplastType III chaperone

HR

DEFENSE

NucleusDISEASE

GenomaPrimo sequenziato nel 2000: PTO, poi PSY e PPHq , pCirca 6 MbCirca 5500 geniCirca 300 geni coinvolti nella virulenzaCirca 30 TTSS

Genoma di PSA asiatico (luglio 2011)

MAFF 302091MAFF 302091Pseudomonas syringae pv actinidiae Takikawa, Serizawa, Ichikawa, Tsuyumu and Goto 1989Source: Actinidia deliciosa Liang et FergusonSource: Actinidia deliciosa Liang et Ferguson (Actinidia chinensis Planch. var. hispidaC.F.Liang), Kanagawa, Japan

Moltiplicazione

Scissione binaria (un batterio si divide in due)

Riproduzione asessuale

Non forma spore di resistenzaNon forma spore di resistenza

Si divide ogni 20 minuti

Potenzialmente (condizioni ottimali):1 batterio – 7 ore – 2 milioni

SopravvivenzaVive su superfici organiche e inorganiche.Sulla plastica (materiale inerte) per 8 giorni(forma biofilm protettivo, resiliente a disinfettanti).Sul legno (2 settimane) o sui residui colturali (2 mesi)

Sopravvive anche per brevi periodi nell’acqua e nel suolo.

E i li l i di i f i t tiEssenziali lavaggio e disinfezione strumenti.

Dispersione

Materiale propagativo

Probabili:Probabili:Diffusione naturale (schizzi di pioggia, vento, insetti, api, uccelli)Diffusione attraverso l’uomo (abiti, calzature, strumenti, macchinari)

Vanneste et al.Actinidieto di Latina

Dispersione: il polline

Novembre 2010:Ministero dell’Agricoltura e delle Foreste della Nuova ZelandaCampioni di polline positivi a PSA raccolti nel 2009 e nel 2010.

Occorre impiegare solo polline valutato per PSA.Ruolo principale: pioggia, vento, mezzi meccanici, materiale vegetativo.

Ulteriori studi necessari

PenetrazionePsa-V penetra attraverso aperture naturali o ferite.Stomi sulle foglie: in primavera-estate

Ceppi marcati con GFP

Infezioni primarie e secondarie

INFEZIONI PRIMARIE (esterne)Avvengono attraverso le foglie, facilitate da brina, vento e pioggiae pioggia. PSA-V penetra attraverso stomi, idatodi e ferite.Maculature fogliari, tra le venature

INFEZIONI SECONDARIE (interne)Dormienza, poi migrazione (inverno e inizio primavera)Dormienza, poi migrazione (inverno e inizio primavera) e infezione sistemica attraverso xilema e floema. Infezione di tronchi e tralci.Cancri su tronchi e tralci.Essudati bianchi (batteri)Essudati rossastri (composti fenolici del kiwi)

Fattori predisponenti

T ottimale 10-20°CT superiori: inibentiT superiori: inibentiT inferiori: cresce più lentamente

Psa-V predilige clima umido e fresco.

I f i f it i t i iInfezione favorita in autunno e in primavera.

Fattori predisponenti

Gelate, Grandine,F it t l ti h i hFerite provocate con le pratiche agronomiche(legatura, potatura)

Il batterio nella piantaIl batterio sopravvive come epifita sulla superficie delle piantep p p p1 FASE ASINTOMATICA: I batteri risiedono negli spazi tra le venature sulla superficie fogliare e usare i nutrienti delle piante.

Il batterio penetra attraverso ferite e aperture naturali (infezione)2 FASE DI TRANSIZIONE: I batteri colonizzano gli stomi, si diffondono attraverso le venature allo stelo e al tronco Infezioni asintomaticheattraverso le venature, allo stelo e al tronco. Infezioni asintomatiche. Poi invasione avanzata: avvizzimento, necrosi germigli e tralci. Popolazioni elevate sulle foglie provocano maculature.

3 MORTE CELLULARE: I batteri colonizzano i tessuti e raggiungono il sistema vascolare (xilema e floema).

Le radici ?

Il ciclo vitaleEstate

PrimaveraProduzione dell’inoculoNuove infezioni: stomi

Moltiplicazione nei tralciFase stazionariaInfezioni occasionali cheNuove infezioni: stomi Infezioni occasionali che portano a maculature fogliari

Maculature fogliari

Avvizzimento delle gemme

Cancri sul trono e sui tralciCancri sul trono e sui tralci

Essudato biancoInfezioni secondarieAutunnoInfezione avviene alla caduta foglie (peduncolo)

InvernoSopravvivenza nei cancri

Essudato rosso

g (p )e alla raccolta

pMoltiplicazione nei tessuti vegetali

Primavera

1°) AVVIZZIMENTO PRIMAVERILE DA INFEZIONE INVERNALE

2°) AVVIZZIMENTO DI GEMME E GERMOGLI DA INFEZIONE PRIMAVERILE

3°) AVVIZZIMENTO DI GIOVANI RAMI E MIGRAZIONE SISTEMICA

EstateCOLONIZZAZIONE STOMATICACOLONIZZAZIONE STOMATICA

FORMAZIONE DI CANCRI SU CORDONE ETRONCO IN PIENA ESTATETRONCO IN PIENA ESTATE

PENETRAZIONE ATTRAVERSO LE LENTICELLEPENETRAZIONE ATTRAVERSO LE LENTICELLE

AUTUNNOPENETRAZIONE, DOPO LA RACCOLTA, ATTRAVERSO, ,LE CICATRICI DEL PEDUNCOLO DEL FRUTTO

MIGRAZIONE DAL PEDUNCOLO AL RAMO DURANTE IL PERIODO

INVERNOMIGRAZIONE DAL PEDUNCOLO AL RAMO DURANTE IL PERIODO

INVERNALE / ESSUDATI

Isolamento e caratterizzazioneIsolamento in capsula su substrato agarizzatoIsolamento in capsula su substrato agarizzato24 ore di crescita a RTcolonie batteriche di forma circolare, diametro di 2 mm, colore bianco-giallo chiaro. Gram negativi aerobi non producono pigmenti fluorescentiGram negativi, aerobi, non producono pigmenti fluorescenti

Caratterizzazione morfologica, funzionale, biochimica e nutrizionale

Identificazione molecolareSequenziamentoSequenziamento16S della regione ribosomale (più lunga, laboriosa e costosa).

PCR ifiPCR specificaRicerca di primer specifici per l’amplificazione selettiva di isolati di PSArispetto ad isolati appartenenti ad altre patovar di Pseudomonas syringae oad altre specie all’interno del genere Pseudomonas.

RAPD (Koh e Nou, 2002)( )gene 16S rDNA (Scortichini et al., 2002)gene argK (Sawada et al., 2002; Templeton et al., 2005)

spaziatori intertrascritti ribosomali (ITS): due nuove coppie di primer(PsaF1/R2 e PsaF3/R4) (Rees-George et al., 2010)

AGROINNOVA: PCR specifica e sequenziamento ITS

Isolati positiviLe amplificazioni con le coppie di primer PsaF1-PsaR2 e Psa3F-Psa4R hannoLe amplificazioni con le coppie di primer PsaF1-PsaR2 e Psa3F-Psa4R hannogenerato due amplificati di 280 bp e 175 bp in 60 dei 92 campioni analizzati.

PSA1F/PSA2RPSA1F/PSA2R

PSA3F/PSA4R

13 isolati batterici da kiwi. I primi 7 pozzetti sono gli isolati ottenutida foglia, gli altri 6 da ramo.

Ceppi virulenti e meno virulenti

Ceppi virulenti e meno virulenti

Ceppi virulenti e meno virulenti

Giappone, 1984

Analisi MLST

(MultiLocus Sequence Typing)

Italia, 1992

Latina, 2008R 2009

Quattro geni conservati:

gapA, gltA, gyrB, rpoD

Ravenna, 2009Latina, 2009

Ferrante e Scortichini, 2010

NJ dati concatenati

Ceppi virulenti e meno virulenti

Ferrante e Scortichini, 2010

Ceppi virulenti e meno virulenti

Caratterizzazione molecolare degli isolati

I l ti i t i l i li i ti iIsolati piemontesi, laziali e asiatici

Analisi AFLP

Definire l’origine degli isolati

Collaborazione con Università della Tuscia

Il progetto CRT: Contenimento della batteriosi dell’actinidia (Pseudomonas syringae pv. actinidiae) in Piemonte ( y g p )

1. Aspetti epidemiologici2 Dif2. Difesa3. Caratterizzazione molecolare4 Divulgazione4. Divulgazione

Grazie per l’attenzione!