Enterobacteriaceae
Enterobacteriaceae Comprende più di 40 generi con un vasto numero di specie
batteriche il cui habitat naturale è rappresentato
dall’intestino dell’uomo e degli animali, ma anche dal suolo,
acque, piante, materiali in decomposizione.
CARATTERISTICHE MORFOLOGICHE:
bacilli Gram negativi, mobili o immobili, asporigeni, quasi sempre capsulati, provvisti di pili
CARATTERISTICHE METABOLICHE:
aerobi anaerobi facoltativi
Fermentano il glucosio, in anaerobiosi è frequente la produzione di gas;
ossidasi negativi per l’assenza del citocromo C
catalasi positivi
CARATTERISTICHE COLTURALI:
poco esigenti: crescono nei comuni terreni di coltura.
CLASSIFICAZIONE
GLI ENTEROBATTERI VENGONO SUDDIVISI IN NUMEROSI GENERI IN BASE A:
• Caratteristiche biochimiche
• Caratteristiche antigeniche
• Caratteristiche genotopiche studi di ibridazione DNA-DNA sequenziamento rRNA16S
Caratteristiche biochimiche
• capacità di utilizzare particolare substrati come fonte di carbonio es. acidi organici o loro sali
• presenza di alcuni enzimi es. ureasi, lisina e ornitina-decarbossilasi, fenilalanina-deaminasi etc.
• produzione di specifici prodotti metabolici es. idrogeno solforato, indolo, acetoino etc.
• capacità di fermentare taluni zuccheri
CARATTERI ANTIGENI Antigene O di natura polisaccaridica (catene laterali dell'LPS) stabile al calore Antigene K posto più superficialmente rispetto all’antigene O è rappresentato dai polisaccaridi acidi che compongono lo strato mucoso stabile al calore Antigene Vi solo nelle salmonelle l’antigene K è indicato come antigene Vi Antigene H è rappresentato dalle proteine flagellari, quindi è presente nelle specie mobili
FATTORI DI VIRULENZA
polisaccaridi dello strato mucoso o della capsula azione antifagocitaria
endotossina azione tossica del lipide A
adesine
sistema di secrezione di tipo III rilascio di fattori di virulenza nelle cellule ospiti
tossine proteiche
variazione di fase e antigenica
Salmonella
>2400 sierotipi di bacilli Gram negativi, mobili per flagelli peritrichi, non fermentanti il lattosio
Descritto per la prima volta da Theobald Smith (1859-1934) e da Daniel Elmer Salmon (Salmonella choleraesuis) nel 1885
ANTIGENI
I sierotipi sono identificabili sulla base di tre tipi di Ag:
ANTIGENI O o somatici
ANTIGENI H o flagellari (presenti in tutti i sierotipi ad eccezione di S. gallinarum e S. pullorum)
Possono esistere in due forme FASE 1 e FASE 2; una data cellula esprime un Ag di fase per volta ed i due antigeni corrispondono a due diverse molecole di flagellina (es. di variazione antigenica)
ANTIGENI Vi o capsulari
Sono polisaccaridici
Sembrano associati alla virulenza
Classificazione di Kauffman e White
2 specie
S. enterica (2443 sierotipi)
S. bongori (20 sierotipi)
S. typhi S. enterica subsp. enterica serovar Typhi
S. paratyphi S. enterica subsp. enterica ser. Paratyphi
S. choleraesuis S. enterica subsp. enterica ser. Choleraesuis
S. typhimurium S. enterica subsp. enterica ser. Typhimurium
S. enteritidis S. enterica subsp. enterica ser. Enteritidis
enterica (>95% sierotipi repertabili
in materiali patologici umani)
salamae
arizonae
diarizonae
houtenae
indica
studi ibridazione
DNA-DNA
subspecies
Forme cliniche di salmonellosi
• enterite
• febbre tifoide e paratifoide
• setticemia
• colonizzazione asintomatica
• enterite
Forme cliniche di salmonellosi
è la forma più comune
• enterite
• febbre tifoide
• setticemia
• colonizzazione asintomatica
Forme cliniche di salmonellosi
•
• 6-48 h dall’ingestione di acqua o cibo contaminato
• nausea, vomito, diarrea
• febbre, dolori addominali, mialgia, cefalea
IL-8
Forme cliniche di salmonellosi
febbre tifoide
• febbre tifoide
Forme cliniche di salmonellosi
ingestione di batteri con alimenti o acqua
stomaco intestino linfonodi mesenterici circolo ematico sistema reticolo-endoteliale di fegato, milza, midollo osseo
moltiplicazione batterica
reinvasione del circolo ematico
diffusione ad altri organi
concentrazione nella cistifellea bile intestino
escrezione con le feci
cefalea, mialgia, malessere, anoressia stato stuporoso febbre alta sub-continua (39-40°C)
fine del periodo d’incubazione (10-14 giorni)
? IL-8
Shigella
Shigella
La denominazione deriva dallo scopritore Shiga che identificò tali batteri nel 1898. Sono bacilli Gram-negativi, immobili.
CLASSIFICAZIONE
Sono distinte in 4 specie o sottogruppi:
Shigella dysenteriae o sottogruppo A
Shigella flexneri o sottogruppo B
Shigella boydii o sottogruppo C
Shigella sonnei o sottogruppo D
BIOTIPI di ESCHERICHIA COLI
Shigella
L’uomo è l’ospite naturale (NO serbatoio animale)
La trasmissione della malattia avviene direttamente
da persona a persona per via oro-fecale e, meno
frequentemente, attraverso acqua e cibi
contaminati; anche le mosche possono fungere da
agenti vettori.
Le Shigelle sono in grado di dare malattia anche con
una minima carica infettante (2x102 microrganismi)
Shigella Passing Through the Mucous Membrane
and Invading Mucosal Epithelial Cells
A proposed model for invasion of epithelial cells of the colon.
1) The Shigella first cross the mucosa by passing through specialized cells called M cells. The M
cell passes the Shigella on to a macrophage from which it subsequently escapes - possibly by
inducing apoptosis, a programmed cell suicide.
2) The Shigella then uses its invasins to enter the mucosal epithelial cells from underneath. The
invasins cause actin polymer rearrangements in the cell's cytoskeleton resulting in the bacterium
being engulfed and placed in an endocytic vesicle in a manner similar to phagocytic cells. Once
inside, the Shigella escape from the vacuole into the cytoplasm and multiply.
3) The Shigella are able to move through the host cell and spread to adjacent host cells by a
unique process called actin-based motility. In this process, actin filaments polymerize at one end
of the bacterium, producing comet-like tails that propel the Shigella through the cytoplasm of the
host cell.
4) When they reach the boundary of that cell, the actin filaments push the Shigella across that
membrane and into the adjacent cell.
Sistema di secrezione
di tipo III IpaA, IpaB,
IpaC, IpaD
DISSENTERIA BACILLARE
è una malattia assai comune nei climi caldi e si associa a basse condizioni igienico-sanitarie. Maggiormente diffusa nelle collettività e in ambito pediatrico.
Il periodo d’incubazione è 2-4 gg.
I bacilli, penetrati per os, raggiungono l’intestino penetrando nelle cellule epiteliali della mucosa (ileo distale e colon) e moltiplicandosi nella sottomucosa, con formazione di microascessi e successive necrosi e ulcerazioni superficiali. Abitualmente non viene invaso il circolo ematico.
Sintomatologia da moderata a grave. Diarrea solitamente acquosa all’inizio (produzione di 2 enterotossine, ShEt1 e ShEt), successivamente compaiono sangue e muco.
• Nelle forme sostenute da Shigella dysenteriae tipo 1, produttrice della tossina di Shiga, sono possibili complicanze quali: colite emorragica, sindrome uremico- emolitica.
Terreno di Amies Selenite Broth
18-24 h 35°C
Hektoen Enteric Agar
Xylose-Lysine-Desoxycholate (XLD) Agar
SS Agar
18-24 h 35°C
18-24 h 37°C
18-24 h 35°C
Protocollo diagnostico Salmonella e Shigella nelle feci
ARRICCHIMENTO
Terreni selettivi e differenziali
ENTEROBATTERI
subcolture
Test biochimici
Reazioni sierologiche
(ricerca antigeni O per Shigella, ricerca antigeni O e antigeni H per Salmonella)
IDENTIFICAZIONE COMPLETA DI SPECIE
S. typhi
Escherichia coli
Bacillo Gram negativo mobile lattosio-
fermentante
Fa parte della normale flora intestinale umana
(rappresenta la specie aerobia facoltativa
predominante della comunità batterica residente
a livello dell’intestino crasso)
Escherichia coli
Escherichia coli
È causa di:
• Infezioni urinarie
• Setticemie
• Meningiti neonatali
• Gastroenteriti
infezioni endogene
infezioni esogene
Escherichia coli
Patotipi:
• Enteritogeni
• Extraintestinali
Enteropatogeni Enterotossigeni Enteroemorragici Enteroinvasivi Enteroaggreganti Diffusamente aderenti
Uropatogeni Causa di meningiti neonatali Aderenti invasivi Necrotossigeni Cell detaching E. coli
Escherichia coli
Sequenziamento ceppi E. coli isolati:
• core genome: circa 2200 geni
• pan-genome: circa 13000 geni
• genoma maggior parte E. coli patogeni:
circa 5000 geni
SETTICEMIA
E. coli è il bacillo Gram-negativo più frequentemente isolato da pazienti setticemici.
La setticemia generalmente origina da un’infezione delle vie urinarie o del distretto gastroenterico. È favorita dalla presenza di una patologia di base del paziente (diabete, neoplasie, emopatie) o da condizioni di immunocompromissione.
Escherichia coli
UPEC
adesine: pili tipo 1, pili P, pili S
siderofori: enterobactina, aerobactina
Tossine: emolisina formante-pori; tossina autotrasporter
secreta (Sat)
IBC: intracellular bacterial communities
Escherichia coli
STIPITI ENTERITOGENI
•E. coli enteropatogeni (EPEC)
•E. coli enterotossigeni (ETEC)
•E. coli enteroemorragici (EHEC)
•E. coli enteroinvasivi (EIEC)
•E. coli enteroaggregativi (EAEC)
•E. coli diffusamente aderenti (DAEC)
ETEC O6 H16
O8 H9
O11 H27
O15 H11
O20 NM
O25 H42, NM
O27 H7
O78 H11, H12
O128 H7
O148 H28
O149 H10
O159 H20
O173 NM
EPEC O55 H6, NM
O86 H34, NM
O111 H2, H12, NM
O119 H6, NM
O125ac H21
O126 H27, NM
O127 H6, NM
O128 H2, H12
O142 H6
Classificazione secondo Kauffman
e White
ENTEROPATOGENI (EPEC)
Rappresentano la causa più frequente di diarrea infantile nei paesi in via di sviluppo.
Sono responsabili di diarrea acquosa, anche persistente, spesso associata a vomito e febbre.
Privi di potere tossinogeno o invasivo, sono dotati di un
particolare carattere di adesività localizzata alle cellule
dell’intestino tenue, mediata inizialmente da pili a fasci
(Bfp) e quindi dall’intimina il cui recettore (Tir) viene
inserito nella membrana della cellula epiteliale
attraverso un sistema di secrezione di tipo III.
L’adesione degli EPEC ai microvilli ne causa la distruzione
con conseguente diarrea da malassorbimento.
microcolonie
Immagine al microscopio elettronico che mostra EPEC aderenti all’orletto a spazzola delle cellule della mucosa intestinale con evidente distruzione localizzata dei microvilli.
ENTEROTOSSIGENI (ETEC)
Importante causa batterica di diarrea infantile nei paesi in via di sviluppo, più comune causa di diarrea del viaggiatore.
Causano una tipica diarrea acquosa con nausea, crampi addominali e febbre di modesta entità.
Nella patogenesi delle lesioni indotte dagli stipiti ETEC, che aderiscono (Colonization Factor Antigen 1 and 2 (C.F.A.)) a specifiche regioni della membrana delle cellule epiteliali del’intestino tenue, svolge un ruolo fondamentale la produzione di:
• enterotossina termolabile (LT-1 e LT-2) meccanismo d'azione simile alla tossina colerica (diarrea per aumento dell'AMPc)
• enterotossina termostabile (ST-a e ST-b) meccanismo d'azione diverso da quello della LT ma con effetto finale molto simile (diarrea per aumento di GMPc)
ENTEROEMORRAGICI (EHEC)
Bassissima carica infettante (circa 50 batteri)
La maggior parte dei casi di malattia è stata attribuita al consumo di carne macinata di manzo contaminata durante la lavorazione e consumata poco cotta (MALATTIA DELL’HAMBURGER); consumo di acqua o di latte o succhi di frutta non pastorizzati, verdura cruda, frutta.
Principalmente appartenenti al sierotipo O157:H7, riconosciuto una causa crescente di infezioni acquisite per via alimentare. Sono i ceppi più comunemente responsabili di malattia nei Paesi industrializzati.
ENTEROEMORRAGICI (EHEC)
Dopo aver aderito alla mucosa dell’intestino crasso, producono 2 potenti citotossine (Verotossine o Shiga-like toxin (Stx) 1 e 2) una delle quali (Stx-1) identica alla tossina di Shiga prodotta da Shigella dysenteriae sierotipo 1, mentre la Stx2 presenta il 60% di omologia.
Sono tossine di tipo AB; il frammento attivo si lega ad uno specifico glicolipide sulle cellule bersaglio (globotriaosilceramide) particolarmente abbondante sulle cellule intestinali e sulle cellule endoteliali renali. La porzione attiva della tossina una volta all’interno delle cellule si lega all’rRNA 28S bloccando la sintesi proteica con conseguente distruzione dei villi intestinali, malassorbimento ed escrezione di fluidi. Gli effetti a distanza ad esempio sul rene sono conseguenti all’entrata in circolo.
Manifestazioni cliniche associate agli stipiti EHEC molto varie:
diarrea
colite emorragica (30-60% dei casi)
sindrome uremica emolitica (5-10% bambini <10 anni infetti)
insufficienza renale acuta
piastrinopenia
anemia emolitica microangiopatica
ENTEROEMORRAGICI (EHEC)
ENTEROINVASIVI (EIEC)
colonizzano la mucosa del colon e ne invadono le cellule attraverso un meccanismo di endocitosi; lisano il vacuolo endocitotico, si moltiplicano all’interno della cellula che viene uccisa, e diffondono alle cellule adiacenti provocando distruzione tissutale e un’intensa risposta infiammatoria.
La loro patogenicità è legata ad una ISOLA DI INVASIVITÀ che include numerose proteine della membrana esterna tutte codificate da un plasmide.
Sono responsabili clinicamente di una forma dissenterica simile a quella causata dalle Shigelle caratterizzata da:
febbre, crampi addominali, malessere
emissione di feci prima acquose poi mucosanguinolenti, ricche di PMN
ENTEROAGGREGANTI (EAEC)
Derivano il loro nome dalla caratteristica modalità di adesione alle colture tissutali, consistente nella formazione di aggregati a “pila di mattoni”.
ENTEROAGGREGANTI (EAEC)
Colonizzano l’intestino tenue, provocando diarrea acquosa persistente specialmente infantile nei Paesi in via di sviluppo; possono causare diarrea cronica con ritardo della crescita.
Potrebbero essere una causa importante sottostimata di diarrea infantile nei Paese industrializzati.
Aderiscono mediante fimbrie di adesione aggreganti (AAF/I, AAF/II, AAF/III) e stimolano la produzione di muco da parte delle cellule della mucosa intestinale, da cui i batteri risultano inglobati formando un biofilm.
Producono 2 tipi di tossine:
tossina enteroaggregante termostabile
tossina plasmidica
DIFFUSAMENTE ADERENTI (DAEC)
Aderiscono alle colture tissutali senza formazione di aggregati. Stimolano l’allungamento dei microvilli.
E. coli enteritogeni: meccanismi patogenetici
Nataro J. P. and Kaper J. B. Clinical Microbiology Reviews. 1998
Protocollo diagnostico UPEC
McConkey Agar
Colonie rosa acceso
Identificazione biochimica e antibiogramma
Protocollo diagnostico NMEC
McConkey Agar
Colonie rosa acceso Identificazione biochimica e antibiogramma
Protocollo diagnostico EPEC
Eosin Methylene Blue (EMB) Agar, Levine
Tipizzazione sierologica
Terreno di Amies
24 h, 37°C
Colonie verde-metallico, confluenti
McConkey Agar
Colonie rosa acceso
Eosin Methylene Blue (EMB) Agar, Levine
Tipizzazione sierologica
Terreno di Amies
ricerca produzione di enterotossina
(test immunologici per LT, prove biologiche per ST,
sonde genetiche per i geni LT e ST)
24 h, 37°C
Colonie verde-metallico, confluenti
Protocollo diagnostico ETEC
Diarrea infantile e dei viaggiatori
Protocollo diagnostico ETEC
Terreno di Amies
Sorbitol Mac Conkey Agar
Tipizzazione sierologica O157:H7
24 h, 35°C
Colonie sorbitolo-ramnoso negative
HUS (Sindrome emolitica uremica)
Protocollo diagnostico EHEC
ricerca produzione tossina Shiga-like (test immunologici, biologici o molecolari)
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