Post on 12-Jul-2015
Le micotossine nella
filiera vitivinicola
Prof. Ornella Pastoris
Università degli Studi di Pavia
Centro Riccagioia
Torrazza Coste, 27 marzo 2013
Micotossine
I funghi filamentosi microscopici, comunemente noti
come muffe, possono svilupparsi su una grande
quantità di derrate alimentari ed in particolari
condizioni ambientali e di conservazione
In particolari condizioni di
squilibrio nutrizionale la muffa può
attivare vie metaboliche
secondarie che portano alla
formazione di micotossine
Alimento con muffapotrebbe non contenere micotossine
Alimento integro potrebbe contenere micotossine
Funghi patogeni nell’uva
Erysiphe necator
Plasmopara viticola
Alternaria spp
Aspergillus spp
Botrytis cinerea
Cladosporium spp
Penicillium spp
Rhizopus spp
A. flavus e A. parasiticus aflatossine
ritrovate nell’uva solo occasionalmente
Micotossine nell’uva
Ocratossina A
Fumonisine
Ocratossina A (OTA)
• Comunemente presente in cereali, uva, caffè, spezie, cacao
• Individuata nell’uva e nel vino per la prima volta nel 1996
• Prodotta da Aspergillus spp. e Penicillium spp.
• Nei cereali i principali produttori sono P. verrucosum e A. ochraceus
Ocratossina A (OTA)
• Nell’uva l’OTA viene prodotta principalmente da A. niger e da A. carbonarius
• 70-100% dei ceppi di A. carbonarius e 2-20% di A. niger che contaminano l’uva sono produttori di OTA
• Gli Aspergilli in vitro degradano l’OTA prodotta ricavando una serie di composti che probabilmente favoriscono la crescita del fungo
• OTA può essere presente anche se non si rileva la presenza di specie ocratossigene
• La presenza di muffe sull’acino non implica contaminazione da OTA
Ocratossina A (OTA)
Il problema della
contaminazione del vino
nasce nelle vigne
Durante la lavorazione
l’alcol inibisce la
formazione di micotossine
L’OTA è prodotta principalmente quando A. carbonarius
infetta gli acini prima del raccolto
Effetti di OTA sulla salute
• Nefrotossica (danni dipendenti da dose ed esposizione)
• Immunotossica
• Teratogena
• Cancerogena (gruppo 2B, IARC 1993)
Lunga emivita
Maiale: 70-120 ore
Pollo: 4 ore
Uomo: 840 ore
Presente anche in prodotti
di origine animale destinati
all’alimentazione umana
TWI
120 ng/kg di peso corporeo (Efsa, 2006)
Livelli di esposizione
15-60 ng/kg di peso
corporeo alla settimana
OTA nell’uva e nel vino
• Clima (temperatura e umidità)
• Zona geografica (latitudine)
• Annata di produzione
• Fattori legati alla vinificazione
La presenza di OTA nell’uva e
nel vino è influenzata da
numerosi fattori:
Livelli massimi di OTA ammessi in
succo d’uva, mosto e vino
2 µg/kg (Regolamento CE n. 123/2005)
Effetto del clima
Temperatura ed umidità sono fattori fondamentali che
influenzano la crescita fungina e la produzione di micotossine:
la conoscenza di come tali fattori possono favorire la
produzione di OTA è di grandissima importanza per poter
prevedere e quindi prevenire eventuali contaminazioni
Condizioni ottimali di crescita fungina
Specie T aw
A. carbonarius 30°C 0.97
A. niger 35°C 0.98
Leong et al., Int J Food Microbiol. 2006; 110: 209-216
Effetto della temperatura
Leong et al., Int J Food Microbiol. 2006; 110: 209-216
La temperatura ottimale per la produzione di OTA è di 15-20°C
Effetto dell’umidità
Leong et al., Int J Food Microbiol 2006; 110: 209-216
I valori ottimali di aw per la produzione di OTA sono
molto simili a quelli che favoriscono la crescita fungina
Effetto della latitudine
I vini dei Paesi più meridionali sono in genere più
contaminati come conseguenza del clima più caldo e secco
Valero et al., Food Chemistry 2008; 108: 593–599
CII 15% > 2µg/l
CIII 27% > 2µg/l
Annata di produzione
L’annata – come conseguenza del clima e della presenza di fenomeni
metereologici – può influenzare la presenza di OTA nelle uve
Lucchetta et al., Toxins 2010; 2: 840-855
Lopez De Cerain et al., Food Addit Contam 2002; 11:1058–1064
Fattori legati alla coltivazione
Varietà di uva, grado di
maturazione, danni fisici agli
acini possono favorirne il
deterioramento e la crescita
di funghi ocratossigeni
La presenza di danni sulla
buccia dell’acino favorisce
la penetrazione del fungo
all’interno
Fattori legati alla coltivazione
La fase di maturazione e l’esposizione a raggi UV
influenzano il grado di contaminazione dell’uva
Leong et al., Int J Food Microbiol 2006; 111: S83-S87
Fattori legati alla coltivazione
La presenza di danni alla buccia degli acini
favorisce l’infezione da A. carbonarius
De Curtis et al., Int J Food Microbiol 2012; 159: 17-24
Fattori legati al tipo di vinificazione
Pur non essendoci differenze di contenuto di OTA tra
uva bianca e nera, il contenuto di micotossina nei
vini rossi è superiore rispetto agli altri vini
Brera et al., J Agric Food Chem 2008; 56: 10611–10618
Fattori legati al tipo di vinificazione
• Il processo di vinificazione può svolgere un ruolo
importante nel determinare il contenuto finale di
OTA nel vino
• È fondamentale conoscere i passaggi critici che
influenzano tale contaminazione allo scopo di poter
tener sotto controllo i livelli di OTA durante tutto il
processo di lavorazione
• La maggior parte dell’OTA originariamente presente
nell’uva rimane legata alle fecce e con esse viene
eliminata
Fattori legati al tipo di vinificazione
Livelli di OTA nel vino
Livelli di OTA negli
scarti di lavorazione
Fernandes et al., Am J Enol Vitic 2007; 58: 92-96
AF = Fermentazione alcolica
MLF = Fermentazione malolattica
Fattori legati al tipo di vinificazione
• In seguito alla pigiatura, quando le bucce rimangono
a contatto con il mosto, può esserci un aumento di
OTA, che poi diminuisce nei passaggi successivi
• Durante la macerazione
per la produzione dei vini
rossi il contatto tra bucce
e succo può determinare
un aumento di OTA in
quest’ultimo stimato
intorno al 20%
Fattori legati al tipo di vinificazione
Il processo di vinificazione porta ad una riduzione dei
livelli di OTA nel vino. Una ulteriore riduzione (fino al
17%) si può avere anche durante l’invecchiamento
Grazioli et al., Int J Food Microbiol 2006; 111: S93-S96
Fattori legati al tipo di vinificazione
I livelli di OTA variano anche in funzione della qualità
del vino, sebbene non ci sia correlazione tra il prezzo
ed il grado di contaminazione
Brera et al., J Agric Food Chem 2008; 56: 10611–10618
L’importanza della campionatura
• È fondamentale conoscere le zone
maggiormente soggette all’attacco dei
funghi ocratossigeni allo scopo di
effettuare una corretta campionatura
per verificare una eventuale
contaminazione prima della vendemmia
Raccogliere campioni a intervalli
regolari lungo un percorso
prestabilito
• Non c’è relazione tra il contenuto di OTA
e la posizione di un grappolo sul ramo o
la localizzazione della pianta nel vigneto
I risultati migliori si ottengono
campionando, in una posizione
predefinita, un grappolo per ogni
pianta da almeno dieci piante
Aspergillus spp nelle uve italiane
Le uve del nord sono complessivamente più contaminate (~82%)
A. carbonarius è virtualmente assente nei campioni provenienti dal
nord, mentre è presente (~10%) nelle uve del sud
Lucchetta et al., Toxins 2010; 2: 840-855
OTA nelle uve italiane
Il 30.4% dei campioni risulta contaminato con una considerevole
differenza legata all’area geografica di provenienza
Il 24% dei vini del sud Italia ha livelli di
OTA>0.02 µg/l, mentre il 4.5% supera il
limite imposto dalla CE di 2 µg/l
Lucchetta et al., Toxins 2010; 2: 840-855
Contaminazione delle uve italiane
• Non c’è una correlazione significativa tra la presenza di
Aspergilli totali e contaminazione da OTA
• Nelle regioni del nord e
del centro la presenza
di alti livelli di funghi
non necessariamente
implica la presenza
anche di OTA
• Esiste una correlazione
positiva tra presenza di
A. carbonarius e
contaminazione da OTA
OTA nei vini italiani
La regione di origine del vino, come conseguenza diretta
del diverso clima, influenza il contenuto di OTA
Brera et al., J Agric Food Chem 2008; 56: 10611–10618
OTA nei vini italiani
Piemonte
3 ng/l
Lombardia
15 ng/l
Triveneto
43 ng/l
Romagna 115 ng/l
Marche 25 ng/l
Abruzzo 195 ng/l
Puglia 1302 ng/l
Sicilia 1366 ng/l
Toscana 498 ng/l
Emilia 17 ng/l
Considerando solo i vini rossi
si crea un gradiente dei
livelli di OTA da nord a sud
lungo il versante adriatico
Pietri et al., Food Addit Contam 2001; 18: 647-654
Esposizione della popolazione italiana
Sebbene i cereali siano considerati la maggior fonte di esposizione
ad OTA, recenti studi hanno sottolineato l’importante contributo
apportato dal vino (in particolare dai vini rossi)
Miraglia e Brera, 2002
Esposizione della popolazione italiana
L’assunzione quotidiana di OTA con il vino varia considerevolmente a
seconda del consumo, del tipo di vino e dell’area geografica
Brera et al., J Agric Food Chem 2008; 56: 10611–10618
TDI = 17.1 ng/kg
Come minimizzare il rischio di contaminazione
Minimizzare il danno agli acini sulla vite è uno degli elementi
chiave per ridurre il rischio di contaminazione da OTA
• tenere sotto controllo gli eventuali danni agli acini causati
da funghi o da muffe patogene tramite l’utilizzo di fungicidi
• tenere sotto controllo i danni causati da insetti utilizzando
insetticidi
• sfruttare pergolati e la potatura in modo che i grappoli
abbiano una adeguata esposizione al sole, non rimangano
impigliati nei fili dei tralicci ed abbiano spazio a
disposizione
• controllare le tempistiche di irrigazione per ridurre il
rischio di rottura degli acini in caso di pioggia prima del
raccolto
Come minimizzare il rischio di contaminazione
• Strumenti che permettono di prevedere le regioni viticole a
rischio di contaminazione da OTA e che sfruttano modelli che
tengono conto delle temperature e delle precipitazioni stagionali
• Raccolta di campioni nei vigneti sa sottoporre ad analisi
microbiologiche
• Applicazione dei metodi di
controllo della contaminazione
da Aspergillus spp
Controllo chimico
(fungicidi)
Controllo biologico (lieviti,
agenti di biocontrollo)
Controllo chimico della produzione di OTA
I fungicidi possono sia ridurre che favorire (a seconda
anche della temperatura) l’infezione dell’uva da parte di
A. carbonarius
Bellì et al., Food Addit Contam 2006; 23: 1021-1029
Controllo chimico della produzione di OTA
I fungicidi che inibiscono le infezioni degli acini riducono
anche il contenuto di OTA nelle uve
Bellì et al., Food Addit Contam 2006; 23: 1021-1029
Trans-resveratrolo
• Il trans-resveratrolo (3,5,4-triidrostilbene) è un
composto antiossidante naturale che si accumula nelle
foglie e nella buccia degli acini in risposta a danni di
varia natura (infezioni fungine, radiazioni UV, danni
chimici…)
• Si può trovare anche nel vino in concentrazione
variabile in funzione dei processi viticoli ed enologici
• Ha proprietà di pesticida naturale
Trans-resveratrolo
Nei vini rossi esiste una correlazione positiva tra contenuto di OTA,
stilbeni totali e trans-resveratrolo, il che suggerisce che la produzione
di OTA stimoli la sintesi sia di stilbeni che di trans-resveratrolo
Perrone et al., J Agric Food Chem 2007; 55: 6807-6812
Svantaggi dei fungicidi
• Residui nell’uva dopo la
vendemmia e quindi possibile
presenza nel vino
• Potenziali effetti nocivi per la
salute
• L’uso persistente favorisce la
selezione di ceppi resistenti
Necessità di sviluppare metodi
di controllo alternativi
Controllo biologico della produzione di OTA
• Utilizza microrganismi (agenti
di biocontrollo) antagonisti dei
funghi patogeni e rappresenta
una buona e promettente
alternativa ai pesticidi
• Uno dei vantaggi è che gli
agenti di biocontrollo possono
essere impiegati insieme ai
pesticidi, riducendo quindi i
livelli di questi ultimi
necessari per tenere sotto
controllo la crescita fungina
I lieviti come agenti di biocontrollo
L’azione protettiva dei lieviti è influenzata da temperatura e umidità,
ma alle condizioni ideali si osserva una riduzione significativa della
crescita del fungo patogeno negli acini pretrattati
De Curtis et al., Int J Food Microbiol 2012; 159: 17-24
I lieviti come agenti di biocontrollo
I livelli di OTA negli acini pretrattati con lieviti
sono significativamente inferiori
De Curtis et al., Int J Food Microbiol 2012; 159: 17-24
I lieviti come agenti di biocontrollo
I livelli di OTA negli acini pretrattati con lieviti
sono significativamente inferiori
De Curtis et al., Int J Food Microbiol 2012; 159: 17-24
I lieviti come agenti di biocontrollo
L’azione degli agenti di biocontrollo è
maggiore se impiegati nella fase di
stoccaggio dei frutti, quando cioè le
condizioni di temperatura ed umidità
possono essere controllate in modo da
garantire la massima azione protettrice
L’applicazione degli agenti di
biocontrollo prima del raccolto
comunque favorisce la
colonizzazione della superficie del
frutto e delle lacerazioni della buccia
aumentando così l’efficacia durante
lo stoccaggio
I lieviti epifiti
• Sono i principali costituenti della flora microbica
che ricopre la superficie degli acini di uva
• Sono evolutivamente adattati a questa nicchia
ecologica
• Possono essere validi agenti di biocontrollo per
la loro capacità di colonizzare i grappoli di uva e
competere (per spazio e nutrienti) con i funghi
patogeni
• Possono sopravvivere e colonizzare gli acini
nelle vigne mantenendo l’equilibrio
dell’ambiente naturale
I lieviti epifiti
Portano ad una considerevole riduzione della crescita sia
di A. carbonarius che di A. niger sugli acini di uva
Bleve et al., Int J Food Microbiol 2006; 108: 204-209
Vantaggi degli agenti di biocontrollo
• Non influenzano le caratteristiche organolettiche
dell’uva
• Uno dei normali passaggi nella produzione del vino
consiste nell’aggiunta di anidride solforosa
(antiossidante, conservante e antisettico), che
porta anche alla neutralizzazione dei lieviti per
evitare che entrino in competizione con i lieviti
che vengono aggiunti nei processi di
fermentazione alcolica
• Con la svinatura si separa il vino dalle vinacce ed
altri elementi solidi comprendenti anche i residui
degli stessi lieviti
Interventi durante la vinificazione
I principali elementi che riducono i rischio di
contaminazione durante e dopo la raccolta:
• selezione dell’uva e raccolta in modo da
minimizzare i danni agli acini e ridurre la
perdita di succhi durante il trasporto
• rapido trasporto alla cantina
• conservazione a bassa temperatura dell’uva
raccolta
• corretta condotta igienica nella cantina
Interventi durante la vinificazione
Durante la fermentazione
alcolica l’OTA viene adsorbita
da mannoproteine presenti
sulla parete dei lieviti e quindi
“sottratta” al vino
Selezionare ceppi di lievito la
cui parete abbia una
composizione proteica che
garantisca elevata capacità di
adsorbire l’OTA
Agenti raffinanti (es. carbone vegetale) rimuovono l’OTA dal vino,
ma compromettono la qualità del prodotto finale
Agenti proteici (es. albumina) e la bentonite legano l’OTA, ma la
loro efficacia può dipendere dalla presenza di altre proteina
nell’uva
Interventi durante la vinificazione
In base alle norme generali di salvaguardia della salute e alle
direttive comunitarie, tutte le aziende del settore alimentare – e
quindi anche le cantine che producono vino – devono mettere a
punto dei sistemi di autocontrollo basati sulle norme HACCP
Individuare i punti critici di controllo, ossia quei passaggi della
lavorazione in cui il rischio di contaminazione è maggiore ed in cui
vanno quindi concentrate le analisi di controllo
Nei processi di vinificazione i punti critici di controllo per
monitorare i livelli di OTA sono la pigiatura e la fermentazione
alcolica. Al termine di questi passaggi è quindi buona norma
effettuare dei prelievi per opportune analisi
Fumonisine (FB)
• Micotossine cancerogene prodotte da Fusarium
Verticillioides e da altre Fusarium spp
• FB1, FB2 e FB3 sono cancerogene. FB2 è la più
citotossica
• FB2 è stata ritrovata in varie piante e prodotti di
origine vegetale, soprattutto nel mais e derivati,
nella birra e negli asparagi
• In Europa il limite massimo di FB totali ammesso
nei prodotti a base di mais è di 0.2-2 µg/g
Fumonisina B2 (FB2)
È prodotta anche da A. niger: l’80% dei ceppi noti produce FB2; il
17% produce OTA; il 10% produce FB2+OTA
A. niger produce anche FB4 ed
FB6, ma non FB1
Poiché A. niger infetta
frequentemente l’uva, il rischio
di contaminazione dei prodotti
vitivinicoli con FB è elevato
Problema recente
Ricerca PubMed
“ochratoxin A + wine” 222 articoli dal 1996
“fumonisin + wine” 16 articoli dal 2006
Frisvad et al., J Agric Food Chem 2007; 55: 9727-9732
FB2 nei vini italiani
In uno studio su 51 vini italiani è risultato che 9
(pari al 17.6%) contenevano FB2 (0.4-2.4 ng/ml)
200 ml
2.9 ng/kg
PMTDI = 2 µg/kg
Logrieco et al., Food Addit Contam 2010; 27: 1136-1141
Il vino, da solo, non rappresenta un rischio, ma insieme ad altre
fonti può contribuire al raggiungimento della PMTDI
70 kg
FB2 nei vini rossi
I vini rossi sono più contaminati dei vini bianchi,
mentre non c’è relazione tra contenuto di FB2 e
la regione di provenienza o l’annata del vino
Mogensen et al., J Agric Food Chem 2010; 58: 4853-4857
Conclusioni I
• La contaminazione da micotossine nel vino
rappresenta un rischio concreto
• L’OTA è presente maggiormente nei vini rossi delle
aree geografiche più meridionali
• L’esposizione ad OTA dovuta
al vino è molto inferiore alla
TDI, ma può comunque
contribuire al raggiungimento
di tale limite se si assumono
altri alimenti contaminati
Conclusioni II
• Esistono mezzi preventivi
e di controllo per
minimizzare il rischio di
presenza di OTA nei vini
• Recentemente è emerso
anche un ruolo delle FB2
nella contaminazione dei
prodotti vitivinicoli