Fotorecettori

Come fanno i germinelli ad accorgersi della presenza, della quantità e della qualità di luce?

Come cambia la pianta?

Un fattore ambientale essenziale nella vita delle piante: la LUCE

Fotomorfogenesi Germinazione dei semi Inverdimento Fioritura Fototropismo…

Luce come SEGNALE Segnali chimici (ormoni)

Luce Buio

Fotomorfogenesi

Il processo di “riprogrammazione” del germinello dal punto di vista morfologico (ma anche biochimico…) scatenato dalla luce

La luce regola lo sviluppo della pianta

1) rinverdimento, 2) allungamento (ipocotile- e radice+), 3) apertura cotiledoni

Scotomorfogenesi: morfogenesi al buio

Plantule di mais (monocot)

Anche nelle monocot ritroviamo i tratti fondamentali

Plantule di fagiolo

L’effetto della dipende dalla lunghezza d’onda

(non è solo una questione di quantità di fotoni)

c’è di mezzo più di un fotorecettore

Germinazione dei semi di lattuga: l’induzione (non la germinazione) è reversibile

Le λ NON sono equivalenti spettro d’azione

La luce rossa stimola, quella rosso lontana inibisce.

E’ cruciale quale tipo di luce colpisca i semi per ultima

Spettro d’azione per la stimolazione e l’inibizione della germinazione

Lo spettro d’azione a quale pigmento può corrispondere?

Uno o due pigmenti (responsabili) per i due effetti?

Ipotizzato negli anni 40, il fitocromo viene rilevato nel 1959, purificato nel 1983 e clonato nel 1985.

Spettro di assorbimento del fitocromo dall’avena (forma Pr e Pfr)

I due spettri hanno una parziale sovrapposizione

To cut a long story short...

Le due forme si interconvertono per effetto della luce

Pr PfrRed light

Far-red light

Equilibrio Fotostazionario

Rosso 85% Pfr 15% PrRosso lontano 97% Pr 3% Pfr

Il rapporto fra Pr e Pfr dipende dalla lunghezza d’onda della luce

Risposta dei germinelli di Arabidopsis alla diverse qualità di luce

In qualche modo i germinelli “vedono” diversi tipi di luce

E’ facile ricercare mutanti che non rispondono continuano ad allungare l’ipocotile (mutanti hy)

I mutanty hy di Arabidopsis hanno permesso di isolare diversi geni importanti nella fotomorfogenesi (tra cui alcuni per i fotorecettori

I mutanti phyB mostrano una ridotta sensibilità alla luce rossa

phyB agisce come sensore per la luce rossa

Funziona come sensore anche per la luce FR?

No phyB percepisce ancora lo stimolo FR

Ricerca di mutanti insensibili alla luce FR

F2 di semi mutagenizzati illuminati con luce FR

E’ possibile trovar mutanti alterati nel recettore per il FR?

Mutante che continua ad allungare

I mutanti phyA mostrano una ridotta sensibilità alla luce FR

Il nuovo mutante è alterato nel gene per il fitocromo A

Il rapporto R/FR può cambiare nel tempo e nello spazio

In sunlight most P gets converted to Pfr form. After a long night most gets converted to Pr. At dawn, most P gets converted to Pfr form again.

I germinelli phyA rimangono parzialmente eziolati negli ambienti ricchi in luce FR

I mutanti phyA cresciuti in luce normale non hanno fenotipo

I mutanti phyB al contrario hanno internodi più lunghi e fioriscono precocemente

Questo fenotipo assomiglia a quello delle piante cresciute a basso R:FR

Esistono fitocromi diversi

La famiglia genica del fitocromo

Tipo I : fotolabile, alte concentrazioni in plantula eziolataTipo II: fotostabile, presente in pianta alla luce

Tipo I

Tipo II

Classificazione 1) in base alla sequenza o 2) in base al comportamento dopo illuminazione

PHYA è labile alla luce

PHYB,C, D e E sono stabili alla luce

Effetti diversi mediati dai fitocromi (fotorecettori) possono richiedere quantità diverse di luce:

Fluenza: mol fotoni/ m2

Irradianza: mol fotoni/ m2 sec

Irradianza = velocità di fluenza

QUANTITA’

INTENSITA’

VLFR (Very Low Fluence Response)

LFR (Low Fluence Response)

HIR (High Irradiance Response)

(µmoli/m2)

Risposte mediate dal fitocromo

• Quantità di luce richiesta

• Fotoreversibilità

• Tempo di fuga

Response mode

Fluence requirement PhotoreversibilityReciprocity valid

VLFR 100 pmol/m2–100 nmol/m2 no yes

LFR 1–1000  μmol/m2 yes yes

HIR >1000   μmol/m2 no no

Fluence requirements are based on Mancinelli, 1994 and references therein. LFR fluence requirements are for red light.

VLFR• Risposte con quantità di fotoni molto basse (da

0.0001 fino a 0.1 µmoli/m2): un decimo dei fotoni emessi da una lucciola durante un impulso

• Non fotoreversibili• La luce produce quantità molto piccole di Pfr

(<0.02%): qualsiasi luce non può esimersi dal produrre Pfr

La luce far red converte solo il 97% del Pfr in Pr, per cui circa il 3% del fitocromo rimane come Pfr. Questo è molto di più dello 0.02% richiesto per indurre le risposte VLFR.

E’ la forma Pfr quella attiva (che scatena la risposta biologica)

PhyA funziona in questo modalità (ma non solo)

VLFR (Very Low Fluence Response)

LFR (Low Fluence Response)

HIR (High Irradiance Response)

Spettro d’azione HIR per l’inibizione della crescita dell’ipocotile

(germinelli di lattuga al buio)

Lo spettro d’azione non coincide con quello del fitocromo: sia il fitocromo che un altro recettore (criptocromo) contribuiscono ad inibire la crescita

I due effetti si sovrappongono nello spettro di azione (ma è possibile distinguerli)

Ruoli antagonisti di PhyA e PhyB nel de-eziolamento

Nelle risposte a bassa fluenza (LFR) è la % di Pfr che determina la risposta

Nelle risposte ad alta irradianza (HIR) è importante il valore di Pr/Pfr

Wild type (A), and mutants in phyA (B), phyB (C), phyBDE (D), phyABE (E) and phyABDE (F). Seedlings were grown in 8 h photoperiods of white light at 120 µmol photons m-2 sec-1. Scale bar represents 5 mm.

Pfr determina l’effetto (e non la scomparsa di Pr):Mutanti Arabidopsis senza la maggior parte dei fitocromi sono hy (hanno l’ipocotile lungo) in luce bianca o rossa

phyABDE

wt phyA phyB

phyBDE

phyABE

In luce bianca bassissima phyA non germina

In luce rossa phyB ha l’ipocotile lungo

In luce rossa l’espressione di PhyC e PhyD (e anche PhyA) dipende da PhyB

Gli effetti sono dovuti alle regolazioni incrociate o alla mutazione?

L’effetto delle mutazioni varia con la specie: in pomodoro senza PhyA e i due PhyB, i frutti (ma solo quelli) mancano di clorofilla

La luce come segnale influenza molti processi del ciclo vitale

Il rapporto R/FR influenza non solo l’allungamento dell’ipocotile...

Molte piante quando esposte a luce con un basso rapporto di R/FR, hanno una risposta denominata “fuga dall’ombra” (shade avoidance)

In questo modo la pianta esplora lo spazio intorno alla ricerca di luce ottimale

NON è solo una questione di quantità di luce.

Il sensore R/FR aiuta a sentire la presenza di competitori

(A) Seedlings of Datura ferox growing at increasing densities (32, 100 and 240 seedlings m-2) for three weeks. (B) As an even canopy develops with time, perception of the neighbors stimulates stem elongation, and increased leaf area results in a decrease in light intereception per plant. However, the elongation response precedes mutual shading.

La risposta all’allungamento risponde al rapporto R/FR, NON alla quantità di luce

FUGA DALL’OMBRA

luce rossa

Le piante sciafile (che amano l’ombra) non hanno questa risposta (o l’hanno ridotta)

Le vecchie varietà di mais erano piantate a circa 30.000 piante/ettaro

Le varietà moderne sono piantate a una densità di 70-80.000 piante /ettaro

Come è fatto il fitocromo?

Cromoforo + Apoproteina = Oloproteina

Fitocromobilina + Catena polipeptidica = Fitocromo

Prodotti di degradazione dell’eme nei sistemi animali

Structura delle forme di Pr e Pfr del cromoforo (fitocromobilina)

Nell’isomero cis l’azoto e il metile sono in cis

Nell’isomero trans vale il contrario

L’assorbimento della luce porta ad una isomerizzazione del cromoforo

L’isomerizzazione causa a sua volta un cambio nella conformazione della proteina

Sintesi del cromoforo

Assemblaggio del fitocromo (Pr)

Conversione in Pfr

Effetto biologicoIsomerizzazione cis-trans e

cambio conformazionale

Effetti di Pfr

C’è anche un effetto sui flussi di ioni (molto veloce)

L’esposizione del NLS determina l’importo nel nucleo con un

effetto sull’espressione genica

Il fitocromo è una proteina kinasi autofosforilante

L’attività del fitocromo è modulata dallo stato di fosforilazione

La fosforilazione regolatoria avviene in siti diversi dall’autofosforilazione

Proteine COP regolano il turnover di regolatori dello sviluppo

Giorno

Notte

COP1 interagisce con il fitocromo

(dopo la traslocazione al nucleo)

Meccanismo d’azione e secondi messaggeri

Il mutante aurea di pomodoro non sente lo stimolo fotomorfogrnrtico. Fornendo fitocromo e luce rossa (o cGMP e Ca2+) si induce il rinverdimento

cGMP, Ca++, calmodulina e le proteine G sono secondi messaggeri

Il network a valle è complesso e lungi dall’essere chiarito

Si conoscono alcuni early targets come un fattore di trascrizione Myb che a sua volta regola i geni fotosintetici come LhcB (Light Harvesting Complex B)

L’induzione de messaggero di Myb è molto precoce e precede quella del messaggero di LhcB

WT al buio cop1 al buio

Mutante cop1D costitutive photomorphogenesis1

COP / DET / FUS

Fenotipo fusca

Spettro d’azione ad alta intensità per l’inibizione della crescita dell’ipocotile

(germinelli di lattuga al buio)

Nella zona blu dello spettro l’inibizione della crescita da chi è mediata?

Mutanti di Arabidopsis phyA phyB sono ancora inibiti dalla luce blu per quanto riguarda l’allungamento dell’ipocotile Non può essere il fitocromo, deve esistere un recettore per il blu

Effetto dovuto a PhyA

Effetto dovuto al Criptocromo

Recettori per il blu: CRIPTOCROMI

Cry 1, 2 in Arabidopsis

Fenotipo del mutante hy4 (= cry1)

Alla luce CRY1 è stabile, mentre CRY2 viene degradato.

Sullivan and Deng, Developmental Biology 260 (2003) 289–297

La loro attività è regolata da fosforilazione. Interagiscono con PHYA che le fosforila

CriptocromoGli effetti della luce blu sono veloci

Spettro d’azione

Anche per il criptocromo esistono eventi precoci sulla membrana plasmatica (attivazione di canali anionici) e regolazione della trascrizione. Traslocano al nucleo in seguito ad illuminazione e interagiscono con COP1.

Physiological characteristics of cryptochrome and phototropin mutants.

Christie J M , Briggs W R J. Biol. Chem. 2001;276:11457-11460

©2001 by American Society for Biochemistry and Molecular Biology

Fototropismo: non è mediato dal criptocromo perché i mutanti cry1 e cry1cry2 hanno una risposta fototropica normale al blu.

Nph1 (non phototropic1) rinominato phot1 (phototropin1)

Light sensing by the LOV domains of phototropin.

Christie J M , Briggs W R J. Biol. Chem. 2001;276:11457-11460

©2001 by American Society for Biochemistry and Molecular Biology

Le fototropine hanno come cromoforo FMN.In seguito all’assorbimento della luce si forma un legame covalente

The +cry1, +cry1T, +cry2, and +cry2T mutants show hypocotyl curvatures that are irrelevant to the phototropic vector.

Ohgishi M et al. PNAS 2004;101:2223-2228

©2004 by National Academy of Sciences

Risposta fototropica del wt (WS e Ler) e del mutante quadruplo

Phot2 media le risposta afluenza più alta

Stomatal opening under blue light

Mao J et al. PNAS 2005;102:12270-12275

©2005 by National Academy of Sciences

Cry1 e Cry2 regolano l’apertura stomatica alla luce blu

Assorbimento della luce cascata di eventi risposte fisiologiche Spesso una risposta fisiologica è influenzata da più fotorecettori e mediata dalla modulazione dell’attività/azione di più ormoni (es. il fototropismo implica la redistribuzione laterale di auxina)

Il fitocromo e i recettori della luce blu esplorano zone diverse dello spettro

Integratori dei segnali che arrivano dai vari recettori