1 Agenti microbici nelle acque e prove interlaboratorio ISS-UNICHIM: F. Pastoni, C. Fontò UNICHIM,...

1

Agenti microbici nelle acque e prove

interlaboratorio

ISS-UNICHIM:

F. Pastoni, C. Fontò

UNICHIM, Milano

valutazioni organizzative e tecniche

2

Prova Interlaboratorio ISS-UNICHIM

3

Microrganismi di riferimento

Escherichia coli NCTC 9001

Enterococcus faecalis NCTC 775

17° ciclo

4



Clostridium perfringens NCTC 13170

18° ciclo

5

- - Verifica dell’integritàVerifica dell’integrità

Ciascuna lenticula viene esaminata per controllarne la integrità e la

rispondenza ai caratteri macroscopici previsti.

Prove effettuate sui materiali prima

dell’utilizzo

6

- - Verifica delle caratteristiche Verifica delle caratteristiche microbiologichemicrobiologiche

Su un numero statisticamente significativo di lenticule (rispetto al

totale utilizzato) vengono preventivamente effettuate tutte le prove microbiologiche previste per

verificarne la rispondenza e la omogeneità.

Prove effettuate sui materiali prima

dell’utilizzo

7

Sospensione A-17Sospensione A-17

Valutazione della carica batterica totale a 22° C ed a 37° C

17° ciclo

Determinazioni da effettuare

8


Sospensione B 17Sospensione B 17

•Ricerca ed enumerazione di coliformi totali

•Ricerca ed enumerazione di Escherichia coli

•Ricerca ed enumerazione di enterococchi, Pseudomonas aeruginosa, Clostridium perfringens

17° ciclo

9

Carica batterica totale a Carica batterica totale a 22°C *22°C *

17° ciclo

Laboratori partecipanti 284

Determinazioni totali 261

W (segnale di preavviso) 5 (1,9%)

A (segnale di intervento) 11 (4,2%)

Valori di z-score compresitra -0,5 e +0,5

202 (77,4%)

* Sostenuta da E. faecalis

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Tali valori sono da considerare non soddisfacenti e devono costituire un

segnale di allarme

quando i valori di z-score sono compresi tra

-2 e -3 o tra +2 e +3

11

I laboratori devono mettere in atto una azione correttiva

quando i valori di z-score sono inferiori a -3 o superiori a +3

12


17° ciclo






203 (77,5%)

* Sostenuta da E. faecalis

13

Clostridium perfringensClostridium perfringens

17° ciclo



Numero di falsi positivi 18 (9,0%)

14

Coliformi totali Coliformi totali

17° ciclo






118 (44,9%)

15

17° ciclo






106(40,2%)

Escherichia coliEscherichia coli

16

Enterococchi Enterococchi

17° ciclo





Numero di falsi positivi 6


181 (69,0)

17

Pseudomonas aeruginosaPseudomonas aeruginosa

17° ciclo



Numero di falsi positivi 16 (7,2%)

18

Positivo è il quadro ottenuto relativamente alle cariche batteriche totali, sostenute tuttavia dallo stipite

di Enterococcus faecalis, specie notoriamente poco sensibile a stress

strutturali o connessi a condizioni operative.

17° ciclo

Valutazioni tecniche

19

Migliorabile il quadro riguardante Escherichia coli, anche in

considerazione del probante significato di indicatore di

contaminazione delle acque che va riconosciuto a questa specie

batterica.

17° ciclo


20

18° ciclo


Sospensione A-18Sospensione A-18

Valutazione della carica batterica totale a 22° C ed a 37° C

21


18° ciclo

Sospensione B 18Sospensione B 18

Ricerca ed enumerazione di:

•coliformi totali

•Escherichia coli

•Enterococchi

•Pseudomonas aeruginosa

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18° ciclo

Sospensione C-18Sospensione C-18

Ricerca ed enumerazione di:Clostridium perfringens (spore comprese)

23

18° ciclo




W (segnale di preavviso) 23(8,3%)

A (segnale di intervento) 22(7,9%)


96(34,5%)

* Sostenuta da E. coli

24

18° ciclo







117 (41,6%)

* Sostenuta da E. coli

25

18° ciclo






77(26,6%)

Escherichia coliEscherichia coli

26

18° ciclo

Coliformi totaliColiformi totali






85 (29,6%)

27

18° ciclo

Pseudomonas aeruginosaPseudomonas aeruginosa




28

18° ciclo

EnterococchiEnterococchi




29

18° ciclo

Clostridium perfringens Clostridium perfringens






75 (36,4%)

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Nel 18° Ciclo della Prova Interlaboratorio MIAC si è per la prima volta superato il numero di 300 laboratori partecipanti (per la precisione

306).Dato indubbiamente rilevante, se si considera

che al 1° Ciclo MIAC parteciparono 75 laboratori.

Non tutti comunque hanno inviato i risultati.

18° ciclo


31

Quadro dei laboratori che hanno inviato i risultati

• CBT a 22 °C = 278 su 306• CBT a 37 °C = 281• Escherichia coli = 290• Coliformi totali = 287• Enterococchi = 281• Pseudomonas aeruginosa = 236• Clostridium perfringens = 206

18° ciclo


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Cariche batteriche totali (I)

• A proposito della carica batterica totale a 22 °C, il numero di strutture analitiche i cui dati sono contrassegnati con “W” e “A” ammontano rispettivamente a 23 (pari al 8,3% sul totale di 278 laboratori) ed a 22 (7.9%).

18° ciclo


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Cariche batteriche totali (II)

• Sostanzialmente migliore il dato a 37 °C, con 9 “W” e 9 “A” (su un totale di 281 laboratori pari

al 3,2% ciascuno).• Su tale quadro, complessivamente

soddisfacente, verosimilmente incide il fatto che le cariche batteriche medesime fossero sostenute da uno stipite di Escherichia coli, più facile da riscontrare nelle condizioni colturali proprie della carica batterica a 37 °C.

18° ciclo


34

Escherichia coli e coliformi totali (I)

• Migliorabile il quadro dei risultati: ben 75 laboratori (25,9% sul totale delle 290 strutture analitiche) ha ottenuto valori cui corrisponde un segnale W o A. Le performance inadeguate vengano da laboratori che da minor tempo partecipano alle prove UNICHIM. Lo stesso tipo di valutazione può essere esteso ai risultati riguardanti i coliformi totali.

• Una precisazione a proposito del diverso valore assegnato per E. coli e per i coliformi totali: rispettivamente 33,8 e 38,1. Ciò può apparire incongruente, trattandosi di prove condotte su uno stipite di E. coli.

18° ciclo


35

Escherichia coli e coliformi totali (II)

• Va considerata la maggiore selettività dei substrati di crescita utilizzati per la determinazione di E. coli e quindi la minore capacità di rivivificazione dei microrganismi stressati, quali sono quelli contenuti nei materiali utilizzati nella prova. Ciò riproduce quanto si verifica in campioni naturali: è infatti verosimile ritenere che in un campione di acqua destinato al consumo umano le cellule di E. coli eventualmente presenti non siano in una condizione di piena funzionalità, trovandosi in un habitat molto diverso da quello per loro ottimale.

18° ciclo


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Enterococchi e Pseudomonas aeruginosa• Nessun rilievo particolare a proposito del

quadro riguardante gli enterococchi: solo 7 falsi positivi su un totale di 281 risultati pervenuti (2,5%).

• Non vanno però trascurati le acquisizioni ormai consolidate sulla particolare “robustezza” di questa tipologia di microrganismi.

• Una situazione non dissimile è quella concernente Pseudomonas aeruginosa, con un totale di 12 falsi positivi su 236 risultati trasmessi, pari al 5,1%.

18° ciclo


37

Clostridium perfringens• La valutazione circa il totale di 11 “W” (su 206,

pari al 5,3%) e 54 “A” (pari al 26,2%) non può non tener conto del fatto che la determinazione in questione è tecnicamente più problematica rispetto a quelle elencate in precedenza.

• Da sottolineare inoltre che ben 36 dei 54 “A” sono stati ottenuti da laboratori che da minor tempo partecipano alle prove UNICHIM.

18° ciclo


38

Viene utilizzato il “valore di “valore di consenso da laboratori esperti”consenso da laboratori esperti”

secondo quanto stabilito dalla norma ISO 13528.

Si tratta dei risultati ottenuti da un gruppo di laboratori selezionati sulla

base di criteri per quanto più possibile oggettivi (laboratori accreditati che

abbiano partecipato con buoni risultati alle precedenti prove

interlaboratorio).

Criteri di valutazione dei risultati

(I)

39

Il valore in precedenza richiamato viene utilizzato come termine di confronto per i risultati ottenuti da tutti i laboratori partecipanti

alla prova.


(II)

40

Ciò si rivela indispensabile al fine di disporre di risultati verosimili

(cioè acquisiti in condizioni operative reali) e di poter

pertanto effettuare attendibili valutazioni sui risultati di tutti i

laboratori.


(III)

41

I dati comunicati dal fornitore dei materiali di riferimento non sono infatti adeguati per tale tipo di

valutazione.


(IV)

42

Il fornitore dei materiali di riferimento conduce infatti le proprie prove in condizioni per certi aspetti ottimali

(inoculo per insemenzamento superficiale su Blood agar), non

potendo riprodurre tutte le condizioni sperimentali degli utilizzatori dei

materiali stessi.


(V)

43

Il fornitore dei materiali di riferimento cerca pertanto di

ottenere dei risultati il più vicino possibili al contenuto effettivo

delle confezioni (lenticule nel caso specifico).


(VI)

44

In base alla ovvia constatazione di come le lenticule contengano

microrganismi stressati (come del resto la stragrande maggioranza dei campioni naturali), l’inoculo su Blood

agar consentirà una notevole rivivificazione degli stessi.


(VII)

45

Tale rivivificazione è verosimilmente maggiore di

quella che si ottiene con i metodi di norma impiegati nella routine

laboratoristica (in particolare quando si impieghino terreni

selettivi).


(VIII)

46

Dati interessanti al riguardo vengono comunicati dallo stesso fornitore di materiali attraverso alcune prove parallele condotte

sia su Blood agar, sia su terreni di normale utilizzo.


(IX)

47

Esempio 1


Prova su Blood agar = 80 u.f.c.

Prova su terreno diverso = 44 u.f.c.


(X)

48

Esempio 2

Klebsiella aerogenes NCTC 9528

Prova su Blood agar = 65 u.f.c.

Prova su terreno diverso = 34 u.f.c.


(XI)

49

Esempio 3

Pseudomonas aeruginosa NCTC 10662

Prova su Blood agar = 6,88 x 10 3 u.f.c.

Prova su PCA = 1,96 x 10 3 u.f.c.


(XII)

50

Prova Interlaboratorio ISS-UNICHIM

51



Enterobacter aerogenes NCTC 10006

2° ciclo

52



Klebsiella aerogenes NCTC 9528

3° ciclo

53

In entrambi i cicli, la Prova Interlaboratorio era imperniata sulla ricerca di Escherichia coli,

parametro microbiologico regolamentato per legge nel caso

delle acque di scarico.

2°-3° ciclo


54

I risultati riguardanti Escherichia coli (relativamente ai campioni positivi) appaiono piuttosto contrastanti nei due cicli (risultati

complessivamente migliori nel 2° ciclo rispetto al 3° ciclo).

Va comunque rilevato come la maggioranza i risultati valutati come “A” e “W” provengano da laboratori che partecipano solo da tempi

recenti alle Prove Interlaboratorio.

2°-3° ciclo


55

Soddisfacenti i risultati concernenti Salmonella sp., anche se i campioni

predisposti erano in tutti i casi negativi per questo parametro.


2°-3° ciclo

56

Non appare proponibile approfondire ulteriormente le valutazioni concernenti questa Prova

Interlaboratorio, essendo la attuale casistica limitata a soli tre cicli.


2°-3° ciclo

57

I campioni di prova nelle PI sono sostanzialmente “facili” (si tratta di sospensioni ottenute unicamente

dalle lenticule, pertanto con caratteristiche microbiologiche più

semplici di analoghi campioni naturali, in quanto ad es. privi di germi

“interferenti”).

Considerazioni per la valutazione dei risultati

58

I laboratori partecipanti utilizzano metodi di prova di comune impiego.

Le determinazioni analitiche, stabilite da disposizioni di legge vigenti,

rappresentano la attività routinaria dei laboratori.


59

Le determinazioni analitiche sono del tutto programmabili, in termini di organizzazione delle attività dei laboratori, essendo note

con consistente anticipo le date di invio dei materiali di prova.

Qualunque campione naturale che pervenga in laboratorio non è sempre,

ovviamente, programmabile.


60

I materiali di prova, nella “confezione” in cui vengono inviati

(lenticule), risultano di utilizzo quanto mai pratico e semplice.


61

La esigenza di predisporre dei campioni di prova contraddistinti da caratteristiche

microbiologiche il più possibile riconducibili a quelle proprie delle acque destinate al

consumo umano induce a delineare protocolli di esecuzione delle prove talvolta

contraddistinti da diversi passaggi (predisposizione di sospensioni, diluizioni,

ecc.).Si tratta tuttavia di procedure che non

dovrebbero costituire difficoltà particolari per laboratori accreditati o comunque

“allineati” ai criteri di qualità.


62

La ricostituzione dei campioni di prova partendo dalle lenticule fornite ai laboratori rappresenta contestualmente un momento di rivivificazione dei microrganismi presenti. Imprecisioni nella fase di ricostituzione dei

campioni possono quindi influenzare la rivivificazione.

Qualunque campione “naturale” di acqua contiene comunque, verosimilmente,

microrganismi stressati.


63

Imprecisioni nella esecuzione del protocollo indicato possono indurre effetti non trascurabili sui risultati (ad esempio fenomeni di sedimentazione delle

sospensioni, causate da una non efficace agitazione delle medesime prima del loro

utilizzo, che determinano errori di valutazione in particolare quando si

prelevino aliquote ridotte, come 1 ml. nel caso della valutazione di cariche batteriche

totali).


64

Prove interlaboratorio

UNI CEI EN ISO/IEC 17025

“Assicurazione della qualità dei risultati di prova e di

taratura”

…partecipazione a programmi di prove interlaboratorio…

65

“Dinamica” di una prova interlaboratorio:

effettuazione di determinazioni analitiche su campioni dalle caratteristiche note;

possibilità di confrontare i risultati effettivamente ottenuti con quelli attesi;

riferimento ai risultati conseguiti dagli altri laboratori partecipanti alla prova.

66

I presupposti tecnico-organizzativi di una prova interlaboratorio prevedono

necessariamente l’impiego di materiali di riferimento, cioè

campioni noti contenenti stipiti batterici provenienti da collezioni internazionali, in attesa di potersi

avvalere in futuro di campioni naturali: ciò, presumibilmente, nell’ambito della microbiologia applicata, non potrà avvenire in

tempi brevi.

67

L’utilizzo di una tale tipologia di campioni consente lo sviluppo di una

efficace capacità critica, derivante dalla possibilità di valutare le prestazioni del

proprio laboratorio in virtù del confronto tra i risultati ottenuti e :

o quanto atteso sulla base di riscontri inoppugnabili (caratteristiche note

all’origine);

o i risultati conseguiti da altri laboratori (talvolta ben più significativi rispetto ai

valori precedenti, in considerazione delle condizioni reali da cui derivano).

68

Valutazioni conclusive

Miglioramento graduale dei risultati, nel caso di svariati

laboratori, in particolare quelli che hanno partecipato ad un certo

numero di prove.

“Effetti” delle prove interlaboratorio

69

Diffusione della “cultura” della qualità, anche desumibile dal rapporto

sviluppato con i laboratori partecipanti.

“Effetti” delle prove interlaboratorio

Valutazioni conclusive

70

Grazie per l’attenzione

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