Le Biomolecole “utili” sono prodotte per:

1. Sintesi Chimica

2. Biosintesi (processi biotecnologici e reazioni enzimatiche

3. Sintesi mista (enzimatico-chimica)

4. Isolate da fonti naturali

Sintesi Chimica di molecole organiche

La sintesi chimica di una molecola organica avviene per una o più reazioni tra varie molecole di reagenti e portano ad una variazione della struttura molecolare.

Prima di iniziare una sintesi bisogna prendere in considerazione:

1. Una buona progettazione della sequenza di reazioni da fare (è consigliabile una analisi retrosintetica)

2. Il numero delle reazioni da fare

3. La resa di ciascuna reazione e resa finale

4. Le condizioni di reazione

5. Le condizioni di purificazione (ogni fase o tutto alla fine)

6. Il costo di tutto.

Semplice analisi retrosintetica.

Per trasformazione di gruppi funzionali

Analisi retrosintetica con variazione nello scheletro carbonioso

1. Il numero delle reazioni da fare

2. La resa di ciascuna reazione e resa finale

E’ consigliabile adottare uno schema sintetico con un basso numero di reazioni. A patto che ciò non comporti un abbassamento della resa globale del prodotto finale

A B

La resa di un singolo stadio si calcola come il % in moli del reagente che si trasforma in prodotto

60% Vuol dire che solo il 60 % delle moli di A si trasformano in B

A B50%

C D50%50%

Sintesi multistadio e resa globale

Il prodotto E sarà ottenuto on una resa globale del (50 x 50 x 50 x 50) = 6.2 %

Questo tipo di sintesi viene detta lineare

E50%

Globale 6.2%

Sintesi multistadio convergente

A B50%

E

D50%

C

50%1.0 mol

1.0 mol

12.5%

0.12 mol

J.Am.Chem.Soc. (1994) 116, 1597 and 1599

La sintesi Chimica del Tassolo una sintesi con molti stadi

Sintesi in soluzione o sintesi in fase solida?

La sintesi in soluzione prevede che i reagenti siano tutti solubilizzati in un opportuno solvente.

I vantaggi:

1. Reazioni veloci (dovuto alla elevata mobilità delle molecole)

2. Reazioni stechiometriche

Svantaggi:

1. Il reagente in eccesso (se c’è rimane nella miscela di reazione)

2. I sottoprodotti restano nella miscela di reazione insieme al prodotto desiderato.

3. E’ necessaria una purificazione dopo ogni passaggio sintetico.

Sintesi in fase solida (schema generale)

La sintesi in fase solida prevede che un reagente sia legato ad un supporto solido (non solubile)

I vantaggi:

1. I sottoprodotti sono allontanati per semplice lavaggio e filtrazione del supporto solido che ha legato solo il prodotto di reazione desiderato.

2. I reagenti in eccesso sono analogamente allontanati per lavaggio e filtrazione.

3. Unica purificazione finale

Svantaggi:

1. Per ottenere rese alte è necessario usare forti eccessi del reagente in soluzione

2. La scala di reazione spesso non è elevabile a piacere

Con l'avvento di nuovi è più veloci metodi di screening di attività che permettono la valutazione di decine e centinaia di prodotti in un solo giorno, lo stadio lento del processo di produzione di un farmaco è diventato la individuazione e la sintesi chimica dei prodotti da provare i quali, a loro volta, debbono essere il più possibile diversi tra loro, per poter facilitare la individuazione di nuove strutture attive.

La sintesi chimica deve tenere il passo con le nuove potenzialità di screening biologico. Questo problema è stato risolto con la sintesi combinatoriale.

Oggì è richiesta una sintesi chimica più veloce ed efficiente!

Se il prodotto ricercato è stato progettato razionalmente allora bisogna sintetizzarlo con una struttura ben definita

Se non si ha una idea esatta della struttura del composto, pensato essere farmacologicamente attivo, ma si ipotizza una struttura generica di una certa tipologia, allora può venire utile la Sintesi Combinatoriale

Sintetizzare un solo composto ? (strada lenta)

o più composti simultaneamente (strada veloce) ed ottenere una miscela?

La sintesi Combinatoriale

Questa tecnica sintetica produce un elevato numero di molecole che differiscono strutturalmente per piccole porzioni della molecola. Consente di sintetizzare un elevato numero di molecole da saggiare

Così si ottengono vaste collezioni di prodotti (libraries, librerie) contenenti un alto numero di varianti di una struttura fondamentale;

A: sintesi organica classica. B:sintesi combinatoriale.

Numero di prodotti ottenibili in funzione della lunghezza del peptide utilizzando i 20 amminoacidi naturali.

Esempio

La sintesi combinatoriale è applicabile anche a molecole piccole variando una parte della struttura

Quanti possibili cicli imidazolici trisostituiti si ottengono?

Derivati = 63 = 216

Tali librerie possono essere costituite da prodotti in soluzione o da prodotti ancorati ad una particella solida (bead, perlina).

Il metodo si presta molto bene ad essere automatizzato e sono già commercializzati dei sistemi robotizzati che sono in grado di produrre da 1000 a 2000 prodotti al giorno.

Sintesi in soluzione o Sintesi in fase solida

A prima vista può sfuggire l'utilità di questa tecnica. Vi è chiaramente un risparmio di lavoro: se avevamo a disposizione 6 reagenti per posizione, abbiamo ottenuto 216 prodotti... peccato che siano tutti assieme!

In realtà esistono tecniche di marcatura o deconvoluzione che permettono di risolvere elegantemente il problema dell'identificazione di un eventuale composto attivo tra i 1000 sintetizzati

Come identificare il prodotto più attivo?

Le procedure di deconvoluzione permettono di identificare i composti di interesse attraverso un processo interattivo di screening e sintesi.

“On-Bead Assay for Receptor Binding using a Fluorescently Labeled Receptor”

Beads

1) Add labeled receptor labelled with fluorescent tag2) allow to bind to ligands on the beads

3) wash to remove unbound receptor

Libreria di molti prodotti. Su ogni sferetta c’è legata una sola tipologia di molecola.

Solo le sferette che hanno legato la molecola attiva che riconosce il recettore divengono fluorescenti

Libreria su sferette (di vetro) identificazione mediante saggio con recettore fluorescente

A: il recettore è mescolato con le perline della libreria. B: il recettore si lega alla perlina che contiene il prodotto affine. C: si aggiunge il substrato dell'enzima; la perlina, alla quale è legato il recettore modificato, si colora (porpora) e può essere individuata ed isolata.

Un possibile metodo di selezione per affinità con il recettore

Micro sferetta colorabile

Vediamo un esempio concreto di sintesi in fase solida di una libreria di 27 prodotti e come si individua il prodotto più biologicamente attivo

Il metodi di sintesi è definito:

Sintesi parcellizata (Split Sinthesis)

In genere la sintesi in fase solida viene effettuata su un supporto solido facilmente parcellizzabile o rimescolabile.

Sono preferite sferette di vetro o altro materiale, comunque di forma definita e dimesioni non troppo piccole in quanto devono, in alcuni casi, poi poter essere anche individuate singolarmente

Split synthesis (mixture libraries)

A

B

C

A

B

C

A

B

C

A

B

C

A

B

C

A

B

C

A

B

C

D

D

D

E

E

E

F

F

F

combine, mix,split

Ecombine, mix,split

A

B

C

D

F

G

A

B

C

D

D

D

A

B

C

E

E

E

A

B

C

F

F

F

A

B

C

D

D

D

A

B

C

E

E

E

A

B

C

F

F

F

A

B

C

D

D

D

A

B

C

E

E

E

A

B

C

F

F

F

A

B

C

D

D

D

A

B

C

E

E

E

A

B

C

F

F

F

G

G

G

G

G

G

G

G

G

A

B

C

D

D

D

A

B

C

E

E

E

A

B

C

F

F

F

H

H

H

H

H

H

H

H

H

A

B

C

D

D

D

A

B

C

E

E

E

A

B

C

F

F

F

I

I

I

I

I

I

I

I

I

H

I

Split synthesis (continuazione)

Perchè non è conveniente fare così?

Perchè la reattività dei prodotti può non essere la stessa e ciò porta ad una libreria in cui I prodotti non sono egualmente rappresentati.

Nella Split synthesis tutti i composti sono in eguali quantità pechè ogni accoppiamento è individualmente controllato (ovvero con un solo reagente)

A,B,C

A

B

C

D,E,F

A

B

C

A

B

C

A

B

C

D

D

D

E

E

E

F

F

F

G,H, Ietc

Deconvolution della libreria attraverso attività biologica e sintesi di sub-librerie (Selezione del composto attivo)

G

A

B

C

D

D

D

A

B

C

E

E

E

A

B

C

F

F

F

G

G

G

G

G

G

G

G

G

A

B

C

D

D

D

A

B

C

E

E

E

A

B

C

F

F

F

H

H

H

H

H

H

H

H

H

A

B

C

D

D

D

A

B

C

E

E

E

A

B

C

F

F

F

I

I

I

I

I

I

I

I

I

H

I

G H I

Biological activity of the library

select library H

Si staccano i prodotti dal supporto e si ottengono tre librerie ognuna contenente nove prodotti di tipo X-Y-Z. La Libreria che termina con il residuo H risulta la più attiva.

A

B

C

D

D

D

A

B

C

E

E

E

A

B

C

F

F

F

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

E-H F-H

Biological activity of the library

select library D-H

A

B

C

A

B

C

A

B

C

D

D

D

E

E

E

F

F

F

H

D-H

A

B

C

D H

D H

D H

A D H

B D H

C D H

B-D-H C-D-H

Biological activity of the library

select library C-D-H

A-D-H

Lead Cmpd

Tra i nove prodotti selezionati ‘c’è il prodotto attivo. Per individuarlo bisogna suddividere il gruppo in tre sottogruppi che si possono sintetizzare a partire dai dimeri separati.

I tre sottogruppi, staccati dal supporto sono poi saggiati per l’attività biologica. Il Diagramma indica che il prodotto che termina per D-H è quello più attivo.

Ciò restringe il campo a soli tre possibili prodotti: A-D-H, B-D-H, C-D-H

A

B

C

D

D

D

A

B

C

E

E

E

A

B

C

F

F

F

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

E-H F-H

Biological activity of the library

select library D-H

A

B

C

A

B

C

A

B

C

D

D

D

E

E

E

F

F

F

H

D-H

A

B

C

D H

D H

D H

A D H

B D H

C D H

B-D-H C-D-H

Biological activity of the library

select library C-D-H

A-D-H

Lead Cmpd

A

B

C

D

D

D

A

B

C

E

E

E

A

B

C

F

F

F

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

H

E-H F-H

Biological activity of the library

select library D-H

A

B

C

A

B

C

A

B

C

D

D

D

E

E

E

F

F

F

H

D-H

A

B

C

D H

D H

D H

A D H

B D H

C D H

B-D-H C-D-H

Biological activity of the library

select library C-D-H

A-D-H

Lead Cmpd

Si sintetizzano singolarmente i tre prodotti, si staccano dai supporti e si saggiano. Risultato: il prodotto C-D-H è il più attivo!

Problemi:• La deconvoluzione può essere un lavoro lungo•Il lavoro può essere falsato dalla bassa concentrazione del prodotto attivo• L’attività, a volte, può dipendere dalla combinazione di più prodotti. Ciò impedisce l’idenficazione del singolo composto attivo

Vantaggio:• Può essere sinntetizzato un elevato numero di composti in un tempo breve (dipende dalla sintesi)

Sintesi parallela “spazialmente indirizzabile”

A

B

C

A

B

C

A

B

C

A

B

C

D

D

D

D E F

E

E

E

F

F

F

Questa tipologia di sintesi si basa su molecole legate ad un supporto in genere una superficie su cui si fa passare il reagente solo in determinate zone (come in caselle di una scacchiera). Ogni zona (casella) avrà un determinato prodotto.

A

B

C

A

B

C

A

B

C

A

B

C

D

D

D

G I

E

E

E

F

F

F

H

G

G

G H

H

H I

I

I

Sintesi parallela “spazialmente indirizzabile”

Il recettore (“labelled”) si fa passare su tutta la superficie della scacchiera individuando la zona e quindi la molecola che lo lega specificamente

Sintesi parallela “spazialmente indirizzabile”

Invece di supporti stratificati in un foglio oggi si preferisce usare apparati automatici che consentono più sintesi contemporanee in fase solida.

Ogni supporto è collocato in un reattore separato su cui vengono fatti passare i diversi reagenti.

Il risultato è lo stesso (ma con maggiori quantità ottenibili) di una sintesi spazialmente indirizzable su diverse zone di superficie

Acc. Chem. Res. 1996, 29, 114-122

Apparato automatico per sintesi di libreria (simultanea su più reattori diversi)

Un blocco precostituito di 100 mini reattori per libreria di 100 composti

Vantaggi: Si sintetizzano composti puri (non in miscela) quindi non c’è bisogno di deconvoluzione

Svantaggi: Le librerie tendono ad essere piuttosto piccole

Sintesi parallela “spazialmente indirizzabile”

Esempio di sintesi divergente