5LDUUDQJLDPHQWR GHL JHQL SHU OH · PDF file5lduudqjldphqwr ghl jhql shu oh ,ppxqrjorexolqh h...

30/05/2016

1

Riarrangiamento dei geniper le Immunoglobuline e

sviluppo dei linfociti B

Università di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016

ATTENZIONE: questi file compresi testo ed immagini in essi contenuti sono destinati esclusivaemnte agli studenti del corso per favorirne lo studio. Nessun file, che potrebbe contenere materiale soggetto a copyright, può essere utlizzato per altri fini senza autorizzazione

• I geni che codificano i recettori per gli antigeni (BCR e TCR) sono presenti in uno “stato” non funzionale nella linea germinale

• Diversi eventi di ricombinazione devono avvenire durante lo sviluppo di ciascun linfocita per rendere funzionali questi geni

• Ciascun evento richiede l’introduzione di doppie rotture nel DNA cromosomico


30/05/2016

2

Chromosome localization of Ig loci


• Sia le catene leggere che le catene pesanti sono codificate da famiglie multi-geniche separate• Nel DNA della linea germinale ciascuna famiglia multi-genica contiene diverse sequenze codificanti, dette segmenti genici, separate da regioni non codificanti

• Durante la maturazione dei linfociti B questi segmenti genici vengono riarrangiati• Il riarrangiamento crea un esone funzionale corrispondente alla regione variabile


30/05/2016

3


La regione VL è codificatada più di un segmento genico

• La regione variabile della catena leggera (VL) è codificata da 2 segmenti genici– segmento genico V

• codifica per i primi 95-101 a.a.– segmento genico J

• codifica per pochi a.a. (fino a 13)Il riarrangiamento dei segmenti V e J crea un esone (VJ)

che codifica per l’intera regione VL

VL

CL

Corrispondenza tra segmenti genici e domini Ig


30/05/2016

4


La regione VH è codificatada più di un segmento genico

• La regione variabile della catena pesante (VH) è codificata da 3 segmenti genici– segmento genico V– segmento genico D– segmento genico J

Il riarrangiamento dei segmenti V, D e J crea un esone (VDJ) che codifica per l’intera regione VH


VH

Cm1

Cm3

Cm2

Cm4

Corrispondenza tra segmenti genici e domini Ig

Cm1 Cm2 Cm3 Cm4 TM Cyt

30/05/2016

5


Germline organization of Ig light- and heavy-chain loci in human genome


30/05/2016

6

Riarrangiamento catena kDNA catena k germ-line

DNA catena k riarrangiato

Trascritto primario catena k

V-J joining

Trascrizione


Trascritto primario catena k

RNA splicing + poliadenilazioneCoda poli-A

TraduzionemRNA catena k

Polipeptide nascente catena k

Catena k


30/05/2016

7

DNA catena H riarrangiato

Trascritto primario

DNA catena H germ lineRiarrangiamento catena pesante

D-J joining

V-DJ joining

Trascrizione


Catena Hm Catena Hd

splicing alternativoTrascritto primario catena H

mRNA catena H

Polipeptide nascente catena H

Catena H


30/05/2016

8

Co-espressione di IgM e IgD• Nelle cellule B naive il trascritto primario della catena pesante contiene sia gli esoni per i domini costanti della catena m che della d

– il trascritto primario non contiene esoni per altre catene pesanti (g, e, a)• Attraverso lo splicing alternativo vengono prodotti sia mRNA per m che per d• La cellula B naive co-esprime IgM e IgD con la stessa specificità antigenica

– stesso esone VDJ per dominio variabile delle catene pesanti m e d– catena leggera associata identica

• Le altre classi di Ig non sono mai co-espresseUniversità di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016

Recombination Signal Sequence, RSS• Accanto a ciascun segmento genico sono presenti delle sequenze dette recombination signal sequences (RSS)

– 1 RSS è collocata al 3’ di ciascun segmento V– 1 RSS è collocata al 5’ di ciascun segmento J– 1 RSS è presente al 5’ e un’altra al 3’ di ciascun segmento D

• Queste sequenze funzionano da segnali per i processi di ricombinazione


30/05/2016

9

Recombination Signal Sequence, RSS• Ciascuna RSS contiene

– NONAMERO: sequenza conservata non codificante di 9 nucleotidi• sito di legame per RAG1; ancora le proteine RAG al DNA

– EPTAMERO: sequenza conservata non codificante di 7 nucleotidi• aumenta legame di RAG, specifica sito di taglio

– eptamero e nonamero sono separati da uno “spacer” di 12 o 23 paia di basi• lo spacer varia di sequenza ma la sua lunghezza è conservata e corrisponde a uno (12 bp) o due (23 bp) giri di DNA doppia elica• la lunghezza dello “spacer” è cruciale per la ricombinazione

– permette corretta giustapposizione di nonamero ed eptamero


Sequenze RSS


30/05/2016

10


“Regola 12/23”

Un segmento genico fiancheggiato da una RSS con uno spacer di 12 bp può ricombinare con un segmento fiancheggiato da uno spacer con 23 bp

Il complesso della ricombinasi V(D)J• Il complesso di enzimi che opera la ricombinazione somatica V(D)J è detto ricombinasi V(D)J• Recombinant-Activating Genes: RAG-1 e RAG-2

– i prodotti di questi geni costituiscono la componente della ricombinasi specifica dei linfociti (B e T)• necessari per la generazione dei recettori per l’antigene

– topi KO per uno dei due geni Rag non sviluppano linfociti B né T• sono espressi durante lo sviluppo dei linfociti solo quando avviene il riarrangiamento dei geni per il recettore dell’antigene

• La ricombinasi V(D)J include anche enzimi espressi ubiquitariamente e coinvolti nella riparazione del DNA– DNA ligasi IV, DNA-PK (DNA-dependent protein kinase), Ku70/80, Artemis

• La ricombinazione avviene alle giunzioni tra le sequenze RSS e le sequenze codificantiUniversità di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016

30/05/2016

11


Recombinant-Activating Genes:RAG-1 e RAG-2

• Proteine nucleari, altamente conservate in vertebrati• Costituiscono la componente della ricombinasi specifica

dei linfociti (B e T)• Necessari per la generazione dei recettori per l’antigene

• Il core di RAG-1 contiene– regione per legame a nonamero– regione centrale che interagisce con eptamero e RAG2– sito catalitico per taglio DNA


• Il core di RAG-2– è necessario per il taglio del DNA– interagisce con RAG1– aumenta l’affinità di legame con il DNA

• RAG2 contiene una regione che lega la lisina 4 trimetilata dell’istone H3 (H3K4me3)– guidando il complesso RAG nelle regioni di cromatina attiva

Recombinant-Activating Genes:RAG-1 e RAG-2

30/05/2016

12


Fasi della ricombinazione 1• RAG1 e RAG2

riconoscono RSS– (alla formazione del complesso

partecipano anche altre proteine)

• le RSS di un segmento V e di uno J sono portate in prossimità

Segmento genico V

Segmento genico J

RSS - 1 giro

RSS - 2 giri


Fasi della ricombinazione 2• taglio di un filamento di

DNA da parte di RAG-1 e RAG-2 alla giunzione delle RSS con le sequenze codificanti– tra eptamero e segmento

genico codificante

Segmento genico V

Segmento genico J

RSS - 1 giro

RSS - 2 giri

30/05/2016

13


Fasi della ricombinazione 3• l’estremità tagliata del

segmento genico codificante, viene unita al filamento opposto producendo una “forcina”

• all’estremità della RSS, viene prodotta una doppia rottura del DNA

Segmento genico V

Segmento genico J

RSS - 1 giro

RSS - 2 giri

• Vengono reclutate altre proteine– Ku70/Ku80

• La forcina viene tagliata in posizione casuale– RAG/Artemis– l’estremità viene poi modificata da

• esonucleasi• TdT (terminal deoxynucleotidyltransferase)

• Riparo e legame delle sequenze codificanti e di quelle segnale– DNA ligasi IV

Ricombinazione 4


30/05/2016

14

Generazione della diversità anticorpale(GoD, Generation of Diversity)

• Molteplici segmenti genici– diverse combinazioni V-(D)-J

• Flessibilità nel processo di giunzione– aggiunta e rimozione di nucleotidi

• Combinazione di catene pesanti e leggere• Ipermutazione somatica

– in linfociti B attivatiUniversità di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016


200 1.2x1066x103

6x103 0.72x106

1.92x106

120

Possibili combinazioni teoriche

xx

==

+=

30/05/2016

15


Figure 3-6Variabilità degli aminoacidi nelle Ig

Regione V catena pesante Regione V catena leggera

Variab

ilità

Variab

ilità

FR, frame region HV, hyper-variable region

HV3 ha una varibilità maggiore

di HV1 e HV2HV3 ha una

variabilità maggiore di HV1 e HV2

La regione del DNA dove avviene la giunzione V(D)J codifica per la regione ipervariabile 3 (HV3) che

corrisponde al CDR3

HV regions

HV1 HV2 HV3

HV1 HV2 HV3


30/05/2016

16

Flessibilità nel processo di giunzione:aggiunta e rimozione di nucleotidi

• l’estremità tagliata del segmento genico codificante, viene unita al filamento opposto producendo una “forcina”• (v. diapo precedenti)

Eptamero della RSSEptamero della RSS



(P-addition)• Il taglio della forcina genera un filamento singolo

• Gli enzimi di riparazione aggiungono nucleotidi complementari a questa sequenza generando una sequenza palindromica– P-nucleotidi

• Variazioni nella posizione del taglio della forcina generano variazioni in questa sequenzaUniversità di Roma Tor Vergata - Corso di Laurea in Scienze Biologiche - Immunologia Molecolare - dott. Claudio PIOLI - a.a. 2015/2016

30/05/2016

17


• Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (TdT) aggiunge fino a 15 nucleotidi alle giunzioni D-J e V-DJ.• I nucleotidi aggiunti generano sequenze randomiche• La N-addition contribuisce largamente alla variabilità del CDR3 della catena pesante


(N-addition)

• La N addition si verifica quasi esclusivamente nella catena pesante


30/05/2016

18

Ig TCRabDiversità totale(combinazioni V(D)J e catene L/H + diversità giunzioni N/P addition)

1011 1016

Tuttavia, in un determinato momento ciascun individuo haun repertorio di circa 107 cloni B e T



30/05/2016

19

Esclusione allelica• Ciascuna cellula B esprime i geni riarrangiati

della catena pesante di un solo cromosoma e i geni riarrangiati della catena leggera di un solo tipo (k o l) e di un solo cromosoma– esclusione allelica

• Assicura che una cellula B funzionale esprima una sola catena pesante e una sola leggera una sola specificità antigenica



Esclusione allelica in singole cellule B

I due aplotipi diversi sono espressiin cellule diverse

Ceppo di aplotipo“a/a” per la catena pesante delle Ig

Ceppo di aplotipo“b/b” per la catena pesante delle Ig

Ibrido F1 di aplotipo“a/b” per la catena pesante delle Ig

5LDUUDQJLDPHQWR GHL JHQL SHU OH · PDF file5lduudqjldphqwr ghl jhql shu oh ,ppxqrjorexolqh h...

Documents

Transcript of 5LDUUDQJLDPHQWR GHL JHQL SHU OH · PDF file5lduudqjldphqwr ghl jhql shu oh ,ppxqrjorexolqh h...