LE NUOVE TERAPIE CELLULARI: IL LABORATORIO TRASLAZIONALE

CROAviano

Dr. Mario Moreno Mazzucato

Dipartimento di Ricerca Traslazionale

S.O.S.D TCS-TC (Stem Cell)

È una cellula capace di rinnovarsi, di

replicare se stessa per un tempo indefinito,

ma anche di dare origine a tutte le cellule

presenti nel sangue circolante».

Prof. Adolfo Ferrata, 1920: Emoistioblasto

A. Wilson: Ann. N.Y. Acad. Sci. 1106: 64–75

(2007). C 2007 New York Academy of

Sciences.

CD150+, CD34-,

CD45-

CD150+, CD34+, CD45+,

CXCR4, MPL

CD150+, CD34+, CD41+,

CXCR4, MPL

CD41+, CXCR4, MPL+,

VWF

CELLULE STAMINALI SONO RICHIAMATE DA TESSUTI

DANNEGGIATI

Trapianto di cuoreDonna(donatore)-uomo(ricevente

Cardiomiociti(actina sarcomerica)

Cromosoma Y

Muscolatura liscia(actina della muscolatura

liscia)

Cellule endoteliali(Fattore VIII)

Arterioli coronari

Cellule endoteliali(Fattore VIII)

Capillari venosi

PLASTICITA’ DELLE CELLULE STAMINALI ADULTE

DEFINIZIONE DI PLASTICITA’

Cellule staminali del midollo osseo, chenormalmente danno origine alle cellule maturedel sangue, possono, in opportune condizioni econ bassa frequenza, dare origine a cellulemuscolari scheletriche, cardiache o lisce,neuroni, epatociti e cellule epiteliali.

D.E. Discher: SCIENCE VOL 324 26 JUNE 2009

Fig. 1. Stem cell niche and designs. (A) Soluble and matrix-bound factors combine with cell-cell contact,

cell-matrix adhesion, and gradients to direct cell fate. (B) Substrates with micropatterns of ECM control the

size of ESC colonies and pluripotency based on immunofluorescence for the transcription factor Oct4 (in

two dimensions, 2D) (7). (Plot) Large islands increase the pluripotent population; small islands inhibit

with a time constant of 24 hours. (C) Substrates with microwells help to standardize the diameter of

quasi-spherical embryoid bodies (15). Cells and ECM (laminin) exhibit a spherically symmetric pattern

(in three dimensions, 3D), with pluripotent cells in the inside.

Fig. 2. Forces and ECM in stem cell trafficking. (A) To extravasate from the circulation and invade a tissue, stem cells must adhere

strongly to the vessel wall and withstand high flow forces. Within a tissue, additional physical factors can direct motile cells,

including durotaxis into stiff, fibrotic regions of tissue where cells engraft. (B) Soft tissue elasticity scale ranging from soft brain (72),

fat (73), and striated muscle (21), to stiff cartilage [E ≈ 20 to 30 kPa at the scale of adhesions (74, 75)] and precalcified bone (21).

(C) In vitro substrates that mimic soft and stiff tissue microenvironments (left) show that cells anchor more strongly to stiff

substrates, building focal adhesions and actin-myosin stress fibers. (Right) Matrix adhesion and growth factors influence both cell

physiology and lineage. Signals from growth factor receptors not only propagate into the nucleus (dashed blue arrow) and direct

transcription (black arrow), but also affect Rho-GTPase (guanosine triphosphatase) activity (dotted blue arrow). Rac drives motility

forward, and Rho regulates contraction of stress fibers (red), and both can also influence gene expression (dotted red arrow).D.E. Discher: SCIENCE VOL 324 26 JUNE 2009

Cell Differentiation

YAP/TAZ (transcription regulators) in mechanotransduction

Dupont S.; Nature, 2011; 474: 179-185

PATRIMONIO GENETICO COMUNE

CELLULA INDIFFERENZIATA(STAMINALE/TOTI-PLURIPOTENTE)

CELLULA DIFFERENZIATA(ESPRESSIONE DI GENI SPECIFICI)

DIFFERENZIAMENTODEDIFFERENZIAMENTORIPROGRAMMAZIONE

iPSCs?

Checkpoint

Stimoli esterni

Fattori di crescita

Adesione cellulare

Ligando recettore

Sintesi

STIMOLI AMBIENTALI

Checkpoint

Controllo DNA

Duplicato

Checkpoint

Danno del DNA

CheckpointVerifica del

Fuso mitotico

Figure 1. The Generation of iPSCs Is a Multistep Process that Can Be Modulated by Extracellular Cues and Reprogramming

Factor Levels. Known events occurring in early, middle, and late phases during the OSKM-mediated reprogramming of mouse

embryonic fibroblasts to iPSCs are depicted.During the final emergence of fully reprogrammed iPSCs, so-called

„„reprogramming-competent cells‟‟ appear to be inhibited by the continued expression of the factors. The reprogramming

process can be preferentially trapped in partially reprogrammed states when certain reprogramming factor levels and/or

stoichiometries are employed (top) or can be redirected to a different cell identity, without going through the pluripotent state, by

changing culture/growth factor conditions and timing of OSKM expression (bottom).

Bernadett Papp and Kathrin Plath: Cell 152, March 14, 2013

John B. Gurdon Shinya Yamanaka

Nobel 2012 per la Medicina

iPSC: cellule staminali pluripotenti indotte

Volume 4

EU Guidelines to

Good Manufacturing Practice

Medicinal Products for Human and Veterinary Use

TERAPIE CELLULARI

Cellule

staminaliProdotti medicinali a

base di cellule

Manipolazione

cellulare estensivaUso Clinico

PRODOTTO MEDICINALE PER TERAPIA CELLULARE (PTC)

“Si intende con Prodotto medicinale per Terapia Cellulare (PTC) ogni

preparazione che venga somministrata a un essere umano con finalità

analoghe ai Medicinali che contenga cellule vive o parti complesse di

esse, sia che queste siano somministrate da sole o insieme a

matrici/involucri di origine sintetica o biologica”.

LINEE GUIDA SUI PRODOTTI PER TERAPIA CELLULARE

Notiziario ISS volume 17, n° 7-8 Luglio-Agosto 2004

IL PERCORSO VIRTUOSO DI UN PRODOTTO DI TERAPIA CELLULARE

DAL LABORATORIO AL “LETTO DEL MALATO”

• Dati in modelli pre-clinici

• Validazione delle procedure in condizioni GMP

• Sottomissione ed approvazione del dossier di sperimentazione da parte

ISS o AIFA

• Approvazione del protocollo da parte del Comitato Etico locale

• Produzione GMP in una Cell Factory autorizzata dall‟ AIFA e dotata di

almeno una Qualified Person

• Registrazione di tutti i casi arruolati in studi clinici con PTC in un

registro nazionale

IL SISTEMA DI ASSICURAZIONE DELLA QUALITA‟

NELLA PRODUZIONE DI UN MEDICINALE

Materia prima

Processo produttivo

Controllo di qualità

Prodotto finale

Conformità con le

specifiche di rilascio

Sistema di assicurazione della qualità

sicurezza

qualità

efficacia

I MACROELEMENTI DELL’ASSICURAZIONE DELLA QUALITA’ (2)

Materia prima Prodotto finale

Training del

personale Documentazione

Standard

Pulizia e

sanitizzazione

Comportamento e

vestizione

Direttore MedicoQP: Mario Mazzucato

Responsabile Assicurazione Qualità:

Cristina Durante

Responsabile Qualità: Francesco Agostini (QP)

Responsabile Produzione: Stefania Zanolin

Organigramma “Cell Factory” CRO-IRCCS AVIANO

OP Produzione: Marco Valvasori

SettembreIncontro a Monza

DDG 111 21 giugnoAccordo con Monza

Luglio/Dicembre/Marzo2014Progettazione

Layout-User Requirements

Novembre/DicembreAddetsramento

Direttore e TLB Produzione

DicembreRinnovo Accordo

DDG 111 21 giugno 2013

Attività addestramento personale/Opere Strutturali

CRO-Aviano/Lab. “Stefano Verri” Monza

2012 2013 2014 2015 2016 2017

MarzoAddestramento

RQ/RAQ

Dicembre 2014Magazzino

criogenico di prodotto finito

Procedure di Gara

C.R.O.-IRCCS AvianoProtocolli clinici sperimentali di terapia avanzata

Cellule Mesenchimali(MSC)

Cytotoxic T-cell Lines(EBV-CTL)

Megacariociti(MKS)

Chimeric Antigen Receptor –T-Cell(CAR Cell)

Da Tessuto Adiposo

Da Sangue Midollare

Medicina Rigenerativa:

-Ricostruzione Mammaria

post mastectomia

-Ricostruzione Tessuti molli

post chirurgia oncologica

-Immunomodulante: GVHD

Autologo/Allogenico

Autologo -Linfomi EBV associati

Autologo/Allogenico -Piastrinopenie

iporigenerative

Autologo -Onco-ematologia,

Oncologia

Mundra V. et al.

Depositi adiposi (sottocutanei) facilmente accessibili con procedura semplice (liposuzione)

Procedura di raccolta sicura e ben tollerata, economica e poco invasiva

Rapporto Stem Cells/grammo tessuto estremamente elevato (fino a 2x10^5/grammo di tessuto adiposo, mille volte in più rispetto alle MSC del midollo osseo)

non necessitano di espansione ex-vivo

alta numerosità anche 1000 volte superiore rispetto a quelle del

midollo osseo

Cellule Mesenchimali da Tessuto Grasso

Grasso Liquido

Collagene/Adipociti/Detriti

Cellule pellet/eritrociti

Marco L. Davila et al.

HT-1080/NG2+

SUBSTRATE: Collagen Type VI

DISPOSITIVI IN GRADO DI FORNIRE UN AMBIENTEADEGUATO ALLA CRESCITA DI ORGANISMI BIOLOGICI

BIOREATTORI

AMBITI DI UTILIZZO:FarmaceuticaAlimentareEnergeticaDepurazioneBiotecnologieEcc……

BIOREATTORI

STATICI

DINAMICI

BIOMIMETICI

3D Flow Bioreactor

Pallotta et al.: TISSUE ENGINEERING:. 2011: 12 (17); 1223-1232

Megacariociti/Attivazione

MEGAKARYOCYTE/PROPLATELET

Trombi piastrinici su collagene fibrillare più VWF (15mg/ml) efibrinogeno (100mg/ml), shear rate 50sec-1. Le piastrine sono stateprodotte da bioreattore a partire da megacariociti al 14 giorno dicultura.

2013 2014 2015 2016 2017

MSC

EBV-CTL

MKS

CAR Cell

Realizzo Cell Factory

Capitolato/Gara/Costruzione ?

Gene

Terapy

Cell

Terapy

Protocolli clinici sperimentali di terapia avanzata

Traslazione in GMP del protocollo sperimentale e iter autorizzativo AIFA

Produzione

Protocollo sperimentale fase di ricerca preclinica

CRO-Aviano/Lab. “Stefano Verri” Monza

Layout, User

Requirements

Cell FactoryC.R.O.-IRCCS Aviano

SOSTENIMENTO ECONOMICO/DIVULGATIVO

C.R.O.-IRCCSAviano

Fondazione CRO Aviano ONLUS

Associazioni Volontariato

AIL, AVIS, ADMO, AFDS, AIRC, ADISCO, Via di Natale

Soggetti /Enti Privati, Banche

Trasferimento Tecnologico

Progetto Obbiettivo

Smart ClotStem Cell

Fattori di crescitaintrapiastrinici

GRAZIE PER L’ATTENZIONE