1. A B V = - d[A]d[A] dtdt d[B]d[B] dtdt = Velocità di reazione V= Velocità istantanea:...
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1
A B
V = -d[A]
dtd[B]
dt=
Velocità di reazione
V= Velocità istantaneaV= Velocità istantanea: coefficiente angolare della retta : coefficiente angolare della retta tangente alla curva in quel puntotangente alla curva in quel puntoQuando Quando t=0t=0 la velocità istantanea sarà massima ( la velocità istantanea sarà massima (VV00))
2
3
Teoria delle collisioni (Arrhenius, 1888)
Urti molecolari e velocità di reazione (1)
Ogni reazione chimica decorre attraverso la
formazione di un “Complesso
attivato” generato da un “urto efficace”Condizioni per un “urto
efficace”: Sufficiente energia (almeno pari a Ea)
Giusto orientamento (Effetto sterico)
Complesso attivato
EEaa Energia di
attivazione
Coordinata di reazione
Energ
ia lib
era
, G
A ─ A
Es: A2
B-B
+ B2
B B
A A
→ [A2B2]
B BA A
→ 2AB
2AB
A2B2
A2+ B2
A ─ A
B B
A A
B
A A
B
B B
4
Sono efficaci soltanto gli urti nei quali lo ione
ossidrile attacca l’alogeno-derivato alchilico dal lato
opposto a quello dove è legato l’atomo di
alogeno
Urti molecolari e velocità di reazione (2)
Effetto Sterico
OHOH-- + CH + CH33Cl Cl [OH [OH … … CH CH33Cl]Cl]-- CH CH33OH + ClOH + Cl--Es1:
-- + --
Es2: N2O + NO N2 + NO2[N-N…O…N-O]#
5
L’energia di attivazione (Ea) corrisponde alla minima energia necessaria per un urto efficaceMinore è il valore di Ea maggiore è il numero di molecole in grado di superare la barriera energetica e formare i prodottiLa reazione anche se è termodinamicamente spontanea (Gr<0) potrebbe non avvenire se non attivata
Urti molecolari e velocità di reazione (3)
Energia di attivazione
Spontaneità di reazione non vuol dire immediatezza
Istantanea
kJ -79=G OHOH+H
Lenta Molto
kJ396G COO C
o2982
-aq
+aq
o298g2g2diamante
l
Istantanea
kJ -79=G OHOH+H
Lenta Molto
kJ396G COO C
o2982
-aq
+aq
o298g2g2diamante
l
6
Es: 2H2 + O2 → 2 H20 G° = - 115 Kcal/mol La reazione da un punto di vista
termodinamico è spontanea ma non avviene. Occorre una scintilla che innesca la reazione la quale poi continuerà a fornire l’energia di
attivazione necessaria perché altre molecole di H2 e O2 reagiscano
Urti molecolari e velocità di reazione (4)
Energia di attivazione
H
En
erg
ia lib
era
, G
H H
Coordinata di reazione
EEaaO - O
A A
O H
HH- Gr<0HH-
HH
HHO
O O
7
T1
TT22 TT33
Ea
NE=N • e-Ea /RT
NE
N
Energia cinetica
T1 < T2 < T3T1 < T2 < T3Aumentando la temperatura, aumenta l’energia cinetica media (ECm) delle molecole e di conseguenza aumenta il n°di molecole (NE) aventi l’energia minima necessaria
per formare il complesso attivato (Ea).Si può dimostrare (Arrhenius,1988) che a temperatura T,
la frazione di molecole che hanno energia Ea è proporzionale a e-E*/RT (area colorata sotto la curva)
AA BB
Teoria delle Collisioni e Temperatura
ECm1 ECm2 ECm3
8
Parametri che influenzano la velocità di reazione
Secondo quanto detto sulla teoria delle collisioni è evidente che la velocità di una reazione chimica dipende da:
Temperatura (energia cinetica) Energia di attivazione (barriera energetica) Fattore Sterico A (orientamento dell’urto molecolare)
k = A·e-Ea/RT Costante cinetica
Concentrazione dei reagentiConcentrazione dei reagenti (numero degli urti)
V = k · [ConcentrazioneConcentrazione]
9
V = k · [A]m · [B]n
Concentrazione e velocità di reazione
aA + bB cC + dD
m,n : Ordine di reazione di un singolo reagente (si ricava solo sperimentalmente)
m + n : Ordine di reazione complessivoMolecolarità : n° di particelle (molecole, atomi, ioni) che urtano per dar
luogo ad un singolo atto reattivo (reazione elementare)
Es1: H2 + I2 2HI V=k[H2][ I2] 2° ordine, bimolecolareEs2: 2N2O5 4NO2 + O2 V=k[N2O5] 1° ordineEs3: 2NO+H2 N2 + 2H2O V=k[NO]2[H2] 3° ordine, trimolecolareEs4: NO2+2HClNO+H2O+Cl2 V=k[NO][HCl] 2°ordine
Solo nei processi elementari (Es1, 3) il coefficiente stechiometrico (a,b) coincide con l’ordine di reazione (m,n) e con la molecolarità
10
Dai dati sperimentali riportati in tabella è evidente che la reazione èdi 1° ordine, in quanto la sua velocità si dimezza quando viene
dimezzata la concentrazione di A mentre non si raddoppia quandoviene raddoppiata la concentrazione di B
V = k·[A]V = k·[A] [A] [B] velocità (moli/litro) (moli/litro) (moli/litro/minuto) 0,2 0,1 0,1 0,1 0,1 0,05 0,2 0,2 0,1
Determinazione ordine di reazione (1)
A + B C
11
[A] [B] velocità (moli/litro) (moli/litro) (moli/litro/minuto) 0,1 0,1 0,1 0,1 0,2 0,4 0,2 0,2 0,4
Dai dati sperimentali riportati in tabella è evidente che la reazione èdi 2° ordine rispetto a B, in quanto la sua velocità è proporzionale
alla seconda potenza della concentrazione di B e non varia al variaredella concentrazione di A
V = k·[B]V = k·[B]22V = k·[B]V = k·[B]22
Determinazione ordine di reazione (2)
A + B C
12
Dai dati sperimentali riportati in tabella è evidente che la reazione èdi 2° ordine, in quanto la sua velocità si duplica sia quando vieneraddoppiata la concentrazione di A che quando viene raddoppiata
la concentrazione di B
Dai dati sperimentali riportati in tabella è evidente che la reazione èdi 2° ordine, in quanto la sua velocità si duplica sia quando vieneraddoppiata la concentrazione di A che quando viene raddoppiata
la concentrazione di B
V = k·[A]·[B]V = k·[A]·[B]
[A] [B] velocità (moli/litro) (moli/litro) (moli/litro/minuto) 0,2 0,3 0,10 0,4 0,6 0,40 0,2 0,6 0,20
Determinazione ordine di reazione (3)
A + B C
Si può anche dire che la reazione è di 1° ordine rispetto ad A e di 1° ordine rispetto a B
13
V = k [A]V = k [A]22
In generale una reazione viene definita di 2° ordine se la sua velocitàrisulta sperimentalmente essere funzione lineare della concentrazione
di un solo reagente elevata al quadrato o al prodotto delle concentrazionidi due reagenti.
Quindi, la reazione è di secondo ordinesecondo ordine se si verifica sperimentalmentesperimentalmente uno dei casi seguenti:
V = k [B]V = k [B]22 V = k [A][B]V = k [A][B]
Determinazione ordine di reazione (4)
14
Meccanismo di reazione
Es: 2 ICl + H2 2 HCl + I2 V= k [ICl][H2]
La reazione è il risultato di due reazioni elementari ICl + H2 HCl + HI Stadio lento V= k [ICl][H2]
ICl + HI HCl + I2 Stadio veloce
2 ICl + H2 2 HCl + I2 V= k [ICl][H2]HI = “Intermedio di reazione”
Salvo rare eccezioni l’equazione chimica rappresenta la somma di un certo numero di reazioni intermedie
(Reazioni Elementari) da essa non desumibili
La velocità di reazione è data dallo stadio lento (tappa limitante)
15
La tappa limitante nelle reazioni a più stadi
Reagenti Intermedi Prodotti
Stadio 1 Stadio 2
Rapido
Stadio limitante la velocità
Lento
A B C D FG H I
La velocità totale del processo è uguale a quella della reazione più lenta (V= k[D])
Questo è spesso sfruttato negli organismi viventi per regolare il metabolismo
k
16
X + Y → X-Y Reazione non catalizzata (Ea alta, V bassa)X + C → X-C Reazioni in presenza di catalizzatore (C)X-C + Y → X-Y + C (Ea bassa, V alta)X + Y → X-Y C non si consuma perché riciclato
L’azione del catalizzatore (1)
coordinata di reazione
GG
EaEa
EaC
En
erg
ia lib
era
, G
XY
X + Y
X-Y
XC+Y
Il catalizzatore diminuisce Ea facendo percorrere alla reazione un
cammino diverso senza variare il valore di G
Il catalizzatore non rende spontaneo un processo endoergonico
17
H3C CO
OH H O CH3
H3C CO
OCH3
H2O
Es1: Esterificazione di un acido carbossilico
La reazione è lenta ma viene accelerata aggiungendo un acido inorganico alla miscela di reazione
L’azione del catalizzatore (2)
HOH
C
O
O CH3H3C
H+
C
OH
O CH3H3C+
C
OH
H
O CH3H3C
OH+
C-
OH
H
O- CH3H3C-
OH
H3C -COH
OH
+H
O CH3 C -
OH
H
O
CH3
H3C-
OH
+
H+H3C C
OH
OH
OH+
H3C CO
OHH3C C
OH
OH
OH+
18
L’azione del catalizzatore (3)
Es2: 2H202 → 2H2O + O2 G°= -50,2 Kcal/mol
coordinata di reazione
GrGr
EacEac
G
H202
2H2O+O2
Ea
Le bollicine di O2 che si sviluppano quando si versa H2O2 su una ferita sanguinante sono dovute all’azione catalitica della catalasi, un enzima presente nel sangue
1) H2O2+2Fe+2+2H+→2H2O+2Fe+3
2) H2O2 + 2Fe+3 →O2+2H++2Fe+2
2H2O2 2H2O + O2
Fe+2 , H+
Fe+2 e H+ = catalizzatori
19
Catalisi omogeneaIl catalizzatore e i reagenti sono nella stessa fase
Es: 1)H2O2 + I- →H2O + IO-
2)H2O2 + IO- →H2O + O2+ I-
2H2O2 → 2H2O +O2
Video
20
Catalisi eterogeneaIl catalizzatore e i reagenti NON sono nella stessa fase
Es1: 2H202 → 2H2O + O2
MnO2
Video
Marmitta Catalitica
Es2:
Al2O3
2 CO + O2 2 CO2
CxHy + a O2 b CO2 + c H2O
2 NO O2 + N2
2 NO2 2 O2 + N2
21
Equilibrio chimico e velocità di reazione (1)
k1
k-
1
R Pt=0 vvH
k1
k-
1
RP
t=eq vvH
][1 Rkv
][1 Pkv H
KeqR
P
k
k
eq
eq
][
][
1
1eqeq PkRk ][][ 11
22
Equilibrio chimico e velocità di reazione (2)
In generale per una reazione reversibile:
aA + bB + pP + qQ +
All’equilibrio avremo:••••
••••
==1
ba
qp
1- ]B[]A[
]Q[]P[
k
kKeq
Se l’equazione è scritta nella forma inversa:
pP + qQ + aA + bB +
••••
••••
==1
1qp
ba-
]Q[]P[
]B[]A[
k
keq'K da cui:
Keqeq'K
1=
23
Cinetica Enzimatica
“In vivo” ogni reazione è catalizzata da un enzima specifico
Enzimi: Proteina (PM12.000÷1.000.000) Alto potere catalitico in condizioni blande
di T, P e pH Elevata specificità e assenza di sottoprodotti Possibilità di regolazione fine
Composizione
CATENA POLIPEPTIDICA ÷ COFATTORE
Apoenzima Oloenzima
Coenzima o Gruppo prostetico(se legato covalentemente)
24
Gli enzimi sono classificati in base alle reazioni che catalizzano
25
Azione catalitica dell’enzima (1)
L’aumento della velocità di reazione può
variare di parecchi ordini di grandezza Es: Anidrasi carbonica 107
Fosfofruttomutasi 1012
Ureasi 1014
26
Azione catalitica dell’enzima (2)
Effetto prossimità:l’enzima facilita l’urto efficace
mediante un “aiuto sterico”
27
Azione catalitica dell’enzima (3)Un esempio di “Effetto di prossimità”
nelle razioni organiche
28
Stereospecificità del sito catalitico
Azione catalitica dell’enzima (4)
29
Azione catalitica dell’enzima (5)Stiramento e/o distorsione del legame da rompere
30
Analisi equazione di Michaelis & Menten
1
1
K
KcatkKm
]S[+K
]S[V=v
m
•maxo
]S[+K
]S[V=
2
V
m
•maxmax
mK=]S[
]S[+K=]S[2 m
E + S ES P + E
k1
k-1
kcat
1
- +=
k
kkK
cat1
m
31
Grafico dei doppi reciproci (Lineweaver & Burk)
]S[+K
]S[V=V
m
•maxo
]S[V
]S[
]S[V
K
]S[V
]S[K
v maxmax
m
max
m
o •••+=
+=
1
[ ]maxmax
m
o V
1+
S
1•
V
K=
V
1
32
Significato di Km (1)
Il valore di Km indica il grado di affinità di un enzima
per un certo substrato
Es1: confronto dei valori di Km tra due enzimi con i relativi substrati
Anidrasi carbonica 107
Fosfofruttomutasi 1012
Ureasi 1014
33
Significato di Km (2)
Es2: Confronto dei valori di Km della Esochinasi con due substrati diversi
Minore è il valore di Km, maggiore è l’affinità dell’enzima per quel
substrato
D-Glucosio (S1) Km=0,05D-Fruttosio (S2) Km=1,5
La Km più bassa riflette una maggiore affinità
dell’enzima per S 1
La Km più alta riflette una minore affinità dell’enzima per S 2
34
Spiegazione alternativa
Significato di Km (3)
1
cat1-
kk+k
=mK se kcat<<k-1 (ipotesi quasi sempre verificata) avremo:
“Costante di Dissociazione” del Complesso ES
E + S ES P + E k1
k-1
kcat
]ES[
]S][E[Ks ==
1
1-
kk
ES E + S k1
k-1
[ES] Alta → Ks bassa → Alta Affinità
sK==1
1-
kk
mK
35
Significato di Vmax
V0 = kcat [ES]
Vmax = kcat [ET]
[ET] = [E] + [ES]
Vmax è una misura della concentrazione enzimatica
e si esprime in Unità Internazionali (U)
1U= Quantità di enzima che catalizza la formazione di 1M di prodotto
per min in condizioni definite (pH, T, ...)
Conoscendo [ET] e Vmax si può calcolare Kcat
]E[
V
T
max=catK“Costante catalitica” o “Numero di turnover”
(M di substrato trasformate per min)
V0
[S]
Vmax3
Vmax2
Vmax1
[E3]>[E2]>[E1]
36
Effetto del pH sulla stabilità e attività dell’enzima
E EES
S P
E ES
S
E ES
S
H+
OH-
37
Effetto della Temperatura sulla stabilità e attività dell’enzima
Risultato di due processi concorrenti:
Aumento di V0 all’aumentare di T k = A·e-Ea/RT
(vedi teoria degli urti di Arrenius)
Diminuzione di V0 a temperature superiori a quella ottimale per la rottura di legami deboli della struttura terziaria della catena polipeptidica della proteina(vedi denaturazione delle proteine)
T ottimale
Km =Vmax
E + S ES P + E
+ I EI “Complesso abortivo irreversibile”
38
Inibizione enzimaticaL’inibizione (Reversibile o Irreversibile) è uno dei maggiori sistemi di regolazione del metabolismoInibizione Irreversibile
k1
k-1
kcat
Es: Inibizione dell’ Acetilcolinesterasi con il gas nervino Diisopropilfluorofosfato (DIFP) (“Inibitore suicida” vedi anche 5F-U)
E E
O CH3
CH2-OH + F-P-O-CH
O CH3
H3C-CH-CH3
O CH3
CH2-OH-O-P-O-CH + HF
O CH3
H3C-CH-CH3
..Acetilcolinesterasi(degrada l’acetilcolina)
39
[ ]( ) [S]+KiI+1m
•maxo K
[S]V=v
Inibizione Competitiva (IC)
[ ]( )maxmax
m
o V1
+[S]1
VK
=v1
•Ki I +1
Vmax =Kmapp
Km app
40
Diidrofolato Sintetasi(Solo batterica)
Es1: Antimetaboliti (sulfamidici, pro-farmaci analoghi di basi e nucleosidi purinici e pirimidinici)
Inibizione Competitiva (2)
Acido p-aminobenzoico
R=H: Sulfanilamide
Acido Folico DNA
NH2
COOH
NH2
O=S=O
H–N–R
Parte essenziale per l’attività
dUMP dTMPTimidilato Sintetasi
Negli animali non esiste la diidrofolato reduttasi.
L’acido folico deve essere assunto dalla dieta
(vitamina)
“Antagonizza” l’incorporazione dell’acido
p-aminobenzoico nell’acido folico
41
Inibizione Competitiva (3)
Succinico deidrogenasi
Succinato
Fumarato
Es2: Analogo non metabolizzabile
COO-
CH2
CH2
COO-
Malonato
COO-
CH2
COO-
COO-
CHHC COO-
E-FAD E-FADH2
)
)+
+
Sito attivo
42
Es3: Analogo metabolizzabile Inibizione Competitiva (4)
Etanolo
Metanolo
Acetaldeide
Formaldeide
Alcool deidrogenasi
NAD NADH + H+
C-O-HH
HH
C-C-O-HH
HH
H
H
HC-C=OH
H H
C=OH
HIdrossimetila
proteine e acidi nucleici
30 ml di metanolo sono letali
43
Inibizione Non Competitiva (INC)
[S]+K
[S]V
=Vm
max
o
•Ki[I]
+1
( ) ( )Ki
[I]+1
Ki
[I]+1
maxmax
m
o V1
+ [S]1
VK
=v1
•Vmax Km =
44
Inibizione Incompetitiva (IIC)
[S]+K
[S]V
=Vm
max
o
•
Ki
[I]+1
Ki
[I]+1
[ ][ ]( )ki I +1•
maxmax
m
o V1
+ S1
VK
=v1
Vmax
Kmapp
45
Schema riassuntivo dei grafici dei doppi reciproci
IC, INC, IIC
Ki
I
VV
Km
vo
][maxmax
111
Vmax Kmapp
46
Macromolecole proteiche a più subunità
(monomeri o protomeri) Se i siti catalitici sono indipendenti (non
cooperativi) avremo enzimi con “cinetica classica Micheliana” (V0/[S] curva iperbolica)
Se i siti sono dipendenti (cooperativi) avremo “enzimi allosterici”(V0/[S] curva sigmoide)
Enzimi oligomerici
Km K0.5
47
Enzimi allosterici
L’interazione (binding) di una molecola di “legando” (substrato, inibitore, attivatore) con un sito catalitico di una subunità, modifica il binding, aumentando
o diminuendo l’affinità degli altri siti liberi
Interazioni omotropiche:stesso legando (substrato)Interazioni eterotropiche:legandi diversi (substrato,inibitore,attivatore)
48
+ - S S
C C
SS CC
S SCC
Interazioni Omotropiche
Regolazione degli enzimi allosterici (1)
[S]
V0
K0.5
½ Vmax
49
Regolazione degli enzimi allosterici (2)
Interazioni Eterotropiche
C R
+ -
S RC
S
S
► Substrato
● Modulatore positivo(Attivatore)
■ Modulatore negativo (Inibitore)
50
Due possibili modulazioni allosteriche
Vmax K0.5 =
Vmax =K0.5
51
Enzimi allosterici: chiave di controllo nella regolazione metabolica
Gli enzimi allosterici si trovano spesso in punti strategici delle vie metaboliche ed agiscono con “effetto switch on-off”