Acidi nucleici - 1

presentazione del prof. Ciro Formica

Ripercorrere le tappe che hanno portato a identificare nel DNA il materiale genetico;•gli esperimenti di Griffith•di Avery-McLeod•di Hershey e Chase.

Prima degli anni ‘202

Erano già stati eseguiti:-gli esperimenti di Mendel nell’800 sui piselli-gli esperimenti di Sutton sull’appaiamento dei cromosomi omologhi-i primi esperimenti di Morgan sulla Drosophila-l’estrazione della nucleina da parte di Miescher

Del DNA si conosceva solo che era formato da composti a base di fosfati, ma nulla si sapeva della doppia elica, né che fosse il materiale della trasmissione ereditaria.

Gli scienziati erano invece convinti che fossero le proteine a trasmettere l’informazione genetica

Immagini e testi tratti da:wikipedia.it, unimi.it, genome.wellcome.ac.uk

I primi studi di genetica: Mendel3

Gregor Mendel (1822-1884) fu un abate di origine ceca studioso di matematica e botanica. Oggi è conosciuto come il "padre della genetica moderna”. Per i suoi esperimenti coltivò e analizzò durante 7 anni circa 28.000 piante di piselli. Nei 2 anni successivi elaborò i suoi dati e giunse a 3 formulazioni, che poi diventarono famose come leggi dell’ereditarietà.

I caratteri di Mendel della pianta di pisello

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Scoperta della nucleina: Miescher5

Friedrich Miescher, biologo svizzero (1844 -1895) scoprì nel 1869 la NUCLEINA, una sostanza ricca di fosfato nel nucleo dei globuli bianchi. Fu uno dei primi passi verso la futura scoperta del DNA.Trattando le cellule del pus con la pepsina ottenne dei nucleiche poi trattava con soluzioni debolmente alcaline. Poi neutralizzò con soluzioni acide ottenendo un precipitato insolubile in acqua e in soluzioni saline.

La nucleina di Miescher

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La sostanza che aveva isolato non poteva essere nessuna delle proteine conosciute e fu denominata NUCLEINA. In seguito Altmann eliminò le proteine dalla nucleina. Fu il primo ad usare l’espressione ACIDO NUCLEICO

Scoperte successive collegate a questa:Kossel basi azotateLevene deossiribosio e tetranucleotide (dati sperimentali errati: credeva che il peso molecolare medio del DNA fosse di circa 1500 dalton compatibile con 4 x 330 dalton, peso medio dei singoli nucleotidi).

Laboratorio di Miescher

il DNA come macromolecola – P. Levene

7Phebus Levene biochimico lituano/USA (1869-1940) scoprì che il DNA era composto da nucleotidi ognuno formato da base azotata, fosfato e zuccheri, che isolò per primo. Erroneamente ritenne però che il DNA fosse composto solo da tetranucleotidi A – T –G –C in proporzioni equimolari: (ATGC)n, ed escluse che fosse sede del materiale genetico. Non pensò inoltre che con 4 nucleotidi si possono formare numerose combinazioni (es.ATGC ATCG AGTC AGCT ACGT ACTG ) oltre a quelle con basi ripetute.Si dovette attendere gli anni ‘40 per l’analisi cromatografica del DNA con cui si scoprirono i veri rapporti percentuali tra le basi

Cromosomi omologhi e geni: Sutton

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Walter Sutton, biologo USA (1877-1916) scoprì nel 1902 insieme a Boveri che durante la meiosi e la mitosi i cromosomi omologhi si appaiano. Ma il suo più importante contributo alla biologia fu la teoria cromosomica dell’ereditarietà: i cromosomi sono costituiti da unità portatrici dell’informazione ereditaria che vennero definite geni.“EVERY student of elementary genetics learns of Walter Sutton. He was the first to point out that chromosomes obey Mendel's rules—the first clear argument for the chromosome theory of heredity.”

Le mutazioni: De Vries

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Hugo de Vries , biologo olandese (1848-1935) introdusse la teoria della mutazione (1903). Riscoprì Mendel e si interessò a Darwin, ma scoprì nelle piante delle variazioni discontinue, e al contrario di Darwin le attribuì alla comparsadi una nuova specie. Definì il processo come una mutazione..”

Trasmissione caratteri cromosoma X: emofilia

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Gli studi sulla Drosophila: Morgan11

Thomas H. Morgan, biologo USA (1866-1945) eseguì, a partire dal 1910, fondamentali ricerche sul moscerino della frutta. Grazie ad esse dimostrò localizzazione e ordinamento lineare dei geni sui cromosomi, dopo averneindividuato numerosi sui 4 cromosomi di Drosophila. Dimostrò l’esistenza delle mutazioni a conferma della teoria cromosomica dell'ereditarietà

A partire dagli anni ‘2012

Alcuni scienziati, soprattutto in USA e Gran Bretagna, cominciarono a studiare i batteri.Le motivazioni:-sono diffusi in ogni ambiente,-crescono rapidamente (in media una divisione ogni 30-60 minuti,-sono invisibili singolarmente, ma si rendono visibili quando si sviluppano le colonie-hanno una struttura apparentemente semplice e agevole da studiare.

Dimensioni e crescita delle cellule procarioti

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Bacilli

La crescita batterica è esponenziale: dopo n generazioni ci

saranno 2n batteri. Esempio in 20 generazioni (circa 3 giorni) 220 = 1.048.576 batteri

Frederick Griffith, UK, 1879-1941 14

Medico britannico, lavorando con lo pneumococco (vedi figura) scoprì il principio della trasformazione batterica. Fu una tappa fondamentale nella storia della genetica, in quanto ha fornito le basi biologiche per stabilire che il DNA è il depositario dell’informazione genetica.

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Usò 2 ceppi batterici di Streptococcus pneumoniae (ex Diplococcus pneumoniae), noto come diplococco, batterio sferico che provoca la polmonite:

-tipo capsulato, con una capsula polisaccaridica che circonda la parete batterica: coltivato su capsula di Petri forma colonie lisce di tipo S (smooth, liscio). È il ceppo più patogeno perché la capsula protegge il batterio dall’attacco del sistema immunitario.

-tipo non-capsulato, cioè privo della capsula, forma colonie rugose di tipo R (rough, rugoso). L’assenza della capsula rende lo pneumococco aggredibile dalle difese immunitarie.

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Ceppo S Ceppo R

Esperimento di Griffith, 192818

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Dal sito unive.it

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Oswald Avery, Canada, 1877-195522

Medico canadese, visse a lungo negli USA (morì a Nashville, Tennessee, dove negli anni ‘60 si svolse un famoso raduno rock). Nel 1944 si sapeva che nei cromosomi c’era il materiale genetico e che erano formati da nucleoproteine, ovvero molecole contenenti proteine e DNA.

All'epoca si credeva che la componente fondamentale del materiale genetico, responsabile della trasmissione dei caratteri ereditari, era costituita dalle proteine poiché i 20 amminoacidi erano un linguaggio più efficace per spiegare la grande variabilità genetica degli esseri viventi rispetto ai soli 4 nucleotidi.

Colin Mc Leod, 1909 -1972;Mclyn McCarthy, 1911 - 2005

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Mclyn McCarthy, genetista USA.

Colin McLeod. Genetista canadese.

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Dagli pneumococchi S virulenti uccisi con il calore furono estratte proteine, lipidi, polisaccaridi e acidi nucleici. Si cercò di capire quale fosse in grado di trasmettere i caratteri ereditari.Per dimostrare che il DNA era effettivamente il principio trasformante furono eseguiti numerosi test biochimici per separare le varie componenti chimiche al fine di testarle separatamente e comprendere quali fossero in grado di trasformare i batteri R non virulenti in batteri S virulenti. Ogni componente veniva aggiunta ai batteri R non virulenti che venivano poi iniettata nella cavia.1- Proteine – sopravvivenza2- Lipidi – sopravvivenza3- Polisaccaridi – sopravvivenza4- Acidi nucleici – NON sopravvivenza. Ciò significava che erano queste molecole, e quindi il DNA, erano in grado di trasformare i batteri R non virulenti in batteri S virulenti. I batteri estratti dalla cavia erano, a loro volta, in grado di causare la morte di altri topolini.

Esperimento di Avery-Mc Leod-McCarthy 1944

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Esperimento di Avery-Mc Leod-McCarthy 1944

Avery-Mc Leod-McCarthy26

Ceppi R e ceppi S

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Trasformazione genetica di una cellula batterica di tipo R mediante acquisizione e ricombinazione di un frammento di cromosoma contenente il gene S

http://www.dnaftb.org/17/problem.html

Animazione:ceppi R non patogeni, ceppi S patogeni

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trattamenti con gli enzimi RNasi e DNasi

Alfred Hershey, USA, 1908-199729

Genetista statunitense, premio Nobel per la medicina nel 1969, insieme a Salvador Luria e Max Delbrück, per la scoperta della replicazione dei virus e della loro struttura genica.Insieme a Marta Chase scoprì di che natura era il “principio trasformante” individuato da Griffith.

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Marta Chase, USA, 1927-200331

Insieme ad Avery condusse due esperimenti.1) Preparazione di una coltura di fagi marcati con 35S (zolfo radioattivo). Lo zolfo è presente solo nel rivestimento proteico ma non nel DNA.2) altra coltura di fagi marcati con 32P (fosforo radioattivo), che si trova solo nei nucleotidi del DNA ma non nel rivestimento proteico.Con le due colture di fagi vennero infettate due diverse colonie batteriche di Escherichia coli, cresciute senza sostanze radioattive nel terreno. Il principio trasformante si sarebbe trovato all'interno delle cellule del batterio, dato che il virus le sfrutta per riprodursi.Agitando fortemente le cellule infettate si staccano le teste virali dalle cellule batteriche. Poi la centrifugazione faceva andare sul fondo le teste col DNA e nel sopranatante le proteine.

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Esperimento di Hershey e Chase, 1952

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Marcatura radioattiva con 32P e 35P

Hershey e Chase incorporarono il 32P nel DNA e il 35S nelle proteine in colture separate di fagi. Usarono le diverse colture per infettare indipendentemente colture batteriche. Dopo il tempo sufficiente perché avvenisse l’infezione essi centrifugarono per separare le cellule batteriche dal materiale fagico rimasto fuori delle cellule (“ghost”) e quindi misurarono la radioattività nelle due frazioni. Nei fagi marcati con 32P la gran parte della radioattività si trovava all’interno delle cellule batteriche il DNA del fago era entrato nella cellula; 32P veniva anche trovato nella progenie fagica.Nei fagi marcati con 35S, gran parte della radioattività si trovava nei ghost le proteine fagiche non erano entrate nelle cellule batteriche.

Conclusione: il DNA è il materiale ereditario, mentre le proteine sono semplicemente veicoli strutturali che vengono scartati dopo che il DNA virale è stato inserito nella cellula batterica.

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Il fosforo (P) dei nucleotidi

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Lo zolfo (S) negli amminoacidi: metionina e cisteina

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Fago T2: struttura e ciclo

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La radioattività da 32P fu trovata sulle cellule del fondo, mentre quella da 35S fu trovata nel soprananante e non era entrata nella cellula. era la prova definitiva che il DNA è il vero materiale genetico della cellula.

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http://www.ipbz.it/imagesupload/area/9/materiali_didattici/brescia08/presentazione_bonolis.pdf

Una galoppata verso la double helix

Acidi nucleici - 2

presentazione del prof. Ciro Formica

Conoscenza dei dati sperimentali forniti da R. Franklin, M. Wilkins, E. Chargaff che hanno contribuito a scoprire la struttura del DNAIl modello a doppia elica di Watson e CrickLe funzioni del DNA dipendono dalla sua struttura.

Erwin Chargaff, Austria, 1905-200240

Biochimico austro-statunitense (Impero austro-ungarico, nacque a Czernowitz, che oggi si trova in Ucraina). Emigrò negli USA durante il nazismo e divenne cittadino USA nel ‘40.Mediante la cromatografia su carta riuscì a separare la molecola del DNA nelle sue basi costituenti a determinarela loro abbondanza relativa. Quindi purine e pirimidine hannola stessa percentuale, cioè %A+G = % T+CLe ricerche furono fondamentali perconoscere la struttura del DNA.

Ricerche di Chargaff, 194841

Regole di Chargaff :1- c’è un rapporto 1:1 tra le purine (A+G) e le pirimidine (T+C) contenute nel DNA di una cellula. Il rapporto è costante in tutte le specie, ma per specie diverse le % delle varie basi saranno anch'esse diverse, a causa della diversità delle specie. Vale per ogni genoma, tranne che per quello di mitocondri, cloroplasti e DNA virale a singolo filamento.

2- in una molecola di DNA a doppio filamento:%A = %T, %C = %G%A +G = %C+T%G+C è costante per una stessa specie, ma varia da specie a specie.

dati di Chargaff42

Percentuale di basi azotate nel DNA di varie specie

A G C T A/T G/C A+G/C+T

%G+C

Uomo 31,0 19,1 18,4 31,5 0,98 1,04 1,00 37,5

Topo 28,6 21,4 21,7 28,4 1,01 0,99 1,00 43,1

Drosophila 27,3 22,5 22,5 27,6 0,99 1,00 0,99 45,0

Mais 25,6 24,5 24,6 25,3 1,01 1,00 1,00 49,9

E. coli 26,0 24,9 25,2 23,9 1,09 0,99 1,04 50,1

Rosalind Franklin, UK, 1920-195843

Chimica e fisica britannica, terminò gli studi universitari nel 1941 ma a quell'epoca l'università di Cambridge non rilasciava la laurea alle donne. Studiò dapprima le fibre di carbonio, poi alla fine della Seconda Guerra Mondiale lavorò a Parigi dove si specializzò nella diffrazione dei raggi X, una tecnica che permette di analizzare la struttura di molecole di grandi dimensioni.Riuscì ad ottenere notevoli risultati in questo campo e, proprio per questo, nel 1951 venne invitata a lavorare nel laboratorio di Biofisica del dottor John Ransall, al King's College di Londra, diretto da un altro grande scienziato, Maurice Wilkins.

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Allora non si conosceva ancora la struttura molecolare del DNA, ma grazie ai suoi studi di diffrazione dei raggi X, fu la prima ricercatrice ad ottenere un’eccellente fotografia della doppia elica, passata alla storia come foto 51. Fotografare molecole complesse all'epoca era molto difficile e rischioso: poteva richiedere anche 100 ore di esposizione alle radiazioni. A causa della piccola lunghezza d’onda dei raggi X i cristalli funzionano da reticolo di diffrazione.

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La Franklin ottenne un brillante risultato, nonostante l'ambiente difficile nel quale operò e i rapporti difficili con Maurice Wilkins, che la considerò sempre come una sua assistente e non una scienziata capace.Fu proprio Wilkins a mostrare a Watson la foto 51, senza il permesso della Franklin. Basandosi su questa immagine Francis Crick e James Watson formularono il modello a doppia elica del DNA che noi tutti conosciamo.Il 25 Aprile del 1953, su Nature apparve un articolo dei due ricercatori che mostrava, per la prima volta al mondo, la struttura dell'acido desossiribonucleico; i due scienziati non fecero neppure un accenno alla donna che aveva reso possibile la realizzazione di quel modello

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Morì giovanissima a 38 anni per cancro alle ovaie causato probabilmente dalla notevole esposizione ai raggi X con scarsi dispositivi di protezione e non seppe mai quale importante contributo avesse dato alla doppia elica: “According to her biographer, she never knew of the crucial role that her photograph 51 had played in the discovery of the double helix”

Wilkins, Crick e Watson ricevettero il Nobel nel 1962 ma neanche in quella occasione, 4 anni dopo la morte di Rosalind, fu menzionato l'importante contributo della scienziata alla comprensione della struttura molecolare del DNA. Purtroppo il Nobel può essere assegnato solo a scienziati viventi.

Maurice Wilkins, UK, 1916-200447

Biofisico britannico (nato in N.Zelanda), fu definito il Terzo uomo della doppia elica. Lavorò anche nel Manhattan Project per costruire la prima bomba atomica della storia.Ottenne la prima immagine ai r.X del DNA dove dimostrò che aveva una forma cristallina regolare. Quando la Franklin si unì al suo gruppo pensò che fosse assegnato a lei l’intero progetto, mentre lui la considerava solo un’assistente. Da qui nacque l’equivoco che compromise in modo irreparabile I loro rapporti.

Rosalind Franklin’s photo 5148

Struttura a diffrazione o diffrattogramma ai raggi X del DNA.Al centro-periodo minore 0,34 nmIn periferia-periodo maggiore 3,4 nmLa molecola del DNA è una fibra cilindrica d= 2 nm con le basi impaccate come una pila di monete e i piani centrali distanziati di 0.34 nm (periodo minore). Un giro dell’elica misura 3.4 nm (periodo maggiore), un multiplo di 10 della distanza tra basi contigue.

Si ipotizzò dunque che il DNA fosse formato da 2 -3 catene

Dati di cristallografia del DNA ai raggi X

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Dati di Franklin Dati di Chargaff Dati di Pauling

Distanza tra 2 eliche

2 nm

In caso di legame purina-purina

> 2 nm

In caso di legame pirimidina-pirimidina

< 2 nm

appaiamento A-T (30%)G-C (20%)

deduzione *1 *2 *3

*1: La distanza di 2 nm è la media tra i valori, quindi si dedusse che a legarsi sono sempre una purina con una pirimidina.*2: i filamenti sono antiparalleli, direzione 5’3’, le basi sono complementari e sono unite da 2 legami a idrogeno (A-T) e da 3 legami a idrogeno (G-C).*3: i filamenti formano una spirale, come avviene per le proteine

La doppia elica del DNA, aprile 1953

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Da sinistra: Francis Crick e James Watsonnel 1953 davanti al modello di doppia elica

Doppia elica51

Watson e Crick senza fare esperimenti ma con modelli in cartone e fil di ferro combinarono i dati disponibili in un modello di struttura del DNA compatibile con tutti i fatti noti, comprendente tutte le proprietà attese per il materiale genetico.Ipotizzarono che si trattasse di una doppia elica stabilizzata da legami a idrogeno. Crick lesse gli appunti che aveva preso al pub in una conversazione con Chargaff: %A = %T, %C = %G in tutti i DNA. Di quella conversazione Chargaff ricordava un proprio commento “two pitchmen in search of a helix…”: i due giovanotti gli erano sembrati troppo ambiziosi e troppo ignoranti e confondevano le purine con le pirimidine.La viscosità del DNA diminuisce drasticamente a temperature tra 70° e 80°C, indicando che legami chimici termosensibili, quali i legami-idrogeno, sono importanti per la struttura

Doppia elica52

I legami a idrogeno dovevano perciò legare A con T e G con C, le basi complementari. La larghezza dell’elica risultava perciò costante e le basi erano planari e perpendicolari all’asse della D.E. Le catene pentoso-fosfato fortemente anioniche si devono trovareall’esterno della molecola a contatto con l’acqua, mentre le coppie di basi, idrofobiche, si impaccano le une sulle altre al centro della molecola, escludendo l’acqua.Ciascuna catena ha una estremità 3’ e una estremità 5’. Esse sono disposte in modo antiparallelo in quanto i legami fosfodiesterici che uniscono i pentosi contigui hanno polarità opposte. Quindi il 5’ di una catena si trova di fronte all’estremità 3’ di quella opposta.Le due eliche differiscono per polarità, sequenza e composizione in basi, ma sono perfettamente complementari, cioè la sequenza di una catena è completamente determinata da quella della catena opposta

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basi complanari;3 legami a idrogeno (G-C) e 2 legami (A-T)

Modello di replicazione semiconservativa

L’alfa elica delle proteine

Legame idrogeno

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L’appaiamento corretto è PURINA-PIRIMIDINA: larghezza costante, maggiore stabilità, minori

torsioni della D.E.Distanza tra le

eliche

< 2 nm

> 2 nm

2 nm

misura giusta

doppia elica e basi complementari

Linus Pauling, USA, 1901-199457

Chimico, pacifista e scrittore USA, vincitore del Nobel 1954 per la chimica delle proteine e del 1962 Nobel per la pace. Scoprì la natura del legame chimico e compilò la scala dell’elettronegatività. Dimostrò come cambia la struttura dell’emoglobina quando si lega all’O2 e come un’emoglobina mutata producesse l’anemia falciforme. Studiò anche l’attività degli enzimi e la natura planare del legame peptidico.

Nei ’60 denunciò pubblicamente il rischio di contaminazione da fallout radioattivo in seguito agli esperimenti atomici dell’epoca nel Pacifico.

James Watson, USA, 1928 - vivente58

Watson era un biologo USA che seguì il lavoro di Luria, Nobel 1969 e capo del Phage group. Il DNA era allora considerato uno "stupido tetranucleotide" di supporto strutturale per le proteine, ma Watson conosceva il lavoro di Avery sul DNA come "contenitore" dei geni. Il suo progetto di ricerca prevedeva l'utilizzo di raggi X per inattivare l'attività infettiva dei fagi.

Nel ’51 conobbe Wilkins a Napoli (Stazione Zoologica) proprio quando stava presentando i dati sulla cristallografia del DNA ai r.X. A Cambridge conobbe Crick e insieme lavorarono alla struttura anche utilizzando i dati di Linus Pauling sulle proteine. Giunsero così a definire la doppia elica nell’aprile 1953.Fu il primo responsabile del Progetto Genoma Umano, 1990, seguito poi da Collins

Francis Crick, UK, 1916-200459

Scienziato britannico, scoprì insieme a Watson e Wilkins la D.E. DNA . Lavorò agli studi di diffrazione cristallografica ai r.X e insieme costruirono il modello sulla base di un bozzetto eseguito dalla moglie pittrice di Crick.Successivamente con Brenner cercò di determinare come la sequenza di basi specificasse la sequenza proteica, fino al quando nel ’61 dimostrarono che la traduzione implica un codice di 3 nucleotidi.

Una curiosità: l’ordine dei nomi sulla rivista Nature, dove fu pubblicato l’articolo della doppia elica nel ‘53, fu deciso col lancio di una monetina.

Le funzioni del DNA dipendono dalla sua struttura

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I legami dei nucleotidi

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NUCLEOTIDEBase azotata-zucchero: C1’Zucchero-fosfato: C5’

LEGAME CON ALTRI NUCLEOTIDIZucchero-fosfato:C5’ col nucleotide precedenteC3’ col nucleotide successivoOgni filamento decorre in direzione 5’3’

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Caratteristiche della DE:•diametro uniforme•destrorsa•antiparallela•basi azotate situate nei solchi minori e maggiori

Caratteristiche della doppia elica

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Le bp (basi appaiate) si trovano su piani perpendicolari al l’asse della DE.Questa è stabilizzata anche dalle interazioni idrofobiche tra le basi azotate

Caratteristiche della doppia elica

Appaiamento delle basi del DNA

A = TG CT = A

A = T

C G

T

CCA

GG

TA

G C

T = A

T = A

C G

A = T

A = TG

C

5’

3’

5’

3’

5’ 3’

3’ 5’denatured

strands

hybridizedstrands

Hydrogen bonds

C G C

G

G C

Phosphate-sugar backbone

Youtube: Corso citologia-DNA e cromosomi

http://www.youtube.com/watch?v=el81jTUdl7s

Codice genetico

UUU FenilalaninaPHE

UCU

SerinaSER

UAU TiroxinaTYR

UGU CisteinaCYSUUC UCC UAC UGC

UUA

LeucinaLEU

UCA UAASTOP

UGA STOP

UUG UCG UAG UGG Triptofano TRP

CUU CCU

ProlinaPRO

CAU IstidinaHIS

CGU

ArgininaARG

CUC CCC CAC CGC

CUA CCA CAA GlutamminaGLN

CGA

CUG CCG CAG CGG

AUUIsoleucina

ILE

ACU

TreoninaTHR

AAU AsparaginaASN

AGU SerinaSERAUC ACC AAC AGC

AUA ACA AAALisinaLYS

AGAArginina

ARGAUGCodone inizio

ACG AAG AGG

GUU

ValinaVAL

GCU

AlaninaALA

GAU Ac.AsparticoASP

GGU

GlicinaGLY

GUC GCC GAC GGC

GUA GCA GAA Ac.glutammicoGLU

GGA

GUG GCG GAG GGG

Dalla doppia elica al cromosoma

Quadrupla elica?

Il Dna nelle cellule umane può assumere anche una forma 'a quadrupla elica', e non solo quella a doppia scoperta proprio 60 anni fa da Watson e Crick con il contributo fondamentale di Rosalind Franklin. Lo ha scoperto Giulia Biffi, una ricercatrice italiana che lavora all'università di Cambridge con uno studio pubblicato dalla rivista Nature Chemistry, che per la prima volta ha isolato questa struttura nelle cellule umane.Le strutture a quadrupla elica erano già state isolate in provetta, ma nessuno era mai riuscito a vederle nelle cellule umane.