RAPPORTO MICRORGANISMO-OSPITE

1. COMMENSALISMO (MICROBIOTI)2. SIMBIOSI MUTUALISTICA

(MICROBIOTI)3. PARASSITISMO (PATOGENI)

POPOLAZIONI MICROBICHE DEL CORPO UMANO

Microrganismi normalmente residenti

MICROBIOTA=FLORA MICROBICA

Quantità di microrganismi presenti in ufc/ml, ufc/g,ufc/cm2

COLON

Stomaco e Duodeno

Digiuno e Ileo

MICROBIOTI DEL TRATTO GASTRO- INTESTINALE

500 SPECIE DIVERSE DI MICRORGANISMI

MICROBIOTI DEL TRATTO GASTRO- INTESTINALE: Fattori che influenzano la composizione del microbiota

VELOCITA’ DEL FLUSSO

PRESENZA DI OSSIGENO

pH

SOSTANZE ANTIMICROBICHE

DIETA

Microbioti del tratto G-I nell’uomo adulto (Log n. batteri/g contenuto) stomaco digiuno ileo colon

AEROBIEnterobatteri 0 – 2 0 – 3 2 – 6 4 – 10Streptococchi 0 – 3 0 – 4 2 – 6 5 – 10Stafilococchi 0 – 2 0 – 3 2 – 5 4 – 7Lattobacilli 0 – 3 0 – 4 2 – 5 6 – 10Miceti 0 – 2 0 – 2 2 – 3 2 – 6ANAEROBIBatteroidi rari 0 – 2 3 – 7 10 – 12Bifidobatteri rari 0 – 3 3 – 5 8 – 12Cocchi rari 0 – 3 2 – 5 8 – 11Clostridi rari rari 2 – 4 6 - 11

MICROBIOTI DEL TRATTO GASTRO- INTESTINALE: da dove vengono?

il microbiota intestinale deriva dall’interazione tra ospite e ambiente

Isolauri E. et al, 2004, BP &RCG, 18, 299-313

MICROBIOTI DEL TRATTO GASTRO- INTESTINALE: Specie più rappresentative

Bifidobatteri

- nel neonato il 90 % dei microbioti è rappresentato da Bifidobatteri;

- nell’individuo adulto i Bifidobatteri costituiscono solo il 50 %

E’ possibile suddividere i microbioti in tre gruppi in relazione al loro comportamento nei riguardi dell’ospite umano :-potenzialmente dannosi : Proteus, Staphylococcus, Clostridi, Veillonella, Prevotella, Candida-indifferenti o benefici: Bacteroides, batteri enterici, Enterococcus. -benefici : Lactobacillus, Eubacterium, Bifidobacterium

MICROBIOTI DEL TRATTO GASTRO- INTESTINALE: Rapporti con l’ospite

Bifidobatteri

Lattobacilli

Gram positivi,

Anaerobi obbligati

Gram positivi,Anaerobi facoltativi

FUNZIONI NUTRITIVE-METABOLICHE

Sintesi e produzioneMetabolizza

1- vitamine del gruppo B 1- acidi biliari

2- vitamina K 2- farmaci

3- acidi grassi a catena corta(BUTIRRATO, PROPIONATOACETATO)

MICROBIOTI DEL TRATTO GASTRO- INTESTINALE: Cosa fanno?

MICROBIOTI E SISTEMA IMMUNE

1- importante ruolo nello SVILUPPO e OMEOSTASI del sistema immunitario2- produzione di s-IgA 3- mantiene uno stato permanente di INFIAMMAZIONE FISIOLOGICA

MICROBIOTI DEL TRATTO GASTRO- INTESTINALE: Cosa fanno?

Antagonismo con potenziali patogeniMicrobioti Patogeni

MICROBIOTI DEL TRATTO GASTRO- INTESTINALE: Cosa fanno?

Antagonismo con potenziali patogeni

Antagonistic activities of lactobacilli and bifidobacteria against microbial pathogens Servin A.L. FEMS Microb. Review , 2004, 28, 405-440

Rapporto Ospite-Microbiota

VANTAGGI PER L’OSPITE

1. Vitamine e fattori nutrizionali

2. Antagonismo con potenziali patogeni

3. Stimolazione del sistema immunitario

VANTAGGI PER I MICROBIOTI

1. Disponibilità di nutrienti

2. Condizioni ambientali ottimali (temp., pH, O2, aw)

SIMBIOSI MUTUALISTICA

MICROBIOTI DEL TRATTO GASTRO- INTESTINALE: Cosa faremmo senza di essi? Come valutare il microbiota intestinale. Considerazioni sperimentali

•Studi condotti su animali germ-free (axenici)

MICROBIOTI DEL TRATTO GASTRO- INTESTINALE: Come valutareil microbiota intestinale. Considerazioni sperimentali

Colonie di E. coli in agar MC

La maggior parte delle specie batteriche del nostro microbiota intestinale sono scarsamente coltivabili in laboratorio

Metodi molecolari alternativi: 16S rRNA, PCR, FISH ecc.

MICROBIOTI DEL TRATTO GASTRO- INTESTINALE: Questioni aperte

•Gnotobioti

La funzione della maggior parte dei membri della comunità

microbica è sconosciuta

•Studio della comunità microbica nel suo complesso

•Interazioni tra i microbi e tra i microbi e l’ospite

•STRESS•ANTIBIOTICI•MALATTIE •BATTERI PATOGENI • VIRUS•DIETA

MICROBIOTI DEL TRATTO GASTRO- INTESTINALE: Fattori che modificano la composizione della comunità microbica

CONSEGUENZE di un alterato microbiota intestinale

1. funzioni fisiologiche alterate

2. cattivo assorbimento di nutrienti

3. indebolimento delle difese immunitarie

4. infezioni

5. diarrea o stipsi

Clostridium difficile

MICROBIOTI DEL TRATTO GASTRO- INTESTINALE: Cosa succede se si rivoltano contro l’ospite?

Batteri normalmente residenti Condizioni cliniche associate alla

flora microbica normale

PROBIOTICI

1882 - Metchinkoff Primi studi

alta concentrazione di LATTOBACILLI=

MAGGIORE SALUTE E LONGEVITÀ DELL’UOMO

1965 – Lilly e Stillwell Prima definizione:

“… è probiotico qualsiasi sostanza o microrganismo in grado di contribuire

all’equilibrio della flora batterica…”1998 – Salminen

“…PROBIOTICI come MICRORGANISMI vivipresenti nei cibi che hanno un effetto positivo sulla salute umana”

Using probiotics and prebiotics to improve gut health

Tuohy, K.M . et al Drug Discovery Today, 2003, 8 (15), 692-700

Batteri lattici- aggregato Lactobacillus acidophilus:

Lactobacillus gasseriLactobacillus crispatus

Lactobacillus amylovorusLactobacillus gallinarumLactobacillus johnsonii

- aggregato Lactobacillus casei:Lactobacillus paracasei

Lactobacillus rhamnosus- Lactobacillus reuteri

- Lactobacillus salivarius- Lactobacillus plantarum

- Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus- Streptococcus thermophilus

Bifidobatteri:- Bifidobacterium longum- Bifidobacterium bifidum- Bifidobacterium breve

- Bifidobacterium infantis- Bifidobacterium animalis

- Bifidobacterium lactis

Altri microrganismi:- Enterococcus faecium- Propionibacterium spp.

- Saccharomyces boulardi

acido e bile resistenza

sicurezza ed efficacia

difesa della mucosa intestinale;

antagonismo verso batteri patogeni

PROBIOTICI

Caratteristiche

Caratteristiche dei microrganismi probiotici

I microrganismi per essere considerati probiotici devono soddisfare i seguenti requisiti:

•essere di provenienza intestinale. I microrganismi probiotici devono essere normali componenti della microflora dell’intestino

umano in condizioni di salute;•essere assolutamente sicuri per l’impiego nell’uomo senza causare effetti collaterali specialmente in pazienti debilitati o

immunocompromessi;•essere attivi e vitali alle condizioni ambientali che sono presenti

a livello intestinale •essere resistenti ad un basso pH, al succo gastrico, alla bile ed al

succo pancreatico;•essere in grado quindi di persistere, almeno

temporaneamente,nell’intestino umano

Azione patogena dei batteri

Fattori di virulenza

1) Fattori di attacco2) Fattori di invasione e colonizzazione

3) Strategie per sfuggire ai meccanismi di difesadell’ospite

4) Danneggiamento dei tessuti

Rapporto Microrganismo –Ospite

Parassitismo

1) Penetrazione all’interno dell’ospite 2) colonizzazione dei tessuti dell’ospite 3) resistenza ai meccanismi di difesa 4) malattia

PATOGENICITA’ E VIRULENZAPATOGENICITA’ E

VIRULENZA

Malattia infettiva

E’ “LA RISULTANTE” TRA L’AZIONE PATOGENA DEL MICRORGANISMO E LA

RISPOSTA DIFENSIVA DELL’OSPITE

BATTERI ADESINE

Streptococcus pyogenes Proteina F

Streptococcus mutans Glicosil transferasi

Streptococcus salivarius Acidi Lipoteicoici

Streptococcus pneumoniae Proteine di superficie

Staphylococcus aureus Proteine di superficie

Neisseria gonorrhoeae Pili

E. coli Enterotossigeno Pili tipo I

E. Coli Uropatogeno Pili tipo I

Bordetella pertussis Pili

Vibrio cholerae Pili

Treponema pallidum Peptide della membrana esterna

Mycoplasma Proteina di membrana

Fattori di attacco dei batteri alle cellule dei tessuti ospite

Adesione dei batteri ai tessuti dell’ospite

Rapporto tra i batteri patogeni e le cellule dell’ospite

INVASINE BATTERI ATTIVITA

Ialuronidasi Streptococci, staphylococci e clostridi Ac.ialuronico

Collagenasi Clostridium Collagene

Neuraminidasi Vibrio cholerae e Shigella dysenteriae Acido neuraminico

Coagulasi Staphylococcus aureus Fibrinogeno/Fibrina

Chinasi Staphylococci e streptococci Plasminogeno/Plasmina

Leucocidine Staphylococcus aureus Antifagocitaria

Streptolisine Streptococcus pyogenes Antifagocitaria

Emolisine Streptococci, staphylococci e clostridia  Fosfolipasi

Lecitinasi Clostridium perfringens lecitine

Fosfolipasi Clostridium perfringens fosfolipidi

Fattori di invasione e colonizzazione

DIFESE COSTITUTIVE

Difese innate, non specifiche,

Pronte per l’uso

DIFESE COSTITUTIVE DELL’OSPITE

1. Barriere anatomiche,ecc.

2. Proteine, peptidi, enzimi antimicrobici

3. Risposta infiammatoria (Fagocitosi)

Fagociti professionalineutrofili

macrofagi

INGLOBARE E DISTRUGGERE I MICRORGANISMI

Fasi della fagocitosi

•RICONOSCIMENTO

•INGESTIONE E FORMAZIONE DEL

FAGOSOMA

•FORMAZIONE DEL FAGOLISOSOMA

•DIGESTIONE

Fase di riconoscimentoFase di riconoscimento

IgG FcR

CR

OPSONIZZAZIONE

OPSONIZZAZIONE

OPSONINA, IgG

Microbo invasore

Recettore FcR

Facilita il processo di riconoscimento

OPSON= SALSA

FRAMMENTO Fc

FAGOCITA

Respiratory BurstEsplosione respiratoria

2O2

- + H2O2

.OH + OH- + 1O2

Glucose +NADP+

G-6-P-dehydrogenase

Pentose-P

+ NADPH

NADPH + O2

Cytochrome b558

NADP++ O2

-

2O2

- + 2H+

Superoxide dismutase

H2O2 + 1O2

Produzione di radicali tossici dell’ossigeno

Esplosione respiratoriaEsplosione respiratoria

H2O2 + O2-2O2

- + 2H+

Superoxide dismutase

H2 O2 + Cl-

myeloperoxidaseOCl- + H2O

H2O + O2-2 H2 O2

catalase

2OCL- + H2O1O2

-+ Cl-+ H2O

Batteri

Caratteristiche delle esotossine

• Natura proteica

• Alto potere immunogeno

• Attività enzimatica

• Azione citotossica (specifica o ampia)

• Azione a “lungo raggio”

• E’ possibile ottenere dei tossoidi

AZIONE TOSSICA DEI BATTERI

TOSSINE

Cholera toxin(A-5B)

Diphtheria toxin (A/B)

Pertussis toxin (A-5B)

E. coli heat-labile toxin LT (A-5B)

E. coli heat stable toxin ST

Shiga toxin (A/5B)

Pseudomonas Exotoxin A (A/B)

Botulinum toxin (A/B)

Tetanus toxin(A/B)

Anthrax toxin LF (A2+B)

Bordetella pertussis AC toxin (A/B) and Bacillus anthracis

Tossina difterica

Prodotta da Corynebacterium diphtheriae

•Tossina di tipo A/B

•Pm 60KDa

•535 aminoacidi

Azione tossica

Interagisce con recettori cellulari

Meccanismo d’azione della tossina difterca

Inibizione della sintesi proteica della cellula ospite

Basi genetiche e molecolari dei fattori di virulenza

                                                                                                                                                                                                                                                                                         

Cromosoma principale

Plasmidi

Batteriofagi

Trasposoni

Fattori di virulenza

Evoluzione patogena dell’Escherichia coli

GENOMICA EVOLUTIVA

E. coli virulento

E. coli non virulento

DNA batterico

DNA batterico

1. Trasferimento genetico.

ConiugazioneTrasduzione

Trasformazione

2. Cambiament

o di virulenza.

Plasmidi

3. Malattie intestinali:

dovute ai geni per i fattori di virulenza

Adesine

Invasine

Enterotossine

Citotossine

Endotossina (LPS)

Endotossina o LPS

Attività tossica dei batteri

ENDOTOSSINE ESOTOSSINE

NATURA CHIMICALipopolisaccaride(mw =

10kDa)Proteine (mw = 50-

1000kDa)

Relazione con la cellula batterica

Parte della membrana esterna Estracellulare, diffusibile

Termoresistenza si no

ANTIGENICITA SI SI

FORMAZIONE DI TOSSOIDI

No SI

POTENZA Relativamente bassa (>100μg) Relativamente alta (1 μg)

SPECIFICITA bassa alta

ATTIVITAENZIMATICA

No solitamente

PIROGENICITA SI occasionalmente

Fattori di virulenza dello Staphylococcus aureus

Siti di infezione e malattie provocate da S. aureus

Staphylococcus aureus è un patogeno molto versatile

PATOGENICITA’ DI S.AUREUS

• Lo S. aureus è causa di lesioni superficiali della pelle quali:

• Impetigine• Ectima• Infezioni dei follicoli dei capelli• Infezione secondaria delle ferite della pelle • Sindrome di desquamazione cutanea da

stafilococco• Sindrome da shock tossico• Scarlattina da stafilococco

Inoltre lo S. aureus è in grado di determinare infezioni più gravi come:

polmonitemastiteflebite

meningiteinfezioni del tratto urinario

osteomieliteendocardite

Lo S. aureus è una causa importante di infezioni ospedaliere;

è anche causa di intossicazioni alimentari dovute al rilascio di enterotossine negli alimenti.

TOSSINE PRODOTTE DA S.AUREUS-tossina: shock settico

β, -tossina: ruolo sconosciuto

-tossina e leucocidina: la prima emolitica, la seconda necrotica

Enterotossine: emesi

TSST-1: shock tossico

ET: sindrome da desquamazione cutanea

Esotossine batteriche

FOLLICOLITE

Colonizzazione: adesine Invasione: Invasine: stafilochinasi

Altri enzimi (proteasi, lipasi, nucleasi, collagenasi, elastasi. ecc.) Resistenza alla fagocitosi: coagulasi, leucocidine

Resistenza alla risposta immune: coagulasi Azione tossica: tossine citotossiche (emolisina e leucocidine)

POLMONITE Colonizzzione: adesine

Invasione: Invasine: stafilochinasi, ialuronidasi

Altri enzimi (proteasi, lipasi, nucleasi, collagenasi, elastasi. ecc.) Resistenza alla fagocitosi: coagulasi, leucocidina, emolisina, carotenoidi,

superossido-dismutasi, catalasi, crescita a basso pH Resistenza alla resposta immune: coagulasi, variazione antigenica

Azione tossica: Tossine citotossiche (emolisine e leucocidine)

POSSIBILI FATTORI DI VIRULENZA ESPRESSI DURANTE LA PATOGENESI DI ALCUNE INFEZIONI DI Staphylococcus aureus

I POSTULATI DI KOCH

• Alcuni microrganismi patogeni non sono coltivabili• Poiché alcuni patogeni crescono solo in un ospite umano, il

loro studio richiederebbe la sperimentazione sull’uomo• Alcune specie commensali possono avere un ruolo patogeno• ….• …..

Critiche

Chiave molecolare 1. L’inattivazione dei gene o dei geni sospettati del carattere

di virulenza deve fare diminuire la virulenza in modo sostanziale

2. La sostituzione del gene mutato con il gene originario ripristina la virulenza

3. Il gene /i geni per il fattore/fattori di virulenza deve essere espresso durante la patogenesi

4. Gli anticorpi diretti contro il prodotto del gene hanno un’azione protettiva

DIFESA SPECIFICA

CARATTERISTICHE DEL SISTEMA IMMUNITARIO

1.SPECIFICITA’

2.MEMORIA

3.CAPACITA’ DI DISCRIMINARE TRA SELF E NON SELF

NON IMMEDIATAMENTE DISPONIBILE

SISTEMA IMMUNITARIO

Immunità umorale

Immunità cellulo-mediata

LINFOCITI B

LINFOCITI T

Sistema immunitario

Immunità umorale Immunità cellulo-mediata

Linfociti B Plasmacellule

ANTICORPI

Linfociti T

Regolazione

CITOTOSSICITA’

Produzione di Interleuchine

Caratteristiche degli antigeni

1.Alto peso molecolare ( proteine, zuccheri)

2.Complessità chimica

3.Non-self

Molecole o strutture microbiche con caratteristiche antigeniche:

LPS, flagelli, pili, peptidoglicano, capside, esotossine ecc.

Difesa costitutiva Difesa immunitaria

Caratteristiche della difesa costitutiva e della difesa

immunitaria

Caratteristiche della difesa costitutiva e della difesa

immunitaria

Nessuna memoria

Antigene independente

Immediatamente disponibile

Non specifico

Antigene dipendente

Periodo di adattamento

Specifico

Sviluppo di memoria immunitaria

Anatomia del sistema immunitario

Ruolo dei Macrofagi nella risposta immune

I macrofagi sono cellule APC (Antigen Presenting cell)

Macrofagi=APC cellule presentanti l’antigene

IMMUNITA’ CELLULO -MEDIATA

• Linfociti TH (CD4) • Linfociti Tc (CD8): Linfociti citotossici

• distruzione delle cellule infette

• rigetto trapianti• distruzione delle cellule

tumorali

TH1: ATTIVAZIONE DEI

MACROFAGI E DELLE CELLULE NATURAL KILLER

TH2: ATTIVAZIONE

IMMUNITA’ UMORALE

I linfociti T CD8-citotossici- possono interagire direttamente con l’antigene

LINFOCITI T CD8 CITOTOSSICI

ANTICORPIIMMUNITA’ UMORALE

Struttura degli anticorpi

• Catena leggera:– VL & CL

– Catena pesante– VH & CH1 - CH3

(o CH4) CH1

VL

CL

VH

CH2 CH3

Hinge Region

Carbohydrate

Disulfide bond

Regione cerniera

Classi delle Immunoglobuline

• IgG – catene pesanti Gamma

• IgM - catene pesanti Mu

• IgA - catene pesanti Alpha

• IgD - catene pesanti Delta

• IgE - catene pesanti Epsilon

Rapporto tra Struttura/Funzionenegli anticorpi

Fab sito di legame per l’antigene

Sito di legame del

ComplementoSito di legame per i recettori del

frammento Fc Frammento FC

Risposta primaria

Risposta secondaria

Sistema del complemento

Complesso MAC

Membrane Attack

Complex

Citotossicità cellula-mediata anticorpo dipendente ADCC

Superantigene prodotto da S.aureus

Stimolazione incontrollata dei linfocitiT

IMMUNIZZAZIONE

ATTIVA

IMMUNIZZAZIONE

PASSIVA

naturale

artificiale

naturale

artificiale

naturale