lezioni 17&18-11-11

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ALEXIS CARREL (inizio anni ‘60):

Le cellule sono entità immortali; la loro morte è un evento

patologico legato a grossolane perturbazioni dell’omeostasi.

LEONARD HAYFLICK:

Le cellule invecchiano e muoiono fisiologicamente.

J. KERR (’65):

Descrisse un nuovo tipo di morte cellulare con caratteristiche

diverse da quelle della necrosi, che definì con il termine

APOPTOSI (dal greco: caduta delle foglie dagli alberi o dei

petali dai fiori).

NECROSI es. ischemia /ipossia

• Riduzione fosforilazione ossidativa

• Riduzione attività pompa sodica di membrana ATP-dipendente

• Rigonfiamento cellulare

• Metabolismo cellulare energetico alterato e riduzione

del pH intracellulare

• Esaurimento dei depositi di glicogeno

NECROSI es. ischemia /ipossia

Aumento della concentrazione intracellulare di Calcio

Attivazione di enzimi quali, fosfolipasi, proteasi,endonucleasi, con conseguente diminuzione di fofolipidi,distruzione delle proteine, danno alla cromatina

CARIOLISI CARIORESSI

Differenze tra necrosi e apoptosi

Fasi dell’apoptosi:

1. Disgregazione del nucleolo

2. Taglio lamina

3. Condensazione e taglio della cromatina in frammenti di

180-200 paia di basi

4. Migrazione dei granuli compatti di cromatina

degradata verso la periferia del nucleo e verso lamembrana plasmatica dove vengono circondati da

evaginazioni della membrana che conferiscono alla

cellula un aspetto a bolla (blebbing)

5. Le blebs si staccano dal corpo cellulare trascinando consé citoplama e materiale cellulare-corpi apoptotici-

fagocitosi

Durata del processo: 1-2 hr

APOPTOSI

E’ un processo fisiologico di eliminazione dellecellule danneggiate, invecchiate, potenzialmentedannose per l’architettura dell’intero tessuto-organo o cellule non più utili all’organismo.

Le cellule degli organismi pluricellulari non esprimono

tutti i geni in loro possesso, ma attivano di volta in volta“pacchetti di geni specifici”, cui corrispondono specifici“programmi cellulari”: la morte per apoptosi rappresentauno di questi programmi, alla pari del differenziamento edella divisione cellulare e comporta, come gli altri

programmi, una complessa rete di segnalazione inter-cellulare e un processo decisionale interno alla cellulastessa, nel quale vengono soppesate le varie opzionipresentate dai segnali che giungono alla cellula.

L’apoptosi è molto importante nell’:

EMBRIOGENESI

INVOLUZIONE ORMONO-DIPENDENTE

OMEOSTASI CELLULARE

IMMUNITA’ CELLULO-MEDIATA

INVOLUZIONE ORMONO-DIPENDENTE

• distruzione cellule endometriali durante il ciclo mestruale

•Atresia dei follicoli ovarici nella menopausa

•Regressione della mammella dopo lo svezzamento

IL PROGRAMMA APOPTOTICO

SI AVVALE DI MOLECOLESPECIFICHE, I CUI GENI SONO

ALTAMENTE CONSERVATI

The model organism

S. Brenner riuscì ad indurre mutazioni di specifici geni

del genoma di C.elegans utilizzando EMS (etil metano

sulfonato). Mutazioni a geni diversi determinavano effetti

specifici sullo sviluppo degli organi. La combinazione

dell’analisi genetica e l’osservazione delle divisioni

cellulari al microscopio pose le basi alle scoperte

successive.

Mapping the cell lineage

Identification of “death genes”

ced - 3ced - 4

ced - 9

Pro- apoptotici

Anti-apoptotici

(ced Caenorabdis elegans death)

Brenner, Sulston, Horvitz

Nobel per la Fisiologia e Medicina 2002

Hanno dimostrato che lo sviluppo degli organi e lamorte cellulare programmata sono regolatigeneticamente. Essi hanno identificato i geni chiave cheregolano la morte cellulare programmata in C.elegans edimostrarono che i geni corrispondenti esistono anchenegli animali superiori, incluso l’uomo. Come quasi sempre accade, l’evoluzione ha però complicato il meccanismo a mano a mano che si saliva verso

organismi più complessi, sostituendo a un gene prototipo tutta una famiglia di geni con proprietà simili ma non del tutto sovrapponibili.

LE 3 FASI DELL’APOPTOSI:

Induzione

Esecuzione

Riconoscimento e Fagocitosi

La cellula riceve di continuo informazioni (cross talk ),segnali e stimoli che ne condizionano la sopravvivenza.

Segnali di sopravvivenza e segnali di morte vengonointegrati all’interno della cellula.

I diversi stimoli che sopraggiungono alla cellulasembrano seguire 2 distinte vie di segnalazione:

una attivata da “segnali di morte” che giungono aspecifici recettori di superficie (VIA RECETTORIALE)

una attivata da “segnali endogeni” e regolata dalmitocondrio (VIA MITOCONDRIALE)

Entrambe le vie convergono nell’attivazione di proteasispecifiche dette CASPASI. Questo evento segna l’inizio della fase di esecuzione . L’attivazione delle caspasi è

determinato da un evento proteolitico e determina a suavolta un’ulteriore cascata di eventi proteolitici enucleolitici preordinati, che amplificano il segnale eportano alle tipiche modificazioni morfologichedell’apoptosi. Tale fase richiede ATP.

APOPTOSOMA, Complesso di origine mitocondrialecomprende:

un adattatore (APAF-1) una pro-caspasi iniziatrice (pro-caspasi 9)

Una molecola di citocromo C

Una molecola di ATP

Fas, ora classificato come CD95,è

, ,una proteina di superficieappartenente alla superfamiglia deirecettori del TNF-NGF

Fas, ora classificato come CD95,è

una proteina di superficieappartenente alla superfamiglia deirecettori del TNF-NGF

INDUZIONE

Ligando-Recettore-Adattatore-Procaspasi-Caspasi

ESECUZIONE

Caspasi (proteasi):

Taglio del DNA

Taglio proteine strutturali del nucleo

Taglio proteine del citoscheletro

Prima però che le caspasi effettrici entrino in azione,rendendo irreversibile il cammino verso la mortecellulare, deve essere completata la fase di induzione,durante la quale vengono soppesati i segnali chegiungono alla cellula. Infatti, una cellula riceve segnali dimorte (per via recettoriale o endogeni), ma nel frattempopuò ricevere segnali di sopravvivenza veicolati da fattoridi crescita, da citochine o da integrine e molecole diadesione.

3 MODULATORI

Mammiferi

(anti-apoptotici) Bcl-2, BclxL

(pro-apototico) Bax, Bad, Bak

Nel particolare “gioco a scacchi” che si gioca nella cellula (tra fattoripro- e anti-apoptotici), le due vie opposte schierano i propri “pezzi” sulla membrana esterna del mitocondrio. Alla fine, vinceranno i più

numerosi: la preponderanza di modulatori anti-apoptotici , manterràintegra la membrana mitocondriale, mentre la preponderanza dimodulatori pro-apoptotici determinerà nel mitocondrio l’apertura dimegapori, che causeranno la caduta del potenziale mitocondriale e lafuoriuscita di sostanze pro-apoptotiche.

3. MODULATORI

bcl-2 ced-9

E’ stato il primo gene dell’apoptosi ad

essere studiato nell’uomo, isolato da

una leucemia di tipo B

(B Cell Leukemia-2)

4. EFFETTORI

I complessi che si formano a livello dei domini recettoriali (e gliapoptosomi) operano dei tagli nelle pro-caspasi iniziatrici , che in tal modo si

attivano. Si tratta di enzimi proteolitici (proteasi) il cui centro reattivo ècaratterizzato da una Cisteina e che tagliano i loro bersagli a valle di unabreve sequenza di quattro aa, l’ultimo dei quali è un residuo di acido Aspartico .

I due spezzoni della molecola si uniscono a formare un dimero; le caspasi

iniziatrici formano tetrameri (due molecole di caspasi, ciascuna costituitada due spezzoni) dopo aver perso una porzione regolatrice. Tipicamente, lecaspasi iniziatrici (2,8,9,10) attivano le caspasi effettrici (3,6,7), ma possonoanche essere attivate da queste ultime (amplificazione del segnale).

Non tutte le caspasi sono coinvolte nell’apoptosi; alcune svolgono altricompiti, come la caspasi 1 che regola l’attività dell’interleuchina 1β (una

citochina proinfiammatoria).

VIA DI SEGNALAZIONE RECETTORIALE

VIA DI SEGNALAZIONE MITOCONDRIALE

La fase di esecuzione sembra essere comune a tutte oquasi le vie d’innesco. A differenza del C. elegans , in cuiè presente la singola caspasi CED3, nell’uomo sono

state identificate almeno 10 di tali proteine.

U d i iù i t ti b li d ll i ff tt i i è ICAD

Uno dei più importanti bersagli delle caspasi effettrici è ICAD,l’inibitore di CAD (Caspase Activated Dnase), un’endonuclesi specifica dell’apoptosi. Una volta liberatasi dall’inibitore grazieall’azione delle caspasi, CAD effettua tagli al doppio filamento nella

regione internucleosomica della cromatina, rendendosi cosìresponsabile della frammentazione del DNA, tipica dell’apoptosi.(Altre due nucleasi sono attive nell’apoptosi: ENDO G e AIF , chefuoriescono dal mitocondrio insieme agli altri fattori pro-apototici).

Il taglio proteolitico effettuato dalle caspasi attiva alcune molecole

e ne inattiva altre: il fine è quello di portare alla frammentazione dellacellula mantenendone integra la membrana plasmatica. Verrannoquindi inattivate le molecole coinvolte nella riparazione del DNA (es.PARP ), mentre vengono attivate acinus (responsabile dellacondensazione della cromatina) e la trans-glutaminasi , una molecola

che rende più resistente la membrana cellulare.

5 INIBITORI (IAP)

• Le caspasi non devono assolutamente attivarsi per eventi casuali, per cuisono di norma complessate con inibitori naturali, endogeni, che devonoessere rimossi.

• cytokine response modifier A (CrmA) protein inibisce la caspasi 8 e dunqueprotegge le cellule dall’apoptosi attivata da CD95 o dal recettore di TNF

• cellular FLICE-inhibitory protein (c-FLIP) è capace di modulare l’attivazione della pro-caspasi 8 e dunque previene l’apoptosi mediata dai “recettori dimorte”

• Heat Shock Proteins (HSP) proteggono la cellula dall’apoptosi, legando

molecole come il citocromo c, l’APAF-1 o le caspasi.

5. INIBITORI (IAP)

Smac/Diablo inattivano gli

inibitori delle caspasi

6. INDUTTORI

Appartengono alla categoria degli INDUTTORI un insiemeeterogeneo di molecole, in grado di indurre apoptosi attraverso la via

mitocondriale, determinando uno sbilanciamento tra modulatori anti-e pro-apoptotici a favore dei secondi.

reaper, hid e grim di Drosophila , sono induttori che si attivano inbase a un “orologio interno”, ancora sconosciuto. Sembrano attivare

il rilascio del citocromo c dal mitocondrio

p53 , si attiva quando la cellula non riesce a compiere correttamentele tappe del ciclo cellulare a causa di danni al DNA. Se il dannopersiste, p53 induce la sintesi di un modulatore pro-apoptotico, bax ,che si localizza sulla membrana mitocondriale e favorisce l’apertura dei megacanali.

Meccanismi di riconoscimento delle cellule apoptotiche da parte dei macrofagi.

Recettore delle asialoglicoproteine: sulle membrane di alcuni tipi cellulari (es. epatociti) durante il processo apoptotico vengonoesposti alti livelli di glicoproteine desialilate che vengono riconosciute dalle cellule circostanti mediante il recettore delleasialoglicoproteine

Recettore della vitronectina (VnR)/CD36: é il sistema più complesso e meglio caratterizzato, utilizzato dai macrofagi derivati daimonociti. Al sistema di riconoscimento partecipano tre molecole: i) Trombospondina : molecola trimerica, adesiva, prodotta e secretadal macrofago, che funziona da "ponte molecolare" tra corpo apoptotico e complesso VnR/CD36; ii) VnR : presente sulle membranedel macrofago, é un eterodimero che appartiene alla famiglia delle integrine, molecole di membrana implicate nelle funzioni diadesione e ancoraggio cellulare; iii) CD36 : molecola di superficie, tipicamente espressa dai monociti, dai macrofagi e dalle piastrine,la cui funzione fisiologica non é ancora ben determinata. Non é ancora stata identificata la molecola riconosciuta sul corpo apoptoticoda parte di questo complesso recettoriale.

Recettore della fosfatidilserina (PS): normalmente i residui di PS sono situati sulla faccia citoplasmatica della membrana; nelle

cellule apoptotiche l'asimmetria del foglietto lipidico viene persa in seguito all'attivazione di un enzima specifico (" scramblase ") chetrasloca i residui di PS sulla faccia esterna della membrana.

ALCUNE TECNICHE DI STUDIO DELL’APOPTOSI

Microscopia Elettronica

Microscopia Ottica a fluorescenza

Elettroforesi del DNA

KO dei geni dell’apoptosi

LEUCEMIA LINFOCITICA

CARIORESSI

AUTOFAGIA o morte cellulare di tipo II

Il termine “autofagia” o “autofagocitosi” deriva dal grecoe significa letteralmente “mangiare se stessi”. E’ un

processo di auto-degradazione lisosoma-mediato.

E’ considerata una risposta cellulare allo stress e viene

attivata principalmente in due condizioni:

• quando è necessario rimuovere componenti intracellularialterate• quando occorrono macromolecole essenziali e fonti dienergia in carenza di elementi nutrizionali (stress da fame)

Esistono tre tipi di autofagia: macrofagia, microfagia eautofagia chaperone-mediata.

M f i l i lt d d i

Macrofagia: un organulo viene avvolto da una doppiamembrana di derivazione del RE

Nella microfagia il lisosoma ingloba direttamente le regionicitoplasmatiche da degradare attraverso un complesso sistemadi invaginazioni ed evaginazioni tubuliformi della propriamembrana.

Nell’autofagia mediata da chaperonine , proteine-bersaglio

citosoliche recanti una specifica sequenza pentapeptidicavengono riconosciute e legate da una“chaperonina”

citosolica, che le trasporta sulla membrana dei lisosomi

oltre 30 geni ATG sono stati trovati nel lievito e molti di lorosono ortologhi nei mammiferi per controllare i processidinamici di autofagia

l 30 i ATG i i l li i l i di l

oltre 30 geni ATG sono stati trovati nel lievito e molti di lorosono ortologhi nei mammiferi per controllare i processidinamici di autofagia quali:

(i) induzione o inizio, regolata negativamente da mTOR(bersaglio della rapamicina mammiferi);

(ii) nucleazione (formazione dell’autofagosoma), che èmediata dal complesso Beclin-1 (Atg-6) e Vps34(PI3K)

(iii) allungamento, che è un passo fondamentale nelformare il autofagosoma controllato da due sistemi diconiugazione(Atg12-Atg5 e LC3/Atg8)

(iv) la maturazione, che prevede la fusione tra

autofagosoma e lisosoma e degradazione del contenuto.

In Dictyostelium discoideum , un’ameba difettiva del

macchinario apoptotico. In questo modello, l’autofagia è

stata convincentemente dimostrata come meccanismo dimorte cellulare in quanto una mutazione del gene ATG 1diminuisce l’autofagia e la morte cellulare per autofagia.

In Drosophila melanogaster è stato dimostrato che la morte

cellulare è tessuto-specifica: es. durante lo svilupponell’intestino si ha la morte cellulare per autofagia,mentre nelle cellule salivari per apoptosi

Nei mammiferi non c’è una chiara evidenza di morte cellulare per

autofagia in condizioni fisiologiche

In condizioni patologiche come ipossia/ischemia è stata osservatamorte cellulare per autofagia nel cervello di topi neonati ed adulti.

La mancanza di ATG 7 nel SNC dei topi previene la morte neuronaleindotta da ipossia/ischemia

Nei topi atg Knowckout si osserva un aumento di morte cellulare perapoptosi allo stadio embrionali suggerendo una funzione anti-apoptotica per l’autofagia

Nel riquadro in alto a sinistra si osserva una cellula sana,completamente distesa (il citoplasma è colorato in verde)con il nucleo circolare (in giallo). La cellula apoptotica(freccia bianca), al contrario si presenta piccola con

vescicole che emergono dai bordi. Il nucleo inoltre èdisomogeneo e frammentato in diversi corpuscoli (inarancione). Nel riquadro in basso invece sono rappresentatecellule in cui, in verde, è marcata la proteina autofagica LC3.Nella cellula sana (a destra) la proteina si presenta dispersain maniera omogenea nel citoplasma, nella cellula di sinistrainvece il processo autofagico è evidenziato dalla presenzadi vescicole la cui formazione è permessa proprio dallaproteina LC3.

APOPTOSI AUTOFAGIA

Rapido collasso degli elementi delcitoscheletro Preservazione del citoscheletrofino alla fase finale

Preservazione degli organelli finoalla fase finale

Rapida eliminazione degli organelli

Assenza di infiammazionetissutale

Attivazione della caspasinecessaria

DNA frammentazione e attivazionecaspasica solo nella fase ultimadel processo

Morte cellulare per necrosi (A) e apoptosi (B e C). La cellula in figura C è stata fagocitata da una cellula vicina

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