1. “ENHANCER TRAP”

2. SOVRAESPRESSIONE di TRANSGENI

3. STUDIO DI PROMOTORI

DROSOPHILA TRANSGENICA

TECNICA dell’ENHANCER TRAP

Un enhancer trap contiene un promotore minimo, insufficiente di per sé, per indurre la trascrizione. Se, dopo la trasposizione si inserisce in una regione sotto l’influenza di un enhancer genomico, la sequenza inserita dovrebbe essere trascritta in maniera che riflette l’attività dell’enhancer.

Tecnica utilizzata per:1)Identificazione di nuovi geni2)Analisi dell’espressione di geni tempo/tessuto specifici3) Permette analisi molti geni simultaneamente

TECNICA dell’ENHANCER TRAP

A) Enhancer TRAP P(LacZ): gene reporter codifica per la beta-galattosidasi L’attività dell’enhancer è localizzata tramite immunoistochimica o reazione con X-gal.

A) Enhancer TRAP P(LacZ) e B) Enhancer TRAP GAL4

A) Enhancer TRAP P(LacZ)

1) LINEE “ENHANCER TRAP”

a) Banche di drosophila con pattern espressione, collezione dioltre 4000 ceppib) Con incroci specifici si possono studiare vari pattern diespressione

B) Enhancer TRAP GAL4: sistema di Lievito. GAL4 attiva trascrizione di geni a valle di UAS (Upstream Activating Sequence)

Utilizzato per IDENTIFICARE NUOVI GENI e SOVRAESPRESSIONE di geni

LIEVITO

DROSOPHILA

2) Enhancer TRAP GAL4 per identificazione di NUOVI GENI

GAL4 è prodotto SOLAMENTE se si inserisce sotto enhancer

Gene reporter (LacZ/GFP) è espresso solo se GAL4 lega la seq UAS

GAL4/UAS

SOVRA-ESPRESSIONE/SILENZIAMENTO di TRANSGENI

GAL4/UAS: sovraespressione di TRANSGENI tessuto specifica

GAL4/UAS: sovraespressione di TRANSGENI tessuto/tempo specifica

IL TRANSGENE (GENE X ) E’ ESPRESSO SOLAMENTE NEL TESSUTO SPECIFICO

1) Promotore UBIQUITARIO2) Promotore SPECIFICO (spazio)3) Promotore Temp-SENS (tempo)

Collezione di ceppi di Drosophila

PROMOTORETessuto specifico

GAL4/UAS: sovraespressione di TRANSGENI tessuto/tempo specifica

ESISTONO MIGLIAIA di CEPPI di DROSOPHILA CHE ESPRIMONO GAL4 IN DIFFERENTI TESSUTI E STADI DIFFERENTI DELLO SVILUPPO

GAL4/UAS

SOVRA-ESPRESSIONE/SILENZIAMENTO di TRANSGENI

SPAZIO TEMPO

Tecnica molto utilizzata per studio di ONCOGENI

•WT•MUTATO•DELETO•antisenso

UAS/Cbl oncogeneWT

GAL4/UAS: sovraespressione di TRANSGENI tessuto/tempo specifica

Studio del PROMOTORE

Drosophila puo’ essere un ottimo strumento per l’ANALISI del PROMOTORE:identificazione di regioni NECESSARIE per la funzione del Promotore

Vengono prodotti MUTANTI di DELEZIONE fusi al gene LacZIl geni ibrido viene fuso nell’elemento P e inserito nell’embrione

L’attività della betagalattosidasi permette di identificarela regione MINIMA del PROMOTORE e sequenze NECESSARIE alla sua regolazione

Analisi del PROMOTORE del gene DRONC: caspasi di Drosophila essenziale per apoptosi durante lo sviluppo embrionale del moscerino.

Studio del PROMOTORE

Distinct promoter regions regulate spatial and temporal expression of the Drosophila caspase dronc T J Daish, D Cakouros and S Kumar

embrionecervello

intestino ghiandole salivari

Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans

ANDREW FIRE*, SIQUN XU*, MARY K. MONTGOMERY*, STEVEN A. KOSTAS*†, SAMUEL E. DRIVER‡ & CRAIG C. MELLO‡

RNA interference

Fire at al, Nature V391 pp 806-811 (1998)

dsRNAi is cut in 21-23 nt fragments

Zamore et al, Cell, v101 pp25-33 (2000)

Ambion Inc. Austin, Texas, USA