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b Test LACTA™ 50 68250

Determinazione rapida di resistenza a cefalosporine di terza generazione per Enterobacteriaceae

16004494 – 2017/10

Indice

1. USO PREVISTO

2. RIEPILOGO E ILLUSTRAZIONE DEL TEST

3. PRINCIPIO DELLA PROCEDURA

4. REAGENTI

5. AVVERTIMENTI E PRECAUZIONI

6. CAMPIONI

7. PROCEDURA

8. LIMITAZIONE DEL TEST

9. PRESTAZIONI

10. RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI

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1. USO PREVISTO b LACTATM è un test qualitativo colorimetrico utilizzato per la determinazione di ceppi con sensibilità ridotta alle cefalosporine di terza generazione. Tale sensibilità ridotta è dovuta alla presenza di enzimi specifici nei batteri. Il test può essere eseguito direttamente con colonie isolate di Enterobacteriaceae oppure con pellet batterici ottenuti da emocolture o urine positive. 2. RIEPILOGO E ILLUSTRAZIONE DEL TEST Il meccanismo di resistenza più comune nelle Enterobacteriaceae è la resistenza ai b-lattamici attraverso la produzione di b-lattamasi (1, 2). Nel corso degli anni questi enzimi hanno progressivamente diversificato le loro informazioni genetiche. Le b-lattamasi responsabili della resistenza alle cefalosporine di terza generazione (3GC) destano maggiori preoccupazioni (1, 2). Queste vengono classificate in tre categorie: • b-lattamasi a spettro esteso (o ESBL), la cui prevalenza è in continuo aumento dagli anni '90; • Cefalosporinasi acquisite (tipo AmpC), incluse AmpC derepresse e plasmidiche; • Carbapenemasi, in particolare metallo-b-lattamasi (MBL) e Klebsiella pneumoniae Carbapenemasi (KPC). Il test ß LACTA™ offre al medico informazioni rapide per prescrivere una terapia antibiotica empirica senza dovere attendere i risultati completi della suscettibilità antimicrobica (3). Il test ß LACTA™ deve essere sempre associato a un test completo di suscettibilità antimicrobica per confermare la terapia antibiotica empirica (precedentemente) prescritta. 3. PRINCIPIO DELLA PROCEDURA Il principio del test b LACTATM è basato sulla scissione di una cefalosporina cromogena, HMRZ-86*. Questo substrato, inizialmente di colore giallo, diventa rosso in presenza di ceppi di Enterobacteriaceae produttori di b-lattamasi che conferiscono resistenza alle cefalosporine di terza generazione. La cefalosporina cromogena HMRZ-86 non è idrolizzata da penicillinasi acquisite (ad es., SHV-1, TEM-1) ma da ESBL, carbapenemasi (KPC, MBL) e AmpC acquisite. Il kit b LACTATM comprende due flaconi con contagocce contenenti i reagenti da mescolare (R1 e R2). Il test viene eseguito direttamente in microprovette utilizzando colonie di Enterobacteriaceae appena isolate o pellet batterici ottenuti da flaconi di emocolture positive o urine positive per Enterobacteriaceae. La lettura deve essere effettuata entro i 15 minuti successivi. * La formulazione dell'HMRZ-86 è stata sviluppata grazie al contributo del Dr. Hideaki Hanaki della Kitasato University. 4. REAGENTI 4.1 Descrizione Un kit contenente i reagenti R1 e R2 e 50 microprovette

Identificazione Descrizione Presentazione

R1 Soluzione di estrazione (incolore) Conservante: 0,1% ProClinTM 200 Una fiala pronta per l'uso, 2,0 mL

R2 Soluzione cromogena (arancione) Conservante: 0,1% ProClinTM 200 Una fiala pronta per l'uso, 2,6 mL

4.2 Condizioni di conservazione e trattamento Il presente kit deve essere conservato a una temperatura di + 2-8° C al riparo dalla luce. I reagenti possono essere utilizzati fino alla data di scadenza indicata sulla confezione.

Identificazione Conservazione (dopo la prima apertura) R1 al riparo dalla luce, 3 mesi a + 2-8° C R2 al riparo dalla luce, 3 mesi a + 2-8° C

Assicurarsi che i tappi delle due fiale siano saldamente avvitati per evitare un'eventuale contaminazione o essiccazione dei reagenti. Conservare le fiale in posizione verticale. 5. AVVERTIMENTI E PRECAUZIONI Esclusivamente per uso diagnostico in vitro. Esclusivamente per uso professionale. Norme per la salute e la sicurezza: � Questo kit deve essere maneggiato esclusivamente da personale adeguatamente addestrato e qualificato nelle procedure

di laboratorio e cosciente dei potenziali rischi connessi. Indossare abbigliamento protettivo, guanti e protezioni per occhi/viso adeguati e manipolare gli oggetti in maniera appropriata nel rispetto della buona pratica di laboratorio.

� Procedere allo smaltimento di tutti i campioni e i materiali utilizzati per l'esecuzione del test come potenzialmente infetti. I rifiuti pericolosi di laboratorio o di natura chimica o biologica devono essere manipolati e smaltiti nel rispetto di tutte le normative locali, regionali e nazionali.

� Per le raccomandazioni su precauzioni e rischi correlati ad alcuni componenti chimici del presente kit, consultare i simboli riportati sulle etichette e le informazioni fornite alla fine delle istruzioni per l'uso. La scheda di sicurezza è disponibile all'indirizzo www.bio-rad.com.

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Precauzioni relative alla procedura 5.1. Preparazione • Non mescolare, né unire reagenti di diversi batch nello stesso ciclo. • Non congelare i reagenti R1 e R2. • Non preparare in anticipo il composto formato da R1 e R2. • Prima dell'uso, lasciare stabilizzare i reagenti ad una temperatura compresa tra 18 e 30°C per 10 minuti. • Pulire il puntale del contagocce al fine di ottenere gocce correttamente calibrate. • Tenere il flacone del reagente sempre in posizione verticale per ottenere gocce calibrate. • Non utilizzare reagenti scaduti. • Non utilizzare colonie di Enterobacteriaceae isolate da supporti con un'incubazione superiore a 24 ore. • Utilizzare esclusivamente singole colonie adeguatamente isolate. • L'uso di colonie di Enterobacteriaceae isolate da agar MacConkey con o senza violetto cristallo è sconsigliato. • Per applicazioni relative a urina ed emocoltura:

- L'uso di un pellet batterico contenente globuli rossi è sconsigliato. - In assenza di un pellet batterico visibile, non eseguire il test.

5.2. Trattamento • Eseguire il test a temperatura ambiente (tra 18 e 30°C). • Rispettare la quantità di inoculo e utilizzare un occhiello pieno da 1 µl. • La lettura colorimetrica deve essere effettuata entro 15 minuti. 6. CAMPIONI Il test può essere eseguito con colonie di Enterobacteriaceae fresche e adeguatamente isolate dopo 16-24 ore di incubazione, oppure con pellet batterici ottenuti da un'emocoltura positiva o da urina con sospetta positività. Lo stato di positività dell'emocoltura o del campione di urina è di responsabilità del laboratorio e deve essere accertato conformemente ai criteri di routine del laboratorio stesso. I pellet batterici devono essere ottenuti da urina appena raccolta o da flaconi di emocoltura risultati positivi al test. Preparazione del pellet batterico da un'emocoltura positiva: Sono previsti due protocolli validi per l'ottenimento di un pellet da un'emocoltura positiva: • Protocollo A: una provetta per la raccolta di sangue con attivatore di coagulazione e gel per la separazione del siero viene

riempita con 2 mL di emocoltura. Attenersi alle raccomandazioni del produttore per la separazione dei globuli rossi. Il surnatante viene quindi rimosso e i batteri presenti sulla superficie del gel vengono delicatamente sospesi in 1 mL di acqua distillata sterile. Centrifugare per 3 minuti a 300 g. Introdurre un campione del surnatante da 800 µl in una microprovetta e centrifugare per 1 minuto a 15.000 g. Rimuovere delicatamente il surnatante e conservare il pellet batterico ottenuto per l'esecuzione del test.

• Protocollo B: un campione da un mL di terreno per emocoltura viene introdotto in una provetta da 1,5 mL per essere

centrifugato per 1 minuto a 1.000 g. Rimuovere delicatamente il surnatante e mettere in sospensione il pellet in 1 mL di soluzione TritonTM X-100 appena preparata allo 0,1% in un miscelatore Vortex per 10 secondi.

Centrifugare per 1 minuto a 13.000 g. Rimuovere delicatamente il surnatante. Miscelare il pellet con 1 mL di acqua distillata sterile mediante aspirazione ed espulsione. Centrifugare per 1 minuto a

13.000 g. Rimuovere delicatamente il surnatante e conservare il pellet batterico ottenuto per l'esecuzione del test. Preparazione del pellet batterico da urina con sospetta positività per Enterobacteriaceae Dall'urina con sospetta positività, prelevare un campione da 1,5 mL, introdurlo in una provetta da 1,5 mL e centrifugare per 5 minuti a 3.000 g. Rimuovere il surnatante e conservare il pellet batterico ottenuto per l'esecuzione del test. Per qualsiasi protocollo per l'ottenimento del pellet batterico, il metodo utilizzato deve essere validato con ceppi di controllo positivo contenenti b-lattamasi che conferiscono resistenza a cefalosporine di terza generazione e ceppi di controllo negativo. 7. PROCEDURA 7.1 Materiali necessari

7.1.1 Materiali forniti • Microprovette • Reagenti R1 e R2

7.1.2. Materiali necessari ma non forniti • Occhielli in plastica da 1 µl • Timer

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7.2 Procedura di dosaggio

7.2.1 Per il test eseguito con le colonie • Apporre l'etichetta sulla microprovetta. • Aggiungere una goccia di reagente R1 e una goccia di reagente R2 nella microprovetta. • Selezionare colonie isolate di Enterobacteriaceae e prelevarle con l'occhiello da 1 µl. L'occhiello deve essere pieno.

Selezionare da un terreno cromogenico le colonie con lo stesso colore omogeneo. • Svuotare l'occhiello nella microprovetta. Osservare il colore della miscela a T0. • Lasciare la microprovetta ad una temperatura compresa tra 18 e 30°C e procedere alla lettura del risultato entro 15

minuti. • Annotare eventuali variazioni di colore e interpretare il risultato (negativo/positivo/non interpretabile).

7.2.2 Per il test eseguito con il pellet • Aggiungere una goccia di reagente R1 e una goccia di reagente R2 nella microprovetta contenente il pellet. • Mettere in sospensione il pellet nella miscela. Osservare il colore della miscela a T0. • Lasciare la microprovetta ad una temperatura compresa tra 18 e 30°C e procedere alla lettura del risultato entro 15

minuti. • Annotare eventuali variazioni di colore e interpretare il risultato (negativo/positivo/non interpretabile).

7.3 Controllo di qualità • Controllo negativo, es. Escherichia coli ATCC 35218 (ceppo produttore di penicillinasi tipo TEM-1) • Controllo positivo, es. Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, Escherichia coli ATCC 51446. Questi ceppi contengono b-

lattamasi che conferiscono resistenza alle cefalosporine di terza generazione. Nel test di routine, è possibile utilizzare un ceppo clinico ben caratterizzato con fenotipo ESBL.

7.4 Interpretazione dei risultati Risultato Interpretazione Nessuna variazione di colore rispetto a T0 Negativo Sensibile alle 3GC Il colore diventa rosso/rosso porpora Positivo Non sensibile alle 3GC Il colore diventa arancione Non interpretabile Non interpretabile 8. LIMITAZIONI DEL TEST • Si sconsiglia di incubare il test ad una temperatura superiore a 30°C. • Attenzione! L'uso di colonie di Enterobacteriaceae isolate da agar MacConkey con o senza violetto cristallo è sconsigliato.

Il colore delle colonie interferisce con la miscela di reazione e il risultato finale non è interpretabile. • I risultati del test devono essere interpretati in riferimento alle condizioni cliniche del paziente. • Non eseguire il test in assenza di un pellet batterico visibile.

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9. PERFORMANCE 9.1. Studio di precisione Su un periodo di 4 settimane, 5 ceppi sono stati analizzati 10 volte in triplicato da 2 diversi operatori. Due batch diversi di b LACTATM sono stati sottoposti a test per quanto attiene a ripetibilità intermedia e riproducibilità. Tutti i test si sono rivelati conformi ai risultati previsti. 9.2. Performance cliniche e analitiche 9.2.1 Utilizzo delle colonie Uno studio clinico prospettico è stato condotto su un periodo di 3 mesi. Tutte le colonie di Enterobacteriaceae isolate da diversi campioni (urina, emocoltura e altri) sono state analizzate con il kit b LACTATM e la lettura e l'interpretazione dei risultati sono state effettuate in base alle istruzioni del produttore. I risultati del test b LACTATM sono stati confrontati con quelli ottenuti mediante dischi di ceftazidime (CAZ), cefotaxime (CTX) e cefepime (FEP) utilizzando il metodo Kirby-Bauer. 482 colonie diEnterobacteriaceae sono state analizzate con b LACTATM. Di queste, 81 hanno mostrato un risultato non sensibile alle 3GC (risultato positivo), 392 sono risultate sensibili alle 3GC (risultato negativo) e 9 si sono rivelate non interpretabili mediante il test b LACTATM (inferiore al 2%). Performance generali Metodo di riferimento N. di

ceppi N. di ceppi sensibili a CAZ, CTX e FEP*

N. di ceppi resistenti o intermedi a CAZ, CTX e FEP**

β LACTA™

Negativo 374 18 392 Positivo 8 73 81 Non interpretabile 3 6 9 Totale 385 97 482

* I risultati di tutte le cefalosporine menzionate sono sensibili. ** Almeno un antibiotico analizzato (CAZ, CTX, FEP) presenta un risultato intermedio o resistente.

9.2.1.1 Specificità N. di ceppi sensibili a CAZ, CTX e FEP* (%)

β LACTA™

Negativo 374 Positivo 8 Totale 382 Specificità 374 / 382 (97.9%)

Esclusi i risultati “non interpretabili”, <2% della popolazione esaminata * I risultati di tutte le cefalosporine menzionate sono sensibili. • 6 ceppi su 8 risultati positivi al test b LACTATM sono stati identificati come ceppi di Klebsiella oxytoca con un'iperproduzione

delle rispettive b-lattamasi cromosomiche.

9.2.2.2 Sensibilità N. di ceppi resistenti o intermedi a CAZ, CTX e FEP**

β LACTA™

Negativo 18 Positivo 73 Totale 91 Sensibilità 73 / 91 (80,2%)

Esclusi i risultati “non interpretabili”, <2% della popolazione esaminata ** Almeno un antibiotico analizzato (CAZ, CTX, FEP) presenta un risultato intermedio o resistente. • 17 ceppi su 18 resistenti o intermedi ad almeno una cefalosporina e negativi con il b LACTATM sono produttori di

cefalosporinasi. 11 ceppi sono stati identificati come Enterobacter sp., Morganella morganii, Citrobacter freundii, Hafnia halvei; gli altri 6 come Escherichia coli.

• Un ceppo di Escherichia coli con fenotipo ESBL sensibile a CTX e FEP e intermedio a CAZ ha avuto un risultato negativo con b LACTATM.

I valori predittivi positivi e negativi del presente studio corrispondono rispettivamente al 90,12% e al 95,41%.

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9.2.2 Utilizzo di un pellet batterico Performance di β LACTATM con pellet batterici ottenuti da emocolture: Sono stati condotti studi analitici su emocolture seminate con inoculi calibrati di ceppi di Enterobacteriaceae. Le performance sono state valutate su un pannello comprendente 37 ceppi di Enterobacteriaceae isolati da campioni clinici e perfettamente caratterizzati sia genotipicamente che fenotipicamente. Questo pannello includeva: • 10 ceppi sensibili alle 3GC, • 27 ceppi resistenti alle 3GC. I pellet batterici sono stati ottenuti conformemente al protocollo descritto al paragrafo Campioni.

Numero di ceppi sensibili alle 3GC (n = 10) Presenza visibile di un pellet Protocollo A Protocollo B

β LACTA™

Negativo 10 9 Positivo - - Totale 10 9 Specificità 10/10 (100%) 9/9 (100%)

Un risultato “non interpretabile" è stato escluso dal calcolo relativo al protocollo B.

Numero di ceppi resistenti alle 3GC (n = 27) Presenza visibile di un pellet Protocollo A Protocollo B

β LACTA™

Negativo 4 3 Positivo 21 23 Totale 25 26 Sensibilità 21/25 (84%) 23/26 (88,5%)

Due risultati "non interpretabili" per il protocollo A e 1 per il protocollo B sono stati esclusi dai calcoli.

Performance di β LACTATM con pellet batterici ottenuti da urina: Uno studio prospettico è stato condotto su 102 campioni di urina raccolti in base alle procedure di routine di un laboratorio ospedaliero. Le osservazioni effettuate nel corso di un esame diretto di tutti questi campioni di urina hanno rivelato la presenza di bacilli Gram-negativi. È stato ottenuto un pellet batterico conformemente al protocollo precedentemente descritto al fine di eseguire il test β LACTATM. I risultati ottenuti mediante questo test sono stati confrontati con quelli ottenuti nel corso della normale procedura di routine per l'analisi microbiologica dell'urina. L'analisi dei 102 campioni di urina risultati positivi tramite esame diretto ha prodotto i seguenti risultati: • 4 campioni di urina non contenevanoEnterobacteriaceae; • 73 campioni di urina contenevano uno o più ceppi di Enterobacteriaceae sensibili alle 3GC (ceftazidime e cefotaxime) in base

al test di sensibilità antimicrobica; • 25 campioni di urina contenevano uno o più ceppi di Enterobacteriaceae che mostravano resistenza alle 3GC (ceftazidime e

cefotaxime). I dettagli delle performance del test β LACTATM su questo pannello sono riportati nella tabella sottostante. Numero di campioni di urina positivi per bacilli Gram-negativi

tramite esame diretto (102)

Numero di campioni di urina con

Enterobacteriaceae isolate sensibili alle 3GC

Numero di campioni di urina con Enterobacteriaceae isolate resistenti alle

3GC Totale 73 25

β LACTA™

Negativo 73 5 Positivo - 20 Specificità 73/73 (100%) Sensibilità 20/25 (80%)

Gli studi analitici sono stati condotti con ceppi appartenenti a specie diverse dalle Enterobacteriaceae, al fine di valutare le potenzialità di qualsiasi reattività non specifica o crociata. Non è stata rilevata alcuna reattività crociata con i pellet batterici ottenuti mediante ceppi quali Candida albicans, Streptococcus agalactiae, Enterococcus faecalis e Staphylococcus aureus.

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10. RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI 1. Bush K. Alarming b-lactamase-mediated resistance in multidrug-resistant Enterobacteriaceae. Curr Opin Microbiol. 2010;

13: 558-564 2. Pitout JDD, Laupland KB. Extended-spectrum β-lactamase-producing Enterobacteriaceae: an emerging public-health

concern. Lancet Infect Dis 2008; 8: 159-66. 3. Renvoisé A., Decré D., Amarsy-Guerle R., Huang TD., Jost C., Podglajen I., Raskine L., Genel N., Bogaerts P., Jarlier V.,

Arlet G. Evaluation of the β Lacta test, a rapid test detecting resistance to third-generation cephalosporins in clinical strains of Enterobacteriaceae. J. Clin. Microbiol. 2013, 12: 4012-4017.

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