Colture cellulari

Colture cellulari

Cellule che si moltiplicano “in vitro” per una o più generazioni, utilizzate nella ricerca come modello sperimentale in innumerevoli tipi di esperimenti.

Sono utilizzate per analizzare l'effetto di farmaci e verificare tossicità, mutagenicità e cancerogenicità delle sostanze. Vengono inoltre utilizzate come modello in cui studiare effetto dell'espressione di particolari geni.

Vantaggi: !  Controllo condizioni ambientali !  plasticità dei modelli !  Caratterizzazione ed omogeneità !  Economicità e rapidità risposta !  Riduzione sperimentazione in vivo

Svantaggi: •  Perdita di funzioni organo-specifiche e di alcune attività enzimatiche •  Accelerazione del ciclo cellulare •  Alterazioni morfologiche e delle proprietà antigeniche

Colture cellulari

Colture cellulari

Colture a termine (Colture Primarie)

La coltura da espianti viene definita coltura a termine per indicare che le cellule isolate da qualsiasi tessuto animale sono in grado di compiere un numero finito di divisioni cellulari in vitro per poi andare incontro a degenerazione e morte.

Colture continue (Linee Cellulari) Sono cellule in cui mutazioni spontanee o indotte hanno annullato il programma genetico della senescenza. Possono essere coltivate in vitro per un tempo indefinito

TIPO DI PREPARAZIONE

SISTEMI INTATTI

COLTURE D’ORGANO

COLTURE PRIMARIE

LINEE CELLULARI

Alterazioni rispetto alla situazione in vivo 0 ++ +++ ++++

Livello organizzazione tissutale ++++ ++++ + 0

riproducibilità ++++ ++++ + ++++ accessibilità + ++ +++ ++++ Manipolazioni genetiche + + + +++

Alterazioni genetiche per mutazione o selezione

+ + Da + a ++++

Controllo ambientale + ++ ++++ ++++

Colture cellulari: tipologie

Colture cellulari

ADERENTI SEMI-ADERENTI SOSPENSIONE

L’adesione è un fenomeno attivo che richiede l’interazione dei recettori di membrana, le integrine, con le proteine adesive, quali la fibronectina, adsorbite sulla piastra di coltura.

Colture cellulari: tipologie

cellule fusiformi fibroblasti

cellule poligonali cell. epiteliali

Colture di cellule aderenti

Le cellule aderenti vengono poste in piastra o in fiasca e crescono fino ad occupare l’intera superficie disponibile.

Piastrada6cmdidiametro:25cm2

Piastrada10cmdidiametro:55cm2

Fiaschepiccole:25cm2

Fiaschegrandi:75cm2

Le piastre per colture cellulari aderenti sono in polistirene ma sono trattate per renderle idrofile e cariche negativamente. In tal modo il polistirene lega stabilmente la fibronectina e la vitronectina presenti nel siero che permettono l’adesione di diversi tipi di cellule.

Dove trovare le linee cellulari:

•  Produzione in laboratorio

•  Banche cellule

–  American Tissue Culture Centre (USA) (www.atcc.org)

–  European Collection of Cell Culture (www.hpacultures.org.uk)

–  National Cell Culture Center (USA) (www.nccc.com)

–  German Collection of Microorganism and Cell Culture (www.dsmz.de)

–  IZS Centro Substrati Cellulari (www.bs.izs.it)

–  IST Servizio Biotecnologie (www.biotech.ist.unige.it)

–  Interlab Cell Line Collection (www.iclc.it)

Fabbisogni nutrizionali/ambientali

•  Terreni

•  Reagenti

•  Siero

•  pH

•  Temperatura

•  Umidità relativa

•  O2, %CO2

Terreni di coltura più usati

•  Eagle’s Basal Medium (BME, EMEM) •  Minimum Essential Medium (MEM) •  Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) •  Nutrient Mixture F-10 (HAM’s F-10) e Nutrient

Mixture F-12 (HAM’s F-12) •  DMEM/HAM’s F-12 •  Medium 199 •  NCTC Medium •  RPMI 1630 Medium •  RPMI 1640 Medium

Questi terreni differiscono tra loro per il contenuto in a.a. e sali e per la concentrazione di glucosio

Terreni: composizione

Amminoacidi Arginina Cistina Glutammina Istidina Isoleucina Leucina Lisina Metionina Fenilalanina Treonina Triptofano Tirosina Valina

Vitamine Biotina Colina Folato Nicotinammide Pantotenato Piridossale Tiamina Riboflavina

Sali NaCl KCl NaH2PO4 NaHCO3 CaCl2 MgCl2

Vari Glucosio Rosso Fenolo

Penicillina Streptomicina

Siero

NEAA

Sodio Piruvato

MEM

Glutammina

Il terreno al momento dell’uso viene completato con:

•  Formulazione aspecifica di fattori di crescita

•  Sostegno alla crescita per molti tipi cellulari

•  Aumenta la capacità tampone

•  Protegge dai danni meccanici

•  Facilita l’adesione

Siero Bovino (FBS, FCS, NCS)

Cavallo (DHS)

Prima del suo utilizzo, il siero viene disattivato in stufa a 56°C per 30’ allo scopo di eliminare il Sistema del Complemento, che potrebbe interferire con la crescita delle cellule.

SIERO

I terreni sono provvisti dell’indicatore rosso fenolo

7.3 6.8-7.0 > 7.6 pH

Il colore viola indica che le cellule non sono metabolicamente attive o che la regolazione della CO2 è errata.

Terreni: indicatore

Con il proliferare delle cellule il terreno tenderà al giallo a causa dell’acidificazione prodotta dalla CO2 proveniente dal metabolismo cellulare.

L’equilibrio di dissociazione del sistema tampone HCO3

-/H2CO3 è descritto dalla legge d’azione di massa, espressa come equazione di Henderson-Hasselbach, nella quale l’H2CO3 è inserito sotto forma di pCO2 moltiplicata per un coefficiente di solubilità della CO2 in H2O (si ottiene un dato in mEq/L)

HCO3-

0.0301 pCO2

pH = 6.1 + log

CO2 + H2O H2CO3 HCO3- + H+

CO2 e pH La pressione parziale di CO2 usata nella coltura delle cellule corrisponde alla pCO2 misurata all’interno dei tessuti (35-45 mmHg). In questo modo l’incubatore riproduce rigorosamente le naturali condizioni di sviluppo delle cellule.

Zavizion et al., 1996 Doubling Time, h 33°C 37°C 39

BME-UV1 cells 52-54 22-24 36-38

Crescita e Temperatura Le cellule possono sopportare l’ipotermia (sono conservate congelate) ma la loro attività metabolica è notevolmente disturbata.

Non possono sopportare l’ipertermia (anche piccoli aumenti di temperatura per brevi periodi possono far morire le cellule). Una temperatura di 43°C per pochi minuti provoca la morte per apoptosi.

L’umidità relativa RH è un parametro che è portato ad un livello elevato (RH >98%) senza necessariamente essere controllato. L’energia fornita dall’incubatore serve sia a mantenere la temperatura che ad evaporare l’acqua dall’apposito vassoio per portare il livello di umidità relativa alla giusta percentuale. L’obiettivo è di limitare l’evaporazione dell’acqua contenuta nei terreni di coltura per non provocare un aumento della pressione osmotica.

Crescita e umidità relativa

Disidratazione del terreno di coltura: ogni punto corrisponde ad una apertura della porta dell’incubatore

Miniaturizzazione supporti di crescita e RH

Piastra a 96 pozzetti: disidratazione del terreno di coltura dopo 72 h (% di disidratazione)

Colture di cellule aderenti

Le cellule aderenti vengono poste in piastra e crescono fino ad occupare l’intera superficie disponibile

Coltura confluente

A confluenza la crescita si arresta e le cellule devono essere trasferite in nuove piastre

72h48h24h 96h

Diagramma di crescita cellulare in vitro

arresto della crescita a confluenza

fase logaritmica di crescita

Subcolture Routine

conteggio

37°C, 5% CO2, 100% umidità, 3-5 giorni

esperimento

Tripsina 0.05% EDTA 0.53 nM

congelamento

scongelamento

semina

Prevenzione della contaminazione

Sono possibili differenti tipi di contaminazione

I principali tipi di contaminanti microbici :

Batteri e funghi

Micoplasma

Virus

La contaminazione può avvenire:

Errore dell’operatore

Terreni contaminati

Cappa a flusso laminare non funzionante

Incubatore contaminato

Conservazione in azoto liquido contaminato

Precauzioni per la prevenzione delle contaminazioni: 1) I terreni e le soluzioni che si usano devono essere tutti sterili

2) Aggiungere penicillina-streptomicina per scongiurare il pericolo di

contaminazioni da batteri; anfotericina B (se non tossica per le

cellule) contro i miceti.

3) Destinare il laboratorio solo alle colture cellulari

4) Operare sempre sotto cappa a flusso laminare

5) Utilizzare solo materiale sterile (di vetro o di plastica)

6) Utilizzare sempre pipettatori elettrici

7) Pulire bene la cappa a inizio e fine lavoro

8) Controllare periodicamente i filtri della cappa

9) Mantenere con attenzione ben pulito l’incubatore a 37°C

Prevenzione della contaminazione

Il laboratorio per le colture cellulari

incubatorecappa

centrifuga

microscopio

Test di vitalità cellulare e Citotossicità

La citotossicità è la proprietà di una sostanza di produrre a livello cellulare un qualche effetto tossico che si manifesta sottoforma di deviazioni dalla normale morfologia e funzionalità cellulare. I test di citotossicità rappresentano un “metodo di valutazione“ dei danni biologici provocati dalle sostanze.

Test più diffusi:

Trypan Blue

MTT

LDH

Test di vitalità cellulare

Saggio con il Trypan Blue Il Blu Tripano è un colorante utilizzato nel test di determinazione della vitalità cellulare. Questo colorante permette di discriminare tra le cellule vitali e quelle morte in quanto è assunto solo dalle cellule morte.

A= media delle cellule vive B= media delle cellule morte C= fattore di diluizione D= fattore di conversione in ml

Concentrazione cellule vive= A*C*D Concentrazione cellule morte=B*C*D

Volume della conta = 0,1x 1 mm2=0,1 mm3 Fattore di conversione= 104

(0,1 mm3=0,1ul= 10-4ml)

Punti cruciali

" Un’adeguata accuratezza della misura si ottiene contando almeno 100 cellule

" Il Trypan blue è tossico ed è un potenziale cancerogeno

" Le cellule devono essere ben distinte e uniformemente distribuite

" Evitare la presenza di bolle e detriti

" Non riempire eccessivamente la camera

" Se le cellule sono poche, operare una nuova centrifugazione e risospendere in meno terrreno

Test di vitalità cellulare

MTT(giallo)

Formazano(azzurro)

Il saggio MTT è un saggio colorimetrico standard per la misurazione dell'attività degli enzimi che riducono l‘MTT (bromuro di 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difenil tetrazolio) a formazano, conferendo alla sostanza un colore blu/violaceo. L'enzima mitocondriale succinato deidrogenasi (reduttasi), è attivo infatti soltanto nelle cellule vive e la sua funzione consiste nel tagliare l'anello di tetrazolio dell‘ MTT (sostanza di colore giallo) con la formazione, di conseguenza, di formazano (blu).

Saggio dell’MTT

Tale reazione è valutata e misurata mediante la lettura spettrofotometrica del campione, alla lunghezza d'onda di 570 nm. Ciò accade prevalentemente nei mitocondri; questo saggio può essere utilizzato per determinare la citotossicità di farmaci o altri tipi di sostanze chimicamente attive e potenzialmente tossiche.

Saggio dell’MTT

Un test di citotossicità sfrutta una reazione che normalmente avviene

all’interno delle cellule. L’enzima Lattato Deidrogenasi (LDH) è un enzima

Saggio di Citotossicità

LDHLDH

normalmente presente nel citoplasma

delle cellule e catalizza la reazione di

trasformazione del lattato in

piruvato.

In seguito ad un danno alla parete

cellulare l’enzima LDH dal citoplasma

si riversa all’esterno della cellula, e nel

caso di cellule in vitro, nel mezzo di

coltura.

Il test di citotossicità accoppia alla reazione dell’enzima Lattato

Deidrogenasi una reazione contraria dove il substrato è un composto

profluorescente (la Resazurina) che viene trasformato dall’enzima

Diaphorase in un composto fluorescente (la Resorufina).

Eccitatoa560nm

Emissionea590nm

Saggio di Citotossicità

Trasfezione

DNA TRASFEZIONE Non virale

INFEZIONE virale

Transiente Stabile

Linee ingegnerizzate: Linee transfettate con un gene di interesse (es. espressione di particolari recettori, modificazione di vie metaboliche, ecc)

Trasfezione

Transiente: Si usa per saggi a breve termine o

quando non è possibile ottenere cloni stabili

Stabile: si usa quando si devono fare esperimenti di lunga durata, quando si vuole maggiore

riproducibilità o quando l’efficienza di trasfezione in transiente è troppo bassa.

HBS 2X

DNA +

CaCl2

Coprecipitato DNA/Fosfato di Calcio

Principali metodiche di trasfezione di cellule di mammifero

Il coprecipitato si deposita sulle cellule e viene

fagocitato

Il DNA entra nel nucleo e il gene estraneo viene

espresso

1) Precipitazione con Fosfato di Calcio

! NO attrezzature particolari ! Reagenti facilmente disponibili e a basso costo ! OK diversi tipi cellulari ! OK trasfezioni stabili

2) Lipofezione 3) Elettroporazione

Principali metodiche di trasfezione di cellule di mammifero

Per staccare le cellule dal fondo si utilizza una soluzione di EDTA e tripsina

EDTA = chela il Ca++ ed il Mg++ indispensabili per l’adesione

Tripsina = degrada le proteine della matrice che mantengono le cellule aderenti.

Le cellule staccate devono essere riseminate in numero adeguato: non crescono in modo efficiente e vanno incontro

a morte se seminate al di sotto di una certa densità

Conteggio

Camera di Burker

1 mm

V=1mm2x0,1mm=10-4 ml

Crioconservazione delle colture cellulari

Banca Cellulare

Indicazioni generali:

•  Congelamento lento (pochi gradi al minuto)

•  Scongelamento rapido (subito a 37 °C)

•  Vitalità superiore al 90%

•  Cellule in fase di crescita logaritmica

•  Alta percentuale di siero (>20%)

•  Criopreservante: DMSO (10%) o glicerolo

•  Conservazione a T < -135°C (vapori di azoto, o azoto liquido)

•  Sistema di catalogazione