PIANTE TRANSGENICHE

PRODUZIONE di PIANTE TRANSGENICHE

IMPORTANTE caratteristica delle cellule vegetali: TOTIPOTENZAQuesta caratteristica è alla base della possibilità di creare piante transgeniche

la possibilità di rigenerare un’intera pianta da singole cellule differenziate

in vitro è possibile ri-generare un organismo vegetale variando il rapporto di auxina e citochinina (ormoni vegetali che regolano

proliferazione e differenziamento)

•CALLI :ammassi cellulari sdifferenziati propagabili in vitro all'infinito.

•GERMOGLI•RADICI

Foglia sterilizzata

Auxina/Citochina

Auxina/Citochina

Auxina/CitochinaRADICI

GERMOGLI

CALLO

RIGENERAZIONE DI PIANTE IN VITRO

RIGENERAZIONE DI PIANTE IN VITRO

Auxina/CitochinaAuxina/Citochina

germogliradici

PRODUZIONE di PIANTE TRANSGENICHE

1)Agrobacterium tumefaciens2)Bombardamento

Agrobacterium tumefaciens Batterio del suolo Gram-

Fitopatogeno che trasforma geneticamente le piante colpiteCOLPISCE LE DICOTILEDONI (vite, rose, piante frutto carnoso e seme legnoso)

Agrobacterium tumefaciens

Plasmide Ti (induttore del Tumore)Contiene il T-DNA (transfer DNA)

T-DNA 12-24Kb

Il batterio è attirato da compostifenolici escreti dalla ferita della piante

Agrobacterium tumefaciens Il batterio è attirato da composti

fenolici escreti dalla ferita della piante

Queste sostanze ATTIVANO i geni VIR (7/8) del plasmide TiL’attivazione dei geni VIR è necessaria per l’integrazione nel DNA della pianta

T-DNA è trasferito come molecola lineare a singolo filamento con meccanismo simile a coniugazione batterica

Le regioni ripetute alle estremità (25bp) IMPORTANTIper meccanismo di taglio e integrazione

PRIMA: si attivano i geni VIR importanti per trasferimento T-DNADOPO: si attivano i geni del T-DNA AUXINA-CITOCHINA-OPINA

Fonte di Carbonio utilizzabile solo da A.t.

Agrobacterium tumefaciens per produzione di PIANTE TRANSGENICHE

Svantaggi:

1)Auxine/Citochine prodotte dal T-DNA impediscono corretta rigenerazione della pianta2)Produzione dell’Opina non è utile per la pianta (dannosa?)3)Plasmidi Ti sono grandi (200-800Kb)4)Plasmidi Ti non hanno ORI

Agrobacterium tumefaciens per produzione di PIANTE TRANSGENICHE

2 METODI

Neomicina trasferasiResistenza alla Kanamicina

Per amplificare il plasmidein E.Coli

1) VETTORE BINARIO

No geni VIR

Aiuta il trasferimento del T-DNA del VETTORE BINARIO

geni VIR

Agrobacterium tumefaciens per produzione di PIANTE TRANSGENICHE

2) VETTORE COINTEGRATO

RICOMBINAZIONE

1) VETTORE BINARIO 2) VETTORE COINTEGRATO

Agrobacterium tumefaciens per produzione

di PIANTE TRANSGENICHE

DICOTILEDONI MONOCOTILEDONI

Alcuni protocolli elaborati hanno permessol’utilizzo di A.tumefaciens anche in mais e riso

• Trasformazione mediata da microproiettili rivestiti da DNA• Utilizzato per saggi RAPIDI• BASSA frequenza di integrazione stabile ed ereditabile del DNA nel genoma della pianta• Possibilità di inserzioni MULTIPLE

BombardamentoUtilizzato per la maggior parte delle Monocotiledoni

Utilizzato per inserire DNA in:

•Monocotiledoni•Sospensioni di cellule vegetali

•Colture di callo•Embrioni immaturi

•Polline di molte piante•Mitocondri e cloroplasti

Bombardamento

Particelle d’oro o tungsteno,ricoperte da DNA (precipitato con CaCl2/spermidina) sonoaccelerate a 300-600 m/s con un “cannone da particelle” (polvere da sparo, elio, aria compressa)

A questa velocità il DNA supera la parete vegetale e penetra nel NUCLEOIl DNA si integra nel genoma mediante meccanismi non noti

Agrobacterium e Bombardamento

Introduzione del DNAsolo nel NUCLEO

Introduzione del DNAanche in cloroplasto/mitocondrio

Infetta soloDICOTILEDONI

InfettaMONOCOTILEDONI

DICOTILEDONIEMBRIONI

etc

ALTRI METODI

ORGANISMO MODELLO: Arabidopsis Thaliana

L’ Arabidopsis thaliana è un ottimo ORGANISMO MODELLO:

Le piccole dimensioni

Il breve ciclo vitale

Il piccolo genoma (più piccolo tra tutte le piante 125 Mb)

L’ Arabidopsis thaliana è un ottimo ORGANISMO MODELLO:

Facilità nel divenire transgenica

Notevole disponibilità di mutanti

Elevata produzione di semi (1 pianta: 10.000 semi)

d:0,5mm

Utilizzo di GENI REPORTER nelle cellule vegetali trasformate

Importante poter rilevare se la trasformazione è avvenuta

GFP: Green Fluorescent protein

LUCIFERASI

GUS: -D-glucuronidasi

GUS: -D-glucuronidasida E.coli

GENE reporter uidA codifica per GUS

Numerosi glucorinidi possono essere usati come substrato della reazione enzimatica:

•Colorazione istochimica: X-Gluc•Saggi spettrofotometrici: il p-nitrofenil β-D-glucuronide •Saggi fluorimetrici: il 4-metilumbelliferil-beta-D-glucuronide

Studio dei PROMOTORI/ENHANCER(promoter trap/enhancer trap)

Neomicina trasferasiResistenza alla Kanamicina/G418

Per amplificare il plasmidein E.Coli

PROMOTOREassente/PROMOTOREminimo

Gene REPORTER

ENHANCER TRAP (GUS)

ENHANCER TRAP (GFP)

GAL4/GFP-ENHANCER TRAP

COLLEZIONE di ArabidopsisGAL4/GFP-ENHANCER TRAP

T1-T6 lunedi 10/05 ora:16-18T7-T12 giovedi 13/05 ora:16-18

D1-D6 lunedi 17/05 ora:16-18D7-D11-P4 giovedi 20/05 ora: 16-18

P1-P7 lunedi 24/05 ora: 16-18P8-P14 giovedi 27/05 ora: 16-18