COMPLEMENTAZIONE DI COMPLEMENTAZIONE DI

UNA MUTAZIONEUNA MUTAZIONE

XX --

XX --

FENOTIPOFENOTIPO

XX -- Cromosoma

PLASMIDE

Y

TRASFORMAZIONETRASFORMAZIONE

PLASMIDE

Y

Cromosoma

Y

Plasmide Cromosoma

P

XX --

XX ++

FENOTIPOFENOTIPO

XX -- Cromosoma

PLASMIDE

X

TRASFORMAZIONETRASFORMAZIONE

PLASMIDE

X

Cromosoma

X

Plasmide Cromosoma

P

E. coli E. coli FB182FB182

hisAhisA

His PhenotypeHis Phenotype

XXhisBhisB++hisAhisA--hisFhisF++

E. coli E. coli FB182FB182

hisAhisA

His PhenotypeHis Phenotype

XXhisBhisB++hisAhisA--hisFhisF++ hisA

E. coli E. coli FB182FB182

hisAhisAXX

hisBhisB++hisAhisA--hisFhisF++ leuC

TRASFORMAZIONETRASFORMAZIONEIncorporaziome di molecole di DNA

(ricombinanti o non)da parte di

cellule ospiti “competenti”

Miscela di cellule competenti del ceppoMiscela di cellule competenti del ceppoFB251 FB251 hisBhisB e di e di

molecole di DNA molecole di DNA plasmidico phisAplasmidico phisA

Una frazione delle cellule competentiUna frazione delle cellule competentiincorpora molecole di DNAincorpora molecole di DNA

Come riconoscere, tra tuttele cellule (qualche miliardo)

potenzialmente trasformabili, icloni positivi,

cioè quelli che hanno incorporatoil plasmide ricombinante phisA?

QuesitoQuesitoQuesito

Piastra di terreno selettivo contenente tetraciclina E Piastra di terreno selettivo contenente tetraciclina E istidinaistidina

Lamoltiplicazione

diqueste celluleporterà allacomparsa di

colonieresistenti allatetraciclina

LaLamoltiplicazionemoltiplicazione

didiqueste cellulequeste celluleporterà allaporterà allacomparsa dicomparsa di

coloniecolonieresistenti allaresistenti allatetraciclinatetraciclina

Come verificare se esisteuna colonia contenente un

plasmide capace di complemetarela mutazione his?

Come verificare se esisteCome verificare se esisteuna colonia contenente un una colonia contenente un

plasmideplasmide capace capace di di complemetarecomplemetarela mutazione la mutazione hishis??

QuesitoQuesitoQuesito

EstrazioneDNA

plasmidicoda tuttele colonie(miscela diplasmidi

ricombinanti)

EstrazioneEstrazioneDNADNA

plasmidicoplasmidicoda tutteda tuttele coloniele colonie(miscela di(miscela diplasmidiplasmidi

ricombinantiricombinanti))

Extraction of plasmid DNAfrom all reombinant clonesExtraction Extraction ofof plasmid plasmid DNA DNAfrom from all all reombinant clonesreombinant clones

Transformation ofhisA E.coli cells

Transformation ofTransformation ofhisAhisA E.coli E.coli cells cells

Ability of mutant plasmids to complement hisA

Ability of mutant plasmids to Ability of mutant plasmids to complement complement hisAhisA

Piastra di terreno selettivo contenentePiastra di terreno selettivo contenentetetraciclina ma NON ISTIDINAtetraciclina ma NON ISTIDINA

Terreno contenente tetraciclina Terreno contenente tetraciclina

E ISTIDINAE ISTIDINATerreno contenente tetraciclina Terreno contenente tetraciclina

MA NON ISTIDINAMA NON ISTIDINA

Replica-Replica-platingplating

Terreno contenente tetraciclina Terreno contenente tetraciclina

E ISTIDINAE ISTIDINA

ASSENZA di CRESCITAASSENZA di CRESCITA di TUTTE le COLONIE di TUTTE le COLONIE

su terreno contenente tetraciclina su terreno contenente tetraciclina

MA NON ISTIDINAMA NON ISTIDINA

Il Il promotore promotore del gene del gene hishis portato dalportato dalplasmide ricombinanteplasmide ricombinante NONNON è riconosciutoè riconosciuto

dalla RNA-dalla RNA-polimerasi polimerasi di di E. coliE. coli ... ...

Terreno contenente tetraciclina Terreno contenente tetraciclina

E ISTIDINAE ISTIDINA

ASSENZA di CRESCITAASSENZA di CRESCITA di TUTTE le COLONIE di TUTTE le COLONIE

su terreno contenente tetraciclina su terreno contenente tetraciclina

MA NON ISTIDINAMA NON ISTIDINA

Il geneIl gene hishis NONNON è stato clonatoè stato clonato

Terreno contenente tetraciclina Terreno contenente tetraciclina

E ISTIDINAE ISTIDINA

ASSENZA di CRESCITAASSENZA di CRESCITA di TUTTE le COLONIE di TUTTE le COLONIE

su terreno contenente tetraciclina su terreno contenente tetraciclina

MA NON ISTIDINAMA NON ISTIDINA

Terreno contenente tetraciclina Terreno contenente tetraciclina

E ISTIDINAE ISTIDINA

CRESCITACRESCITA di ALCUNE COLONIE di ALCUNE COLONIE

su terreno contenente tetraciclina su terreno contenente tetraciclina

MA NON ISTIDINAMA NON ISTIDINA