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Il controllo di insetti parassiti nella vite

Anna Rodolfa Malacrida - Giuliano Gasperi

Dipartimento di Biologia e Biotecnologie “L. Spallanzani”

Università di Pavia

FORMARE E INFORMARE PER AUMENTARE IL LIVELLO DI COMPETITIVITA’ DEL TERRITORIO LOMBARDO

22 ottobre 2013 RICCAGIOIA S.C.p.A. – TORRAZZA COSTE (PV)

Funghi

Peronospora della vite

Oidio o mal bianco della vite

Muffa grigia

Mal dell’esca

Escoriosi

Marciume nero o black-rot

Marciume radicale fibroso

Marciume radicale lanoso

Marciume acido

Malattie della vite

Batteri

Tumore batterico

(Agrobacterium tumifacines)

Virus

Malformazioni infettive

(arricciamento, mosaico

giallo, etc.)

Accartocciamento

Legno riccio

Fitoplasmi

Flavescenza dorata

Rickettsie

Malattia di Pierce

Nematodi

Nematodi galligeni

Acari

Ragno rosso della vite

Ragnetto giallo

Acariosi della vite

Erinosi

Vite

Insetti

Fillossera della vite

(Daktulosphaira vitifogliae)

Cicaline

Scaphoideus titanus

(flavescenza dorata)

Hyalesthes obsoletus

(cicalina del Legno nero)

Empoasca vitis

(cicalina verde della vite)

Eupoecilia ambiguella

(tignola della vite)

Lobesia botrana

(tignoletta dell’uva o della vite)

Drosophila melanogaster

(marciume acido per acetobatteri)

Drosophila suzukii

(rischio presunto)

fillossera della vite (Daktulosphaira vitifoliae, Rhynchota, Homoptera)

cicalina della Flavescenza dorata (FD) (Scaphoideus titanus, Rhynchota, Homoptera)

cicalina del Legno nero (Hyalesthes obsoletus, Rhynchota, Homoptera)

cicalina verde della vite (Empoasca vitis, Rhynchota, Homoptera)

tignola della vite (Eupoecilia ambiguella, Lepidoptera, Hetroneura)

tignoletta dell’uva o della vite (Lobesia botrana, Lepidoptera, Hetroneura)

Drosophila melanogaster, Diptera (marciume acido da acetobatteri)

Drosophila suzukii, Diptera (rischio presunto)

Alcune specie di insetti dannosi per la vite

fillossera della vite (Daktulosphaira vitifoliae)

Su vite Europea

Il danno, determinato dalle sue punture, si riscontra:

sulle radici (formazione di galle nodose) e perdita di capacità assorbente

sulle foglie (galle tondeggianti e rugose) con danno apparentemente trascurabile

Su vite Americana

il danno radicale è limitato perché le radici sono poco sensibili e reattive alle punture

le foglie sono molto reattive e producono un grande numero di galle

All'interno delle galle si completa lo sviluppo degli stadi giovanili e la specie sverna

(in Europa) allo stadio di uovo, a livello radicale

Specie di origine Americana,

arrivata in Europa alla metà

del secolo IX, diffondendosi

rapidamente.

larva 5a età larve 2a-3a età

Scaphoideus titanus

uova adulti in accoppiamento

Specie di origine Americana, monovoltina, svernante come uova nei tralci;

è il vettore del fitoplasma che causa Flavescenza dorata (FD)

Nell’infezione dell’insetto, i fitoplasmi attraversano la parete dell’intestino medio, si moltiplicano

nell’emolinfa, entrano nelle ghiandole salivari e si moltiplicano ulteriormente

Quando l’insetto si nutre su una nuova pianta, i fitoplasmi sono introdotti nel floema (= tessuto

di conduzione della linfa elaborata) insieme con i fluidi salivari, e infettano le cellule del floema

Fitoplasmi

in cellula di floema Il processo di trasmissione è caratterizzato da tre fasi interdipendenti:

1. Acquisizione: alimentazione su piante infette, allo stadio giovanile (ninfe di III e V età)

2. Latenza: periodo variabile (14-28 giorni) che trasforma le cicaline da infette a infettive

(= quando raggiungono le cellule di vari organi, tra cui le ghiandole salivari).

3. Inoculazione: attraverso la saliva durante l’attività trofica, gli adulti sono in grado di

infettare le piante sane su cui si nutrono (tempi d’inoculazione di alcune ore)

A: disseccamento del grappolo

B: arrossamenti fogliari settoriali su vitigno a bacca rossa

C: ingiallimenti e ripiegature fogliari su vitigno a bacca bianca

D: aspetto generale di un filare fortemente colpito

Sintomi riconducibili a Flavescenza dorata (FD)

A B

C D

cicalina del Legno nero (Hyalesthes obsoletus)

Specie polifaga, con ciclo su

differenti organi della pianta ospite.

Vettore di fitoplasma (gruppo Stolbur),

diffente dal fitoplasma trasmesso da

Scaphoideus

cicalina verde della vite Empoasca vitis

Specie diffusa in tutta la regione paleartica

In Italia si ritrova con maggior frequenza nelle regioni settentrionali

Cicadellide polifago, dannoso soprattutto su vite in seguito alle punture

provocate sulle nervature fogliari che determinano alterazioni cromatiche

del lembo fogliare.

L'entità degli attacchi è generalmente limitata, non arrivando a causare

gravi danni sulla qualità e quantità della produzione.

Ha un nemico naturale: parassitoide delle uova (imenottero Anagrus anatomus)

Tignola della vite, Eupoecilia ambiguella

Specie di Lepidottero con 2 generazioni all’anno (1a generazione antofaga), la seconda

(carpofaga) svernante allo stadio di nel ritidoma della vite

Si alterna negli anni con la tignoletta dell’uva (dimensioni minori), ed in talune aree

le due specie coesistono.

tignoletta dell’uva o della vite Lobesia botrana

Specie di Lepidottero con 3 generazioni all’anno:

1a generazione: uova deposte sui bocci fiorali

2a generazione: uova deposte sugli acini

3a generazione: stadio di crisalide va incontro a diapausa nel ritidoma della vite

Drosophila melanogaster (moscerino della frutta o m. dell’aceto)

Specie di dittero, divenuto organismo modello di eccellenza per le ricerche genetiche, di biologia

dello sviluppo, di neurobiologia

Ciclo vitale in natura = 3 – 4 settimane

Le uova sono deposte su materiale organico (frutta) in decomposizione

Marciume acido dell’uva da acetobatteri

Drosophila suzukii (spotted wing drosophila)

Di origine asiatica, è una nuova specie invasiva.

Al di fuori dell’Asia, il 1° record storico è del 1980 in Hawaii

2008: California, USA

2009: Italia, Spagna, Francia, Germania e Svizzera

Nei Paesi in cui si è diffusa ha trovato habitat ideali per espandersi, e lo svernamento avviene

in ambienti associati con le abitazioni

La femmina depone uova nei frutti in maturazione (piccoli frutti, talvolta acini d’uva)

fillossera della vite (Daktulosphaira vitifoliae)

originaria di USA orientali

1a entrata in Europa: Francia, 1863

cicalina della Flavescenza dorata (FD) (Scaphoideus titanus),

Originaria di Stati Uniti

1° entrata in Europa: Francia 1958

drosofila con le ali macchiate (Drosophila suzukii)

originaria di Asia

1° entrata in Europa: 2009

Specie esotiche di insetti dannosi per la vite che hanno espanso il loro areale

di diffusione stabilendo popolazioni derivate, lontano dal loro areale (home-range)

sono tra le altre:

Aspetti dinamici

Estensione della

distribuzione al di là

della zona naturale

Effetti legati alla

stagione

Adattamento

Ospiti

Virus, parassiti

L’ambiente

(Complessità)

Olfatto

Insetti parassiti

Cos’è un processo invasivo?

Quale è l’origine geografica delle specie di interesse ?

Definizione geografica dell’areale di diffusione della

specie esotica

Processi invasivi

Migrazione Invasioni Biologiche

Componente importante dei cambiamenti globali con effetti

potenzialmente dannosi sulla salute pubblica, l'agricoltura e

la biodiversità.

Una popolazione invasiva è un insieme di individui

(propagulo) che:

1) è stato introdotto in una nuova zona (ARRIVO)

2) si è stabilita, accresciuta di numero (STABILIMENTO: la

popolazione cresce e si espande)

3) Si è d

Ma perché alcune specie diventano invasori

di successo? :

(Cicaline, moscerini della frutta, zanzare)

La diversità di caratteri relativi alla «life history» può

implicare sostanzialmente diverse e imprevedibili

potenzialità d’ invasione per ciascuna specie, ciò

determina il successo o il fallimento delle invasioni.

Il punto critico è una comprensione

della storia del processo di

invasione

La variabilità delle popolazioni avventizi dipende

da:

• La storia della popolazione ancestrale

• Il numero/dimensione dei propaguli

• I percorsi geografici dei propaguli: molteplici

popolazioni di origine e siti di introduzione

introduzione di una considerevole variabilità nel

corso di un breve periodo di tempo.

Conoscendo le fasi dell’invasione è possibile prendere in considerazione strategie atte a frenare o bloccare un’invasione

La ricostruzione dei percorsi

d’invasione:

PERCHE’?

• Esso facilita la progettazione di strategie per

prevenire invasioni (misura di quarantena);

• Per eradicazione/contenimento: l'efficacia delle

misure di controllo dipende dalla

diversità/origine genetica e geografica del

genotipo introdotto.

Metodi di ricostruzione di un

percorso invasivo:

• Diretti

- Sulla base di documenti storici di presenza/assenza di taxa invasivi

(e.g.: Scaphoideus titanus in Europa)

Metodi per la ricostruzione

• Indiretti

Modelli genetici osservati dentro e tra le popolazioni con marcatori molecolari (RAPD; SSRs, SNPs, etc.).

Metodi di Clustering:

• Basati sui dendrogrammi (es. neighbour-joining tree) dalle matrici di distanze genetiche tra le popolazioni.

• Antenati in comune degli individui invasori con popolazioni del range nativo (STRUCTURE by Pritchard et al., 2000).

Assegnazione di probabilità: direzione d’introduzione(GeneClass).

Il caso studio

La storia delle specie invasive, Scaphoideus

titanus

Records storici di Scaphoideus titanus

FRANCIA meridionale 1958 ITALIA settentrionale 1963 SVIZZERA occidentale e meridionale 1968 CROAZIA 1987 SLOVENIA 1987 SERBIA 2003 SPAGNA 1995 PORTOGALLO settentrionale 1999

Metodo diretto

La specie è di origine nord-Americana,

introdotta accidentalmente in Europa nel

XX secolo.

Risulta essere monofaga su vite in Europa;

è il vettore specifico di Phytoplasma vitis,

agente eziologico della Flavescenza dorata (FD)

della vite.

FD, inizialmente identificata nella Francia

meridionale, si è diffusa in molte zone viticole

del nord-Italia, della Spagna, della Slovenia e

della Svizzera, assumendo caratteristiche

epidemiche.

Metodi indiretti mediante l’uso di marcatori molecolari che definiscono

il “fingerprint” dei singoli individui di ciascuna popolazione geografica,

presenti sia nell’areale originario della specie (popolazioni ancestrali)

sia nell’areale di diffusione (popolazioni derivate o avventive)

Sviluppo di un database di riferimento che permette studi di tracciabilità

ogniqualvolta si sia in presenza di un focolaio invasivo (outbreak)

Tale database diventa ulteriormente importante se vengono introdotte

informazioni relative alla presenza di un patogeno (es. Fitoplasma) nelle

singole poplazioni

Sviluppo di mappe di rischio

(per arginare sia insetto vettore che il patogeno)

Raccolta dei campioni di S. titanus nell’areale di diffusione

Pattern molecolare di individui di due popolazioni di S. titanus ottenuto con l’uso del

marcatore molecolare RAPD 494N: San Colombano (Italia) e Valois (USA).

Un frammento specifico (410 bp) è presente solo in individui Americani (= marcatore

molecolare di popolazione per saggi di tracciabilità); un frammento monomorfo (430 bp)

è presente in ambedue le popolazioni

Scelta dei marcatori molecolari per determinare i “fingerprints” dei singoli individui

Relazioni genetiche tra popolazioni

illustrate dall’ albero di consenso

Neighbour Joining (NJ), basato su

distanze genetiche D di Nei, derivate

dalle frequenze dei marcatori RAPD.

Le popolazioni Americane sono

chiaramente separate dal mix eterogeneo

delle popolazioni Europee.

USA (NY state)

Francia

Italia

Svizzera

Slovenia

Spagna

Considerazioni dedotte dall’analisi dei dati

In accordo con l’origine Neartica della specie, le due popolazioni native Americane hanno un’elevata

plasticità genetica, che può costituire per la specie un alto potenziale adattativo.

In questo contesto è opportune ricordare che nell’areale originario, S. titanus ha capacità di adattamento

a diversi ospiti.

La diffusione di S. titanus in Europa è avvenuta da occidente ad oriente, adattando il suo ciclo biologico

in relazione con il ciclo di Vitis vinifera (Boudon-Padieu, 2002).

Ma come è avvenuta questa diffusione, dato il suo ristretto grado di mobilità ed il suo essere monovoltino?

Queste caratteristiche biologiche potrebbero suggerire una diffusione “step by step” che dovrebbe riflettere

la cronologia delle invasioni.

Al contrario, i dati genetici mettono in luce una frammentazione genetica tra popolazioni sia entro

che tra i Paesi Europei, senza un gradiente Ovest – Est.

Questo pattern genetico eterogeneo è conseguente ad introduzioni indipendenti (propaguli diversi)

entro e tra le aree Europee.

E’ possibile che questo scenario sia associate agli scambi commerciali di barbatelle infestate da

uova di S. titanus sotto la corteccia (Boudon- Padieu 2002; Weintraub and Beanland 2006).

Vitis vinifera è la pianta ospite di S. titanus ed è anche riserva di fitoplasma.

Considerando la quantità di materiale vivaistico prodotto e scambiato commercialmente, è evidente

la necessità di rigorosi controlli di qualità sia per la presenza di uova che per la presenza di fitoplasma.

Metodi di controllo contro gli insetti

Metodi su base chimica (insetticidi)

Metodi compatibili con l’ambiente

su base biologica (bioinsetticidi, feromoni, etc)

su base genetica (SIT, Tecnica dell’Insetto Sterile)

su base biotecnologica (transgenesi e paratransgenesi)

All’interno di una popolazione esistono fattori biochimici e genetici che conferiscono resistenza

ad un dato insetticida; la velocità di evoluzione della resistenza è correlata a numerosi parametri

Fattori genetici Fattori biologici / ecologici

Resistenza agli Insetticidi

frequenza di alleli di resistenza

numero di alleli resistenti

dominanza di resistenti

interazioni degli alleli resistenti

precedente selezione con altri insetticidi

grado di integrazione di genomi

resistenti con fattori di fitness

Biotici

numero di generazioni / stagione

numero di prole / generazione

monogamia vs poligamia; partenogenesi

Ecologici /Comportamentali

isolamento; mobilità; migrazione

monofagia, oligofagia; polifagia

presenza di rifugi entro l’area trattata

NB: Questi fattori non possono essere facilmente controllati, e l’importanza di alcuni non può

essere definita fino a quando la resistenza si sia espressa

Resistenza agli Insetticidi

Fattori operativi

Caratteristiche chimiche

natura chimica degli insetticidi

relazione di prodotti chimici con

quelli usati in precedenza

persistenza dei residui; formulazioni

Caratteristiche delle applicazioni

soglia di applicazione

soglia di selezione

stadio(i) del ciclo di sviluppo selezionato

modalità di applicazione

selezione limitata nello spazio

selezione alternata

I fattori operativi che influenzano lo sviluppo della resistenza sono mediati dall’uomo,

e pertanto possono essere guidati.

Il management rella resistenza di popolazioni di insetti dannosi sta diventando una componente

estremamente importante di ogni programma di “pest management, specialmente a causa del

fatto che vengono attualmente prodotti meno prodotti pesticidi nuovi.

I nuovi approcci biotecnologici, permettendo di conoscere la struttura del

genoma del parassita (insetto, patogeno), offrono le possibilità di capire

a livello molecolare:

la sua biologia,

i suoi processi riproduttivi

la sua interazione con la pianta ospite

Su queste basi si potrà interferire per bloccare

il rapporto insetto – pianta ospite

il rapporto patogeno – insetto ospite

Aspetti dinamici

Estensione della

distribuzione al di là

della zona naturale

Effetti legati alla

stagione

Adattamento

Ospiti

Virus, parassiti

L’ambiente

(Complessità)

Olfatto

Insetti parassiti

Popolazioni - ambiente: l’olfatto

come finestra sul comportamento

(manipolazione dell’olfatto)

Lo studio dell’olfatto e della chemorecezione permette di identificare l’apparato

molecolare coinvolto nel riconoscimento di importanti segnali per la scoperta del cibo,

per l’accoppiamento e per l’identificazione dei siti di ovoposizione.

Fornisce strumenti per lo sviluppo di prodotti attrattivi / repulsivi, maschio / femmina

specifici, per trappolaggio e monitoraggio (di interesse per industrie biotecnologiche)

Esempio: Ceratitis capitata

mosca mediterranea della frutta

Genomica, genomica funzionale e approcci

biochimici/fisiologici: sequenze specie/sesso specifiche

correlate alla recezione chimica e alla riproduzione

ESTs (profili di espressione) 27,167 high quality ESTs from:

Embryo (10,267 ESTs),

Adult Head (10,986 ESTs),

Male Accessory gland and testes

(5914 ESTs)

Sequenza genomica

Consortium: Pavia, Baylor College, USDA

Obp - Odorant Binding Proteins (OBPs)

Pbp - Pheromone Binding Proteins (PBPs)

Or - Odorant Receptors (ORs)

Csp - Chemosensory Proteins (CSPs)

Ode - Odorant Degrading Enzymes (ODEs)

Noi siamo cratterizzati da geni/proteine coinvolte

nel riconoscimento di ligandi esterni (piante

ospiti e componenti feromoni)

Medfly geni chemosensoriali

Caratterizzazione dei geni: Obp/Pbp

Structural features:

Signal peptide, Conserved Cysteine profile: Classic, Minus-C, Plus-C

(Vieira et al 2011)

Phylogenetic relationships:

looking for orthology with known characterized genes/proteins:

Obp repertoire of D. melanogaster was used as a reference given the

close phylogenetic affinity of the two species (80-100 Mya)

(Ayala et al 1996).

Chromosomal location:

Syntenic groups, Clusters, Cluster conservation

Specificity of tissue expression in relation to the

chemosensorial compartments:

Head, antennae, palps, tarsi

analisi SEM degli organi olfattivi

di Medfly (antennae and maxillary

palps) e identificazione di tre

differenti classi di sensilla

Specificità

dell’espressione tissutale:

I geni Obp sono identificati con funzioni leganti

i ferormoni putativi

Caratterizzaizone dei geni Pbp :

• Localizzazione cromosomica in

gruppi di sintesi;

• Espressione tessuto specifica in

relazione ai comparti

chemosensoriali: testa, antenne,

palpi, tarsi.

Caratterizzazione

funzionale delle

proteine PBP:

• Affinità di binding;

• Cristallizzazione.

Sono Pbps?

Chromosomal location

CcPbprp1 hybridisation to chromosome 6R in position 95b Localizzazione di un gene pheromone binding protein (PBP) sui cromosomi

Espressione

proteica e

purificazione

Purificazione dei ferormoni:

Collection of volatiles

Gas-chromatography-mass

spectrometry

Coupled gas-chromatography

/electroantennography

Comosti attivi antennali Studi di Binding (identificano la specificità

della proteina per il

ligando)

Caratterizzazione funzionale delle proteine PBP

Caratterizzazione di

Pheromone binding protein

Caratterizzazione dei componenti

ferormonici

Analisi SEM degli organi

olfattivi

Saggi di Binding

Seguremo l’approccio che abbiamo adottato per la Medfly:

Siciliano et al.(a) and (b), submitted

22 diversi prodotti chimici isolati dai maschi come

componenti ferormoniche (solo 15 identificati)

19 composti chimici

hanno evidenziato una

elevata risposta

antennale, quando

testati su femmine

14 composti hanno

evidenziato una

risposta antennale,

quando testati su

maschi

Identification of active compounds by GC-EAG

Sono state finora caratterizzate 5 PBPs (Pheromone binding proteins) di

C. capitata e sono stati altresì identificati i loro ligandi (componenti del

feromone)

Silenziando i geni di questi PBPs con opportuni approcci molecolari,

le corrispondenti proteine non verranno più prodotte, e il legame con

lo specifico componente del feromone verrà a mancare.

Di conseguenza, si viene così ad interferire con il riconoscimento tra

i sessi o con altre funzioni evocate dall’emissione di componenti dei

feromoni

L'identificazione e l'espressione in vitro di geni dell’olfatto, permette studi di binding per l'identificazione di molecole

odorose specifiche (ligandi) che innescano la trasduzione di segnale per il riconoscimento della pianta ospite, per

l'attrazione sessuale, e per l'identificazione di siti per l'oviposizione.

Si possono in tal modo mettere a punto metodi biotecnologici che interferiscono con

la capacità dell’insetto di riconoscere odori per la ricerca del frutto, per l'accoppiamento

e per il riconoscimento di siti di oviposizione.

E' quindi possibile identificare nuove molecole che possono rappresentare potenti attrattivi

oppure repellenti, che interferiscono con la capacità dell’insetto di percepire un particolare odore.

Tali molecole sono di grande importanza per attività di monitoraggio e per il controllo di insetti

dannosi.

Infatti, l'interazione tra queste molecole odorose (ligandi) e il complesso OBP o PBP/OR

determina nell'insetto risposte attrattive o repulsive.

L'identificazione di proteine chemosensoriali e dei loro ligandi specifici permette alle compagnie

Biotech di adattare high-throughput technologies utilizzate nell'industria chimico-farmaceutica

per l'identificazione di molecole (ligandi) che interferiscono con la trasduzione di segnale nei

diversi sistemi di chemiorecezione dell’insetto.

Monitoraggio e metodi di eradicazione

delle popolazioni

Le biotecnologie sono importanti anche per l’applicazione

della Tecnica dell’Insetto Sterile (SIT)

La Sterile Insect Technique (= SIT)

Rilascio di un elevato numero di insetti maschi sterili all’interno di una

popolazione wild-type della stessa specie,

così da farli accoppiare e quindi bloccare la riproduzione delle

femmine della popolazione wild-type.

La tecnica SIT prevede l’allevamento di un gran numero di insetti della

specie bersaglio,

esponedoli a radiazioni ionizzanti che detrminano la loro sterilità sessuale,

poi devono essere rilasciati nella popolazione bersaglio.

Il concetto dei SIT è semplice, la pratica è complessa

Il successo dell’applicazione dei SIT richiede:

La capacità di allevare, sterilizzare e distribuire sufficienti insetti per ottenere un

elevato successo dell’insetto maschio sterile nei confronti del maschio wild-type

I maschi sterili devono prevalere in numero rispetto agli omologhi wild-type, devono

perciò poter competere con essi a livello riproduttivo

Sterilizzazione tramite radiazioni

Wimmer 2005, Nature Biotechnology 23: 432

Sterile Insect Technique (SIT)

Ad oggi, SIT è il metodo di controllo più ampiamente utilizzato contro le mosche

della frutta appartenenti alla famiglia Tephritidae:

Pectinophora gossypiella Cydia pomonella

ma è anche

diretto a

lepidotteri:

Bactrocera tryoni Bactrocera dorsalis Anastrepha ludens

Limiti della strategia SIT

• Solo i maschi sterili contribuiscono alla soppressione della

popolazione. La presenza di femmine duplica i costi di

allevamento

• Il successo di SIT dipende dalla fitness e competitività

dei maschi sterili e dal comportamento sessuale delle

femmine wildtype

• Infrastrutture necessarie per allevamento, sterilizzazione,

rilascio, monitoraggio

Nonostante notevoli successi, SIT non si è mostrato appropriato per tutte

le specie di insetti dannosi, principalmente per la necessità di disporre

di:

(1) modalità di allevamento intensivo di grandi numeri di insetti per il

rilascio massivo

(2) efficaci metodi di separazione dei sessi

(3) tecniche di sterilizzazione in grado di produrre grandi numeri di insetti

con minimi effetti sulla fitness

(4) efficienti metodi di rilascio

(5) precisi sistemi di marcatura che permettano di identificare

facilmente gli individui rilasciati

Monitoraggio

Fino ad ora le pupe, allevate in laboratorio e

sterilizzate, sono marcate con polveri

fluorescenti per distinguerle dalle pupe wild-

type quando sono catturate nelle trappole,

posizionate intorno all’area di rilascio.

Svantaggi: polvere costosa, non facile da

gestire, pericolosa per la salute umana,

operazione soggetta a errori

Catherine Smallridge

Possibile soluzione: trasformazione

marcatore fluorescente

Marker ideali:

• Durevole

• Poco costoso

• Non tossico (per insetti e ambiente)

• Chiaramente identificabili

• Non devono influenzare il normale comportamento, crescita,

riproduzione, durata della vita.

white+

genes of interest

Transformazione della linea germinale, basata su trasposoni (= sequenze mobili di DNA)

transposase

Vector + Helper

inject we G0 embryo

with vector/helper

mix

backcross G0 adult

to we host strain

select G1 red eye color

transformants

Sviluppo di un sitema di colorazione dello sperma,

Usando un promotore di un gene specifico per la

spermatogenesi,

driving GFP o DsRed expression

Ricerca di base

(studi sul comportamento

durante l’accoppiamento)

Ricerca applicata

(stima di efficacia SIT)

5’ pBac PUb EGFP 3’ pBac attP b2t DsRedEx G G

Sex and tissue-specific expression of Ccb2t in adult individuals

5’ pBac PUb DsRed 3’ pBac

attP b2t G G tGFP

Risultato:

14 linee transgeniche

Quante copie transgene?

Effetto del sito di inserimento?

Penetranza?

Stabilità del transgene?

Stabilità di espressione?

Marcatura sperma?

È un utilizzo fattibile?

Body marker Testes marker

b2t-tGFP Pub-DsRed

Persistenza della fluorescenza in testicoli di mosche morte

Espressione testicolo-specifica del Ccb2t-DsRedEx e -tGFP

era rilevabile in individui adulti, anche dopo tre mesi dalla

morte

tGFP transformed sperm

from testes

DsRedEx transformed sperm

from testes

868 bp la regione a monte del gene Ccb2tubulin è in grado di

dirigere l’espressione di DsRedEx e tGFP durante la

spermatogenesi, questo consente di evidenziare lo sperma verde

o rosso dai testicoli.

Sono queste le linee potenzialmente utili per la marcatura dello

sperma?

La misurazione risulta difficoltosa

Uso in

laboratorio

Eventuale uso in campo

Fattori essenziali di base:

Longevità

Riproduzione

capacità di accoppiamento

trasferimento / conservazione dello sperma

qualità dello sperma

Capacità di

accoppiamento del

maschio

I maschi delle linee 2 Ccb2t-DsRedEx erano significativamente

meno competitivi dei maschi wild-type quando erano in

competizione con le femmine wild-typeIn media hanno guadagnato

solo il 15% degli accoppiamenti.

In esperimenti sulla competizione in accoppiamento, i maschi delle

linee 2 Ccb2t-tGFP erano in grado di competere con i maschi wild-

type per le femmine wild-type.

Questo è stato particolarmente evidenziato in una linea che ha

guadagnato il 47% degli accoppiamenti.

Effetto della proteina esogena DsRedEx?

tGFP transformed sperm DsRedEx transformed sperm

Spermatozoi transgenici sono trasferiti con successo alle femmine.

Essi sono chiaramente visibili nelle spermateche di femmine

fecondate wild-type.

Questo approccio mira all ’ introduzione di un

meccanismo di resistenza in grado di prevenire la

trasmissione della patologia.

Population replacement

Richiede due principali elementi:

(1) Un meccanismo per la resistenza al patogeno (es. fitoplasma in S. titanus)

(2) Un metodo di diffusione del gene nella popolazione

Attualmente è un approccio in via di sviluppo e

necessita di notevole ottimizzazione

Gli avanzamenti tecnologici degli ultimi decenni hanno permesso di

sviluppare e migliorare, a livello teorico e operativo, sia la tecnica

SIT che gli approcci basati sul ‘population replacement’con l’uso

di batteri simbionti (NB: paratransgenesi)

Il batterio acetico Asaia sp., candidato agente di controllo simbiotico per la lotta a FD della vite trasmessa da

Scaphoideus titanus, è trasferito orizzontalmente tra individui che condividono il substrato alimentare.

La trasmissione orizzontale è stata dimostrata tramite prove di cofeeding su dieta artificiale, condotte alimentando su

una stessa soluzione zuccherina prima un individuo colonizzato con un ceppo marcato di Asaia, e successivamente

un esemplare non colonizzato.

Il grafico indica le cicaline risultate positive a PCR quantitativa con primer specifici per

il gene marcatore (colonne azzurre) sul totale di individui saggiati (colonne blu), in seguito a diversi periodi di condivisione

della dieta (da 24 a 96 ore) (modificato da GONELLA et al., 2012)

46-million-year-old mosquito, the first ever fossilized blood meal

Insetti: le enormi difficoltà di controllarli in maniera efficace

Grazie per l’attenzione