RETICOLO ENDOPLASMATICO (RE)Reticolo endoplasmatico rugoso (RER)Reticolo endoplasmatico liscio (REL)

RETICOLO ENDOPLASMATICO LISCIO (REL)

E’ COSTITUITO DA UN SISTEMA DI SACCHE

TUBULARI AGRANULARI

• biosintesi lipidica

• deposito del Calcio

• detossificazione da farmaci

• metabolismo dei carboidrati• (GLUCOSO 6 FOSFATASI)

REL E BIOSINTESI LIPIDICA

Avviene ad opera di enzimi posti sulla faccia

citosolica della membrana del REL

• FOSFOLIPIDI DI MEMBRANA (principalmente fosfatidilcolina)

• TRIACILGLICEROLI : accumulati nel lume in goccioline

….lipidiche che verrano conservate negli

adipociti

• STEROLI (ormoni steroidei, colesterolo) nelle cellule endocrine delle

gonadi e della corteccia surrenale

•

REL COME DEPOSITO INTRACELLULARE DI Ca++

Le membrane del REL sono in grado di produrre

con grande efficienza

GRADIENTI DI Ca++

• TRASDUZIONE DEI SEGNALI

• STIMOLO NERVOSO

• CONTRAZIONE MUSCOLARE

DETOSSIFICAZIONE

ENZIMI CHE TRASFERISCONO L’OSSIGENO : OSSIGENASI(CITOCROMO P450)

COMPOSTI LIPOSOLUBILI

COMPOSTI IDROSOLUBILI

NETURALIZZAZIONE

METILAZIONEDEMETILAZIONEIDROSSILAZIONE

OSSIDAZIONERIDUZIONE

CONIUGAZIONE CON AA O ACIDI

CONUIGAZIONE CON UN COMPOSTO MOLTO POLARECHE NE PERMETTE IL PASSAGGIO NEL SANGUE E LA

ELIMINAZIONE RENALE O L’IMMISSONE NELLA BILE ELA SUCCESSIVA ELIMINAZIONE CON LE FECI

ALCUNI COMPOSTI DOPO I PROCESSI DI NEUTRALIZZAZIONEVENGONO TRASFORMATI IN C. MAGGIORMENTE TOSSICI :

ALCUNI VELENI E PROCANCEROGENI

DETOSSIFICAZIONI O SINTESI PROTTETIVE

REAZIONI CHIMICHE DI BIOTRASFORMAZIONE

FASE I

FASE II

FASE I O FUNZIONALIZZAZIONECONVERTONO LE SOSTANZE IN UN METABOLITA PIU ’ POLARE

OSSIDAZIONERIDUZIONE

IDROLISI

FASE II CONIUGAZIONE CON UN SUBSTRATO ENDOGENO

ACIDO GLUCURONICO

ACIDO SOLFORICO

ACIDO ACETICO AMINOACIDI

OSSIDAZIONI

AVVENGONO NEL RE AD OPERA DI UN COMPLESSO E “drug metabolizing system” MONOOSSIGENASI CHE RICHIEDONO

NADPH ED O2

(CITOCROMI P450)

RIDUZIONIAVVENGONO NEL CITOSOL E NEL REL DEL

FEGATO E DI ALTRI TESSUTI

IDROLISIAVVENGONO IN VARI TESSUTI AD OPERA DI

ESTERASI E PROTEASI

ETANOLO

Alcool deidrogenasi NAD dip.

MEOS NADP dipendente

Catalasi utilizza H2O2

ACETALDEIDE

ETANOLO ACETALDEIDE + NADH + H+

ACETALDEIDE ACETATO +NADH + H+

ACETATO ACETIL CoA

INDUCIBILE DALSUBSTRATO

A.deidrogenasi

ACETALDEIDE

LA SUA VELOCITA’ DI FORMAZIONE E’ SUPERIORE ALLASUO CATABOLISMO

ACCUMULO

DANNI PRODOTTI DALL’ACETALDEIDE:

INIBIZIONE SINTESI PROTEICA

BLOCCO IMMISSIONE IN CIRCOLO LIPOPROTEINE

DANNO MEMBRANE

INIBIZIONE OX MITOCONDIALE

DANNO CITOSCHELETRO

FASE II CONIUGAZIONE CON UN SUBSTRATO ENDOGENO

ACIDO GLUCURONICO

ACIDO SOLFORICO

ACIDO ACETICO AMINOACIDI

GLUCURONAZIONE

ACIDO GLUCURONICO+FENOLI O ACIDI AROMATICI:COMPOSTI MENO TOSSICI E PIU ’ SOLUBILI

MOLTI FARMACI SUBISCONO CONIUGAZIONE GLUC.

I GLUCURONIDI POSSONOESSERE SCISSI E RIACQUISTARE IL LORO POTERE TOSSICO

(B-GLUCURONIDASI EPATICHE O DAI BATTERI PRESENTINELLA VESCICA: IN QUESTO CASO LA PRESENZA DEI

COMPOSTI TOSSICI NELLA VESCICA PUO ’ DARE LUOGOA TUMORI : DERIVATI DELL’ANILINA)

ACETILAZIONE

ELIMINAZIONE DI SOSTANZE TOSSICHE CONTENENTIGRUPPI AMINICI : SULFAMIDICI

CONIUGAZIONE SOLFORICA

AVVIENE NEL FEGATO E NELLA MUCOSA INTESTINALEFENOLO E ACIDO SOLFORICO

LE SOSTANZE SONO PIU ’ SOLUBILI DEI FENOLI E QUINDIPIU ’ FACILMENTE ELIMINABILI

COME I GLUCURONIDI POSSO ESSERE RIPRISTINATIO NEL FEGATO O NELLA VESCICA

TRASFORMAZIONI METABOLICHE CONAUMENTO DELLA TOSSICITA’

METABOLIZZAZIONE DEI VELENI CON FORMAZIONEDI COMPOSTI PIU ’ TOSSICI O PER DEGRADAZIONE

DEL COMPOSTO O PER COMBINAZIONE CONSOSTANZE PRODOTTE NELL’ORGANISMO

(SINTESI LETALE)

CCl4,

FLUOROACETATOETIONINA

RETICOLO ENDOPLASMATICO RUGOSO (RER)

SISTEMA DI SACCHI APPIATTITI MEMBRANOSI (CISTERNE)

RIBOSOMI SUL LATO CITOSOLICO DELLA MEMBRANA

• Sintesi di proteine integrali di membrana;

proteine localizzate all’interno dei sistemi di endomembrane quali:

reticolo endoplasmatico, Golgi, lisosomi, endosomi, vescicole e vacuoli;

proteine destinate alla secerzione

•Glicosilazione delle proteine (fase iniziale)

• Corretto ripiegamento proteine e assemblaggio proteine multimeriche,

controllo della qualità delle proteine.

•Numerose altre attività enzimatiche

LE PROTEINE SINTETIZZATE DEVONOPOI PASSARE LA MEMBRANA DELL’ORGANULO BERSAGLIO:

TIPI DI TRASPORTO

TRASLOCATORI PROTEICI(mitocondri, reticolo endoplasmatico,

perossisomi)

PORI NUCLEARI(nucleo)

TRASPORTO VESCICOLARE(Golgi, membrana, lisosomi,

spazio extracellulare)

SINTESI DI PROTEINE INTEGRALI DI MEMBRANAPROTEINE DEI SISTEMI DI ENDOMEMBRANE

PROTEINE DI SECREZIONE

IN UNA CELLULA EUCARIOTE VENGONO SINTETIZZATE OLTRE 10.000 PROTEINE DIVERSE, CIASCUNA DELLE QUALI DEVE RAGGIUNGERE LA PROPRIA CORRETTA

DESTINAZIONE.

ANOMALIE NELLO SMISTAMENTO DELLE PROTEINE SONO ALLA BASE DI IMPORTANTI PATOLOGIE UMANE

Le proteine vengono sintetizzate, utilizzando le informazioni degli RNA messaggeri, sia a livello dei ribosomi liberi (che si trovano nel citoplasma) sia a livello dei ribosomi associati alle membrane (reticolo endoplasmatico rugoso).

Le proteine vengono sintetizzate, utilizzando le informazioni degli RNA messaggeri, sia a livello dei ribosomi liberi (che si trovano nel citoplasma) sia a livello dei ribosomi associati alle membrane (reticolo endoplasmatico rugoso).

RIBOSOMI LIBERI:• Proteine che rimangono nel citosol

(glicolisi, citoscheletro)

• Nucleo

• Mitocondri

• Perossisomi

RIBOSOMI ASSOCIATI AL RE• Proteine di membrana

• Proteine secretorie

• Proteine di organelli: Golgi, lisosomi,endosomi, vacuoli

Ribosomi liberi

Ribosomi associati al

reticolo endoplasmatico

La destinazione di queste proteine è differente a seconda di dove sono state prodotte

La destinazione di queste proteine è differente a seconda di dove sono state prodotte

Ribosomi liberi e legati alle membrane

• Gli stessi ribosomi ciclano tra poliribosomi liberi e di membrana.

• Come fanno le cellule ad identificare le due classi di proteine e ad

identificare i loro siti di sintesi?

• Grazie a segnali di indirizzamento

SEGNALI DI INDIRIZZAMENTO:sequenze e segnali di idrofobicità-carica

IL DESTINO DI OGNI PROTEINA È CONTROLLATO DALLA SUA COMPOSIZIONE IN AMINOACIDI

ALCUNI SEGNALI ENTRANO IN FUNZIONE QUANDO LA PROTEINA È COMPLETATA,

ALTRI AGISCONO GIÀ DURANTE LA SINTESI

PROTEINE INGEGNERIZZATE IN MODO TALE DA INSERIRE SEQUENZE SEGNALE ANOMALE, SARANNO

SMISTATE IN SEDI ANOMALE

LE SEQUENZE SEGNALE SONO NECESSARIE E SUFFICIENTI PER DETERMINARE IL DESTINO DI UNA

PROTEINA

SI POSSONO DISTINGUERE DUE PERCORSI PRINCIPALI

•LA VIA SECRETORIA

•LA VIA CITOPLASMATICA

VIA SECRETORIA:

LO SMISTAMENTO INIZIA

DURANTE LA TRADUZIONE

VIA CITOPLASMATICA:

LO SMISTAMENTO INIZIA DOPO IL

COMPLETAMENTO DELLA TRADUZIONE

LA VIA SECRETORIA, O VESCICOLARE, INTERESSA PROTEINE DESTINATE:

•AD ESSERE SECRETE DALLA CELLULA

•A FAR PARTE COME PROTEINE INTRINSECHE DELLE MEMBRANE

•PROTEINE SOLUBILI CHE RISIEDONO ALL’INTERNO DEL DEI COMPARTIMENTI DEL

SISTEMA DI ENDOMEMBRANE CHE INCLUDONO RE, COPLESSO DI GOLGI, LISOSOMI, ENDOSOMI, VESCICOLE E

VACUOLI VEGETALI.

LA VIA CITOPLASMATICA INTERESSA PROTEINE DESTINATE:

•A RIMANERE NEL CITOSOL (ENZIMI GLICOLITICI)

•PROTEINE PERIFIERICHE DELLA SUPERFICIE INTERNA DELLA MEMBRANA

•PROTEINE CHE SONO TRASPORTATE NEL NUCLEO

•PROTEINE DESTINATA E PEROSSISOMI, MITOCONDRI, CLOROPLASTI

LA VIA SECRETORIA: IPOTESI DEL SEGNALE:

PRESENZA DI UN CODICE DI INDIRIZZO A LIVELLO DELLE PROTEINE. BLOBEL 1999: PREMIO NOBEL PER LA

MEDICINA

SEGNALE N-TERMINALE COSTITUITO 16-30 AMINOACIDI CON

UN GRUPPO DI 6-12 AMINOACIDI IDROFOBICI, SPESSO PRECEDUTO

DA UNO O PIÙ AMINOACIDI A CARICA POSITIVA. TALE SEQUENZA

PUO’ ESSERE ANCHE INTERNA E NON APPENA ESCE DAL RIBOSOMA NE INNESCA L’ATTACCO AL RE ED

IL MOVIMENTO DEL PEPTIDE NASCENTE ALL’INTERNO DELLE

CISTERNE, ATTRAVERSOUN CANALE ACQUOSO PROTEICO

DELLA MEMBRANA

• La sequenza segnale porta il ribosoma al traslocatore• Il segnale è poi tagliato

L’indirizzamento è CO-TRADUZIONALE.

La sequenza N-terminale è riconosciuta: da un complesso proteico NAC (Nascent Associated Complex)

che le protegge da altre possibili interazioni

da un complesso ribonucleico particella SRP (particella di riconoscimento del segnale) cosituita da una molecola di RNA (7S) e da sei proteine diverse. SRP lega un recettore per SRP

presente sulla membrana del RE

• Il legame di SRP alla sequenza segnale induce una pausa nella sintesi, per facilitare l’interazione con il recettore.

• SPR lega la sequenza segnale ed anche SPR receptor sulla membrana ER

• Il ribosoma viene quindi posizionato a livello del traslocone

Ribosoma legato la traslocone

• Il poro del traslocone ed il tunnel del ribosoma si allineano: il peptide è traslocato attraverso l’anello del poro nel lume del RE.

• Terminata la sintesi il ribosoma è rilasciato ed il canale si chiude

Le tappe sopra descritte sono regolate dal legame e dall’idrolisi del GTP:

Sia SRP che il suo recettore sono proteine G

Sintesi di una proteina solubile

• Il poro del traslocatore si apre dopo il legame con la leader sequence.

• Dopo la traslocazione il poro si chiude ed il traslocatore si apre

lateralmente e rilascia il peptide segnale

NON APPENA IL POLIPEPTIDE NASCENTE ENTRA NELLECISTERNE DEL RE, SI TROVA AD INTERAGIRE CON UNA

MOLTITUDINE DI ENZIMI LOCALIZZATI SULLA PARTE E NEL LUME

LA PEPTIDASI DEL SEGNALE (PROTEINA INTEGRALE LOCALIZZATA IN PROSSIMITA’ DEL TRASLOCONE ) RIMUOVE LA PORZIONE N-TERMINALE

CONTENENTE LA SEQUENZA SEGNALE

LA OLIGOSACCARILTRANSFERSI (PROTEINA INTEGRALE LOCALIZZATA IN PROSSIMITA’ DEL TRASLOCONE ) ,

AGGIUNGE CARBOIDRATI

NEL LUME SONO PRESENTI ANCHE PROTEINE CHAPRON CHE CONSENTONO IL CORRETTO RIPIEGAMENTO

SONO PRESENTI ANCHE DISOLFUROISOMERASI CHE CATALIZZANO LA FORMAZIONE DI PONTI DISOLFURO

FRA I RESIDUI DI CISTEINA. DI FONDAMENTALE IMPORTANZA PER LA STABILITA’ DELLE PROTEINE PRESENTI SULLA SUPERFICIE CELLULARE

EXTRACELLULARE O PER LE PROTEINE DI SECREZIONE

RETICOLO ENDOPLASMATICO : LA PORTA DI INGRESSO PER IL PERCORSO BIOSINTETICO DELLA CELLULA

Il reticolo endoplasmatico è il compartimento membranoso più esteso della cellula. Sulla sua membrana possono aderire molti ribosomi (13

milioni) negli epatociti. Rappresenta anche la sede di smistamento delle proteine

Destinate: al Golgi, ai lisosomi ed allo spazio extracellulare: viene considerato la porta di ingresso per il percorso biosintetico della cellula.

L’ambiente del lume favorisce il corretto ripiegamento e l’assemblaggio delle proteine e la divisione fra le proteine di

secrezione, le proteine lisosomiali e le altre proteine neosintetizzate.

La segregazione delle proteine neosintetizzate nel lume del RER, le sottrae dal citosol e consente che siano modificate e spedite verso la loro destinazione finale, sia fuori alla cellula

che all’interno degli organuli.

SINTESI DELLE PROTEINE INTEGRALI DI MEMBRANA

Le proteine integrali di membrana, tranne quelle dei mitocondri e dei cloroplasti, vengono sintetizzate sul RER. Queste proteine vengono

trasferite al RER co-traduzionalmente, con lo stesso meccanismo descritto per la sintesi delle proteine di secrezione, ma presentano due regioni:

la sequenza di inizio del trasferimento e la sequenza di arresto del trasferimento

la sequenza di inizio del trasferimento e la sequenza di arresto del trasferimento sono costituite da aa idrofobici

che, transitando nel traslocatore inducono un suo cambiamento conformazionale: quando il traslocone (a

forma di clessidra) incontra la sequenza Stop-transfer, si apre e rilascia la proteina

Orientamento della estremità

C-terminale• Le cariche elettriche intorno

al segmento transmembrana determinano la polarità della proteina. La presenza di residui aminoacidici carichi positivamente orienta la porzione verso il citosol : Il C-terminale può essere esterno o citosolico ed è il traslocone a determinarne il corretto orientamento

Proteine di membrana multipasso• Contengono numerose tratti idrofobici, contengono cioè diverse sequenze

alternate di inizio ed arresto del trasferimento. Le sequenze di inizio non vengono rimosse dalla peptidasi del segnale e rimangono inserite nel

doppio strato lipidico grazie alle loro caratteristiche idrofobiche.

TUTTE LE PROTEINE TRANSMEMBRANA, MONO E MULTIPASSO PRESENTI

NEL GOLGI, NEI LISOSOMI, NELLA MAMBRANA PLASMATICA, MA ANCHE QUELLE DEL LUME DEL GOLGI E DEI LISOSOMI, SEGUONO QUESTA VIA CHE INIZIA NEL RE E PROSEGUE AI

VARI COMPARTIMENTI ATTRAVERSO UN PROCESSO DI TRASFERIMENTO MEDIATO DA VESCICOLE.

QUANDO UNA MEMBRANA SI MUOVE DA UN COMPARTIMENTO ALL’ALTRO LA SUA COMPOSIZIONE VIENE

MODIFICATA AD OPERA DEGI ENZIMI IVI RESIDENTILA MAGGIOR PARTE DELLE PROTEINE DI MEMBRANA

DEL RE VIENE MODIFICATA DALL’ATTACCO COVALENTE DI UNA O PIU’ CATENE OLIGOSACCARDICHE

COSITUENDO COSI’ LE GLICOPROTEINE

BIOSINTESI DELLE MEMBRANE NEL RE

ASIMMETRIA DELLE MEMBRANE

L’ASIMMETRIA VIENE STABILITA INIZIALMENTE NEL RE QUANDOLIPIDI E PROTEINE VENGONO INCORPORATI IN MODO

DIVERSO NEI DUE STRATI

TALE ASIMMETRIA VIENE MANTENUTA QUANDO LA MEMBRANAPASSA DA UN COMPARTIMENTO ALL’ALTRO PER

GEMMAZIONE E PER FUSIONE

I COMPONENTI SITUATI SULLA SUPERFICIE CITOSOLICA DEL RE, SARANNO LOCALIZZATI SULLA SUP CITOSOLICA DELLE

VESCICOLE DI TRASPORTO, SULLA SUP CITOSOLICA DEL GOLGI,E SULLA SUPERFICIE INTERNA (CITOPLASMATICA) DELLA

MEMBRANA PLASMATICA.

LO STESSO PER I COMPONENTI DELLA PARTE LUMINALE DELLA MEMBRANA

SINTESI DEI LIPIDI DI MEMBRANA

LA MAGGIOR PARTE DEI LIPIDI E’ SINTETIZZATA NEL RE.

ECCEZIONI:

SLINGOMIELINE, GLICOLIPIDI: RE E POI GOLGI

ALCUNI LIPIDI DI MITOCONDRI E CLOROPLASTI: NELLA SEDE STESSA

GLI ENZIMI SONO LOCALIZZATI NELLA MEMBRANA DEL REI LIPIDI INTEGRATI NELLA PORZIONE CITOSOLICA DEL RE

VENGONO TRASPORTATI AL GOLGI ED ALLA MEMBRANA PLASMATICA.

NEL PERCORSO VENGONO MODIFICATI

LA MAGGIOR PARTE DELLE PROTEINE DI MEMBRANA DEL RE VIENE MODIFICATA DALL’ATTACCO COVALENTE DI UNA O PIU’

CATENE OLIGOSACCARDICHE COSITUENDO COSI’ LE GLICOPROTEINE

IMPORTANZA FUNZIONALE

IMPORTANZA NEL FOLDING

GLICAZIONE DELLE PROTEINE

GLICOSILAZIONE DELLE PROTEINE

• La maturazione delle proteine sintetizzate avviene preliminarmente nel RER e si completa nel Golgi, comprendendo una fase detta di glicosilazione

• la glicosilazione aggiunge catene laterali di carboidrati a specifici residui amminoacidici delle proteine

• esistono due tipi di glicosilazione:

• la glicosilazione legata ad azoto (N-glicosilazione)• la glicosilazione legata ad ossigeno ( O-glicosilazione)

Funzione della glicosilazione delle proteineLa glicosilazione avviene per più motivi. Innanzitutto perché una

proteina glicosilata raggiunge un folding corretto e, in questo modo, può esplicare la propria funzione.

Inoltre la glicosilazione protegge dall'attacco di proteasi ed aumenta la solubilità della molecola proteica che viene dunque stabilizzata in

tutti gli aspetti.

Infine il meccanismo glicosidico permette lo svolgimento del controllo di qualità

Il principio di riconoscimento avviene sulla base della presenza o meno di un particolare residuo di glucosio sulla struttura glicosidica.

La maggior parte delle proteine che vengono glicosilate, nelle cellule eucariotiche, sono destinate a diventare proteine di membrana: le catene di zuccheri vanno a formare infatti il

glicocalice che circonda il plasmalemma (membrana plasmatica).

La N-glicosilazione vede l'aggiunta di una catena glucidica standard a livello dell'atomo di azoto di una catena laterale di asparagina ad opera di

glucosiltransferasi. La N-glicosilazione ha inizio nel reticolo endoplasmatico rugoso a carico di

una catena peptidica ancora in corso di traduzione.

La prima fase consiste nel trasferimento di una catena di 14 zuccheri (2 di N-acetilglucosammina, 3 di glucosio e 9 di mannosio) ad un residuo laterale di

asparagina.

L'oligosaccaride è assemblato all'interno

del reticolo endoplasmatico a partire da singoli carboidrati, ed è trasferito da uno

speciale enzima (la glicosiltransferasi) da

una molecola di dolicolfosfato

(molecola incorporata nella membrana del RE) alla proteina,

come singolo elemento

I primi 7 zuccheri:5 mannosi e

2 residui di N Acetil Glucosamina

sono traferiti nel citosol.

Il dolico subisce flippaggio e ruotaall’interno del RE

Dove vengono aggiunti i restanti zuccheri:

4 mannosi e 3 glucosi.

Completato lo zucchero viene trasferito al residuo

di asparagina edIl dolicolo puo’ essere esportato sul versante

citosolico

Mutazioni che determinano la totale assenza della N-glicosilazione, causanola morte dell’embrione prima dell’impianto.

Mutazioni che determinano la parziale alterazione della N-glicosilazione, causanogravi disordini ereditari.

Negli organismi più evoluti l’oligosaccaride di base subisce una serie di modifiche nel RE come la rimozione di 2 glucosi.

Questo è un passaggio fondamentale nella vita della glicoproteina neosintetizzata,

che viene valutata da un sistema di controllo di qualità, prima di passare nel compartimento successivo della via biosintetica.

Ruolo della N- glycosilation nel folding

• Le glicoproteine con 1 Glu, si leganono ad una molecola chaperon: calnexina o calreticulina che rimuove il Glu e rilascia la proteina.

• Se la proteina non è ripiegata correttamente, viene riconosciuta da una glucosyl transferase (GT) che le glicosila

Il processo si ripete fino a quando la proteina non raggiunge il folding corretto.

Se la proteina non è in grado di raggiungere un folding corretto,viene distrutta

Le proteine misfolded vengono esportate attraverso un meccanismo di «traslocazione inversa» nel citoplasma

dove vengono degradate dai proteasomi

Struttura dei Proteasomi: Hsp60 chaperones

Sono costituite da 7 subunità polipeptidiche suddivise in due classi: alfa e beta, impilate le une sulle altre. Le

subunità centrali (beta), sono dotati di attività proteolitica.

La selezione delle proteine è basata sulla stabilità biologica della proteina stessa.

Ogni proteina possiede una longevità caratteristica :

alcune sopravvivono per minuti, altre per settimane.

Tutte , indipendentemente dal loro tempo di sopravvivenza, vengono degradate dai proteasomi.

La degradazione avviene previa marcatura con una piccola proteina altamente conservata:

l’ ubiquitina

Ubiquitina

La proteina poli-ubiquitinata si lega al cappuccio del proteasoma

La catena di ubiquitina viene rimossa ed

il polipeptide denaturato ad opera della subunità beta del

proteasomamediante l’energia fornita da

ATP

In certi casi le proteine misfolded si originano con velocità superiore rispetto a quella di esportazione nel citoplasma.

Si attiva la risposta UPR (Unfolded protein response)

Sensori proteici localizzati nel REmonitorizzano la concentrazione

delle misfolded.In condizioni normali i sensori sono

inattivi perché legati a chaperon (BiP)

un aumento della concentrazione di unfolded determina il reclutamento di BiP e la attivazione dei sensori che

dimerizzano e si auto fosforilano

innescando una serie di segnali come:

La regolazione di geni che codificano per:

chaperoni

proteine coinvolte nel trasporto delle misfolded fuori dal RE

ubiqutine

La fosforilazione di eIF2, fattore di inizio della sintesi

proteica, che si inattiva; determinando un rallentamento

nella sintesi proteica

Controllo di qualità della sintesi di proteine

Le proteine che hanno subito sia la glicosilazione che la prima modificazione vengono trasportate, tramite

vescicole, all'apparato del Golgi.

Qui subiscono una sequenza ordinata di importanti cambiamenti e smistate verso le loro destinazioni

definitive.

In questo modo la cellula può regolare il trasporto di proteine, lipidi e carboidrati di nuova sintesi anche

all’esterno (esocitosi).

Smistamento delle proteine dal RE al Golgi, lisosomi, membrana e spazio extracellulare

L’apparato di Golgi

E’ costituito da un insieme di cisterne appiattite, impilate le une sulle altre e a tratti

fenestrate. Ogni cisterna è formata di membrane simili a quelle del RE, disposte a delimitare uno spazio di circa 10nm, che si

allarga nelle regioni laterali (30-50nm).

Ogni pila può contenere da 3 a 20

cisterne.

L’apparato di Golgi è un organulo strutturalmente e funzionalmente polarizzato

La faccia cis è in genere rivolta verso il nucleo ed adiacente al RE; la faccia trans è rivolta verso la membrana plasmatica della cellula. La parte

intermedia costituisce le cisterne mediali

Il lato cis rappresenta la

faccia immatura

forma la rete cis del

Golgi:CGN

Il lato trans corrisponde alla faccia

matura

forma la rete trans del

Golgi:TGN

La polarità dell’apparato di Golgi

Nell’apparato di Golgi si distinguono tre compartimenti

diversi ciascuno dotato di specifici enzimi ed adibito ad una determinata fase della

elaborazione delle glicoproteine giunte dal RER.

I tre compartimenti sono detti cis, mediano e trans.

FUNZIONI DEL COMPLESSO DI GOLGI

• Completamento della glicosilazione delle

glicoproteine, iniziata nel RER

• Aggiunta di gruppi fosfato, solfato ed acidi grassi a

proteine provenienti dal RER

• Sintesi di molecole polisaccaridiche e di alcuni lipidi e

glicolipidi

• Produzione e smistamento degli enzimi lisosomali

La differenza fondamentale rispetto alla glicazione nel RE è la specificità.

Nel reticolo endoplasmatico la glicosilazione è un evento "seriale", che non varia al variare del substrato.

Nel Golgi ogni specifica proteina viene riconosciuta e modificata in base alla futura funzione.

Si possono verificare rimozioni o aggiunte di singoli zuccheri o di catene più lunghe.

La specificità delle singole catene glucidiche è il meccanismo utilizzato dalla cellula per lo smistamento delle proteine alle varie

sedi di destinazione (lisosomi, membrana, perossisomi).

Completamento della glicosilazione delle glicoproteine

iniziata nel RER

FUNZIONI DEL COMPLESSO DI GOLGI

Nel Golgi si completa la sintesi della componente oligosaccaridica delle glicoproteine, iniziata nel RER

O-glicosilazione

La O-glicosilazione è un processo altamente specifico, che non vede

l'aggiunta "seriale" di carboidrati alla proteina in processazione.

Si svolge completamente nell'apparato del Golgi, dove zuccheri vengono legati al peptide a livello dell'atomo di ossigeno delle

catene laterali di serina o treonina.

L'aggiunta riguarda un singolo carboidrato alla volta; solitamente il numero di zuccheri legati durante questo processo è limitato a

pochi residui.

Dal reticolo trans Golgi gemmano vescicole con destino diverso

Trasporto vescicolare• Il trasporto vescicolare usa gemmazione e fusione

di vescicole. I componenti solubili sono trasportati insieme a membrane

• La superficie delle vescicole è rivestita da uno strato proteico con due funzioni fondamentali:

• fungono da dispositivo meccanico per la formazione della vescicola

• cositiuiscono un meccanismo per la selezione del materiale da trasportare

• i rivestimenti proteici operano questa selezione in virtù della loro affinità specifica per le code

citosoliche delle protiene integrali della membrana donatrice

Sono state distinte diverse categorie di vescicole rivestitein base:

alle proteine che costituiscono il loro rivestimento,

al loro ruolo nel traffico cellulare

ed al loro aspetto in microscopia

I tre principali tipi di vescicole sono :

vescicole rivestite da COPII(spostano i materiali in avanti dal RE al Golgi)

vescicole rivestite da COPI(spostano il materiale in senso retrogrado dal Golgi al RE)

vescicole rivestite da CLATRINA(spostano il materiale dal TGN verso i lisosomi, gli

endosomi ed i vacuoli.Spostano i materiali anche dalla membrana plasmatica ai

compartimenti citoplasmatici lungo la via endocitoticae sono coinvolte nel traffico dagli endosomi ai lisosomi)

Le vescicole lisosomali che si staccano dal

RER sono vescicole rivestite di clatrina

Clatrina: complesso proteico a 3 braccia (triskelion) formato da tre polipeptidi più grandi (heavy) e da tre più piccoli (light) in grado di

polimerizzare e formare strutture esagonali a gabbia

LA FORMAZIONE ELLE VESCICOLE DERIVA DALLA POLIMERIZZAZIONE DELLA CLATRINA.CHE NECESSITA DELLA PRESENZA DI ALTRE MOLECOLE DI MEMBRANA:

ADAPTINE IN GRADO DI RICONOSCERE IL CARGO DA TRASFERIRE

LA POLIMERIZZAZIONE FA SOLLEVARE LA MEMBRANA ED ACCRESCERELA VESCICOLA CHE SI STACCA DALLA MEMBRANA MEDIANTE

L’INTERVENTO DI UNA PROTEINA LA DINAMINA.LE VESCICOLE MIGRANO NEL CITOSOL UTILIZZANDO ANCHE IL CITOSCHELETRO

E SI FONDONO CON LE MEMBRANE DEGLI ORGANULI BERSAGLIO

IL RICONOSCIMENTO DELL’ORGANULO BERSAGLIO E’ MEDIATO DALLEPROTEINE SNARE (SNAP Receptor) E DALLE GTPasi Rab

LE SNARE v-SNARE t-SNARE SONO PROTEINE FIBROSE ANCORATE ALLE MEMBRANE

CAPACI DI RCONOSCIMENTO RECIPROCO.

TALE RICONOSCIMENTODETERMINA L’AVVICINAMENTO DELLE DUE MEMBRANE E LA FUSIONE

SUCCESSIVA

LE GTPasi Rab SONO IMPLICATE SIA NEL TRASFERIMENTO DELLEVESCICOLE LUNGO I MICROTUBULI , CHE NEL RICONOSCIMENTO

DELLE SNARE

Il rivestimento di clatrina si disassembla, lasciando la vescicola nuda, ma dotata della sua vSNARE

La vSNAre riconosce la tSNARE specifica e determina l’attacco della vescicola sulla membrana bersaglio

Le SNARE, con il contributo di altre proteine, mediano la fusione delle due membrane e poi si liberano per un nuovo ciclo operativo

Le SNARE, oltre a fornire specificità nell’indirizzamento, contribuiscono anche alla fusione della membrana delle vescicole

con quella del bersaglio.

La specificità delle SNARE in una determinata vescicola sembra dipendere dal contenuto di questa o meglio dalle caratteristiche del

recettore di carico posto sulla sua membrana.

Fusione delle membrane

Dopo la fusione, le SNARE avvolte vengono separate ad opera di una proteina detta NSF che utilizza ATP.

Proteine accessorie intervengono per favorire la fusione dei foglietti lipidici.

Dal reticolo trans del Golgi originano i lisosomi

I lisosomi

Le proteine lisosomiali giungono a questo compartimento entrando inizialmente nel RE (grazie ad una sequenza di indirizzamento)

a livello del Golgi vengono etichettate per poter essere indirizzate ai lisosomi.

Questo indirizzamento è si basa sulla loro glicazione ad opera di un mannosio(fosforilato in posizione 6)

Il segnale mannoso-fosfato delle idrolasi lisosomali

Produzione e smistamento degli enzimi lisosomali

Nel compartimento cis il Golgi separa i futuri enzimi lisosomali dalle proteine destinate ad essere secrete

L’enzima GlcNAc fosfotransferasi riconosce specificamente le idrolasi lisosomali

Endocitosi

Pinocitosi

Fagocitosi

Endocitosi mediata da

recettori

L’endocitosi mediata da recettori costituisce una via d’accesso specifica nella cellula animale

LDL: low density lipoprotein. Rappresenta la forma di trasporto del colesterolo alle cellule

Difetti che alterano l’espressione o il funzionamento dei recettori di LDL sono alla base dell’aterosclerosi.

Endocitosi mediata da recettori nel ciclo della transferrina

GLI ENDOSOMI

Attraverso il processo endocitotico prendono origine gli endosomi che internalizzano i materiali dall’esterno

all’interno del citoplasma.

Il comparto endosomico funge da centrale di smistamento della via endocitotica diretta verso l’interno.

L’ambiente acido dell’endosoma induce molti recettori a liberarsi del loro bagaglio molecolare e ritornare nel loro

dominio di membrana.

Le molecole internalizzate negli endosomi sono prevalentemente destinate ai lisosomi per essere

digerite.

I materiali destinati alla degradazione arrivano al lisosoma seguendo vie diverse

Dal trans Golgi originano vescicole di esocitosi

I segnali possono essere di sequenza di zone

unite nella struttura

IL RITORNO AL RER

ALCUNE PROTEINE DAL GOLGI VENGONO

RIPORTATE AL RER CON UN TRASPORTO RETROGRADO

SI POSSONO DISTINGUERE DUE PERCORSI PRINCIPALI

•LA VIA SECRETORIA

•LA VIA CITOPLASMATICA

VIA CITOPLASMATICA:

LO SMISTAMENTO INIZIA DOPO IL

COMPLETAMENTO DELLA TRADUZIONE

ASSUNZIONE POST-TRADUZIONALE DI PROTEINE DA PARTE DI

MITOCONDRI

NUCLEO

PEROSSISOMI

CLOROPLASTI

SMISTAMENTO DELLE PROTEINE DAL CITOSOL AI MITOCONDRI

Mitocondri e plastidi hanno 2 membrane diverse interna ed esternaLe proteine sintetizzate nel citosol contengono una sequenza segnale amminoterminale “sequenza di indirizzamento ai mitocondri” che viene rimossa da una peptidasi del segnale, generando la proteina matura

Il trasferimento delle proteine richiede la presenza di complessi traslocatori TOM TIM dotati di una porzione di

riconoscimento della porzione di indirizzamemto della proteina e di una porzione che costituisce il vero canale idrofilo per il passaggio

della proteina

La sequenza segnale ha la conformazione di un’alfa elica con una

superficie basica

Trasporto nei mitocondri

• Il trasporto attraverso le due membrane avviene probabilmente nei contact sites

• Il rilascio delle Hsp70 citosoliche consuma ATP• Il trasferimento richiede pontenziale elettrochimico• Le Hsp70 mitocondriali consumano ATP

Il passaggio delle proteine può avvenire solo se la conformazione è mantenuta il più lineare possibile,

questo è reso possibile da molecole chaperon della famiglio delle Hsp70 citosoliche

Hsp70 guida l’importazione delle proteine

Trasporto mitocondriale: proteine di membrana

Trasporto nucleare

Una delle caratteristiche più peculiari della membrana nucleare è costituita dalla

presenza di aperture specializzate, chiamate

PORI NUCLEARI

TRASPORTO NUCLEARE

Ogni poro è costituito da un canale cilindrico che si estende attraverso le due membrane, permettendo la

comunicazione tra citosol e nucleoplasma.

Le due membrane sono fuse tra di loro a livello di ogni singolo poro

formando un canale tappezzato da una complicata struttura proteica ,

il COMPLESSO DEL PORO

Il complesso del poro nucleare ha un diametro di 80-100 nm.

Il complesso del poro (NPC) contiene più di 100 diversi tipi di subunità proteiche.

Le subunità assumono una organizzazione ottagonale, protrudono da entrambi i lati dell’involucro nucleare.

I NPC contengono al loro interno una struttura detta trasportatore, responsabile probabilmente del movimento delle macromolecole attraverso la membrana nucleare.

Altre proteine collegano le otto subunità , dette anche bracci.

Ci sono poi proteine che ancorano il NPC alle membrane ed altre che formano una specie di gabbia nel lato del nucleosoma

• NPC ha una struttura a tre anelli • Gli anelli sono coassiali e sono collegati alle

braccia radiali. Il poro centrale è all’interno

Trasporto nel complesso del poro

• Molecole <50 kDa diffondono liberamente.

• Le altre sono trasportate da recettori di importazione nucleare

L’ATTRAVERSAMENTO DEL COMPLESSO DEL PORO DA PARETEDI MOLECOLE CON MASSA SUPERIORE A 50kDa E’ MEDIATO

DALLA

SEQUENZA DI LOCALIZZAZIONE NUCLEARE (NLS):

brevi sequenze di aminoacidi carichi positivamente come lisina ed arginina

TALI SEQUENZE RICONOSCONO I RECETTORI DI IMPORTAZIONE NUCLEARE

CHE RICONOSCONO LE PROTEINE DEL COMPLESSO DEL PORO E TRASLOCANO L’INTERO COMPLESSO DAL CITOPLASMA AL NUCLEO:

I RECETTORI DILOCALIZZAZIONE NUCLEARE FUNGONO DA NAVETTE DI TRASPORTO

IL PROCESSO E’ MEDIATO DA PARTICOLARI PROTEINE G : LE PROTEINE Ran

CHE ACCOMPAGNANO IL COMPLESSO RECETTORE-CARGO DENTRO E FUORI DAL NUCLEO,

OSCILLANDO FRA UNO STATO ATTIVO NUCLEARE (LEGATO AL GTP)

ED UNO STATO INATTIVO, CITOPLASMATICO (LEGATO AL GDP)

Ran GTPase dirigono il trasporto ALCUNE MOLECOLE ENTRATE NEL NUCLEO NON VI RIMANGONO (PROTEINE CHE REGOLANO LA TRASCRIZIONE) MA PER ESSERE

INATTIVATE DEVONO ESSERE ESPORTATE SEQUENZE DI ESPORTZIONE NUCLEARE NES

SONO RICONOSCIUTE DA RECETTORI DI ESPORTAZIONE

Il legame con Ran-GTP induce il rilascio del cargo

Trasporto nei peroxisomi

• Il trasporto è guidato da una sequenza di 3 amino

acidi di solito at C-terminale