Mutazioni Genomiche (n° Cromosomi # 46)

• Cromosomi Autosomici

• Cromosomi Sessuali

NON EREDITARIE

Mutazioni Cromosomiche (Alterazione Struttura Cromosomi)

• Traslocazioni

• Delezioni

EREDITARIE E NON EREDITARIE

MALATTIE GENETICHE

Mutazioni Geniche • Delezioni, Inserzioni, Mutazioni Puntiformi,

Espansione di Triplette )

Possono essere EREDITATE in modo :

• MENDELIANO:

singolo gene dominate/recessivo, cromosomi sessuali

• NON MENDELIANO:

Espansione triplette, mitocondriali

PATOLOGIA GENETICA

Studia i fenomeni patologici che riconoscono come causa

un’alterazione del genoma

Differenza tra:

• Malattie genetiche

• Malattie ereditarie

• Malattie congenite

Malattie genetiche: comprendono tutte quelle condizioni patologiche

a carico del patrimonio genetico (ereditarie e non)

Malattie ereditarie: Derivano dai genitori, sono trasmesse attraverso le cellule

germinali nelle diverse generazioni e sono quindi familiari

Non tutte le malattie ereditarie si manifestano al momento della

nascita (ex. Corea di Huntington)

Malattie congenite: significa “Nato con”. I sintomi sono riscontrabili

al momento della nascita. Non tutte le malattie congenite sono

ereditarie (ex. Sindrome di Down, raramente lo e’) oppure determinate

geneticamente (ex. Toxoplasmosi).

Derivano da fattori patogeni di natura fisica/chimica/biologica che

agendo durante la vita intrauterina inducono alterazioni organiche

• L’insorgenza di mutazioni é dovuta ad una interazione fra

componenti ambientali (esempio: radiazioni ionizzanti, raggi

UV, composti chimici) e una non perfetta efficienza dei sistemi

di riparazione dei danni al DNA

• Le mutazioni peró possono insorgere anche spontaneamente:

una classe di DNA polimerasi é detta “a bassa fedeltá” proprio

per la sua tendenza ad inserire errori: vi é pressione selettiva

per la riduzione, non per la scomparsa delle mutazioni

Mutazioni ed Evoluzione

NON TUTTE LE MUTAZIONI RISULTANO

ESSERE CAUSA DI MALATTIE…

HIV-1 e DCCR5

Meccanismo di Infezione da HIV-1

Il Recettore CCR5 (CD195)

• Localizzato sul cromosoma 3

• Recettore per le chemiochine RANTES, Mp1alfa e Mip1 beta

• Espresso su linfociti T, Macrofagi, cellule dendritiche e microgliali

• Esiste una mutazione D32 (32 nucleotidi) che produce una proteina

non capace di raggiungere la superficie cellulare

• L’allele D32 è comune nella popolazione Caucasica (frequeunza 10%)

ma quasi assente in Africa e Asia

• I portatori Omozigoti di questa mutazione non hanno CCR5

sulla superficie cellulare

• Sono resistenti all’infezione da HIV-1 (R5)

• Hanno un fenotipo normale

Individui Recanti la Mutazione D32 sono protetti

dall’Infezione HIV-1 (R5)

In 2008, Timothy Ray Brown got what scientist call a sterilizing cure. Brown was

diagnosed with HIV in 1995 and later, in 2006, was also diagnosed with acute myeloid

leukemia. In 2007 and 2008 Mr. Brown received two stem cell transplants from a single

donor with homozygous alleles for the delta-32 mutation. After the initial transplant, Mr

Brown stopped his antretroviral medication treatment, which three months later resulted

in the plummeting of his HIV infection levels and increased the number of CD4 T cells in

his blood. To this day, Mr. Brown is not using antiretroviral drugs and is considered cured

by the scientific community. This has lead other scientists to propose a similar mode of

action though the use of genetically engineered autologous cells to treat HIV by using

gene therapy.

In funzione dell’estensione della mutazione posso essere suddivise in:

1) Mutazioni genomiche (ANEUPLOIDIA): perdita o acquisto di interi

cromosomi (ex. Sindrome di Down)

2) Mutazioni cromosomiche (riarrangiamento di materiale genomico,

ex. traslocazioni)

Definite anche come: Aberrazioni Cromosomiche

3) Mutazioni Geniche

Malattie Genetiche

Aberrazioni Cromosomiche

1) Mutazioni genomiche (Aneuploidia)

2) Mutazioni cromosomiche (ex. Traslocazioni)

Trisomia: 2n+1

Monosomia: 2n-1

• A carico dei cromosomi autosomici sono rare

• Più frequenti a livello dei cromosomi sessuali

Mutazioni genomiche

Mutazioni genomiche

(Cause)

• Alterazione della meiosi durante la gametogenesi

• Alterazioni mitotiche durante le prime fasi dello sviluppo

(MOSAICISMO) (46,XY/47,XY,+21)

In entrambi i casi il fenomeno più frequente è di:

• NON DISGIUNZIONE (meiotica/mitotica)

Raramente SEGREGAZIONE (ritardo nella migrazione del cromosoma)

• NON-DISGIUNZIONE: incapacità dei cromatidi fratelli appaiati di separarsi la divisione meiotica. I due cromosomi o cromatidi congiunti migrano ad un polo e vengono inclusi in una sola cellula figlia, mentre l’altra avrà materiale genetico in meno

• RITARDO ANAFASICO: ritardata migrazione del cromosoma durante l’anafase, conseguente perdita del cromosoma. Mancata incorporazione di un cromosoma nel nucleo di una delle cellule figlie.

Meiosi: è un processo di divisione mediante il quale una cellula eucariotica

con corredo cromosomico diploide dà origine a quattro cellule con corredo

cromosomico aploide.

Aneuploidia per non disgiunzione Meiotica

Sindrome di Down: trisomia 21 (incidenza 1/700)

• causata prevalentemente da non disgiunzione meiotica, a carico

dell’ oocita

• aumenta con l’eta’ della madre (over 35 amniocentesi)

1/1550 sotto 20 anni, 1/25 sopra i 45 anni

• Più raramente (3-4% casi) causata da non disgiunzione mitotica in

una fase più o meno precoce dello zigote (Mosaicismo) con fenotipo

più lieve del precedente

Mutazioni genomiche (Cromosomi Autosomici)

• Traslocazione del braccio lungo del cromosoma 21 sul 14 (rara)

(QUESTA E’ EREDITARIA)

Sindrome di Down

La SD si associa sovente a complicanze malformative che

richiedono interventi chirurgici rilevanti nel corso dei primi anni

di vita:

• il 50% presenta malformazioni cardiache,

• il 30% stenosi duodenale,

• l’1% atresia esofagea,

• il 2% malformazioni anorettali.

• La chirurgia oftalmica è richiesta nel 12% dei casi per

problemi di cataratta.

Oltre alle malformazioni congenite descritte, il soggetto con SD

ha la tendenza a sviluppare patologie secondarie per deficit nel

sistema immunitario con particolare predisposizione ad

infezioni batteriche; nell’1% poi dei casi compare leucemia

acuta. Nel corso della vita il soggetto Down tende anche a

sviluppare ipotiroidismo e diabete mellito.

Sindrome di Down

Edwards Syndrome:

Trisomia 18 (1/6000).

La sindrome ha un tasso molto basso di

sopravvivenza, derivante da anomalie cardiache,

malformazioni renali e

altri problemi negli organi interni.

Mutazioni genomiche (Cromosomi Autosomici)

MANIFESTAZIONI

•Ritardo mentale

•Ipotonia/Ipertonia

•Alterazioni flessioni dita

•Vizi cardiaci

•Anormalita’ piedi

•Occipite prominente

Patau Syndrome:

trisomia 13 (1/15000)

common abnormalites include:

Nervous system Musculoskeletal

and cutaneous Urogenital

Mutazioni genomiche (Cromosomi Autosomici)

•Derivano quasi sempre da non disgiunzione meiotica nell’oocita.

• La probabilità Incrementa con l’età della madre

• A causa della severità del fenotipo, in entrambi i casi, la morte

sopraggiunge nel primo anno di età

MANIFESTAZIONI

•Ritardo mentale

•Microcefalia microftalmo

•Labbro leporino e palatoschisi

•Vizi cardiaci

•Anormalita’ piedi

•Polidattilia

Mutazioni genomiche (Cromosomi Sessuali)

Più numerose perchè meglio tollerate:

• inattivazione di tutti i cromosomi X in eccesso tranne uno

• scarsa quantità di informazione genica presente sul cromosoma Y

Tutte le malattie:

• Causano problemi di sviluppo sessuale e fertilità

• Sono normalmente evidenziabili durante la pubertà

• Possono essere associate a ritardo mentale

Mutazioni genomiche (Cromosomi Sessuali)

Lyonization: (Mary Frances Lyon 1961) solo uno dei due

cromosomi X rimane attivo (in modo casuale paterno/materno),

l’altro viene represso durante le prime fasi dell’embriogenesi e la

repressione persiste nella progenie. Le femmine hanno

mosaicismo derivante da cellule che hanno attivo il cromosoma X

da parte del padre o da parte della madre .

-Evidenziabile dal corpo di Barr nei nuclei in interfase (massa al lato

della membrana nucleare)

- Oggi si sa che non tutti i geni del X inattivo sono veramente inattivi

(ex. Sindrome di Turner femmine con un solo X) hanno severe

anomalie somatiche e sessuali

XIC (X inactivation center) contains four non-translated RNA

genes, Xist, Tsix, Jpx and Ftx,

XIST (X inactive specific transcript), che trascrive un RNA

espresso solo dal cromosoma inattivato e che non codifica alcuna

proteina ricopre, inattivando, il cromosoma dal quale e’ espresso.

XIST non è espresso nel maschio normale (46,XY).

Il cromosoma X differisce dagli autosomi per alcune

caratteristiche:

geni corti, minor numero di geni, bassa densità di geni.

The X-inactive specific transcript (Xist) gene encodes a large non-coding RNA that is

responsible for mediating the specific silencing of the X chromosome from which it is

transcribed. The inactive X chromosome is coated by Xist RNA, whereas the Xa is not .

The Xist gene is the only gene which is expressed from the Xi but not from the Xa.

X chromosomes which lack the Xist gene cannot be inactivated.

Artificially placing and expressing the Xist gene on another chromosome leads to

silencing of that chromosome.

The existence of genes along the inactive X which are not silenced explains the defects

in humans with abnormal numbers of the X chromosome, such as Turner syndrome (X0)

or Klinefelter syndrome (XXY).

Compared to the Xa, the Xi has high levels of DNA methylation, low levels of histone

acetylation, low levels of histone H3 lysine-4 methylation, and high levels of histone H3

lysine-9 methylation, all of which are associated with gene silencing.

X Inactivation

• Klinefelter syndrome: 47,XXY (1/1000)

•Turner syndrome: 45,X (1/5000)

• Multi-X Females: 47,XXX; 49,XXXXX

• XYY Sindrome: 47,XYY (1/1000)

Esempi di malattie causate da anomalie

nel numero dei cromosomi sessuali

Un solo cromosoma Y e’ in grado di determinare il sesso, su di esso

e’ presente il gene SRY (Sex-determining Region Y) che determina la

soppressione dei caratteri primari femminili (utero, tube e ovaio) e promuove

lo sviluppo dei caratteri sessuali maschili

Codifica per un fattore trascrizionale (HMG-box family) che

inizia la determinazione sessuale maschile

Klinefelter syndrome: 47,XXY (1/1000)

• mancato sviluppo dei caratteri sessuali secondari

• microrchidia e aspermatogenesi

• tendenza all'alta statura

• L'analisi dei cromosomi sui linfociti è lo standard

genetico di diagnosi

• deficit di androgeni

• solo il 10% presenta un ritardo mentale.

• ridotto sviluppo del linguaggio, con problemi

di espressività

• sul piano comportamentale si possono riscontrare

immaturità, poca sicurezza, timidezza

Klinefelter syndrome: 47,XXY (1/1000)

Sintomi della sindrome di Turner sono:

• ipogonadismo con fenotipo femminile

• bassa statura

• torace a scudo (piatto) e capezzoli iperdistanziati;

• attaccatura dei capelli bassa

• orecchie a basso impianto;

• il viso può avere un aspetto da persona anziana

• sterilità dovuta a malformazioni dell'ovaia detta "a stria";

• amenorrea primaria, cioè, l'assenza della mestruazione (in Turner la menopausa

avviene prima del menarca all'età di 2 anni);

Turner syndrome: 45,X (1/5000)

Multi-X Females: 47,XXX; 49,XXXXX

Le principali caratteristiche standard sono:

• altezza (maggiore che nella media)

• circonferenza cranica inferiore alla norma (soprattutto alla nascita, poi c’è un ridotto

recupero).

• sviluppo motorio generalmente un po’ ritardato. Inizio della pubertà tendenzialmente

ritardato.

• sviluppo cognitivo. In media di poco inferiore alla norma.

•sviluppo comunicativo e linguistico. Tendenzialmente allo stesso livello o inferiore

rispetto alle prestazioni intellettive generali.

XYY Sindrome: 47,XYY (1/1000)

I maschi XYY non presentano particolari fenotipi

patologici.

Si tratta infatti di persone normali, con sviluppo intellettivo

normale, vita normale e prole normale.

Alcuni vecchi studi, riportano un aumento della statura

media dei maschi XYY.

In una percentuale variabile tra il 25 ed il 50% possono

andare incontro a problemi nella sfera del linguaggio

(Anomalie strutturali dei cromosomi ex. Traslocazioni/Delezioni)

Mutazioni cromosomiche

• (A) acrocentrici : centromero in posizione terminale

• (B) telocentrici: centromero in posizione subterminale

• (C) submetacentrici: centromero in posizione submediana

• (D) metacentrici: centromero in posizione mediana

Mutazioni cromosomiche

Rottura

Rottura e fusione delle estremita’

problemi in meiosi/mitosi

Perdita di un braccio e duplicazione di quello rimanente

LEUCEMIA PROMIELOCITICA ACUTA TRASLOCAZIONE BILANCIATA t (15;17)

Mutazioni cromosomiche

La persona portatrice di questa anomalia è perfettamente sana. È da considerare, però,

che un’alta percentuale dei gameti prodotti dalle persone con traslocazioni bilanciate/ robertsoniane

può essere “sbilanciata”.

Di conseguenza, le persone che hanno una traslocazione, nella loro vita riproduttiva,

hanno un rischio superiore, rispetto a quello di chi non è portatore di traslocazioni, di avere figli con

patologia malformativa o di avere gravidanze interrotte da aborti

TRASLOCAZIONE ROBERTSONIANA

Not Viable

Malattie da Genomic Imprinting

(Prader-Willi, Angelman)

• Per imprinting genomico si intende una modificazione

“epigenetica” di uno specifico allele nel gamete o nello

zigote, responsabile per l’espressione differenziale dei

due alleli del gene nelle cellule somatiche della progenie

• For the vast majority of autosomal genes, expression

occurs from both alleles simultaneously. In mammals

however, a small proportion (<1%) of genes are imprinted,

meaning that gene expression occurs from only one

allele.The expressed allele is dependent upon its parental

origin. For example, the gene encoding Insulin-like growth

factor 2 (Igf2) is only expressed from the allele inherited

from the father.

Genomic imprinting

• Per modificazione epigenetica, si intende una

modificazione ereditaria genomica, che non é associata

ad un cambio della sequenza di DNA.

EPIGENETICA

Epigenetics: the bridge between Genotype and Phenotype

Epigenetic modifications modulate genetic information defining

the cellular Transcriptome and therefore Cell identity

Ne

ura

l ce

lls

Blo

od

Ce

lls

Transcriptome B Epigenome B

Transcriptome A Epigenome A

40

Epigenetic Mechanisms: DNA Methylation and Histon Modifications

• DNA Methylation of promoter and CpG Islands leads to

transcriptional silencing.

• The N-terminal of the core histone are subjected to several

types of post-translational modifications, including Acetylation,

Methylation, Phosporylation, Ubiquitylation, etc. 41

HAT HDACs

Imprinting control region

La delezione di ICR

porta all’espressione

materna di igf2

Demetilated maternal region

Malattie da Imprinting

• Prader-Willi syndrome

• Angelman syndrome

• E’ una malattia genetica rara (colpisce 1 su 15.000-25.000 nati vivi)

caratterizzata dall'alterazione del cromosoma 15

• Ipotonia nell' infanzia, obesità dovuta ad iperfagia, ipogonadismo,

mani e piedi piccoli

• E’ la più comune tra le sindromi di microdelezione cromosomica

• Avviene per due diverse cause accertate, entrambe di tipo genetico:

Delezione sul cromosoma 15 paterno

Disomia uniparentale materna del cromosoma 15

Prader-Willi Syndrome

• Nella PWS il gene materno è silenziato perché sotto imprinting,

mentre quello paterno è deleto

• La regione in questione è sul cromosoma 15 (15q11-q13).

• La PWS è strettamente correlata con la Sindrome di Angelman (AS),

che è causata da imprinting paterno e delezione del gene materno

caratterizzata da movimenti ripetitivi, simmetrici, atassici e da una

disposizione all' allegria, al riso frequente

Prader-Willi/Angelman Syndrome

Stage 1

In the first stage, infants with PWS are hypotonic or "floppy", with very low muscle

tone. Weak cry and a poor suck reflex are typical. Babies with PWS usually are unable

to breastfeed and frequently require tube feeding. These infants may suffer from

"failure to thrive" if feeding difficulties are not carefully monitored and treated. As these

children grow older, strength and muscle tone generally improve. Motor milestones are

achieved, but are usually delayed.

Stage 2

An unregulated appetite characterizes the second stage of PWS. This stage most

commonly begins between ages 2 and 6 years old. Individuals with PWS lack normal

hunger and satiety cues. They usually are not able to control their food intake and will

overeat if not closely monitored. Food seeking behaviors are very common. In

addition, the metabolic rate of persons with PWS is lower than normal. Left untreated,

the combination of these problems will lead to morbid obesity and its many

complications

Genomic Imprinting (Prader-Willi and Angelman Syndromes)

Sono attivi solo:

• Un set di geni Prader-Willi (paterni)

• Un set di geni Angelman (materni)

Sono attivi solo:

• Un set di geni Prader-Willi (paterni)

Sono attivi solo:

•Un set di geni Angelman (materni)

Uniparental Disomy

Stesso risultato delle

delezione

Delezione banda q12

Cromosoma 15

Uniparental Disomy

Perdita del cromosoma

Materno (PWS) o

Paterno (Angelman S)

MUTAZIONI GENICHE EREDITARIE

Tutte quelle malattie derivanti da alterazioni genetiche che:

• possono essere trasmesse per via parentale perché

presenti nelle cellule germinali

Normalmente:

• non alterano la capacità riproduttiva

• sono compatibili con la vita

DEFINIZIONE DI MUTAZIONE

Permanente cambio nella sequenza del DNA

Tutte le mutazioni che avvengo a livello delle cellule germinali possono

essere trasmesse alla progenie e dare luogo a malattie ereditarie

Le mutazioni a carico di cellule somatiche non vengono trasmesse

per via ereditaria ma sono importanti nello sviluppo di

cancro e malattie congenite

Possono verificarsi nelle regioni:

codificanti, regolatorie (ex promotori) e nei siti di splicing

• Mutazioni puntiformi: sostituzione di aa che causano cambio di

sequenza o stop codon (talassemia)

• Frame shift: delezione o inserzione di nucleotidi (cambio intera

sequenza aa a valle della mutazione)

Tipi di Mutazioni Geniche (I)

• Inserzione/delezione di triplette: aggiunta o eliminazione di aa

• Espansione di triplette: caratterizzate dall’essere dinamiche perchè

aumentano durante la gametogenesi (ex.X-Fragile e Corea Huntington)

Introduzione stop

Autosomica recessiva

beta° talasemia

Mutazioni puntiformi

uracil-DNA glicosilasi

Inserzione di 4 nts e cambio della sequenza aa

a valle della mutazione

Mutazioni “frame-shift”

Autosomico recessivo (esosaminidasi A)

Malattia da accumulo lisosomiale nel cervello

Eliminazione di aa con alterazione della struttura/funzione

della proteina)

Fibrosi cistica autosomica recessiva

Delezioni di triplette

Espansione di triplette

• Mendeliane (mutazione di singoli geni con ampio effetto)

• Multifattoriali (genetici e ambientali)

• Malattie da singolo gene con trasmissione non mendeliana (ex.

espansione da triplette, malattie mitocondriali)

Classificazione delle malattie ereditarie

Mendeliane (mutazione di singoli geni con ampio effetto)

• Autosomiche domaninanti (ex. Ipercolesterolemia Familiare)

• Autosomiche recessive (ex. Fibrosi cistica)

• Sex-Linked (ex. Emofilia A, Distrofia Muscolare)

Autosomiche Dominanti (I)

- Manifeste clinicamente allo stato eterozigote (maschi e femmine

affetti in egual misura)

- Fenotipo influenzato da:

• penetranza (% di individui che, avendo il gene malato, manifesta il

fenotipo)

• espressivitá (livello di fenotipo)

Dovute alla presenza di geni modificanti

Autosomiche Dominanti (II)

-Normalmente coinvolgono DUE TIPI DI MUTAZIONI:

- Mutazione per Perdita di funzione

- Mutazione per Guadagno di funzione

-E DUE CATEGORIE DI PROTEINE

- Proteine regolatorie (ex. LDLr Familial Hypercholesterolemia),

- Proteine strutturali (ex. Collagene in Osteogenisis Imperfecta )

Pedigree di una Malattia

Autosomica Dominante

Autosomiche domaninanti (ex. Familial Hypercholesterolemia)

E’ una malattia recettoriale causata da una mutazione nel gene

codificante:

Il recettore per Low-density lipoprotein (LDL) coinvolto nel

trasporto e metabolismo del colesterolo che causa un elevato

livello di colesterolo nel plasma (2-3 volte rispetto alla media)

Caratteristiche soggetti affetti (1/500):

- precoci lesioni aterosclerotiche

- infarto e/o ictus cerebrale con insorgenza giovanile

- Xantomi (accumuli di grasso) tendinei e cutanei

1st

Ricche in trigliceridi Adipociti e muscoli

Estrazione trigliceridi

(Lipoprotein Lipasi)

2nd

3rd

4th

Metabolismo delle LDL

5th

Tramite LDLr

70% dal fegato

Restante da

Fibroblasti, linfociti,

muscolatura liscia Aumentata nei malati

perche’ IDL non assorbiti

Il metabolismo del colesterolo

3-hydroxy-3-methylglutaryl

coenzyme E reductase

CLASSIFICAZIONE DELLE MUATAZIONI LDLr

BASATE SULLE FUNZIONI DELLE PROTEINE MUTATE

Il gene per LDLr è situato sul cromosoma

19, comprende 18 esoni e 5 domini.

Sono state mappate almeno 150 mutazioni

Che differentemente modificano la proteina

• Entrambi i geni devono essere mutati

• L’espressione e’ piu’ uniforme rispetto alle malattie

autosomiche dominanti

• Penetranza completa e’ comune

• In molti casi proteine enzimatiche sono affette da perdita di

funzione

Autosomiche Recessive (I)

Pedigree di un carattere recessivo

Consanguinei

Autosomiche Recessive (III) (ex. FIBROSI CISTICA)

• Difetto del trasporto del cloro a livello epiteliale

causato da mutazioni nel gene CFTR (codificante per il canale dello ione cloro)

• Codifica una proteina di 1480 aminoacidi situata sulla membrana cellulare delle cellule

epiteliali, la cui funzione, normalmente, è quella di trasportare il cloro attraverso le

membrane cellulari a livello della membrana apicale delle cellule epiteliali delle cellule

di vie aeree, del pancreas, dell'intestino, delle ghiandole sudoripare, delle

ghiandole salivari e dei vasi defereni

• Insorgenza 1/1500-4000. E’ la piu’ importante delle malattie genetiche infantili

•Rara in popolazione asiatica e africana

Negli organi interessati, le secrezioni mucose, essendo anormalmente

viscide, determinano un'ostruzione dei dotti principali, provocando

l'insorgenza di gran parte delle manifestazioni cliniche tipiche della malattia

Coinvolge: ghiandole esocrine, epiteli respiratori, intestinali e riproduttivi

produzione di secrezioni mucose viscose che causano:

Infezioni polmonari

Insufficienza pancreatica

Cirrosi epatica

Infertilità maschile

Occlusioni intestinali

Mal nutrizione

CARATTERISTICHE

Polmoni:

Il quadro clinico è dominato da un lento processo distruttivo polmonare. Nella

maggior parte dei casi si manifesta nel primo anno di vita con tosse persistente.

L'esame obbiettivo può subito dimostrare segni indiretti di ostruzione bronchiale.

L'infezione bronchiale cronica determina una progressiva distruzione del parenchima

polmonare.

La risposta immunitaria dell'ospite e i fattori propri dei patogeni contribuiscono

quindi insieme ad innescare un processo patogenetico che è alla base del processo

distruttivo polmonare.

Pancreas:

è colpito nell'80% dei casi con un ristagno dei succhi pancreatici nei dotti con

formazione di cisti con una fibrosi che si va a creare attorno a questi (da qui fibrosi

cistica).

La carenza di succhi pancreatici nel canale intestinale porta a malassorbimento di

grassi (con conseguente steatorrea), e di conseguenza delle vitamine liposolubili,

delle proteine e, in minima parte, degli zuccheri. Con il passare del tempo il

pancreas, sempre più colpito, secerne una minor quantità di insulina portando a una

forma di diabete di solito insulino-dipendente.

Pancreas

Esocrino:

I principali enzimi presenti nel succo

pancreatico sono: tripsinogeno,

chimotripsinogeno, elastasi, lipasi

pancreatiche, amilasi pancreatiche,

fosfolipasi pancreatica, nucleasi

pancreatiche.

Endocrino (Isole di Langerhans)

Cellule A (15%): glucagone

Cellule B (80%). Insulina

Cellule D (3-5%): somatostatina

Cellule F (3-5%): polipeptide pancreatico

This higher-power photomicrograph of the

pancreas shows interstitial tissue and the

presence of small cystic spaces (1) within

the acinar lobules. These spaces are filled

with an eosinophilic proteinaceous

material. The islets of Langerhans (2) are

unaffected.

CANALE DEL CLORO

•2 Domini trasmembrana

• 2 NBD

• Regulatory domain

• 550 mutazioni diverse

• La piu’ comune è una

delezione di tripletta

codificante per phe508

(folding non corretto)

Ex. Acetilcolina

• Classe I: non c'è produzione di proteina

• Classe II: si ha produzione di un corto peptide non funzionante

• Classe III: si produce un polipetide non funzionante

• Classe IV: si produce una proteina difettosa ma in minima parte funzionante

• Classe V: si produce una proteina normale ma in minime quantità

• Classe WT: la proteina normale è prodotta nelle giuste quantità (soggetto sano)

FIBROSI CISTICA

ESPRESSIVITA’

Disfunzione Ghiandole Sudoripare

Ridotto assorbimento

Na+ Cl-

• Metodo di Gibson e Cooke - si misura la concentrazione di Cloro in

almeno 75 mg di sudore

• Valori sono superiori alla norma (60mEq/L) il test è sicuramente positivo

• Valori sotto i 30mEq/L è sicuramente negativo

Low salt levels in the body lead to fatigue, weakness, fever, muscle

cramps, stomach pain, vomiting, dehydration, and heatstroke.

Disfunzione Vie Aeree Superiori

Aumento assorbimento

Na+/H2O

• Sono tutti X-Linked e per la maggior parte recessivi

• Modalità di trasmissione caratteristica:

- I maschi non trasmettono la malattia ai figli maschi

(ma le figlie femmine sono portatrici)

- Le femmine a causa dell’ inattivazione casuale del

cromosoma x hanno un fenotipo variabile

Sex-Linked

Le distrofie muscolari di Duchenne (Dmd) e di Becker (Dmb) sono due varianti,

rispettivamente più e meno grave, della stessa malattia neuromuscolare caratterizzata

dall’assenza, carenza o alterazione di una proteina chiamata distrofina. Queste

condizioni, definite in generale distrofinopatie, portano a degenerazione del tessuto

muscolare e quindi alla progressiva perdita di forza e riduzione delle abilità motorie.

Nella Dmd la distrofina è del tutto assente e i primi sintomi si manifestano,

generalmente, tra i 2 e i 6 anni. I bambini affetti spesso imparano a camminare in

ritardo, mostrano un’andatura particolare (anserina), tendono a camminare sulle punte,

hanno difficoltà a rialzarsi da terra, a saltare, a fare le scale. Tipicamente è presente un

ingrossamento (ipertrofia) dei polpacci. La malattia progredisce causando grave scoliosi,

perdita della deambulazione entro i 12 anni, quindi perdita della funzione degli arti

superiori. Anche i muscoli respiratori e il cuore sono coinvolti e sono proprio le

complicanze cardiache e respiratorie a ridurre l’aspettativa di vita di questi pazienti. In

alcuni casi ci può essere un deficit cognitivo, di entità molto variabile.

Nella Dmb, la distrofina è ridotta o alterata, ma mai assente. A livello motorio, le

manifestazioni di questa forma ricalcano quelle della Dmd, ma in forma più lieve e con

esordio più tardivo. Le complicazioni cardiache costituiscono il problema principale: se

vengono riconosciute e curate in tempo, l’aspettativa di vita di questi pazienti può essere

del tutto normale.

Distrofia Muscolare

Duchenne muscular dystrophy

La malattia si trasmette con modalità legata all’X: in genere solo i maschi (che hanno un

solo cromosoma X) presentano i sintomi, mentre le femmine, a parte alcune eccezioni,

risultano essere delle portatrici sane (perché possiedono un altro cromosoma X oltre a

quello mutato, che può quindi compensarne le funzioni).

Dystrophin is a rod-shaped cytoplasmic protein, and a vital part of a protein complex that

connects the cytoskeleton of a muscle fiber to the surrounding extracellular matrix

through the cell membrane

The dystrophin gene is one of the longest human genes known, covering 2.5

megabases (0.08% of the human genome) at locus Xp21. The primary transcript

measures about 2,400 kilobases and takes 16 hours to transcribe; the mature mRNA

measures 14.0 kilobases. The 79 exons code for a protein of over 3500 amino acid

residues

Dystrophin supports muscle fiber strength, and the absence of dystrophin reduces

muscle stiffness, increases sarcolemmal deformability, and compromises the mechanical

stability

Normale Duchenne

Distrofia Muscolare

• increase in intracellular calcium,

• reactive oxygen species (ROS)

• activation of a protease cascade

Al momento non esiste una terapia risolutiva per la malattia. La qualità di vita dei

pazienti può notevolmente migliorare con trattamenti sintomatici e pluridisciplinari

(fisioterapia, valutazione della funzionalità cardiaca e respiratoria ecc.) che gestiscano i

vari aspetti della malattia: motorio, respiratorio e cardiaco. La somministrazione di

steroidi può aiutare a stabilizzare le abilità motorie. Attualmente sono in corso di

sperimentazione diversi approcci terapeutici, tra cui la terapia cellulare e la terapia

molecolare con exon-skipping.

Sia per la Dmd sia per la Dmb, la diagnosi si basa innanzitutto sull’osservazione clinica

ed esami di laboratorio mettono in evidenza il danno muscolare. In particolare un valore

importante è quello della creatinchinasi un enzima che viene rilasciato nel circolo

ematico quando esiste un danno muscolare.

La diagnosi viene poi confermata attraverso la biopsia muscolare (per verificare la

quantità di distrofina presente nel muscolo) e l’analisi molecolare del gene della

distrofina. In situazione a rischio (donna portatrice sana di distrofinopatia) si può

effettuare la diagnosi prenatale mediante villocentesi o amniocentesi.

Genome engineering using

programmable nucleases

Genome engineering (editing)

Modification of the genome at a precise, predetermined locus.

• Gene disruption (Knock-out): Non Homologous End Joining (NHEJ);

• Gene insertion (Knock-in): Homologous Recombination (HR);

• Gene correction and point mutagenesis: Homologous Recombination (HR);

Programmable nucleases produce site-specific DSBs, which enhance the

efficency of homologous recombination and/or trigger error-prone NHEJ, which

leads to targeted mutagenesis.

*indel: insertion/deletion

*

Three type of nucleases are used for genome editing:

• Zinc Finger Nucleases (ZFNs);

• Transcription Activator-Like Effector Nucleases (TALENs);

• RNA-Guided Engineered Nucleases (RGENs):

CRISPR-Cas9 system

Zinc-Finger Nucleases

Composed of two domains: a DNA-binding zinc-finger protein (ZFP) domain and

the nuclease domain derived from the FokI restriction enzyme.

The sequence specificity of ZFNs is determined by ZFPs, each of which

recognizes a 3-bp DNA sequence.

There is no open-source collection of 64 zinc-fingers that covers all possible

combinations of triplet sites!

Transciption Activator-Like Effector Nucleases

Composed of two domains: a FokI nuclease domain (like ZFNs) and a TALE

DNA-binding domain; TALEs are composed of tandem arrays of 33-35 aa

repeats, each of which recognizes a single base-pair in the major groove

(specificity determined by the Repeat Variable Diresidues).

Easy to design due to the one-to-one correspondence between RVDs and the

4 bases.

Phase 1: the CRISPR system stores

the molecular signature of a previous

infection by integrating fragments of

invading phage or plasmid DNA into

the CRISPR locus as 'spacers'.

Phase 2: in the immunity phase, the

bacterium uses this stored information

to defend against invading pathogens

by transcribing the locus and

processing the resulting transcript to

produce CRISPR RNAs (crRNAs) that

guide effector nucleases to locate and

cleave nucleic acids complementary

to the spacer.

•CRISPR:

Clustered regularly-interspaced

short palindromic repeats

•trans-activating crRNA

•CRISPR-Associated Protein 9 (Cas9)

•CRISPR RNAs (crRNAs)

Functioning of the CRISPR-Cas9 in bacteria

RNA-Guided Engineered Nucleases: CRISPR-

Cas9

In the presence of single

guide RNAs (sgRNAs),

Cas9 is directed to specific

sites in the genome

adjacent to a protospacer

adjacent motif (PAM),

causing a double strand

break (DSB).

Composition:

• Target specific crRNA;

• Invariable target-independent trans-activating crRNA (tracrRNA);

• CRISPR-Associated Protein 9 (Cas9).

crRNA and tracrRNA can be linked to form a single-chain guided RNA (sgRNA), which simplifies the components of RGENs.

RGENs target sites are limited by the requirment for the PAM sequence, which is recognized by Cas9.

Thus, the targetable sequences are 5’-X20NGG-3’ (where X20 corresponds to the 20bp crRNA sequence, called protospacer, and NGG is the Protospacer Adiacent Motif).

This CRISPR/Cas9 system is derived from S. pyogenes; there are some other CRISPR/Cas9 system derived from different Bacteria, as N. meningitis or S. thermophilus, that work in the same way, but with different PAM sequences (and different efficiencies).

Delivery of programmable nucleases (CRISPR-

Cas9)

Programmable nucleases are delivered into cultured cells, embyos or whole

organisms in various forms:

• Transient transfection of plasmid DNA through electroporation or liposome

transfection (gold standard for ES and iPS);

• Protein delivery (or mRNA direct injection);

• Integrating vectors, such as Lentivirus, have been used for continuos

expression of Cas9 and sgRNAs in mammalian cells.

• Adeno-Associated Virus (AAV)

Permanent exon skipping in postnatal mdx mice by AAV-mediated

Myoediting

Rescue of dystrophin expression in postnatal mdx mice by retro-orbital

injection of AAV-Cas9/sgRNAs.

• Risultanti dall’interazione fra le condizioni ambientali e un

numero di geni >1 partecipanti alla determinazione del

fenotipo

• Il rischio di presentare un fenotipo “malattia” é proporzionale

al numero di geni mutati ereditato

• Molte delle piú comuni malattie (diabete, ipertensione,

celiachia) hanno origine multifattoriale

Malattie genetiche multifattoriali

type 1 diabetes—an autoimmune disease in which the body's own immune system

attacks the pancreas, rendering it unable to produce insulin

Compartecipazione genetica : frequente familiarita’, associazione aplotipo HLA

DR3/4. Anticorpi e CD8 citotossici

Compartecipazione ambientale: gemelli omozigotici malatta <50% dei casi

Terapia :insulinica (ricombinante umana)

type 2 diabetes—in which a resistance to the effects of insulin or a defect in insulin

secretion may be seen

Rappresenta l’85% di tutte le forme di diabete, esordio tardivo

Compartecipazione genetica : frequente familiarita’, forse recettori insulinici

Compartecipazione ambientale: iperalimentazione/obesita’