Post on 01-May-2015
Enzimi di restrizione
• riconoscono sequenze specifiche, in genere di 4-6 nucleotidi, di DNA a doppio filamento.
• Queste sequenze sono generalmente palindromi, cioè identiche se lette in direzione 5'--> 3' sia su un filamento che sull'altro.
-Servono a tagliare il DNA in modo preciso e prevedibile
-Sono stati isolati più di 1200 enzimi da procarioti
-Riconoscono più di 130 diverse sequenze nucleotidiche (sequenze palindromiche di 4, 6 o 8 nucleotidi).
Il nome deriva dal batterio da cui è stato isolato:EcoRI E = genere Escherichia
co = specie coli GAATTC R = ceppo RY13 CTTAAG I = prima endonucleasi isolata
BamHI B = genere Bacillus am = specie amyloliquefaciens GGATCC H = ceppo H CCTAGG I = prima endonucleasi isolata
Simmetria binaria
Tipi di taglio
• -BLUNT ENDS O TAGLIO NETTO • Es. SmaI• 5’-CCC GGG-3’ 5’-CCC-3’ 5’- GGG-3’• 3’-GGG CCC-5’ 3’-GGG-5’ 3’-CCC-5’
• -STICKY ENDS O CODINE ADESIVE:• -5’ PROTRUDING (5’ SPORGENTE)• -3’ PROTRUDING (3’ SPORGENTE)
– Es. Eco RI (5’ PROTRUDING)• 5’-G/AATTC-3’ 5’-G-3’ 5’-AATTC-3’• 3’-CTTAA/G-5’ 3’-CTTAA-5’ 3’-G-5’
– Es. Kpn I (3’ PROTRUDING)• 5’-GGTAC/C-3’ 5’-GGTAC -3’ 5’-C-3’• 3’-C/CATGG-5’ 3’-C-5’ 3’-CATGG-5’
Quante volte taglia un enzima
• Probabilità di trovare un sito di restrizione:
• basi probabilità
• 4 (1/4)4 = 1/256
• 5 (1/4)5 = 1/1024
• 6 (1/4)6 = 1/4096
• 8 (1/4)8 = 1/65536
DNA ligasi
defosforilazione
Gel elettroforesi
Southern blot
• Il Southern Blot è una tecnica che permette di identificare la presenza del frammento di DNA che a noi interessa tra una miscela di tantissimi frammenti.
Chimica del DNA
• Soluzione viscosa a pH 7• Diminuzione viscosità a pH estremi o a
T> 80°C• Denaturazione ( aumento D.O)• Rinaturazione (diminuzione D.O.)• Formazione di ibridi anche tra catene di
specie diverse• I nucleotidi vanno incontro a
trasformazioni chimiche (mutazioni)
DENATURAZIONE E RINATURAZIONE
La denaturazione del DNA consiste nella separazione completa dei due filamenti complementari che lo costituiscono. Il processo inverso è detto rinaturazione.
ANALISI FISICA
Effetto ipercromico:Aumento dell’A260nm durante il processo di denaturazione del DNA.
Temperatura di melting (Tm):Temperatura in corrispondenza della quale il DNA è denaturato al 50%.
Maggiore è G+C, maggiore è Tm.
Gra
do d
i d
en
atu
razi
on
e
(%)
40 60 80 100
50
0
1.3
1.2
1.1
1.0
Temperatura (°C)
Assorb
an
za a
26
0 n
m
Tm
Curva di fusione
CINETICA di RINATURAZIONE
Effetto ipocromico:
Diminuzione dell’A260nm durante il processo di rinaturazione del DNA.
Parametri che influenzano la rinaturazione:
1) C0 Concentrazione espressa in nucleotidi/unità di volume
2) Tempo
La misura della velocità di rinaturazione può fornire utili informazioni circa la complessità del DNA
Log CotR
inatu
razi
on
e (
%)
DNA arinaturazionerapida
0
50
100
-2 -1 0 1 2 3 4 5
Curva C0t
DNA arinaturazionelenta
forma A forma B forma Z
Senso elica destrorsa destrorsa sinistrorsa
Diametro 26 A 20 A 12 A
Coppie di basiper ogni girodi elica 11 10.5 12
Distanza tra basi 2.6 A 3.4 A 3.7 A
Piegamento basirispetto all’assedell’elica 20° 6° 7°
Conformazionedello zucchero C-3’ endo C-2’ endo C-2’ endo per pirimidine
C-3’ endo per purine
ConformazioneLegame glucosidico anti anti anti per pirimidine
sin per purine
Cot
Fig. 13 Curva di Cot
% ss DNArimanente
SONDE E MARCATURA
• La sonda è un frammento specifico di DNA (o RNA), reso radioattivo, capace di riconoscere una sequenza complementare di DNA o RNA in una popolazione di tanti frammenti.
Metodi di marcatura
• Nick transaltion
• Random priming
• Marcatura terminale
5’P -3’OH
3’OH -5P’
nick con un -OH disponibile
5’P -3’OH
3’OH -5P’
5’P -3’OH
3’OH -5P’
5’P -3’OH
3’OH -5P’
L’attività 3’5’ esonucleasicarimuove il nucleotide
L’attività 5’3’ polimerasicasostituisce il nucleotide
L’attività 5’3’ esonucleasicasposta il nick verso il 3’
-3’OH5’P
3’OH -5P’
Denaturazione ed appaiamento
degli esanucleotidi casuali
5’P -3’OH
3’P 5’OH
Enzima Klenow + dNTP*
5’P -3’OH
3’P 5’OH
MARCATURA delle SONDE OLIGONUCLEOTIDICHE
RANDOM PRIMING Metodo dell’innesco casuale
NICK TRANSLATIONSpostamento dell’incisione
3’- -5’
-3’3’- -5’5’-
DNA
denaturazione
aggiunta di inneschi esanucleotidici3’-GCATGC-5’
5’-TGCAGT-3’
5’-GCATAC-3’
3’-TAGCAG-5’
ibridizzazazione
-3’5’-3’-TAGCAG-5’3’-TAGCAG-5’
-5’3’-
5’-TGCAGT-3’ 5’-GCATAC-3’
Frammento di Klenow,dNTP
dATP32P-dCTP
dTTPdGTP Sintesi DNA
-3’5’-3’-TAGCAG-5’
-5’3’-
5’-TGCAGT-3’ 5’-GCATAC-3’
3’-TAGCAG-5’
DNA sonda
marcato
denaturazione
riempimento del buco prodotto con un nucleotide radioattivo e rimozione del
nucleotide successivo
-3’3’- -5’5’-
DNAG C G C A A G
C G C G T T C
-3’3’- -5’5’- G G C A A G
C G C G T T C
-3’
3’- -5’5’- G C C A A G
C G C G T T C
-3’3’- -5’5’- G C G A A G
C G C G T T C
-3’3’- -5’5’- G C G C A G
C G C G T T C
32P-dCTP
32P-dCTP
dGTP il taglio si muove in direzione 5’-3’
taglio di un’elica e rimozione di un nucleotide
mediante la DNA polimerasi I
Pol I
3’OH -5P’
5’P -3’OH
Trattamento con fosfatasi
3’OH -5’OH
5’OH -3’OH
Polinucleotide chinasi+[32P]dATP
3’OH -5P’
5’P -3’OH
• I tipi di marcatura non radioattiva sono essenzialmente:
• -marcatura isotopica diretta (incorporazione di nucleotidi modificati conteneti un fluorocromo, cioè un gruppo chimico in grado di emettere fluorescenza se esposto alla luce di una certa ;
• -marcatura indiretta ( associazione tra una molecola indicatrice e un precursore nucleotidico).
• I sistemi più usati sono:• -Il sistema biotina-streptavidina
-La digossigenina
HN
O
O NdUTP
Uracile
Desossiribosio
Trifosfato
HN
O
S
NH
Biotina
Uracile
C U C G A G A U G U C A UG A G C T C T A C A G T A
B B B B
DNA sonda
DNA target
A U G U CT A C A G
B B
EA
EA
A U G U CT A C A G
B B
FA
FA
Ibridazione del DNA sonda colDNA bersaglio dei cromosomi
(A) Avidina-enzima (B) Avidina-fluoroforo
PRINCIPIO DELLE SONDE NON RADIOATTIVE:
Affinità molto elevate tra Biotina e Avidina o Streptavidina
E = molecole reporter fosfatasi alcalina o -galattossidasi
F = molecole reporter
Ibridazione
• L’ibridazione è quel processo per cui due filamenti di DNA (o RNA) possono appaiarsi e formare un ibrido (doppia elica) più o meno stabile mediante la formazione di legame idrogeno per un certo numero di basi complementari.
• L’ibrido può formarsi tra DNA/DNA e DNA/RNA.
• L’ibridazione può avvenire anche tra molecole di DNA non perfettamente complementari.
• Sono molto importanti le condizioni sperimentali.
Condizioni stringenti• Vengono definite condizioni stringenti, quelle condizioni
sperimentali che permettono la migliore ibridazione.
• Condizioni di ibridazione piu’ stringenti (richiedono maggiore percentuale di omologia tra sonda e bersaglio):– maggiore Temperatura– minore concentrazione salina– presenza di denaturanti chimici
• Condizioni di ibridazione meno stringenti (permettono minore percentuale di omologia tra sonda e bersaglio):– minore Temperatura– maggiore concentrazione salina– assenza di denaturanti chimici
Mappe di restrizione in diagnostica
...MAPPATURA di RESTRIZIONE
62 1
A B
TRATTAMENTO DIMENSIONE deiFRAMMENTI (Kb)
INTERPRETAZIONE
Nessuna digestione
Enzima A
Enzima B
Enzima A+ B
9
A
2 7
A
3 6
B
A
36
B
4 3
A B
2
9
2 + 7
3 + 6
2 + 3 + 4
1 + 2 + 6
Sequenziamentocon isotopi radioattivi
a = adeninac = citosinag = guaninat = timina
g t a c g t a c g t a c g t a c
MICROSATELLITE
ripetizione: adenina e citosinaacacacacacacacacacacacacacacac
dinucleotide :(ac)15
SanguePeli Seme
1) ESTRAZIONE DEL DNA
Doppia
Elica
DNA
Individuo A Individuo B Individuo C campione di controllo
3 paia di cromoso
mi
omologhi
2) PCR Polymerase Chain Reaction
3) ELETTROFORESI
Sequenziatore Automatico
Immagine Computerizzata dell’ elettroforesi
Elettroferogrammadi un campione con 12 microsatelliti
PADRE
MADRE
FIGLIO
FIGLIO
GENOTIPO: 263/263
GENOTIPO: 263/277
GENOTIPO: 263/277
GENOTIPO: 263/263
DIAGNOSI POSITIVA
Profilo genetico di un campione
MADRE
FIGLIO
PADRE
FIGLIO
GENOTIPO: 263/277
GENOTIPO: 263/277
GENOTIPO: 263/263
GENOTIPO: 263/263
263
263 277
263
263 277
MADRE
FIGLIO
FIGLIO
PADRE
FIGLIO
GENOTIPO: 128/140
GENOTIPO: 128/146
GENOTIPO: 128/128
GENOTIPO: 124/128
GENOTIPO: 128/128
128 140
128 146
128
124128
128
DIAGNOSI POSITIVA DIAGNOSI NEGATIVA