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Microscopia confocale

Solo per uso didattico, vietata la riproduzione, la diffusione o la vendita

MFN0366-A1 (I. Perroteau) - microscopia confocale

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MFN0366-A1 (I. Perroteau) - microscopia confocale

Solo per uso didattico, vietata la riproduzione, la diffusione o la vendita

Vedi filmato

Esempio di analisi con focale: vedi il filmato corrispondente

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MFN0366-A1 (I. Perroteau) - microscopia confocale e analisi d’immagine

Solo per uso didattico, vietata la riproduzione, la diffusione o la vendita

Dalla figura sottostante si vede che l’immunofluorescenza verde per le proteine “statmina”e “SCG10” nelle cellule ST14 è essenzialmente citoplasmatica. Si nota però anchedell’immunofluorescenza in mezzo al rosso della marcatura nucleare. Le due proteine inquestione oltre alla loro localizzazione citoplasmatica hanno anche una localizzazionenucleare?

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Marcatura “nucleare anche inun’altra linea cellulare (GN-11)

Studio di caso:

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La stessa immagine vista da “sopra” (anche se al microscopio confocale può rsultareda due situazioni diversi: Una localizzazione nucleare “vera” (ipotesi N.1) oppureuna localizzazione nucleare “artefattuale”( ipotesi N.2)

Ipotesi N1 Ipotesi N2

?

Per rispondere alla domanda: “quale delle due ipotesi si applica alla localizzazione distatmina e SCG10?”, è stata fatta una ricostruzione tridimensionale della morfologia delnucleo basata sull’analisi d’immagine della marcatura rossa per la cromatina.

MFN0366-A1 (I. Perroteau) - microscopia confocale e analisi d’immagine

Solo per uso didattico, vietata la riproduzione, la diffusione o la vendita

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vedi il filmato della ricostruzione tridimensionale.

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Solo per uso didattico, vietata la riproduzione, la diffusione o la vendita

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MFN0366-A1 (I. Perroteau) - microscopia confocale e analisi d’immagine

Risposta alla domanda: la marcatura verde non corrisponde ad una vera localizzazioneintracellulare della proteina riconosciuta ma ad un artefatto dovuto alla morfologia delnucleo che comprede delle invaginazione dell’involucro nucleare.

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Vedi filmato

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MFN0366-A1 (I. Perroteau) - microscopia confocale e analisi d’immagine

Ricostruzione tridimensionale di nuclei di altre linee cellulari che presentanoanche loro delle invaginazioni dell’involucro nucleare

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MFN0366-A1 (I. Perroteau) - Tecniche morfologiche : microscopia elettronica immunogold

Incubazioni con anticorpi primari e anticortpi secondari comenel caso dell’immunofluorescenza ma in questo caso glianticorpi seondari sono coniugati con particelle d’oro (opacheagli elettroni) di diametro diverso

Immunogold: marcature singole o doppie analizzate almicroscopio elettronica a trasmissione (TEM)

Microscopia elettronica

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MFN0366-A1 (I. Perroteau) - Tecniche morfologiche : microscopia elettronica immunogold

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Osservazione al microscopio elettronico a trasmissione (TEM)

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MFN0366-A1 (I. Perroteau) - Tecniche morfologiche : microscopia elettronica immunogold

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Esempio marcatura doppia immunogold esaminata al TEM.Sezione di ipofisi analizzata con un anticopo primario anti-prolattina rivelato con un anticorposecondario coniugato a particelle d’oro di 20 nm di diametro e con un anticorpo primarioanti-ormone di crescità rivelato con un anticorpo secondario coniugato a particelle d’oro di 10nm di diametro.A sinistra cellula le cuivescicole di secrezione sonomarcate con particelle d’orodi 20 nm di diametromaggiore: questa cellulacontiene prolattina: si trattadi una cellula “mammotrofa”(M).A sinistra le vescicole sonomarcate con particelle d’orodi diametro inferiore (10nm): si tratta di una cellula“somatotrofa” (S) le cuivescicole di secrezionecontengono l’ormone dicrescità.

MFN0366-A1 (I. Perroteau) - Tecniche morfologiche : microscopia elettronica immunogold

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Colorazioni istologicheImmunoistochimicaImmunofluorescenzaImmunogold

Tecniche che richiedono lafissazione del preparato(cellule o sezioni ditessuto)= materiale morto

MFN0366-A1 (I. Perroteau) - Tecniche morfologiche

GFP

Tecniche che nonrichiedonocompatibili concellule o tessutivivi

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GFPGFP

MFN0366-A1 (I. Perroteau) - GFP

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Green Fluorescent Protein

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MFN0366-A1 (I. Perroteau) - GFP

Plasmide consequenza per GFP

5’ MCS

GFP

……etc

GFP

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Marcatorenucleare(rosso)

Merge

(A) Sovraposizione tra immagine a contrasto di fase eimmagine a fluorescenza: 2 cellule esprimono laproteina GFP. Le cellule sono vive. In campo scuro, laproteina fluorescente GFP si conferma comeprevalentemente localizzata nel citoplasmasma. (B):GFP, (C) marcatore nucleare, (D) sovrapposizione(merge) di B e C.

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MFN0366-A1 (I. Perroteau) - GFP

Transfezione

Sequenza nucleotidicache codifica per la GFP

GFP e tecnologie ricombinanti:

Trascrizionee traduzione

Fluorescenza della proteina GFP

fotoni

Plasmide consequenza perGFP

A

B C D

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MFN0366-A1 (I. Perroteau) - GFP

viene inserita “ inframe” nel plasmideche codifica per laGFP

2 Trasfezione del plasmide di fusione. Le celluletrasfettate esprimono la proteina di fusione che ènella prima parte l’istone H3 e nella secondaparte la GFP. La porteina di fusione è la proteinaH3 con la “lampadina” attaccata.

3 La fluorescenza della proteina di fusionetestimonia della sua localizzazione. La parte checorrisponde a H3 è riconosciuta dai sistemi ditrasporto dal citoplasma verso il nucleo (l’istone H3svolge la sua attività nel nucleo) e di consequenza lafluorescenza è tutta nucleare. B-D: localizzazionedella GFP sola. E-G localizzazione della proteina difusione GFP-H3

Marcatorenucleare merge

B C D

E F G

Con costrutti di fusione, la GFP permette di seguire in modo dinamico la localizzazioneintracellulare di proteine. Esempio: proteina di fusione tra GFP e istone H3

1 La sequenza nucleotidicache codifica per H3(rettangolo blu)

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MFN0366-A1 (I. Perroteau) - GFP

Esempio:Time lapse della proteina di fusioneGFP-caderina in cellule epiteliali incoltura.

Vedi filmato

Notare la localizzazione diffusadella fluorescenza nella cellulaisolata: la proteina di fusione èlocalizzata sulla membranaplasmatica.

Osservare la ridistribuzione dellaproteina di fusione e la suaconcentrazione dei punti diinterazione tra le cellule.

A

Time-lapse: video microscopia di cellule in coltura al microscopiorovesciato a fluorescenza

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Tecniche immunologiche:

anticorpi

Risultato:localizzazione di proteine

Interazioni anticorpo-antigene Altre interazioni ?

MFN0366-A1 (I. Perroteau) - Tecniche morfologiche

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Tecniche ibridazione in situTecniche immunologiche:

anticorpi

Risultato:localizzazione di proteine

Interazioni anticorpo-antigene Interazioni ac nucleici-ac. nucleici

“sonda”di DNA singolofilamento

Risultato:localizzazione di RNAm oppuredi sequenze di DNA

MFN0366-A1 (I. Perroteau) - Tecniche morfologiche: Ibridazione in situ

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Antigen(protein)

Immunohistochemistry

Antibody(protein)

Hybridazione in situ

RNA probe(nucleic acid)

mRNA(nucleic acid)

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MFN0366-A1 (I. Perroteau) - Tecniche morfologiche: ibridazione in situ - immunoistochimica

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Solo per uso didattico, vietata la riproduzione, la diffusione o la venditaSolo per uso didattico, vietata la riproduzione, la diffusione o la vendita

Ibridazione in situ per RNA del virus Epstein-Barr (EBER) in un linfoma plasmablastic di unpaziente positivo al. Marcatura marrone deinuclei delle cellule infette EBER.

Ibridazione in situ per mRNA di SP-A susezione di adenoma pulmonre

Ibridazione in situ

Sezioni di carcinoma mammariomarcate con anticorpo AKT2

Immunoistochimica

MFN0366-A1 (I. Perroteau) - Tecniche morfologiche: ibridazione in situ - immunoistochimica

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FISH (fluorescence in situ hybridization): tecnica utilizzata in citogenetica

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MFN0366-A1 (I. Perroteau) - Tecniche morfologiche: fluorescence ibridazione in situ

Ibridazione della sonda su 2cromosomi metafasiciomologhi

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Specificità di riconoscimento

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MFN0366-A1 (I. Perroteau) - Tecniche biochimiche-molecolari

Western blottingproteine

Esempio di tecnichebiochimiche- molecolaricomunemente utilizzate da chistudia la biologia delle cellule edei tessuti

Northern blottingmRNA

Southern blotting

DNA

Antigene-anticorpo

Specificità di riconoscimento

Ibridazione di acidi nucleici

Ibridazione di acidi nucleici

Extrazione

proteine

mRNA

DNA

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1. Estrazione delle proteine2. Separazione delle proteine mediante corsa elettroforetica su gel

Le proteine dell’estratto, tutte caricate negativamente durante l’estrazione, sonodepositate nel pozzetto. Dopo applicazione della corrente elettrica migrano dunqueverso il polo positivo. La separazione avviene in funzione del peso molecolare diciascuna proteina. Quelle più piccole, di più basso peso molecolare, migrano piùrapidamente all’interno delle “maglie” del gel verso il polo positivo.

MFN0366-A1 (I. Perroteau) - Tecniche biochimiche-molecolari: Western blot

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MFN0366-A1 (I. Perroteau) - Tecniche biochimiche-molecolari: Western blot

Al termine dell’elettroforesi, si procede con il“blotting”, cioè il trasferimento dal gel dielettroforesi ad un supporto più managgevole edidoneo all’incubazioni con gli anticorpi: il filtro(assomiglia ad un foglio di carta delladimensione del gel)

+

3. Trasferimento delle proteine dal gel di elettroforesi al filtro: “Blot”

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Il filtro è poi incubato inpresenza dell’anticorpoprimario, lavato, incubatoin presenza di anticorposecondario coniugato ad unenzima che permette unareazione luminescente. Larivelazione avvieneponendo una lastrafotografica sul filtro, laluminescenza impressionala lastra. Dopo sviluppofotografico della lastra, le“macchie” nerecorrispondono allapresenza della proteinad’interesse (antigene).

MFN0366-A1 (I. Perroteau) - Tecniche biochimiche-molecolari: Western blot

4. Incubazione del filtro con anticorpi e rivelazione

5. Risultato finale:lastra fotografica“impressionata”