«Prevalenza di Campylobacter spp. in animali ed alimenti in Italia con particolare riferimento al settore avicolo»

Di Giannatale ElisabettaMilano 13/09/2018

XXVIII Convegno Nazionale AIVI,12-14 settembre 2018,Milano (Italia)«Attualità dell’igiene degli alimenti: stato dell’arte e prospettive future»

Di cosa parleremo

• Campylobacter e campilobacteriosi e dati generali sulle

contaminazioni animali e alimenti

• Dati su suini al macello, bovini e ovini

• Prevalenze e livelli di contaminazione al macello di

carcasse di pollo e nella carne al dettaglio (dati

monitoraggio 2015/2016)

• Prevalenza e livelli di contaminazione in carne bovina

(Hamburger e prodotti consumati crudi)

• Resistenza agli antibiotici e struttura della popolazione di

Campylobacter

• Focolaio Campylobacter in Abruzzo giugno 2018

Campylobacter : 38 specie e 16 sottospecie (http://www.bacterio.net/-allnamesac.html) (settembre 2018)

La specie tipo è C. jejuni ,3 sottospecie ;

…..altre specie sono conosciute come causa di infezione umana e importanti in termini di malattie di origine alimentare soprattutto nel gruppo dei termofili : C. jejuni, C. coli, C. lari, C. upsaliensis e C. helveticus…

Reservoir

Il serbatoio di diffusione del batterio è il contenuto intestinale degli animali, sia da reddito che selvatici

I polli rappresentano il principale serbatoio maiali, bovini e ovicaprini (sono generalmente considerate a basso rischio), tuttavia le frattaglie crude di questi animali sono a rischio piuttosto elevato di trasmissione così come il latte non pastorizzato

molte altre specie animali che albergano Campylobacter spp. possono essere fonte di infezioni umane.

Campylobacteriosi

Il periodo di incubazione da 2-5 giorni (range 1-10).

Sintomatologia: diarrea, dolori addominali, febbre, mal di testa, nausea e vomito. Generalmente questi sintomi sono autolimitanti e scompaiono nel giro di qualche giorno

Raramente letale (0,001- 0,003%)

Dose infettante <500 batteri

Sequele Sindromi Guillian Barrè e Miller Fisher – paralisi flaccida

Artrite reattiva (1-5%)

Sindrome dell’intestino irritabile, altre disfunzioni gastrointestinali

Trasmissione….dai serbatoi animali e dagli escrementi umani attraverso il cibo e l'ambiente idrico……………

http://www.waterpathogens.org/sites/default/files/Members%20of%20the%20family%20Campylobacteraceae%3A%20Campylobacter%20jejuni%2C%20Campylobacter%20coli.pdf

Report EFSA/ECDC,2017

Campylobacteriosi in ItaliaEFSA/ECDC,2017

62548 63280

70571 698297399972500

66383 66716

59797 58987

18287 1828720750 20960

24291

7901 8114 828813227

15556

774 1178 1252 1014 10570

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

80000

2012 2013 2014 2015 2016

Germania

UK

rep.Ceca

Spagna

Italia

Contaminazioni da Campylobacter :alcuni dati nazionali animali ed alimenti per l’uomo

«Il sistema informativo nazionale delle zoonosi (SINZOO) è un database funzionale alla sorveglianza e al controllo delle zoonosi e degli agenti zoonosici che produce le informazioni utili per le rendicontazioni all’EFSA (Dir. 2003/99/CE), raccogliendo gli esiti degli esami diagnostici effettuati su Mangimi, Animali ed Alimenti».

www.vetinfo.sanita.it

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

2013 2014 2015 2016 2017

Controllo ufficiale

HACCP

Indagine clinica

Progetti

Totale

Fig1.N° campioni e motivo del prelievo

0%

2%

4%

6%

2013 2014 2015 2016 2017

Fig.3-% Prevalenze Campylobacter spp.

Prevalenze

Animali2013-2017

28,07

5,13

18,82

32,09

10,64

1,22 4,04Bovini

Avicoli

Ovi-caprini

Selvatici

Pets

Maiali

Altro

0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 70,00 80,00

Bovini

Avicoli

Ovi-caprini

Selvatici

Pets

Maiali

Altro2017

2016

2015

2014

2013

Fig.4-Positività/totale positivi

Fig. 2 % campioni esaminati varie specie /totale(2013-2017)

ALIMENTI

2013-2017

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

2013 2014 2015 2016 2017

Controllo ufficiale

Prelievi su progetto

HACCP

Totale

Fig.1: Campioni e motivo di prelievo 2013-2017

Fig. 2 % tipologie campioni/totale campioni (2013-2017)

0,00

2,00

4,00

6,00

2013 2014 2015 2016 2017

Fig3. % Pr Campylobacter spp totale alimenti

Prevalenza

61,3

32,2

6,5

latte e derivati

carne e derivati

altro

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

2013 2014 2015 20162017

latte e devivati

carne e prod.base carne

altro

Fig.4: % campioni positivi/totale positivi (2013-2017)

Alcuni dati nei suini : 1 anno di monitoraggio

Campionamento :Abruzzo

Durata 12 mesi, 4 stagioni x 4 campionamenti a stagione

(16 totali)

N° animali 280 prelevati su 12308 macellati

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

Estate Autunno Inverno Primavera

Tampone carcassa

Feci

Regioni provenienza animali

Suini: Prevalenza di contaminazione delle carcasse

Carcasse contaminateLivelli di contaminazione

ufc/cmq

90.8% <10

7.8% 10-50

1.4% 100-150

32,86

50,36

Feci

carcasse

Fig.1: Prevalenza di contaminazione da Campylobacter coli in feci e carcasse

Fig.2: % delle carcasse contaminate e relativi livelli di contaminazione

Dati bovini ed ovini: giugno 2018

SpecieN°allevamen.

N°campioniFeci

Campioni Positivi Pr% C.jejuni C.coli

Bovini 4 156 55 35,25 55 4

Ovini 3 180 67 37,22 20 47

Alcuni dati nei carne bovina : 1 anno di monitoraggio (2015-2016)

Campioni: 1203 campioni rappresentati da : Punti prelievo:Centro-Nord-Sud

IZSTE-IZSTO-IZSFG

57,7

13,9

14,5

13,9Hamburger

Carpaccio

Battuta alcoltello

Salsiccia di Bra

Prevalenza=0,58%

Contaminazione carne bovina

MatriceTotale

campioni

Totale positivi

isolamento

Numerazione

C. coli C. jejuni<10ufc/g

10-100ufc/g

Battuta al coltello 181 0 181

Carpaccio 167 2 167 1 1

Salsiccia tipo Bra 166 1 166 1

Hamburger 689 4 685 1 3 1

Totale 1203 7 1202 1 4 3

Tabella 1. Livelli di contaminazione da Campylobacter spp in carne bovina

Campylobacter in allevamenti avicoli

Produzione di pollame(x 1,000 tonnes)

1st Poland

2nd France

3rd Germany

4th UK

5th Spain

6th Italy

7th Netherlands

8th Hungary

9th Romania

10th Portugal

1307

68154

Italy

Production Import Export

x 1,000 (tonnes)

Data from: Association of Poultry Processors and Poultry Trade in the EU Countries, Annual Report 2016

2015

Studi/pareri EFSA

EFSA Journal 2005“pubblica un parere sulla presenza di Campylobacter neglianimali e negli alimenti, dal quale è emerso che la principalefonte di campylobatteriosi è la carne di pollame

EFSA 2007su richiesta della Commissione europea, la task force per la raccolta di dati sulle zoonosi propone un programma di monitoraggio coordinato per Campylobacter nella carne di pollo nell’UE.Anno 2008 è stata condotta un’indagine in EU presenza di Campylobacter nei polli al macello (decisione 2007/516 / CE )

EFSA journal 2010b ; based on the combined results of the detection and enumeration method in the UE, 2008

C.jejuni, C.coli

Livelli di contaminazione carcasse : 2,72 Log UFC/g

L’EFSA analizza e pubblica i risultati nel 2010; il batterio contamina il 75,8% dei polli

documenti

EFSA Journal 2010d« gli esperti concludono che almeno il 20%-30% dei casi umani di campylobacteriosisono imputabili direttamente alla manipolazione, preparazione e consumo di carne di pollo, mentre il 30%-50% dei casi avrebbe comunque nel pollame la propria fonte d’infezione anche indiretta».

EFSA Journal 2010 c… »la probabilità di avere carcasse contaminate da Campylobacter sia 30 volte maggiore nei lotti di macellazione che pervengono già contaminati »….

EFSA Journal 2011; 9(4):2105“Il controllo di Campylobacter nella produzione primaria dei broiler ha unmaggiore impatto sulla salute pubblica rispetto a quelli che si possonoimplementare lungo la catena di produzione”

EFSA Journal 2015; 9(4):2105

………..Esiste una relazione lineare fra prevalenza di Campylobacter in allevamento e ilrischio per la salute pubblica e :

La riduzione della contaminazione nell’intestino del pollo al macello di 3 log, riduce il rischio per la salute pubblica del 90%

La riduzione della contaminazione delle carcasse di 1 log.riduce il rischio per la salute pubblica tra il 50% e il 90%

La riduzione della contaminazione delle carcasse di 2 log riduce il rischio per la salute pubblica di oltre il 90%.

Controllo

Campylobacteriosi

Criterio microbiologico

Biosicurezza

Misure d’intervento addizionali

Raffredamentorapido superficiale

……………………..

Lavaggio carcasse

Criterio microbiologico 1000 UFC riduzione rischio 50%

• 15% di produzione fuori dal criterio in EU

Criterio microbiologico 500 UFC riduzione rischio 90%

• una produzione fuori dai limite per il 45%

«qualsiasi strategia di controllo nei confronti del Campylobacter deve necessariamente porsi come obiettivo quello di una riduzione dell’incidenza dei casi nell’uomo»

L’applicazione dei criteri microbiologici che impatto determina sulla produzione avicola italiana?

Piano di monitoraggio al macello2015-2016

Obiettivi:

• determinare i livelli di contaminazione delle carcasse

prodotte nei mattatoi italiani;

• stimare i livelli di prevalenza di infezione negli

allevamenti da ingrasso italiani;

• stimare il numero atteso di lotti di macellazione non

conformi ed il livello di riduzione finale del rischio in caso

di applicazione di criteri microbiologici alla macellazione

• Determinazione della struttura di popolazione e dei profili

di antibiotico resistenza di Campylobacter nel pollo da carne

Piano di monitoraggio al macelloPopolazione di riferimento

5178 allevamenti da ingrasso

35 stabilimenti di macellazione

16%

18%

15%

16%

35%

Percentuale di campioni per Regione

ABRUZZO

EMILIA-ROMAGNA

LOMBARDIA

MARCHE

VENETO

Piano di campionamento

a) Campionamento casuale di 450 gruppi di polli da carne nel

corso di 1 anno dal momento dell’entrata in vigore del

Piano.

b) Per ciascun gruppo selezionato, sono selezionati 5

animali e prelevati:

5 “pacchetti” viscerali analizzati in pool per la verifica

della presenza di Campylobacter nel contenuto ciecale,

5 carcasse dopo il raffreddamento a fine catena, da cui

si preleva una porzione della cute del collo.

Gruppo: l’insieme di animali di uguale stato sanitario, appartenenti allo stesso ciclo produttivo, nel medesimo capannone, per i quali è possibile dimostrare la completa separazione fisica e gestionale, ed avviati assieme alla macellazione.

Piano di campionamento

Ripartizione dei campioni di cute del collo per i principali

produttori e Regioni di localizzazione dei mattatoi.

Prelievi da pelle petto

67 gruppi (x 5 carcasse )

Esempi di calcolo della ripartizione dei gruppi da campionare secondo le attività di macellazione mensili (i valori finali sono stati arrotondati all’unità più vicina).

Mese

gruppi macellati gruppi selezionati

taglia piccola taglia media taglia grande taglia piccola taglia media taglia grande

gen 200 300 500 1(*) 2(**) 3(***)

feb 100 300 500 1 2 3

mar 300 600 750 2 4 5

apr 200 150 500 1 1 3

mag 100 60 500 1 1 3

giu 100 150 250 1 1 2

lug 60 120 250 1 1 2

ago 40 60 250 1 0 2

set 300 450 250 2 3 2

ott 200 210 500 1 1 3

nov 200 300 250 1 2 3

dic 200 300 500 1 2 3

Totale 2000 3000 5000 14 20 34

69,2%

57,1%

74,1%

0,0%

10,0%

20,0%

30,0%

40,0%

50,0%

60,0%

70,0%

80,0%

90,0%

CUTE DEL COLLO CUTE DEL PETTO CIECO POOL

Campylobacter spp. Prevalenza (± L.C. 95%) nei lotti

LCI

LCS

PREV

monitoraggio 2015-2016Risultati

55,6%

48,3%

74,8%

0,0%

10,0%

20,0%

30,0%

40,0%

50,0%

60,0%

70,0%

80,0%

90,0%

CUTE DEL COLLO CUTE DEL PETTO CIECO POOL

Campylobacter spp. Prevalenza (± L.C. 95%) nelle carcasse

LCI

LCS

PREV

Monitoraggio 2015-2016risultati

2,949

2,498

6,810

0

1

2

3

4

5

6

7

8

cute collo cute petto ciechi

Log(

UFC

)/g

Campylobacter spp.Media (± L.C. 95%) della distribuzione dei livelli di contaminazione

LC sup 95%

LC inf 95%

Media

Dati sugli esitiRisultati

% di Campylobacter jejuni e C.coli nelle diverse matrici

0,00%

10,00%

20,00%

30,00%

40,00%

50,00%

60,00%

CIECO

PETTO

COLLO

JEJUNI

COLI

Criterio DescrizioneProbabilità di risultato sfavorevole

1º Criterio n=50 (pools of 3), m=103/g, c=5 7.676%2º Criterio n=50 (pools of 3), m=103/g, c=10 0.142%3º Criterio n=50 (pools of 3), m=103/g, c=15 0.000000%4º Criterio n=50 (pools of 3), m=103/g, c=20 0.000000%

Le probabilità di ottenere un risultato positivo per i criteri

ipotizzati sono :.

Domanda :quanto di questo Campylobacter arriva nell’alimento al dettaglio?

Piano alimenti al dettaglio 2015-2016 (IZSTE-IZSTO-IZSFG)

Determinazione della prevalenza e dei livelli di contaminazione Campylobacter spp. in carni di pollo prelevate al dettaglio

Piano di Campionamento e tipologia di campioni

Piano di campionamento

1244 campioni di carne di pollo (petto e coscia/sovraccoscia)in punti vendita al dettaglio durante l’arco di 1 anno (2015-2016)

Prelievi presso punti vendita: Nord (500),Centro (500) e Sud Italia (203)

Al fine di avere campioni rappresentativi dei consumi della popolazione del territorio, la stratificazione del campionamento è stata effettuata in base alla popolazione regionale

I punti vendita sono stati selezionati casualmente in grandi e piccoli centri abitati.

Prevalenze (%)

Totalecampioni

Totale campioni negativi

Totale campioni Positivi

P%

Coscia /sovracoscia 578 452 126 21,79

petto 665 580 90 13,53

Totale campioni 1243 1032 216 17,37

Livelli di contaminazione da Campylobacter spp. nei campioni di coscia e di petto di pollo

Totale campioni

Totale positivi

isolamento

Numerazione

<10 *

ufc/g

10-100 ufc/g

101-500 ufc/g

501-1000ufc/g

>1000ufc/g

Coscia/sovracoscia

578 126 332* 57 17 4 0

Petto 665 90 489* 32 10 0 1

Totale 1243 216 821 89 27 4 1

*48 campioni di coscia e 47 di petto positivi all’isolamento sono risultati alla

numerazione <10 ufc/g

% di resistenza ai singoli antimicrobici dei ceppi di Campylobacter spp. analizzati

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

CIP E GM AN S TE

C.jejuni

C.coli

Cam.spp

Suini: C.coli-resistenze antimicrobici

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Tetracicline Streptomicina Acido Nalidixico Gentamicina Eritromicina Ciprofloxacina Cloranfenicolo

Resistente(R)

Intermedio(I)

Sensibile (S)

Pe

rce

ntu

ale

Resistenze multiple dei ceppi di C.jejuni e C. coli

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

CipEAnSTe CipEAnTe CipAnTe CipAn

C.jejuni

C.coli

Da Polli/carne di pollo Da maiali

Scopo

a) Caratterizzare i C. jejuni nella filiera di produzione del pollo da carne

b) Paragonare i genomi degli isolati italiani con tutti quelli pubblici e disponibili

Numero totale di isolati: 487Pollo carcassa: 250Carne di pollo: 193Casi clinici: 44

polli: 62.2% positivitàalimenti: 17,37% positività

Distribuzione dei C. jejuni CCs in Italia

MLSTCC353 è il complesso clonale

predominante in Italia

CC 353 ST-2116Prevalence of C. jejuni isolates isolated in Italy

MLST

7351

7354

45

137

97

11

233

2219

2109

1701

1326

6017

1363

754

320

408

782

7089

1736018

6043

6049

3036

2854

6028

659

7084

2249

7066714

4852

5489

25

3613

767

2197

766

7008

3451

1971

998

5558

1509

5313

5836

589

7846

241

2223

24377063

242

418

7646

5546

5608

2403

8205

6001

3456

845

1964

3805

399

4539

2663

6783

2203

8520

7647

734

7095

5125

7650

4145

6024

2120116

2681

583

2412

334

538

2691

2600

2454

230

237

7560

2411

25997559

4549

756

2444

7079

94

77

3500

623

295

6055

6036

7086

3791

70905611

5610

2612

7552613

6558

100

240

171

5613

5605

591

5565

6041

13b

6530

14b

6023

672

716

750

4264791 6556

5201

2589

7657

2423

4593

2213

3789

5548

6879

2604

735

3282

7072

2595

665

7099

7098

7243

267

383

291

751

753

4868

2590

1764

7648

7649

736

5394

2467

721

726

4851003

6076

7656

4000

5606

1962

4154

7094

3362

7096

5167

7423

5283

7073

564

5761

1793

7210

625

5549

7655

5753

8211

4004

2823

2438

7651

2686

5974

5612

5609

3497

1673

354

6454

6622

4750

6614

5564

5559

65883467

1237

4747

8379

7054

3155

1073

326

7569

45304542

359

9b

3974

969

2033

3977

1517

730

1805

723

324

18501532

5556

2491

6623

3999

7060

4792

6452

5629

3453

3637 3488

8423

39422216

7570

2856

8498

3981

2288

7545

3325

1489

729

7077

6034

3501

5543

6015

6557

4320

3950

3578

1900

3011

2655

1743

801

6447

8384

7064

3491

6016

2492

3289

4548

3548

2065

449

5244

7309

5545

3943 4871

6237

3941

4147

813

2324

6599

4456

531

2976

2659

2897

7567

7552

4812

3492

3494

6449

3945

6407

5115

3322

658

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131

881

4447

5268

6209

2903

2890

5812

5102

4823

4423

5136

3964

7953

5356

7914

4471

725

219

7101

607

2932

380 4867

7573

442461

1216

863

5285

3623

5281

1915

48516045

6054

4797

349

1491

8209

306

7081

2692

3978

904

6044

22114436

7735

5791

4314

5210

2367

3766

4490

6708

1530

3029

6619

6357

5520

4A5211

6344

57954315

4803

7960

5970

4322

62992901

6831

8396

433

2887

3288

5212

7955

5148

5754

6342

53972900

4865

7708

5759

6188

5019

6343

1257

370

371

566

2930

65

573

6178

974

7056

4584

5436

4411

7091

1301

644

7458116

817

4470

8395

8210

1079

1746

3587

746

7274155

325

1709

4749

8373

2909

6782

3120

3995

4419 2584

4451

5209

44382622

4417

7958

692

4746

39801404

977

6359

6038

6836

5973

7618

6419

4001

5763 54926417

5200

4676

3551

3591

7913

4428

991

6535

39486020

1954

7619

6047

3946

10b

6056

5999

4819

8235

7A

1407

76268375

ST-2116 (in CC353) è stato isolato solo nelpollame italiano

MLST

Usando la piattaforma indipendente PHYLOViZ che ci permette di analizzare i dati provenienti da metodi di tipizzazione basati su sequenze che generano profili allelici in funzione di quelli epidemiologici

la piattaforma PHYLOViZ ci permette di analizzare i datiprovenienti da metodi di tipizzazione basati su sequenze chegenerano profili allelici in funzione di quelli epidemiologici

……….quindi

la carne di pollo come la principale fonte di contaminazione da campylobacteriosinell’uomo,basse cariche di contaminazione….crosscontaminazione..

La bassa prevalenza e bassi livelli di contaminazione evidenziano un ruolo minore della carne bovina nella trasmissione della malattia.

Necessità di investigare le altre fonti di infezione: maiali, ovini,bovini e………….

ruolo importante che la tipizzazione molecolare può offrire nelle indagini epidemiologiche per stabilire l’esatto legame fra alimento e isolati umani e nel confronto con ceppi circolanti negli altri paesi

….preoccupante la crescente resistenza verso fluorochinoloni, chinoloni e Tetraclicline

Breve descrizione focolaio Abruzzese di Campylobacter

• Giugno 2018: Mense scolastiche coinvolte in un focolaio di tossinfezione alimentare

• Indagine ancora in corso

• Microrganismo responsabile : C.jejuni

• Alimento coinvolto: Caciotta prodotta con latte bovino

• Indagine molecolare:138 ceppi

Ceppi in studio

Per le indagini di epidemiologia molecolare abbiamo analizzato i seguenti 136 C. jejuni:

62 umani

33 da caciotte (23 ceppi da formaggio prelevate nella cucina A+ 10 da cucina B)

13 da feci bovine + 2 da latte di massa bovino (azienda fornitrice formaggio)

28 ceppi isolati da tamponi cloacali di polli broiler prelevati dall’azienda avicola 2;

DNA è stato estratto usando il kit Maxwell® 16 Tissue DNA Purification Kit (Promega Corporation, Madison, USA

FOCOLAIO F0RMAGGI

Line 2: Formaggio 1

Line 3:Formaggio 2Line 4-7 e 6-9 : Ceppi umani

NR

G F

1

NR

G F

2

NR

G U

sma-kpn

100

95908580757065

SmaI KPN

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4615/5

4615/16

4615/19

4615/27

4615/20

4615/13

11218/21A

11218/22A

11218/26A

11218/29A

11218/31A

11218/32A

11218/43A

11218/45A

11218/46A

11218/48A

11218/50A

11655

11662

11707

12045

12046

11958

12139

12147

4860/14A1CD

12346

12360

12364

12375

12499

12633

12799

4860/9A2CE

4860/9A2CG

4860/10A2SB

4860/10A2SE

4860/10A2SF

4860/14A1CB

4860/14A1CC

4860/14A1CE

4860/14A1CF

4860/14A1CH

4860/14A1CI

4978/9-3SD

4978/9-3SE

4978/9-3SG

4978/9-3SH

4978/9-2SB

4978/9-2SC

4978/9-1SA

11218/18A

11218/20A

11218/19A

11966

11218/5A

11218/9A

11218/15A

11218/25A

11218/30A

4860/9A2CC

11218/34A

11218/36A

11218/37A

11218/39A

11218/40A

11218/41A

11218/44A

11218/47A

11635

11679

12048

12167

12350

12367

12796

4860/9A2CA

4860/9A2CF

4860/10A2SC

4860/14A1CA

12344

4860/14A1CG

4860/14A1CL

4860/15A1SA

4860/15A1SB

4860/15A1SD

4860/15A1SF

4978/9-3SF

4978/9-2SA

4978/9-2SF

11218/1A

11218/3A

11218/4A

11218/6A

11218/8A

11218/10A

11218/13A

11218/16A

12050

4615/26

4615/33

4615/6

11218/2A

4615/29

4964/47A

4615/14

4964/47B

12800

12935

4615/11

4615/21

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DBDA20.0573

DBDA20.0576

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FECI BOVINE

FECI BOVINE

FECI BOVINE

FECI BOVINE

FECI BOVINE

FECI BOVINE

FECI UOMO

FECI UOMO

FECI UOMO

FECI UOMO

FECI UOMO

FECI UOMO

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FECI UOMO

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FECI UOMO

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CACIOTTA

FECI UOMO

FECI UOMO

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FECI UOMO

FECI UOMO

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CACIOTTA

CACIOTTA

CACIOTTA

CACIOTTA

CACIOTTA

CACIOTTA

CACIOTTA

CACIOTTA

CACIOTTA

CACIOTTA

CACIOTTA

CACIOTTA

CACIOTTA

CACIOTTA

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FECI UOMO

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FECI UOMO

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FECI UOMO

FECI UOMO

FECI UOMO

CACIOTTA

FECI UOMO

FECI UOMO

FECI UOMO

FECI UOMO

FECI UOMO

FECI UOMO

FECI UOMO

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CACIOTTA

CACIOTTA

CACIOTTA

CACIOTTA

FECI UOMO

CACIOTTA

CACIOTTA

CACIOTTA

CACIOTTA

CACIOTTA

CACIOTTA

CACIOTTA

CACIOTTA

CACIOTTA

FECI UOMO

FECI UOMO

FECI UOMO

FECI UOMO

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FECI BOVINE

FECI BOVINE

FECI BOVINE

FECI UOMO

FECI BOVINE

LATTE

FECI BOVINE

LATTE

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A

B

Dendrogramma della matrice combinata dei profili di macrorestrizione di SmaI e KpnI

PFGE

Le similarità tra i profili di macrorestrizionesono state calcolate usando il coefficiente di Dice . La clusterizzazione e la costruzione dei dendrogrammi è stata effettuata col metodo UPGMA.

Protocollo PulseNet,2017

Sequenziamento ed analisi

I. Sequenziamento DNA tramite NGS e l'assemblaggio dei genomi.

DNA genomico totale ottenuto da una singola colonia di C. jejuni è stato quantificato con il fluorimetro Qubit (QubitTM

DNA HS Assay, Life Technologies, Thermo Fisher Scientific Inc.) e la preparazione della libreria è stata eseguita

utilizzando il kit Nextera XT Library Prep (Illumina Inc., San Diego, CA) secondo le istruzioni del produttore. Le librerie

sono state sequenziate usando la piattaforma Illumina NextSeq 500 che produce coppie di sequenze di 150 paia di basi.

Dopo la rimozione degli adattatori, le sequenze sono state ritagliate dall'estremità 5 'e dall'estremità 3 per scartare i

nucleotidi con un punteggio di qualità inferiore a 28 in scala phred. Tutti i genomi sono stati assemblati con SPAdes

versione 3.8.

I. Analisi di genomica comparativa (MLST, cgMLST)

L’analisi di genomica comparativa si è basata sulla valutazione del profilo allelico Multilocus Sequence Typing (MLST)

che è composto da 7 geni housekeeping e dal profilo allelico del core genome MLST (cgMLST) che è composto da 949

geni annotati usando il ceppo NCTC 11168 come riferimento. I profili MLST e cgMLST sono stati ricavati usando il

software SeqSphere+ software v5.0.90 (Ridom GmbH, Münster, Germany).

Core Genome MLST

Coding sequences High nucleotide identity 95 complete genomes

•composto da 949 geni annotati usando il ceppo NCTC 11168 come riferimento. I profili MLST e cgMLST sono stati ricavati usando il software SeqSphere+ software v5.0.90 (Ridom GmbH, Münster, Germany).

Risultati MLSTUomo

1 ceppo CC257(ST)25760 ceppi CC21 (ST) 8831 ceppo CC21 (ST)50 Azienda avicola:

8 ceppi CC-353 ST2116, 7 ceppi CC-607 ST1707, 2 ceppi con CC-206 e ST 3335, 2 ceppi CC-446 e ST2850, 1 ceppo con CC-607 e ST7791, 1 ceppo con CC-354 e ST2863, e i rimanenti 7 ceppi con CC e ST nuovi e non presenti nel database

Azienda bovina: Feci +latte6 ceppi CC-49 ( ST)37205 al CC-21 ( ST50)2 ceppi al CC-45 (ST137)1 ceppo al CC-206 ( ST3335)1 ceppo con CC e ST nuovi

Formaggio (sitoA)Formaggio (sitoB)

23 ceppi CC-21(ST)883.10 ceppi CC-21( ST)883.

Results cgMLSTUomo

• 14 diversi profili allelici di cgMLST uno dei quali dominante (51/60) i rimanenti che differivano da 1 a 3 alleli per i 60 ceppi classificati come CC-21 (ST)883

• CC21 (ST) 50 e 1CC-257 (ST) 257 si sono mostrati divergenti con centinaia di alleli diversi rispetto al clone dominante che identificava 8 ceppi su 10 mentre gli ultimi due profili si differenziavano di uno e nove loci.

Azienda bovina (feci bovine e latte di massa) • 2 profili cgMLST per i ceppi del CC-49 ST3720• 5 profili cgMLST per i ceppi del CC-21 ST50, • 2 profili cgMLST per i ceppi del CC-45 ST137• un profilo cgMLST per il ceppo con CC-206 ST3335,

e per il ceppo con CC e ST nuovi

Results cgMLSTAzienda avicola (tamponi cloacali di pollo)

• 6 profili cgMLST per gli 8 ceppi con CC-353 ST2116, • 4 profili cgMLST per i 7 ceppi con CC-607 ST7791, • 2 profili cgMLST per i due ceppi con CC-446 ST2850,

Formaggio centroA• 5 profili di cgMLST per tutti i ceppi con CC-21 ST883, uno dei

quali dominante che identificava 19 ceppi su 23 mentre i rimanenti profili differivano da 1 a 2 loci.

Formaggiocentro B • tre profili cgMLST per tutti i ceppi con CC-21 ST883 uno dei

quali dominante che identificava 8 ceppi su 10 mentre gli ultimi due profili si differenziavano di uno e nove loci

cgMLST Clustering

cgMLST clustering

Conclusioni1. La comparazione dei genomi dei ceppi isolati dai pazienti suggerisce

come il focolaio sia stato verosimilmente determinato da un’unicafonte in quanto 60 isolati su 62 sono geneticamente identici o con unnumero di mutazioni inferiori a 4 loci.

2. La maggior parte dei C. jejuni isolati dal formaggio prelevato presso ilcentro cottura A e presso la mensa scolastica "B" hanno un genomaidentico ai ceppi isolati dagli uomini e quindi suggeriscono come ilformaggio possa essere la verosimile fonte di infezione.

3. Gli isolati provenienti dall’azienda agricola bovina non sonorelazionabili al focolaio, tuttavia il latte di massa ha rilevato lapresenza di ceppi identici a ceppi isolati dagli animali suggerendo cheil latte di massa è contaminato dagli animali.

4. I ceppi isolati presso l’azienda avicola non si correlano con il focolaio.

Ringraziamenti

Alessandra Alessiani

GiulianoGarofolo

Tiziana Persiani

Gabriella Di Serafino

Katiuscia Zilli

Diana Neri

Silvana Salvatore

Lorena Sacchini

Anna Jonowicz

Anna Abass

Romina RomantiniFrancesca

Marotta

GRAZIE PER L’ATTENZIONE