UNIVERSITA' DEGLI STUDI DI PADOVA
Sede Amministrativa: Università degli Studi di Padova
Sede Consorziata: Università degli Studi “Federico II” di Napoli
Dipartimento di Chimica Biologica
DOTTORATO DI RICERCA
FISIOLOGIA MOLECOLARE E BIOLOGIA
STRUTTURALE
CICLO XX
Caratterizzazione strutturale del
sistema redox Tioredossina/Tioredossina Reduttasi
dall'archaeon Sulfolobus solfataricus
Coordinatore: Ch.mo Prof. Benedetto Salvato
Supervisori: Ch.mo Prof. Adriana Zagari
Ch.mo Dott. Luigi Vitagliano
Dottorando: Dott.ssa Maria Angela Lanzotti
II
Indice
Riassunto............................................................................................................................................................. VI
Abbreviazioni e simboli .................................................................................................................................... IX
Premessa ............................................................................................................................................................. X
CAPITOLO 1 ...................................................................................................................................................... 13
Introduzione...................................................................................................................................................... 13
1.1 Organismi estremofili: gli Archaea................................................................................................. 13
1.1.1 Applicazioni biotecnologiche ................................................................................................ 15
1.1.2 Studio dei meccanismi molecolari alla base della stabilita' di proteine da organismi estremo fili.................................................................................................................................................. 16
1.2 La super famiglia delle tioredossine ................................................................................................... 18
1.3 Il sistema redox Tioredossina-Tioredossina Reduttasi ....................................................................... 23
1.4 Il ponte disolfuro..................................................................................................................................... 31
1.5 Il sistema redox Tioredossina-Tioredossina Reduttasi nell’organismo ipertermofilo S.solfataricus......................................................................................................................................................................... 34
1.6 Obiettivi ................................................................................................................................................... 36
CAPITOLO 2 ...................................................................................................................................................... 39
DETERMINAZIONE CRISTALLOGRAFICA DI SsTrx(B3).................................................................................... 39
2.1 Introduzione............................................................................................................................................ 39
2.1.1 La Tioredossina Reduttasi di E.Coli ............................................................................................... 42
2.1.2 SsTrxR(B3): una proteina con due funzioni.................................................................................. 44
2.2 Materiali e metodi ................................................................................................................................. 48
2.2.1 Preparazione e purificazione di SsTrxR(B3) e del derivato di SsTrxR(B3) contenente la selenio metionina..................................................................................................................................... 48
2.2.2 Cristallizzazione di SsTrxR(B3) ......................................................................................................... 49
2.2.3 Registrazione ed analisi statistica dei dati cristallografici di SsTrxR(B3) ................................. 50
2.2.4 Risoluzione ed affinamento cristallografico di SsTrxR(B3)......................................................... 51
2.2.5 Determinazione della stabilità di SsTrxR(B3) mediante la tecnica spettroscopica del Dicroismo circolare .................................................................................................................................. 52
III
2.2.6 Esperimenti di denaturazione chimica ....................................................................................... 52
2.3 Risultati ..................................................................................................................................................... 53
2.3.1 Proprietà catalitiche di SsTrxR(B3) ................................................................................................ 53
2.3.2 Determinazione della struttura cristallografica di SsTrxR(B3) ................................................... 54
2.3.4 Confronto della struttura di SsTrxR e EcTrxR ................................................................................ 57
2.3.5 Descrizione della struttura complessiva di SsTrxR(B3) ............................................................... 59
2.3.6 Descrizione del sito attivo.............................................................................................................. 62
2.3.7 Struttura cristallografica del complesso SsTrxR-NADPH............................................................ 66
2.3.8 Analisi del contenuto di struttura secondaria............................................................................ 67
2.3.9 Analisi della stabilità termica ........................................................................................................ 67
2.3.10 Denaturazione chimica............................................................................................................... 68
2.3.11 Ponti salini e stabilità termica ..................................................................................................... 71
2.4 Conclusioni ............................................................................................................................................. 73
CAPITOLO 3 ...................................................................................................................................................... 76
DETERMINAZIONE CRISTALLOGRAFICA DI SsTrxA2...................................................................................... 76
3.1 Introduzione............................................................................................................................................ 76
3.1.1 La Tioredossina da E.Coli ............................................................................................................... 78
3.1.2 Trxm del cloroplasto da spinacio ................................................................................................. 79
3.2 Materiali e metodi ................................................................................................................................. 82
3.2.1 Preparazione e purificazione di SsTrxA2...................................................................................... 82
3.2.2 Attività enzimatica di SsTrxA2........................................................................................................ 83
3.2.3 Determinazione del potenziale redox di riduzione................................................................... 84
3.2.4 Misura della termofilicità................................................................................................................ 84
3.2.5 Cristallizzazione di SsTrxA2.............................................................................................................. 85
3.2.6 Registrazione ed analisi statistica dei dati cristallografici di SsTrxA2...................................... 86
3.2.7 Risoluzione ed affinamento cristallografico di SsTrxA2 ............................................................. 88
3.2.8 Determinazione della stabilità di SsTrxA2 mediante la tecnica spettroscopica del Dicroismo circolare .................................................................................................................................. 88
3.2.9 Esperimenti di denaturazione chimica ....................................................................................... 89
3.2.10 Analisi della struttura secondaria............................................................................................... 89
IV
3.3 Risultati ..................................................................................................................................................... 91
3.3.1 Proprietà biochimiche di SsTrxA2 ................................................................................................. 91
3.3.2 Il potenziale redox di SsTrxA2 ........................................................................................................ 92
3.3.3 Inattivazione termica di SsTrxA2 ................................................................................................... 93
3.3.4 Determinazione della struttura cristallografica di SsTrxA2 ....................................................... 93
3.3.5 Descrizione della struttura complessiva di SsTrxA2.................................................................... 95
3.3.6 Descrizione del sito attivo.............................................................................................................. 97
3.3.7 Confronto della struttura di SsTrxA2 e EcTrx, Trxm...................................................................... 97
3.3.8 Analisi del contenuto di struttura secondaria............................................................................ 98
3.3.9 Analisi della stabilità termica ........................................................................................................ 98
3.3.10 Denaturazione chimica............................................................................................................... 99
3.3.11 Stabilità termica.......................................................................................................................... 100
3.4 Conclusioni ........................................................................................................................................... 101
CAPITOLO 4 .................................................................................................................................................... 104
DETERMINAZIONE CRISTALLOGRAFICA DI SsTrxA1.................................................................................... 104
4.1 Introduzione.......................................................................................................................................... 104
4.2 Materiali e metodi ............................................................................................................................... 105
4.2.1 Preparazione e purificazione di SsTrxA2.................................................................................... 105
4.2.2 Attività enzimatica di SsTrxA1...................................................................................................... 106
4.2.3 Determinazione del potenziale redox di riduzione................................................................. 106
4.2.4 Misura della termofilicità.............................................................................................................. 107
4.2.5 Cristallizzazione di SsTrxA1............................................................................................................ 107
4.2.6 Registrazione ed analisi statistica dei dati cristallografici di SsTrxA2.................................... 108
4.2.7 Affinamento cristallografico di SsTrxA1 ..................................................................................... 109
4.2.8 Determinazione della stabilità di SsTrxA2 mediante la tecnica spettroscopica del Dicroismo circolare ................................................................................................................................ 109
4.2.9 Esperimenti di denaturazione chimica ..................................................................................... 110
4.3 Risultati ................................................................................................................................................... 111
4.3.1 Proprietà biochimiche di SsTrxA1 ............................................................................................... 111
4.3.2 Il potenziale redox di SsTrxA1 ...................................................................................................... 112
V
4.3.3 Inattivazione termica di SsTrxA1 ................................................................................................. 113
4.3.4 Determinazione della struttura cristallografica di SsTrxA1 ..................................................... 114
4.3.5 Analisi della stabilità termica ...................................................................................................... 115
4.3.6 Denaturazione chimica............................................................................................................... 116
4.4 Conclusioni ........................................................................................................................................... 116
CAPITOLO 5 .................................................................................................................................................... 119
CONCLUSIONI E PROSPETTIVE...................................................................................................................... 119
Appendice I.................................................................................................................................................... 126
La cristallizzazione.......................................................................................................................................... 126
A.I.1 I cristalli proteici............................................................................................................................... 126
A.I.2 Principi generali della cristallizzazione di proteine.................................................................... 128
A.I.3 Tecniche di cristallizzazione .......................................................................................................... 130
Appendice II................................................................................................................................................... 133
Registrazione ed analisi dei dati di diffrazione ......................................................................................... 133
A.II.1. Strategie per raccolta dati: tecniche di criocongelamento.............................................. 133
A.II.2 Registrazione dei dati di diffrazione: sistema di rivelazione ................................................ 135
A.II.3 Elaborazione dei dati di diffrazione......................................................................................... 136
Appendice III .................................................................................................................................................. 139
Metodi di risoluzione strutturale................................................................................................................... 139
A.III.I La Risoluzione della struttura .................................................................................................... 139
A.III.2 Il metodo della sostituzione molecolare (MR) ...................................................................... 140
A.III.2.1 La funzione di rotazione .......................................................................................................... 142
A.III.2.2 La funzione di traslazione ........................................................................................................ 144
A.III.3 La diffrazione anomala a λ multipla (MAD) ............................................................................... 145
A.III.3.1Trattazione matematica del MAD ............................................................................................. 148
Appendice IV ................................................................................................................................................. 151
Affinamento strutturale................................................................................................................................. 151
A.IV.1 Principi generali dell’affinamento strutturale......................................................................... 151
A.IV.2 Affinamento dei minini quadrati con costrizioni e restrizioni ............................................... 153
Bibliografia ...................................................................................................................................................... 157
VI
Riassunto
Gli studi descritti nell’ambito della presente tesi di dottorato, sono stati
rivolti all’analisi delle relazioni struttura-funzione, struttura-stabilità di enzimi
coinvolti nel processo di regolazione redox cellulare, NADPH-Tioredossina
Reduttasi (o sistema redox Tioredossina-Tioredossina Reduttasi), che si
svolge all’interno dell’organismo ipertermofilo S.solfataricus.
La caratterizzazione molecolare e strutturale del sistema NADPH-
Tioredossina Reduttasi dall’archaeon S.solfataricus, è stata avviata non
soltanto per dare un significato razionale all’apparente ridondanza riscontrata
in tale organismo, ma soprattutto per determinare il ruolo svolto dalle
diverse molecole che partecipano a tale processo.
Le indagini strutturali, effettuate combinando i risultati di studi cristallografici
e analisi spettroscopiche, sono state condotte su tre enzimi appartenenti al
processo redox sopra menzionato, che attraverso un attività enzimatica
altamente correlata, assumono un ruolo fondamentale nei meccanismi di
mantenimento dello stato ridotto all’interno delle cellule, la Tioredossina
Reduttasi, SsTrxR(B3), e le due Tioredossine SsTrx(A1) e SsTrx(A2).
La determinazione cristallografica della struttura terziaria di SsTrxR(B3),
SsTRxA1 e SsTrxA2, ha permesso di valutare similitudini e differenze con
proteine omologhe appartenenti ad altre specie.
Inoltre in accordo con i risultati ottenuti dagli studi spettroscopici effettuati
con la tecnica del dicroismo circolare, è stato possibile individuare i
determinanti strutturali che conferiscono l’elevata stabilità alle alte
temperature.
La determinazione cristallografica e spettroscopica di SsTrxR(B3) ha
mostrato che l’ enzima presenta proprietà specifiche, che attestano alcune
differenze in termini strutturali-funzionali, rispetto alle proteine omologhe
mesofile.
SsTrxR(B3) possiede due differenti attività, un attività Tioredossina
Reduttasica e un attività NADPH-ossidasica. Tuttavia per quanto concerne
VII
l’attività Tioredossina Reduttasica, l’enzima sembra avere due diversi
substrati Trx e PDO.
La caratterizzazione strutturale di SsTrxR(B3) ha mostrato che a differenza di
quanto osservato in struttura note di Tioredossine Reduttasi da eucarya-
eubacteria, la proteina nativa presenta un diverso modo di legare il cofattore
FAD. Infatti l’anello isoallossazinico è molto più esposto e tale osservazione
potrebbe spiegare l’attività aggiuntiva presentata dall’enzima, ossia la
capacità di legare e di ossidare il NADPH.
La stessa ipotesi trova conferma da ulteriori studi strutturali condotti su di un
mutante di SsTrxR(B3), ottenuto sostituendo il residuo di cisteina 147, con
un residuo di alanina, C147A. Infatti il mutante, che presenta una larga
cavità in prossimità del sito attivo, ha un attività marginale NADPH-
ossidasica. In altre parole una maggiore esposizione del cofattore FAD,
rende disponibile l’anello isoallossazinico della molecola per altre reazioni.
Gli esperimenti di denaturazione condotti sull’enzima hanno poi rivelato
interessanti proprietà che concernono l’elevata stabilità dell’enzima.
In particolare la denaturazione dell’enzima in presenza di basse
concentrazioni dell’ agente denaturante cloruro di guanidinio, GuHCl,
monitorata tramite registrazione di spettri CD a temperatura ambiente, ha
dimostrato che le interazioni elettrostatiche presenti nella struttura interna,
largamente contrastate nelle condizioni sperimentali sopra descritte, hanno
un ruolo fondamentale nei processi di stabilizzazione termica.
In particolare le analisi strutturali condotte su SsTrxR(B3) , hanno dimostrato
la presenza di un numero elevato di coppie ioniche all’interfaccia tra i due
domini che caratterizzano la molecola, il NADPH domain e il FAD domain.
Le interazioni elettrostatiche coinvolgono quattro residui amminoacidici
consecutivi carichi positivamente (Lys124, Arg125, Arg126, e Lys 127) e
altrettanti residui carichi negativamente, che non sono conservati nella
sequenza della Tioredossina Reduttasi da E.coli.
Le forme ricombinanti purificate di SsTrxA1 e SstrxA2 sono state ottenute sia
in forma intatta (15kDa), che in forma troncata (12kDa); entrambe le forme
VIII
presentano una struttura omodimerica sia in condizioni non denaturanti che
in presenza di un agente riducente.
Riguardo la struttura quaternaria entrambe le proteine SsTrxA1 e SsTrxA2,
formano un omodimero, una caratteristica riscontrata in un numero piuttosto
limitato di Trx sia da eubacteria che eucarya.
SsTrxA1 e SsTrxA2, sono proteine dotate di un eccezionale termostabilità
infatti la loro inattivazione è stata rilevata soltanto dopo averle esposte a
temperature superiori ai 90°C per un tempo piuttosto lungo.
Per quanto concerne le indagini avviate per la comprensione dei determinati
strutturali che determinano l’elevata stabilità dei tali enzimi, i risultati ottenuti
confermano l’ipotesi secondo la quale ciascun enzima segue un percorso
evolutivo differente per preservare la sua integrità strutturale alle alte
temperature.
In particolare confrontando i dati emersi dagli studi strutturali su SsTrxR(B3)
e SsTrxA2 e SsTrxA1, è risultato che queste proteine pur appartenendo allo
stesso organismo, per rispondere alle diverse esigenze dettate dal loro
specifico ruolo biologico, hanno adottato strategie divergenti per resistere
alle alte temperature.
E’ stato osservato infatti che mentre SsTrxR(B3) deve la sua stabilità ad un
numero elevato di ponti salini, gli altri due enzimi sono termostabili
probabilmente a causa di un maggiore grado di strutturazione che si traduce
in una maggiore compattezza della struttura quaternaria.
La compattezza della struttura tridimensionale è dovuta essenzialmente
all’aumentare dell’estensione dei motivi di struttura secondaria ed ad una
diminuzione della dimensione dei loops, rispetto alla proteine omologhe
mesofile e sembra dunque costituire un’ulteriore strategia adottata dalle
proteine termofile per resistere alle alte temperature.
IX
Abbreviazioni e simboli
Å Angstrom (0.1 nm)
Da Dalton-unità di massa atomica
λ Lunghezza d’onda (nm)
u.a. Unità asimmetrica
Rmsd Deviazione quadratica media
σ Deviazione standard
B Fattore di spostamento atomico
Dsb ossido reduttasi periplasmatica
PDI disolfuro isomerasi
PDO disolfuro ossidasi
SsPDO disolfuro ossidasi da Sulfolobus solfataricus
Trx Tioredossina
SsTrxA1 Tioredossina da Sulfolobus solfataricus forma 1
SsTrxA2 Tioredossina da Sulfolobus solfataricus forma 2
Trxm Tioredossina dal cloroplasto di spinacio
EcTRX Tioredossina da E.Coli
TrxR Tioredossina Reduttasi
SsTrxRB1 Tioredossina Reduttasi da Sulfolobus solfataricus forma B1
SsTrxRB2 Tioredossina Reduttasi da Sulfolobus solfataricus forma B2
SsTrxRB3 Tioredossina Reduttasi da Sulfolobus solfataricus forma B3
NADPH Nicotinammide Adenin Dinucloetide Fosfato
FAD Flavin Adenin Dinucleotide
EDTA Acido Etilendiamminotetraacetico
CD Dicroismo Circolare
SDS Sodio Dodecilsolfato
DTT Ditiotreitolo
GUHCl Cloruro di Guanidinio
X
Premessa
L’attività svolta nell’ambito del Corso di Dottorato in Biologia Strutturale e
Fisiologia Molecolare, ha avuto come oggetto la determinazione della
relazione che intercorre tra la struttura e la funzione di tre diversi enzimi che
partecipano al processo redox NADPH-Tioredossina Reduttasi dall’archaeon
S.solfataricus, la Tioredossina Reduttasi SsTrxR(B3), e le due tioredossine,
SsTrxA1, SstrxA2,.
Ciascuna di queste proteine si caratterizza per la presenza all’interno del sito
attivo di un ponte disolfuro, un motivo strutturale che è essenziale per lo
svolgersi della loro funzione biologica.
L’importanza del ponte disolfuro collocato nella struttura interna di proteine
ha un duplice fondamento: tale motivo strutturale è essenziale sia per
quanto riguarda la stabilizzazione dello stato nativo di alcune proteine, sia
per quanto concerne il ruolo biologico assunto da classi particolari di enzimi
all’interno della cellula. Il ponte disolfuro è un interazione covalente intra
molecolare altamente reversibile che oltre a determinare particolari proprietà
di tipo strutturale, funzionale, caratterizza diverse proteine appartenenti ai
tre domini filogenetici, archaea, eubacteria, eucarya.
Studi recenti inoltre hanno dimostrato che il ponte disolfuro gioca un ruolo
predominante per quanto concerne la stabilizzazione di proteine da
organismi ipertermofili.
Per lungo tempo si è ipotizzato che le condizioni altamente riducenti che
caratterizzano il citoplasma non fossero compatibili con l’esistenza in tale
comparto cellulare di proteine in cui coppie di residui di cisteine fossero nella
forma ossidata. Infatti si era ipotizzato che proteine contenenti ponti
disolfuro avrebbero potuto localizzarsi soltanto nelle zone
extracitoplasmatiche. Questa ipotesi è stata definitivamente abbandonata
allorquando l’evidenza sperimentale dell’ultimo decennio ha rivelato che
all’interno degli organismi ipertermofili esiste un numero elevato di proteine
contenenti ponti disolfuro che si collocano nell’ambiente citoplasmatico.
Questo dato ha suggerito l’ipotesi che in tali organismi il ponte disolfuro
XI
potrebbe dare un contributo decisivo alla stabilizzazione di proteine in
condizioni di temperatura piuttosto elevate, attraverso un meccanismo di
compensazione del livello insufficiente di carica elettrostatica.
Il processo di formazione del ponte disolfuro non è spontaneo ma è regolato
e modulato da un sistema enzimatico piuttosto complesso. Un ruolo
importante in tale processo viene assunto da una classe particolare di
proteine ubiquitarie appartenenti alla superfamiglia delle tioredossine, che
include enzimi quali, le Tioredossine (Trx), la Tioredossina Reduttasi (TrxR) e
le disolfuro ossidasi-isomerasi(PDO, PDI).
La Tioredossina è la principale proteina ubiquitaria responsabile del
mantenimento dello stato ridotto all’interno della cellula. La Tioredossina è il
substrato della Tioredossina Reduttasi, che durante ciascuna interazione
fornisce gli elettroni necessari per rigenerarne lo stato ridotto. Gli elettroni
vengono inizialmente ceduti dal coenzima NADPH e trasferiti tramite il
gruppo prostetico FAD alla Tioredossina Reduttasi. In tale modo l’enzima è
nella forma adatta a ridurre il proprio substrato, Trx.
Il complesso sistema, che coinvolge, la Tioredossina, la Tioredossina
Reduttasi, e il coenzima NADPH, viene denominato come sistema redox
NADPH-Tioredossina Reduttasi o sistema redox Tioredossina-Tioredossina
Reduttasi, ed è presente in tutte le cellule.
Nell’ultimo ventennio le molecole che costituiscono il sistema redox NADH-
Tioredossina Reduttasi, sono state isolate e caratterizzate per diversi
organismi appartenenti ai tre domini, archaea, eubacteria and eukarya. I
risultati conseguiti mettono in luce le differenze tra i vari sistemi a seconda
del dominio di appartenenza.
Tuttavia, per quanto concerne gli eucarya e gli eubacteria, il sistema redox e
le molecole che ne fanno parte, sono stati ampiamente caratterizzati, ma al
contrario ancora poco è noto riguardo gli archaea.
Recentemente studi di genomica condotti sull’organismo ipertermofilo
S.solfataricus hanno rivelato la presenza di diversi geni che identificano
sistemi differenti Tioredossina-Tioredossina Reduttasi. In particolare sono
state identificate due tioredossine (SsTrxA1 e SsTrxA2) e Tioredossine
XII
Reduttasi (SsTrxRB2 e SsTrxRB3), oltre che una proteina contenente il
motivo strutturale conservato CXXC, con elevata identità di sequenza con le
altre TrxR (SsTrxRB1). Tuttavia sembra che il sistema redox Tioredossina-
Tioredossina Reduttasi nell’organismo S.solfataricus sia costituito dalla
Tioredossina SsTrxR(B3) e dalle due tioredossine SsTrxA1 e SsTrxA2 che
sono deputate ad essere i potenziali substrati.
Studi recenti sembrano aver messo in dubbio tuttavia le ipotesi avanzate per
quanto concerne la funzione di alcune proteine ad attività ossido-reduttasica
presenti all’interno di tale organismo. Infatti studi enzimatici comparati sui
sistemi Disolfuro Ossidoreduttasi-Tioredossina Reduttasi SsPDO-SsTrx(B3), e
Tioredossina-Tioredossina Reduttasi, SsTrx-SsTrxR, sembrano mostrare che
un altro potenziale substrato della Tioredossina Reduttasi, possa essere la
Proteina Disulfuro Ossidoreduttasi PDO, anziché le Tioredossina.
La caratterizzazione strutturale di SsTrxR(B3) e le due tioredossine SsTrxA1 e
SsTrxA2 risulta essere necessaria per poter identificare il ruolo effettivo delle
diverse molecole coinvolte nel processo di regolazione redox.
Allo scopo di chiarire la relazione che intercorre tra struttura-funzione, e
struttura-stabilità relativa ai tre enzimi coinvolti nel sistema redox NADPH-
Tioredossina Reduttasi dell’organismo ipertermofilo S.solfataricus, nel
presente lavoro sono stati condotti e messi a confronto i risultati sperimentali
acquisiti nel corso di indagini cristallografiche e analisi spettroscopiche su
SsTrxA1, SstrxA2, SstrxR(B3). Pertanto nel presente testo saranno descritte
le strutture cristallografiche di SsTrxA1, SstrxA2, SstrxR(B3) e presentati i
risultati di esperimenti di denaturazione termica e chimica, monitorati
attraverso la tecnica spettroscopica del Dicroismo Circolare(CD).
13
CAPITOLO 1
Introduzione
1.1 Organismi estremofili: gli Archaea
Negli anni '70 approfonditi studi sul patrimonio genetico e su
particolari classi di molecole di microrganismi che crescono in
condizioni estreme di temperatura, pH e concentrazione salina,
hanno portato alla scoperta di una terza linea evolutiva, ben distinta
da quella di altri procarioti e quella degli eucarioti, gli archaea. Nel
1977, Woese e Fox in base al confronto tra le sequenze nucleotidiche
degli rRNA 16S allora noti, proposero di suddividere i procarioti in
eubatteri e archeobatteri (Woese et al.1977). L'uso del prefisso
archeo- scaturiva dall'ipotesi che tali microrganismi potevano
rappresentare forme ancestrali di vita sulla Terra. In seguito altri
studi hanno evidenziato l'esistenza negli archeobatteri di tRNA e
rRNA peculiari, l'assenza di peptidoglicani nella parete cellulare e la
presenza di lipidi di membrana con una struttura caratteristica
(Woese et al.,1978; Woese, 1993), confermando la distinzione dei
procarioti in eubatteri e archeobatteri. Più recentemente l'analisi
comparativa di un numero sempre maggiore di sequenze di rRNA
16S e 18S isolati da diversi organismi, ha portato alla suddivisione
dei tre domini, chiamati Bacteria, Archaea e Eucarya (Woese et al.,
1990), in diversi regni (Figura 1.1).
E' difficile stabilire se gli archeobatteri siano più prossimi agli
eubatteri o agli eucarioti. Difatti, per quanto riguarda la semplicità
14
strutturale, la presenza di un solo cromosoma, l'assenza di nucleo e
nucleolo e la sensibilità ai batteriofagi, gli archaea appaiono più simili
agli eubatteri. Tuttavia, la natura del loro sistema di traduzione, la
sequenza delle proteine ribosomali e la struttura delle subunità
ribosomali inducono a pensare che gli archaea siano più vicini agli
eucarya.
Gli archaea sono classificati in base alla loro temperatura ottimale
di crescita in mesofili (Topt 30°-50°C), termofili (Topt 60°-70°C) e
ipertermofili (Topt>80°C) (Cowan, 1992).
In particolare, lo studio di archaea termofili può risultare proficuo
principalmente per due motivi: le loro applicazioni biotecnologiche e
il loro studio finalizzato alla comprensione del rapporto struttura-
funzione delle proteine in condizioni di temperatura elevate.
Fig 1.1: Ipotetico albero filogenetico universale degli organismi viventi costruito sulla
base del confronto delle sequenze degli rRNA 16S (Woese, 1993).
15
1.1.1 Applicazioni biotecnologiche
Gli enzimi isolati dagli archaea termofili mostrano la loro massima
attività alle temperature elevate a cui crescono i microrganismi da cui
sono isolati. Molti di questi “termoenzimi” hanno una temperatura
ottimale molto vicina a quella di crescita degli organismi ospiti e sono
invece meno attivi a temperatura ambiente, a cui è invece massima
l'attività degli enzimi isolati da organismi mesofili.
E' facile pensare all'utilità dell'impiego di tali enzimi in processi
industriali, se si pensa che l'elevata resistenza alla temperatura di
questi biocatalizzatori si accompagna anche ad una resistenza, a
condizioni di elevata forza ionica, ai comuni agenti denaturanti per le
proteine come solventi organici, tensioattivi. Fino a qualche anno fa,
l'uso di tali enzimi era fortemente limitato dagli elevati costi di
produzione connessi a problemi di bassa resa in biomassa.
Recentemente però si sono aperte nuove e promettenti possibilità
nell'impiego di enzimi termostabili, grazie all'avanzamento delle
conoscenze sulla genetica degli archaea che ha permesso di clonare
ed esprimere in E.coli e lieviti, i geni codificanti per enzimi di
archeobatteri termofili. Tale strategia ha reso competitiva la
produzione di queste proteine per via ricombinante semplificando
notevolmente il processo di ottenimento.
Uno dei primi esempi di proficua applicazione di termoenzimi è
stato l'uso di DNA polimerasi termostabili e termofile nella
“Polymerase Chain Reaction” (PCR) per l'amplificazione di specifiche
sequenze di DNA.
16
1.1.2 Studio dei meccanismi molecolari alla base della stabilita' di proteine da organismi estremofili
Uno degli aspetti più interessanti ma anche più controversi della
biochimica delle proteine è l’analisi dei meccanismi che conferiscono
la stabilità termica delle proteine da organismi estremofili
(Chakravarty, 2002; Das, 2000).
Lo studio di enzimi provenienti da microrganismi estremofili
fornisce un valido strumento d’indagine per definire le strategie
molecolari che la natura ha adottato per rendere possibile la vita
anche in condizioni estreme. E' ampiamente dimostrato che,
generalmente, la stabilità delle proteine da termofili sia intrinseca:
ovvero sia specificata dalla sequenza amminoacidica e, quindi, risieda
nella struttura terziaria, piuttosto che in fattori stabilizzanti esterni
(ioni metallici, coenzimi etc). E’ opinione diffusa che l’aumento della
stabilità dei termoenzimi non può essere attribuito ad un
determinante comune, ma è il risultato di una varietà di fattori
stabilizzanti che includono interazioni deboli come legami idrogeno,
interazioni elettrostatiche, interazioni con il solvente, effetto
idrofobico e presenza di network di ponti salini (Karshikoff and
Ladestein, 2001).
I termoenzimi ed i corrispondenti enzimi mesofili hanno
sostanzialmente la stessa efficienza catalitica alle loro rispettive
temperature ottimali. Difatti, i termoenzimi hanno una struttura più
rigida alle basse temperature rispetto agli enzimi mesofili ed
acquisiscono quella flessibilità necessaria per l'attività enzimatica solo
ad alte temperature. La maggiore rigidità dei termoenzimi è
necessaria per stabilizzare la conformazione attiva delle proteine ad
elevate temperature. In generale, infatti, un buon enzima deve
essere sufficientemente rigido da preservare la sua integrità
17
strutturale, ma deve essere sufficientemente flessibile per una
catalisi efficace.
Non vi sono tuttavia regole generali che dirigono l'adattamento
delle proteine alle condizioni ambientali estreme di temperatura: ogni
enzima sembra adottare una propria strategia strutturale. Il sistema
d’adattamento delle proteine alle temperature elevate, conferma
l'interdipendenza dei concetti di stabilità e di flessibilità che
permettono agli enzimi estremofili di conservare l'integrità della
propria conformazione e di svolgere un’efficace attività catalitica a
temperature estreme (Feller and Gerday, 1997).
La recente scoperta dell’esistenza di un numero elevato di proteine
dotate di ponti disofuro all’interno del citoplasma di organismi
altamente termostabili implica l’importanza del ponte disolfuro stesso
nel processo di stabilizzazione termica di questa classe di proteine.
La formazione del ponte disolfuro in proteine da organismi termofili
sembra essere la strategia adottata da tali enzimi per resistere alla
alte temperature. In particolare in proteine in cui è presente una
scarsa stabilizzazione elettrostatica la formazione del ponte disolfuro
serve a compensare tale carenza conferendo alle proteine uno stato
maggiormente strutturato. Sembra inoltre che ponti disolfuro
rinvenuti in proteine appartenenti ad organismi ipertermofili svolgono
un ruolo di primaria importanza nelle strategie di stabilizzazione
adottate dalle proteine per contrastare i processi di denaturazione
termica.
18
1.2 La super famiglia delle tioredossine
Il mantenimento dello stato ridotto delle proteine all’interno delle
cellule costituisce una condizione necessaria per il loro corretto
funzionamento. Gli enzimi impegnati ad assicurare lo stato redox
intracellulare appartengono alla stessa superfamiglia di cui fanno
parte le proteine responsabili della formazione dei ponti disolfuro: la
superfamiglia delle tioredossine. La superfamiglia delle tioredossine è
costituita da diverse classi di proteine, tra cui la classe più studiata è
costituita da un gruppo di enzimi ad attività tioltransferasica, che
comprende le tioredossine citoplasmatiche 1 e 2 (TrxA e TrxC), e le
glutaredossine 1, 2, 3 (GrxA, GrxB, GrxC). Inoltre dello stesso
supergruppo fanno parte alcune proteine eucariote che
appartengono alla famiglia delle Disulfuro Ossidasi (PDO), quali ad
esempio, le Proteine disolfuro isomerasi (PDI), Erp57, PDIp, e i
membri della subfamiglia PDI-D che contengono dei domini
relazionati dal punto di vista evolutivo alle tioredossine. Un altro
gruppo di enzimi è costituito da alcune proteine batteriche come la
DsbA, DsbC, DsbD, DsbG e DsbE appartenenti ad E.Coli, che
promuovono la formazione dei ponti disolfuro nelle proteine
periplasmatiche. All’interno della famiglia è possibile tuttavia
annoverare altre biomolecole, quali le proteine Glutatione
Perossidasi, e la Glutatione Transferasi. Di recente sono state
collocate nella superfamiglia, le proteine che interagiscono con la
proteina chinasi C (PICOT), e le nucleoredossine, entrambe ancora
poco conosciute riguardo le loro specifiche funzioni.
Tuttavia ciò che accomuna le Tioredossine, le Glutaredossine, le
proteine DsbA e PDI, è la presenza nel loro sito attivo di due cisteine
che determinano un attività enzimatica del tipo disolfuro ossidasi-
19
reduttasi, disolfuro isomerasi. Nonostante le proteine appartenenti
alla superfamiglia delle tioredossine non presentino un alto livello di
identità di sequenza, molto spesso è stato riscontrato un alto grado
di similitudine a livello strutturale; infatti solitamente tali proteine si
caratterizzano per la presenza nel loro sito attivo del motivo
strutturale altamente conservato CXXC. Per la maggior parte di
queste proteine, il residuo di cisteina N-terminale è deprotonato a pH
fisiologico e largamente esposto al solvente; tale cisteina costituisce
il residuo nucleofilo. Il secondo residuo di cisteina invece è
maggiormente nascosto all’interno della struttura, e solitamente è
nello stato protonato. La natura dei residui compresi tra le due
cisteine varia ampiamente nei differenti enzimi. Il motivo strutturale
CXXC, è collocato su un loop della molecola nella parte terminale di
un foglietto beta solitamente seguita da una lunga α-alica. Per
quanto riguarda il pKa della cisteina nucleofila sono stati misurati
differenti valori per ciascun enzima noto.
Tutte le Proteine Disolfuro Ossido-Reduttasi appartenenti alla
superfamiglia delle Tioredossine sono coinvolte nelle reazioni di
formazione, rottura e isomerizzazione dei ponti disolfuro. Le
Tioredossine sono proteine ubiquitarie che partecipano alla riduzione
di un numero elevato di enzimi citoplasmatici.
Le Glutaredossine sono dotate di attività riducente, ma solo la
Glutaredossina 1 è in grado di ridurre sia in vivo che in vitro il ponte
disolfuro. L’attività delle Glutaredossine 2 e 3 potrebbe essere
limitata solo alla riduzione di ponti disolfuro misti contenenti
glutatione.
La proteina Disolfuro Isomerasi (PDI) è coinvolta nei processi di
formazione delle proteine secretorie, e agisce probabilmente come
chaperone nel processo di formazione e riarrangiamento di ponti
disolfuro in proteine del reticolo endoplasmatico di cellule eucariote.
La proteina DsbA agisce come potente catalizzatore nei processi di
riduzione di cisteine di proteine e peptidi. Tuttavia presenta in vitro
una certa attività anche nel processo di isomerizzazione di ponti
20
disolfuro. L’ossidazione di residui di cisteine da parte di DsbA è
piuttosto rapida ma porta alla formazione di ponti disolfuro che non
sono quelli nativi. Il riarragiamento del ponte disolfuro viene
successivamente catalizzato dalla proteina dimerica periplasmatica
DsbC. Recentemente è stata identificata nel genoma di E.Coli un'altra
proteina che presenta un’ elevata omologia di sequenza con DsbC, la
proteina DsbG, ma attualmente non è ancora nota la sua funzione
biologica. Le proteine DsbC e DsbG entrambe agiscono come
chaperoni.
In tutte le proteine appartenenti alla superfamiglia delle tioredossine
che presentano il motivo strutturale CXXC, l’atomo di zolfo Sγ della
cisteina nucleofila, in condizioni fisiologiche, è deprotonato. Se la
proteina ha potere riducente, il tiolato attacca il ponte disolfuro del
substrato formando un ponte disolfuro misto. Al contrario se l’enzima
ha potere ossidante il tiolato attacca il solfuro del substrato formando
anche in questo caso un ponte misto. Il ponte misto intermolecolare
subisce attacco nucleofilo da parte dell’altro residuo di cisteina che
potrebbe essere deprotonato da parte di un residuo di acido
glutammico o aspartico posto nelle vicinanze del sito attivo. Anche se
non esistono ancora evidenze sperimentali del meccanismo di
reazione descritto in precedenza, alcuni autori ipotizzano che i gruppi
acidi responsabili della deprotonazione del secondo residuo di
cisteina in proteine appartenenti a E.Coli, siano l’acido aspartico in
posizione 26 nella Tioredossina 1, l’acido glutammico 30 in PDI, e
l’acido glutammico 24 in DsbA. L’allineamento di sequenza dei tre
enzimi mostra che la posizione di tali residui è altamente conservata.
Al contrario lo stesso allineamento effettuato aggiungendo la
glutaredossina mostra la presenza di un residuo di valina al posto del
residuo acido. Tale risultato ha suggerito l’ipotesi che nel caso della
glutaredossina il meccanismo di reazione relativo alla formazione del
ponte disolfuro sia piuttosto differente, infatti prevede la
partecipazione del glutatione. Nel sistema redox glutatione-glutatione
riduttasi, è il glutatione stesso che provvede alla formazione del
21
ponte disolfuro intermolecolare enzima substrato. Successivamente
una seconda molecola di glutatione interviene a formare un
diglutatione che determina il rilascio dell’enzima in forma ridotta.
Lo stato ridotto delle tioredossine è assicurato dall’interazione con la
Tioredossina Reduttasi, mentre le glutaredossine vengono ridotte dal
glutatione e dalla proteina glutatione reduttasi.
La proteina DsbA viene mantenuta allo stato ridotto dalla proteina
DSbB, che è presente nella membrana cellulare di organismi
procarioti e trasferisce i suoi elettroni alla catena di trasporto
elettronica, o al menachinone e molecole accettori anaerobici di
elettroni. Le proteine DsbC e DsbG subiscono invece la riduzione da
parte della proteina DsbD che riceve elettroni dalla Tioredossina
citoplasmatica. Occorre notare che alcune di queste proteine oltre ad
avere attività ossidoreduttasica, assumono un numero notevole di
funzioni complesse. Ad esempio la proteine PDI è anche una
subunità di alcune proteine da mammifero quali la proteina
microsomale triacilglicerol transferasi (MTP), la prolil 4-idrolasi (P4H).
La Tioredossina da batteri invece è coinvolta nei processi di riduzione
di specie ossidate altamente reattive e nella regolazione redox dei
processi di fotosintesi e di trascrizione del fattore nucleare kB. Inoltre
la Tioredossina umana sembra essere implicata nei processi di difesa
immunitaria.
Una delle caratteristiche strutturali comune alla maggior parte delle
proteine appartenenti alla superfamiglia delle tioredossine è la
presenza di uno stato foldato costituito da cinque foglietti β sorretti
da quattro α-eliche. Tale stato foldato viene denominato thioredoxin
domain. Esistono tuttavia altri gruppi di proteine che contengono il
thioredoxin domain ma al contrario non presentano il motivo
strutturale CXXC, quali la glutatione S-transferasi e la glutatione
perossidasi. Tuttavia entrambe le proteine citate interagiscono con
un substrato contenente cisteine, il glutatione. Il thioredoxin domain
è costituito essenzialmente da circa 80 residui, ma ciascuna delle
proteine citate presenta un numero variabile di residui addizionali. La
22
glutaredossina e la Tioredossina sono generalmente proteine
monomeriche: la glutaredossina ha un frammento addizionale al
thioredoxin domain, mentre la Tioredossina oltre a tale dominio
presenta nella parte N-terminale un’ α-elica ed un foglietto β in più.
La DsbA è un monomero ma presenta due distinti domini, il
thioredoxin domain e un dominio costituito essenzialmente da α-
eliche. La proteina PDI presenta una struttura molto più complessa,
infatti ha quattro domini, due dei quali sono omologhi alla
Tioredossina e sono deputati alla catalisi delle reazioni di ossido-
riduzione e isomerizzazione. I motivi di struttura secondaria α-elica e
foglietto β del thioredoxin domain si dispongono a formare due
gruppo distinti: il motivo βαβ N-terminale, e il motivo ββα, C-
terminale. I foglietti β1 e β2 sono paralleli, mentre i foglietti β3 e β4
sono antiparalleli. Le coppie β1-β2, β3-β4 formano β-sheet parallele
e antiparallele che caratterizzano il thioredoxin domain. Le eliche N e
C terminali α1 e α3 si dispongono parallelamente rispetto al β sheet
centrale. L’elica α2 connette i due motivi strutturali terminali e si
dispone perpendicolarmente sul lato opposto del β sheet centrale
rispetto alle posizioni occupate dalle eliche α1 e α3. La differenza
sostanziale tra i gruppi di proteine appartenenti alla superfamiglia
delle tioredossine è legata ai diversi valori di potenziale di riduzione
misurati. Per spiegare tale differenza è stata avanzata l’ipotesi che il
potere riducente di questi enzimi dipende essenzialmente dalla
stabilità del ponte disolfuro. La stabilità o l’instabilità del ponte
disolfuro è legata a sua volta al grado di stabilizzazione dell’anione
tiolato della proteina in forma ridotta. Se l’anione tiolato è fortemente
stabilizzato, il valore del pKa è piuttosto basso, di conseguenza il
ponte disolfuro presenta una certa instabilità. Tuttavia sono state
avanzate diverse ipotesi per spiegare quali siano i fattori stabilizzanti
ma al momento non è possibile stabilire se esiste un fattore
predominante rispetto ad altri e se è lo stesso per ciascuna classe di
enzimi.
23
1.3 Il sistema redox Tioredossina-Tioredossina Reduttasi
Tutte le cellule viventi hanno escogitato sistemi enzimatici efficienti
per difendersi delle specie ossigenate altamente reattive (ROS) che
sono normalmente prodotte nei processi metabolici. Le proteine
contenenti gruppi cisteinici ad attività ditiolo-disolfuro ossidoreduttasi
giocano un ruolo chiave nei processi di regolazione redox. Le
tioredossine vengono considerate le principali fonti di attività
disolfuro reduttasica responsabile del mantenimento dello stato
ridotto delle proteine all’interno della cellula. Il sistema redox che
opera attraverso la Tioredossina, costituito dalla Tioredossina stessa,
dalla Tioredossina Reduttasi (TR), e dal NADPH, è presente in tutti gli
organismi a partire dai batteri fino ad arrivare all’uomo. Un altro
enzima importante nel mantenimento di un basso potenziale redox
all’interno della cellula e di un alto numero di gruppi tiolo liberi, è il
glutatione (GSH), che opera attraverso il sistema redox glutatione-
glutatione reduttasi. Per quanto concerne la Tioredossina Reduttasi
(TrxR), attualmente sono state identificate due differenti forme.
Esistono due classi distinte di Tioredossine Reduttasi, che si
differenziano innanzitutto per il diverso peso molecolare. Le
Tioredossine isolate da organismi eucarioti superiori, (Classe I), H-
TrxR, possiedono una massa molecolare di circa 55kDa per singola
subunità. Le Tioredossine Reduttasi isolate da archaea, eubacteria, e
eucarya di classe inferiore, come piante e funghi, possiedono pesi
molecolari nettamente inferiori, infatti ciascuna subunità arriva ad un
peso molecolare di circa 35kDa( classe II). L-TrxR. I due tipi di
Tioredossina Reduttasi sono stati caratterizzati. E’ stato infatti
osservato che entrambe le forme di TrxR fanno parte della
superfamiglia delle flavoproteine ad attività piridina nucleotide
disolfuro ossido reduttasi, esplicano la loro funzione come
omodimeri, e ciascun monomero possiede il gruppo prostetico FAD, il
sito di legame per il NADPH ed un ponte disolfuro ad attività
24
riducente. Tuttavia la sequenza amminoacidica, e il meccanismo
catalitico è differente nelle due forme di TrxR.
La Tioredossina Reduttasi appartenente alla classe I, è stata
caratterizzata in diversi organismi quali Homo sapiens,
Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster e dal protozoo
parassita della malaria, Plasmodium falciparum.
La Tioredossina Reduttasi di classe II è stata rinvenuta in archaea,
bacteria, ed eucarya di livello inferiore, come piante, funghi, e nel
parassita intestinale Entamoeba.
Le TrxR di classe I sono relazionate alle proteine Glutatione Reduttasi
(GR), Tripanotione Reduttasi(TryR), la Mercurio Reduttasi (MerR), e
la Lipoammide Deidrogenasi.
Le tioredossine di classe II presentano maggiori analogie con la
proteina Alchilidroperossido Reduttasi. L’identità di sequenza tra le
due classi di TrxR è pari al 20% in corrispondenza delle regioni della
sequenza dove è possibile effettuare l’allineamento.
Le Tioredossine Reduttasi ad alto peso molecolare presentano un sito
attivo ad attività redox caratterizzato dal motivo strutturale CXXXXC
nel dominio contenente il sito di legame per il gruppo prostetico FAD
( FAD domain) che non è invece presente nel dominio contenente i
FAD delle tioredossine di classe II.
Nelle tioredossine a basso peso molecolare il sito attivo ad attività
disolfuro reduttasica, costituito dal motivo strutturale CXXC, è
localizzato nel dominio strutturale contenente il sito di legame per il
NADPH: Inoltre le tioredossine reduttasi di classe I presentano un
dominio C-terminale addizionale, che è assente nelle tioredossine
reduttasi di classe II, che è responsabile del meccansimo di
dimerizzazione ed è coinvolto nei processi catalitici. Esiste tuttavia
una certa similarità tra le due forme di Tioredossina Reduttasi a
livello di struttura secondaria e terziaria.
La Glutatione Reduttasi viene considerata come il prototipo delle
proteine appartenenti alla superfamiglia dei flavoenzimi ad attività
disolfuro ossido reduttasica, e presenta un’ elevata analogia con le
25
TrxR di classe I. Infatti dal confronto delle strutture terziarie dei due
enzimi è emerso che i siti di legame per il FAD ed il NADPH sono
piuttosto simili. Le similitudini riscontrate avvalorano l’ipotesi che H-
TrxR e L-trxR derivano da un ancestore comune. Tuttavia,
nonostante le due forme di TrxR siano omologhe, entrambe si sono
evolute convergendo verso una stessa specificità per il substrato.
TrxR è stata caratterizzata a livello di sequenza in due generi di
protozoi parassiti, Plasmodium falciparum e Entamoeba, ed è stato
rivelato che nei protozoi sono presenti le due diverse forme di TrxR,
L-TrxR nel parassita Entamoeba, H-TrxR in P.falciparum. Il
ritrovamento delle due diverse forme di TrxR in organismi entrambi
protozoi lascia aperta la questione su quali siano i fattori che
determinano la distribuzione e l’evoluzione dei due enzimi. Mentre
negli archaea, nei batteri, e alcune piante e funghi sono state
ritrovate Tioredossine Reduttasi multiple, nelle cellule di mammiferi
esiste un solo tipo di Tioredossina Reduttasi presente nel citosol.
Per quanto concerne le Tioredossine invece, sono state individuate
essenzialmente almeno due forme differenti nei tre domini, che nelle
cellule eucariote si localizzano nel citosol (Trx1) e nei mitocondri
(Trx2), mentre negli archaea e nei procarya si localizzano
essenzialmente nel citoplasma.
E’ stato rilevato tuttavia che le cellule delle piante contengono due
tipi in più di tioredossine, trxf e trxm, entrambe presenti nello stesso
comparto cellulare, il cloroplasto. Le tioredossine, sono proteine
ubiquitarie a basso peso molecolare che appartengono a tutte le
specie di cellule viventi.
Le Tioredossine delle diverse specie presentano una percentuale di
identità di sequenza che va dal 27% al 69% rispetto alla proteina di
E.Coli dimostrando come tutte le Tioredossine presentano una
struttura tridimensionale simile. Infatti, contengono tutte il
“thioredoxin domain” costituito da un core centrale di cinque β-
foglietti circondati da quattro α-eliche ed, inoltre, risultano
caratterizzate dalla presenza del tetrapeptide –Cys-Gly-Pro-Cys-
26
dotato di attività redox. In tutti i casi, le reazioni catalizzate dalla
Tioredossina risultano essere reversibili e portano alla formazione o
alla rottura di legami disolfuro, a seconda del potenziale redox
posseduto dal suo substrato. Il basso potenziale redox della
Tioredossina (in E.coli TRx1 è pari a -270mV) assicura che la Trx-
(SH)2 sia il maggiore riducente di ditioli all’interno del citosol.
La funzione fisiologica delle tioredossine nei diversi organismi,
sembra si sia evoluta da una reazione fondamentale comune ad un
vasto numero di funzioni diversamente specializzate. Tali funzioni
comprendono la funzione di base che consiste nell’alta capacità di
donare elettroni quando l’enzima è in forma ridotta, e altre attività
altamente specializzate quali ad esempio la partecipazione al
processo di replicazione del DNA del fagio T7 di E.Coli, e al processo
di assemblamento dei fagi stessi.
Risultati recenti dimostrano il ruolo della Tioredossina nella difesa
contro stress ossidativi o nel controllo dell’apoptosi. Molte di queste
funzioni dipendono dall’attività disolfuro reduttasica della proteina,
con l’ausilio del NADPH e della Tioredossina Reduttasi. Esempi
riguardo alle funzioni svolte all’interno dei diversi organismi da parte
della Tioredossina sono riassunti in tabella 1.
27
Tabella 1. Ruoli svolti dalle Trx nei diversi organismi
28
In via sintetica, vengono descritte nella sezione in basso le principali
attività svolte dalla Tioredossina nei diversi organismi.
L’attività ossidoriduttasica della proteina gioca due ruoli principali ben
conosciuti:
- trasportatore di elettroni necessari per il ciclo catalitico di biosintesi
enzimatica (ribonucleotide reduttasi, solfato reduttasi);
-protezione delle proteine citosoliche dall’aggregazione o
dall’inattivazione attraverso la formazione di ponti disolfuro inter- o
intramolecolari.
Un’interessante funzione della Tioredossina è quella di agire come
componente strutturale di altri enzimi, per formare complessi. Questo
dato è ben caratterizzato per quanto riguarda la DNA polimerasi del
fago T7, dove la Tioredossina-(SH)2 lega con alta affinità (Kα=3 nM)
la DNA polimerasi formando un complesso 1:1, conferendo all’enzima
alta processività. Un ruolo strutturale simile è stato assunto riguardo
al ruolo svolto dalla Tioredossina nell’assemblaggio dei fagi.
Analogamente, è stato ipotizzato che la proteina agisca nelle cellule
di mammifero, formando un complesso ad azione inibitoria con la
chinasi segnale di apoptosi 1 (ASK1). Questo favorirebbe l’ipotesi di
un meccanismo di controllo redox dell’apoptosi, con inibizione del
processo apoptotico nelle condizioni in cui la Tioredossina ridotta è la
specie maggiormente presente all’interno della cellula (come ad
esempio nel caso in cui lo stress ossidativo è basso). In tal modo,
viene chiarita la modalità con cui lo stress ossidativo prende parte al
meccanismo di induzione dell’apoptosi. Molti fattori di trascrizione
sono, inoltre, regolati dalla Tioredossina. La loro attivazione o
inattivazione dipende dalla reazione di riduzione catalizzata dall’
enzima. Questo dato conferisce alla Tioredossina ancora una volta un
ruolo centrale nel controllo redox delle funzioni cellulari mediante la
modulazione della trascrizione di specifici geni target. La
Tioredossina ad esempio è importante per la regolazione redox dei
fattori di trascrizione AP-1 e NF-kB , i quali controllano l’espressione
29
di numerosi geni coinvolti nella risposta infiammatoria o allo stress.
In aggiunta, la Tioredossina ha attività antiossidante intracellulare e,
quindi, se positivamente regolata o sovra espressa, protegge dallo
stress ossidativo. A livello extracellulare, la Tioredossina presenta
proprietà immunomodulatorie. Essa viene secreta mediante un
meccanismo ancora poco conosciuto in maniera non dipendente da
un peptide segnale. La secrezione della Tioredossina in condizioni di
stress ossidativo e infiammazione è stata osservata in molte cellule
sia normali che neoplastiche.
Il sistema redox Tioredossina-Tioredossina Reduttasi genera un
processo fondamentale per garantire l’intensa attività delle
Tioredossine stesse. Infatti lo stato ridotto della Tioredossina è una
condizione necessaria per l’espletamento della sua attività disolfuro
reduttasica e viene mantenuto grazie al continuo rifornimento di
elettroni da parte della Tioredossina Reduttasi ogni qual volta
l’enzima viene ossidato.
La Tioredossina Reduttasi, assieme al cofattore FAD, forma un
sistema ciclico di trasporto elettronico promosso dal forte potere
riducente del NADPH, e favorito dalla versatilità dei gruppi solfuro di
cisteine adiacenti ad alternarsi tra uno stato ridotto ed uno ossidato.
In particolare il meccanismo di reazione, altamente reversibile,
promuove il passaggio di elettroni dal NADPH al cofattore della
Tioredossina Reduttasi; il FAD, legato all’enzima in forma ridotta. Il
cofattore una volta acquistati gli elettroni dal NADPH li trasferisce alla
Tioredossina Reduttasi ossidata, determinando la riduzione del ponte
disolfuro. La Tioredossina Reduttasi una volta ridotta, interagisce con
il proprio substrato, la Tioredossina ossidata, riducendo il ponte
disolfuro e conferendogli quindi alto potere riducente. Gli equivalenti
riducenti associati ai due gruppi ditiolo della Tioredossina ridotta,
vengono poi trasferiti a diversi substrati cellulari in modo da
mantenerne il loro stato ridotto. In basso viene riportato uno schema
(fig1.2) sintetico del sistema redox NADPH-Tioredossina Tioredossina
Reduttasi.
30
Fig 1.2. Schema sintetico del processo ossido riduttivo Tioredossina-Tioredossina
Reduttasi.
31
1.4 Il ponte disolfuro
Il ponte disolfuro collocato nella struttura interna delle proteine gioca
diversi ruoli fondamentali. E’ un’interazione di tipo covalente, frutto
di un complesso processo di ossidazione che si stabilisce
essenzialmente tra gruppi ditiolo di residui di cisteine non adiacenti.
Le proteine che contengono ponti disolfuro possono essere suddivise
in due classi: la prima classe è costituita da quelle proteine per cui il
ponte disolfuro tra cisteine costituisce un motivo strutturale stabile
del loro stato nativo; la seconda classe comprende tutte quelle
proteine in cui le coppie di cisteine si alternano tra uno stato ridotto
ed uno ossidato.
Per quanto concerne il primo gruppo è stato rilevato che il ponte
disolfuro potrebbe dare un contributo essenziale al processo di
folding delle proteine e stabilizzare con un grado elevato lo stato
nativo.
Per le proteine appartenenti alla seconda classe il ciclo di
ossidazione-riduzione del ponte disolfuro potrebbe da una parte
costituire il fulcro centrale dell’attività enzimatica, dall’altra assumere
un ruolo chiave nei processi di attivazione-disattivazione delle
proteine. Il processo di formazione del ponte disolfuro all’interno
delle cellule è altamente complesso e variabile nei vari organismi e
coinvolge un numero elevato di molecole. A partire dai batteri fino ad
arrivare agli eucarioti esiste una vasta gamma di proteine in grado di
catalizzare la formazione del ponte disolfuro ad attività ditiolo-
disolfuro ossidoreduttasica.
Nei batteri la formazione dei ponti disolfuro all’interno delle proteine
è catalizzata dagli enzimi appartenenti alla famiglia Dsb, che sono
localizzati nei compartimenti extracitoplasmatici.
32
Nelle cellule eucariote la fomazione del ponte disolfuro è catalizzata
dalle Disolfuro Isomerasi (PDI), proteine localizzate nel reticolo
endoplasmatico.
All’interno degli organismi ipertermofili un ruolo catalitico potenziale
nella formazione del ponte disolfuro nelle proteine intracellulari
sembra essere assunto da una nuova famiglia di proteine, le
Disolfuro Ossidoreduttasi, PDO. La tendenza da parte dei due tioli di
cisteine adiacenti a formare ponti disolfuro o alternativamente la
scissione di un ponte disolfuro preesistente, dipende essenzialmente
dal potenziale di riduzione dell’ambiente cellulare.
Per quanto concerne bacteria ed eucarya, solitamente, è raro
ritrovare proteine contenenti ponti disolfuro nel citosol, dove il
potenziale di riduzione è piuttosto basso. Al contrario il reticolo
endoplasmatico contiene diverse proteine con ponti disolfuro, a
causa dell’alto potenziale di riduzione.
I primi studi condotti sulle proteine termofile sembravano validare
l’ipotesi che, soprattutto a causa delle estreme condizioni in cui si
sviluppano tali organismi, le proteine intracellulari avessero un basso
contenuto di residui cisteinici e quindi una scarsa presenza di ponti
disolfuro. Recentemente invece è stato dimostrato che esiste un
ampio numero di proteine intracellulari appartenenti ad organismi
ipertermofili sia da archaea che da bacteria che contengono ponti
disolfuro di tipo strutturale.
Tale scoperta implica l’importanza dei ponti disolfuro anche per
quanto riguarda la termostabilità delle proteine e i meccanismi di
resistenza delle cellule che costituiscono tali microorganismi.
Probabilmente il ponte disolfuro in proteine da organismi estremofili
rappresenta un elemento strategico per quanto riguarda i
meccanismi di adattamento alle alte temperature.
Il ponte disolfuro sembra proteggere le proteine dalla denaturazione
termica.
Per quanto riguarda la formazione di ponti disolfuro in proteine
native due sono i fattori importanti che entrano in gioco:
33
-la chimica del meccanismo di scambio tiolo-disolfuro;
-la cinetica e la termodinamica dello processo di folding ossidativo
La reazione di interscambio tiolo-disolfuro è una reazione di
ossidazione a due elettroni, dove gli equivalenti ossidanti vengono
trasferiti da un reagente contenente un ponte disolfuro ai gruppi
tiolati di cisteine proteiche.
Il processo di formazione di un singolo ponte disolfuro si svolge in
due steps, è un processo reversibile ed è costituito da due reazioni di
interscambio tiolo-disolfuro.
Nel primo step, la specie a basso peso molecolare contenente il
ponte disolfuro subisce attacco nucleofilo da parte del gruppo tiolato
della proteina, di conseguenza si forma un ponte disolfuro misto.
Nello step successivo il ponte disolfuro misto viene scisso in seguito
all’attacco nucleofilo del secondo gruppo tiolo della cisteina proteica.
Il gruppo uscente, la molecola a basso peso molecolare avrà una
cisteina tiolata, mentre all’interno della proteina è avvenuta la
formazione del ponte disolfuro. Il secondo step della reazione
dipende da un punto di vista termodinamico dalla conformazione
della proteina.
34
1.5 Il sistema redox Tioredossina-Tioredossina Reduttasi nell’organismo ipertermofilo S. solfataricus
Nell’ultimo ventennio, le ricerche sulle Tioredossine da bacteria ed
eucarya hanno portato ad un grado di conoscenza avanzato sul ruolo
svolto da questi enzimi all’interno di tali organismi. Infatti in banca
dati, Protein Data Bank (PDB), si trova depositato un numero
notevole di strutture tridimensionali di Trx e TrxR appartenenti a
questi domini. Al contrario per quanto riguarda gli archaea gli studi
su queste proteine si sono intensificati soltanto di recente e le
conoscenze riguardo le loro proprietà strutturali e il loro ruolo nei
processi redox sono piuttosto limitate. La recente scoperta che
proteine contenenti ponti disolfuro all’interno di organismi estremofili,
non si collocano nell’ambiente extracitoplasmatico ma bensì nel
citoplasma, ossia in un ambiente altamente riducente, hanno favorito
l’incremento degli studi verso questi speciali enzimi.
Infatti recenti pubblicazioni sembrano avvalorare l’ipotesi che il ponte
disolfuro in proteine citoplasmatiche appartenenti ad organismi
estremofili costituisce un motivo strutturale di stabilizzazione termica
per compensare lo scarso livello di ottimizzazione elettrostatica che
tali proteine possono acquisire all’interno del citoplasma.
Recentemente studi di genomica condotti sull’organismo
ipertermofilo S.solfataricus hanno rivelato la presenza di diversi geni
che identificano sistemi diversi Tioredossina-Tioredossina Reduttasi.
In particolare sono state identificate due tioredossine (SsTrxA1 e
SsTrxA2) e Tioredossine Reduttasi (SsTrxRB2 e SsTrxRB3), oltre che
una proteina contenente il motivo strutturale conservato CXXC, con
elevata identità di sequenza con le altre TrxR ( SsTrxRB1).
Tuttavia sembra che il sistema redox Tioredossina-Tioredossina
Reduttasi nell’organismo S.solfataricus sia costituito dalla
35
Tioredossina SsTrxR(B3) e dalle due tioredossine SsTrxA1 e SsTrxA2
che sono deputate ad essere i potenziali substrati.
Studi recenti sembrano aver messo in dubbio tuttavia le ipotesi
avanzate per quanto concerne la funzione di alcune proteine ad
attività ossidireduttasica presenti all’interno di tale organismo.
Infatti studi enzimatici comparati sui sistemi Disolfuro
ossidoreduttasi-Tioredossina Reduttasi SsPDO-SsTrxR, e
Tioredossina-Tioredossina Reduttasi, SsTrx-SsTrxR, sembrano
mostrare che un altro potenziale substrato della Tioredossina
Reduttasi, possa essere la proteina Disulfuro Ossidoreduttasi PDO,
anziché le Tioredossina.
36
1.6 Obiettivi
In questo contesto scientifico, da cui si evince quanto poco ancora si
conosca sul sistema redox Tioredossina-Tioredossina Reduttasi
dall’archaeon S.solfataricus si inserisce il presente lavoro di tesi.
In questo studio saranno, pertanto, presentati i risultati di un
progetto di ricerca, svolto in parte presso il Dipartimento di
Biochimica e Biotecnologie Mediche dell’Università di Napoli,
finalizzato alla caratterizzazione strutturale di SsTrxRB3 e delle due
tioredossine, SsTrxA1 e SsTrxA2 mediante la diffrazione ai raggi X
del cristallo singolo di proteina.
Gli studi strutturali su questi enzimi costituiscono un primo passo a
favore dell’identificazione del reale substrato della Tioredossina
Reduttasi e della comprensione dei ruoli delle diverse molecole
coinvolte nelle regolazione redox all’interno di questo organismo.
Inoltre la determinazione strutturale di SstrxA1 e SstrxA2, che ha
fornito le prime strutture di tioredossine estratte da archaea, ha
permesso di determinare quali sono gli arrangiamenti strutturali di
tali enzimi all’interno di un organismo ipertermofilo.
Infatti, è importante osservare che lo studio di proteine isolate da
microrganismi che crescono in condizioni estreme di temperatura,
può fornire informazioni utili sull’adattamento di tali macromolecole
alla temperatura.
L’attenzione rivolta allo studio di biomolecole appartenenti ad
organismi estremofili è in continua crescita sia in ambito accademico
che industriale e trova giustificazione anche nel fatto che negli ultimi
anni lo sviluppo di tecniche innovative di colture batteriche, e la
mappatura del codice genetico, hanno reso possibile utilizzare sia gli
organismi estremofili ed iperestremofili stessi, che le biomolecole ad
essi appartenenti, per una serie elevata di applicazioni. Tali enzimi
infatti si stanno rivelando particolarmente utili per applicazioni
37
biotecnologiche nei settori agricolo, biomedico, ed industriale per la
loro elevata versatilità.
Parallelamente agli studi cristallografici sono stati effettuati ulteriori
studi strutturali mediante l’impiego della tecnica spettroscopica del
dicroismo circolare (CD). Le indagini spettroscopiche sono state
condotte per approfondire alcuni aspetti riguardanti la correlazione
tra la struttura di queste molecole e l’elevata resistenza alle alte
temperature.
Esperimenti di denaturazione termica effettuati su SsTrxRB3,
SsTrxA1 e SsTrxa2, registrando gli spettri CD nel lontano UV, hanno
mostrato che ognuna di queste proteine è dotata di un’ eccezionale
termostabilità.
Attualmente il numero estremamente ridotto di dati riguardanti la
sequenza e la struttura di proteine ipertermofile e termofile non
consente di stabilire in maniera certa quali siano i determinanti
strutturali che conferiscono l’elevata stabilità alle alte temperature.
Sembra infatti che le diverse proteine termofile abbiano escogitato
differenti sistemi per conservare la loro stabilità in condizioni
estreme.
Studi recenti basati sulla comparazione strutturale di proteine
omologhe hanno rivelato che alcune proteine termofile presentano
un numero maggiore di ponti salini rispetto alle omologhe da fonte
mesofila.
In altri casi la ridotta estensione di alcuni loops in proteine termofile,
sembra essere un ulteriore motivo strutturale di stabilizzazione
termica. Infatti un loop più corto può determinare una struttura più
compatta di conseguenza maggiormente stabile.
Tuttavia è importante notare che per le proteine termofile ad attività
disolfuro reduttasi anche il ponte disolfuro sembra essere un motivo
strutturale di stabilizzazione.
Le indagini spettroscopiche sono state effettuate allo scopo di dare
un contribuito nella comprensione dei determinanti strutturali che
conferiscono l’elevata stabilità di questi enzimi alle alte temperature.
38
Dai risultati ottenuti sembra infatti che i ponti salini giocano un ruolo
chiave nei processi di stabilizzazione termica di SsTrxRB3.
Al contrario invece il basso numero di ponti salini riscontrato nella
struttura di SstrxA1 e SsTrxA2 lascia intravedere l’ipotesi che tali
molecole, di dimensioni nettamente inferiori rispetto SsTrxRB3,
abbiano escogitato altri sistemi per conservare la loro stabilità alle
alte temperature.
Il lavoro qui riportato è diviso in vari capitoli ove si riportano i
risultati sperimentalmente ottenuti. Infine, a corredo di tutto ciò,
sono riportate alcune appendici in cui vengono analizzate le basi
teoriche delle metodologie utilizzate.
39
CAPITOLO 2
DETERMINAZIONE CRISTALLOGRAFICA DI
SsTrx(B3)
2.1 Introduzione
Tutti gli organismi sono dotati di sistemi efficienti per neutralizzare le
specie ossidate altamente reattive prodotte dal metabolismo.
Il sistema redox, thioredoxin system, costituito dalla Tioredossina
stessa (Trx), la Tioredossina Reduttasi, TrxR, e il NADPH svolge un
ruolo chiave nel mantenimento dello stato redox delle cellule oltre a
proteggere dagli stress ossidativi (Arner & Holmgren, 2000; Hirt et
al., 2002). La Tioredossina è la più importante proteina ad attività
disolfuro ossido-reduttasi, capace di mantenere le proteine cellulari in
uno stato ridotto. La Tioredossina è il substrato della Tioredossina
Reduttasi, TrxR, una flavoproteina omodimerica, in cui ciascun
monomero contiene il gruppo prostetico FAD, che provvede
ciclicamente a fornirgli elettroni in modo da rigenerarne lo stato
ridotto. Gli elettroni forniti alle Tioredossine Reduttasi, provengono
originariamente dal nucleotide piridinico, nicotinammide adenin di
nucleotide fosfato, NADPH, e vengono trasferiti tramite il cofattore
nucleotide flavinico, flavin adenin di nucleotide, FAD, al ponte
disolfuro della Tioredossina Reduttasi, che caratterizza il sito attivo
sia della Tioredossina Reduttasi che della Tioredossina. La famiglia
dei flavoenzimi dimerici include la Lipoammide Deidrogenasi, la
Glutatione Reduttasi e la Mercurio Reduttasi. Per questi tre enzimi la
catalisi si basa sul medesimo meccanismo.
40
Nonostante la Tioredossina Reduttasi sia stata isolata da diversi
organismi appartenenti ai tre domini, archaea, eucarya, eubacteria,
esistono sostanziali differenze tra le proteine appartenenti alla
diverse specie. Negli ultimi anni sono stati condotti studi piuttosto
approfonditi sulle proprietà strutturali e sulla funzione, riguardanti la
Tioredossina Reduttasi appartenente ad Escherichia coli, EcTrxR.
Infatti è stato possibile analizzare in dettaglio le correlazioni esistenti
tra la struttura dell’enzima e la sua funzione poiché nel corso di tali
studi si è giunti non soltanto alla determinazione strutturale
dell’enzima nativo sia nella forma ridotta che nella forma ossidata,
ma anche della struttura del complesso tra TrxR e Trx. (Lennon et
al., 2000). La struttura di tale complesso ha portato alla seguente
constatazione: la Tioredossina Reduttasi è una proteina dotata di
un’inusuale plasticità conformazionale che consente un ampia
riorganizzazione strutturale durante la catalisi.
Studi strutturali preliminari sono stati condotti sulla Tioredossina
Reduttasi appartenente all’eubatterio, Mycobacterium tubercolosis,
MtTrxR, e la Tioredossina Reduttasi appartenete alla seconda classe
isolata dall’organismo eucariota, Arabidopsis thaliana, AtTrxR.
Tuttavia si dispone di informazioni piuttosto limitate sulle
Tioredossine Reduttasi di classe II isolate da organismi archaea.
Soltanto di recente sono stati effettuati studi di tipo funzionale sulle
TrxR apparteneti ad Aeropyrum pernix e Pyrococcus horikoshii.
Inoltre sempre di recente sono state caratterizzate dall’organismo
ipertermofilo Sulfolobus solfataricus due Tioredossine Reduttasi,
SsTrxR(B2) e SsTrxR(B3), oltre che una proteina contenente il
motivo strutturale conservato CXXC, con elevata identità di sequenza
con le altre TrxR, SsTrxR(B1). Tuttavia sembra che SsTrxR(B3) e le
tioredossine SstrxA2 e SstrxA1, costituiscono il sistema NADPH redox
all’interno di tale organismo.
SsTrxR(B3) è una flavo proteina composta da 323 amminoacidi con
un peso molecolare pari a 35kDa. L’enzima presenta un’elevata
omologia con le Tioredossine Reduttasi da eubatteri, archaea, e
41
eucarioti di livello inferiore. Dall’allineamento di sequenza con
proteine omologhe è risultato che l’enzima presenta un’elevata
identità con la TrxR di Sulfolobus tokodaii, che è pari a circa il 76%.
Al contrario presenta un’ identità di sequenza nettamente inferiore se
confrontata con enzimi di struttura nota quali, EcTrxR, AtTrxR, infatti
l’identità di sequenza è pari a circa il 25%.
Tab.2. Allineamento di sequenza multiplo di TrxR di classe II. I residui amminoacidi coinvolti nel legame con FAD e NADP sono evidenziati in vede e blu. Il sito attivo contenente il motivo strutturale CxxC è nella area rossa.
SsTrxR(B3), che in studi precedenti era stata identificata come una
proteina NADH ossidasi, nonostante sia altamente termostabile e
appartenga alla classe II delle Tioredossine Reduttasi presenta
inoltre un’ elevate identità di sequenza con alcune TrxR di classe I,
pari a circa il 30-35%. Sembra infatti che alcune proprietà funzionali
di SsTrxR(B3) siano molto simili a quelle presentate dalle TrxR
eucariote ad alto peso molecolare. Questa osservazione è correlata
alla precedente ipotesi che il gene di Solfolobus solfataricus sia il
putativo ancestore del mitocondrio animale. Tuttavia è interessante
notare che SsTrxR(B3) presenta oltre all’attività disolfuro ossido
reduttasi, possiede un’ ampia attività NADH ossidasi. Allo scopo di
comprendere le relazioni esistenti tra la struttura e le proprietà
funzionali di questa classe di enzimi, nell’ambito di questa tesi, sono
state condotte indagini cristallografiche e spettroscopiche su
42
SsTrxR(B3) e i risultati di tali studi saranno ampiamente descritti nei
paragrafi che seguono.
2.1.1 La Tioredossina Reduttasi di E.coli
La Tioredossina Reduttasi da E.coli, EcTrxR è un enzima
appartenente alla famiglia delle flavo proteine ad attività disofuro
ossido reduttasi.
EcTrxR esplica la propria funzione biologica come omodimero,
ciascun monomero ha uno stato foldato del tipo αβα, di peso
molecolare pari a 35000Da, e presenta due domini, uno deputato al
legame con il gruppo prostetico FAD (FAD domain), l’altro
contenente il sito di legame per il nucleotide piridinico NADPH
(NADPH domain). Entrambi i siti di legame mostrano delle similitudini
con gli stessi siti di legame presenti nella proteina Glutatione
Reduttasi (GR), considerata come la proteina prototipo dei flavo
enzimi, tuttavia in EcTrxR il sito attivo contenente il ponte disolfuro è
collocato nel NADPH domain, mentre nella GR è collocato nel FAD
domain. Tale differenza comporta due distinti meccanismi di catalisi.
Il meccanismo di catalisi adottato da EcTrxR si svolge attraverso
l’alternarsi della conformazione dell’enzima tra due diversi
arrangiamenti strutturali dei due domini. La determinazione della
struttura cristallografica della forma ridotta (FR) e ossidata (FO) di
TrxR ha consentito di comprendere ampiamente il meccanismo
catalitico esercitato da tale enzima.
Nella struttura cristallografica risolta a 2 Å, della forma ossidata di
EcTrxR, il ponte disolfuro formato dai residui di cisteina, Cys135 e
Cys138, è localizzato nelle vicinanze dell’anello flavinico. Questa
conformazione consente il trasferimento elettronico dall’anello
flavinico, che è in forma ridotta, al ponte disolfuro.
La struttura ossidata di EcTrxR è stata denominata FO, poiché in tale
conformazione è possibile l’ossidazione dell’anello flavinico da parte
del ponte disolfuro. Tuttavia il ponte disolfuro è nascosto per cui
nello stato FO, non è possibile per l’enzima l’interazione con il proprio
43
substrato, la Tioredossina. Inoltre in tale struttura l’anello
nicotinamminico del NADP+ è distante dal FAD, per cui non è
consentito il trasferimento di elettroni dal nucleotide piridinico al
gruppo prostetico.
La struttura ridotta denominata FR, in cui l‘enzima è in una
conformazione tale da poter effettuare la riduzione del gruppo
prostetico FAD, e al contempo interagire con la Tioredossina, è stata
successivamente risolta a 3 Å, a partire dal complesso EcTrxR-Trx.
Dall’analisi strutturale è emerso che l’enzima per esplicare la propria
attività catalitica, deve alternarsi tra due stati confomazionali dovuti
al notevole riarrangiamento dei due domini l’uno rispetto all’altro.
In sostanza per ottenere la forma FR, è stata utilizzata la
Tioredossina che attraverso un ponte disolfuro misto costituito dal
residuo di cisteina 32 della EcTrx e il residuo di cisteina 138 di
EcTrxR, ha immobilizzato l’enzima nello stato FR. Per simulare il
legame con il nucleotide piridinico NADPH, i cristalli sono stati fatti
crescere in presenza di un analogo del NADPH, la 3-amminopiridina
nucleotide fosfato (ADP+).
Dal confronto tra lo stato FO e lo stato FR, è emerso, come già
anticipato, che la variazione conformazionale è una condizione
necessaria per lo svolgersi dell’attività catalitica dell’enzima. Infatti
nel passaggio dalla forma FO alla forma FR, il dominio contenente il
sito di legame per il NADPH, ruota di circa 66° intorno ad un
ipotetico asse che è perpendicolare all’interfaccia tra i due domini, e
si avvicina di circa 1,4 Å al dominio contenente il sito di legame per il
FAD. L’anello piridinico del nucleotide ADP+ legato all’enzima, in tale
conformazione è vicino al FAD, in un orientazione che gli permette la
riduzione dell’anello flavinico. Inoltre nella conversione dalla forma
FO alla forma FR, le interazioni di legame tra i due domini si
distruggono e nuovi contatti si ristabiliscono. L’area all’interfaccia tra
i due domini si riduce notevolmente, da circa 1000 Å2 passa a circa
630 Å2, il che consente l’esposizione del NADPH domain affinchè
possa avvenire l’interazione con la Tioredossina.
44
In conclusione è interessante notare che EcTrxR, tramite la
rotazione del dominio, ha escogitato una strategia completamente
differente per attendere al meccanismo di catalisi, se paragonata a
quella esplicata dalla GR e le Tioredossine Reduttasi ad alto peso
molecolare di struttura nota.
Infatti nella Glutatione Reduttasi il meccanismo di trasferimento di
elettroni dal NADPH al ponte disolfuro tramite il FAD, non necessita
di alcuna variazione conformazionale. Nella struttura della GR il
NADPH è posizionato da un lato dell’anello isoallossazinico, mentre il
ponte disolfuro è localizzato frontalmente all’altra faccia dell’anello.
Inoltre il ponte disolfuro è posizionato in una zona direttamente
accessibile ai substrati di piccole dimensioni.
Per quanto riguarda le Tioredossine Reduttasi ad alto peso
molecolare, la TrxR umana e quella caratterizzata dal parassita
Plasmodium falciparum, sono omologhe alla proteina Glutatione
Reduttasi, e oltre ad avere il sito attivo nel FAD domain,
interagiscono con un ampio numero di substrati. Tuttavia per
stabilire un contatto tra il ponte disolfuro ridotto dal FAD e il
substrato Tioredossina, questi enzimi utilizzano un secondo gruppo
mediatore ad attività redox che non è presente in E.Coli.
In sostanza EcTrxR e TrxR da cellule di mammifero, hanno sviluppato
meccanismi differenti per il trasferimento di equivalenti riducenti dal
gruppo prostetico FAD, ai rispettivi substrati.
2.1.2 SsTrxR(B3): una proteina con due funzioni
SsTrxR(B3) si distingue per diversi fattori dalle proteine omologhe
appartenenti ad altri organismi. In particolare l’enzima presenta due
distinte attività biochimiche, un’attività Tioredossina Reduttasica
tipica di questa classe di proteine, e un’attività NADH ossidasica che
al contrario è una proprietà che può definirsi atipica.
Nel presente paragrafo viene descritta la caratterizzazione dell’attività
enzimatica di SsTrxR(B3) così come riportato nel lavoro pubblicato
qualche anno fa da Masullo et al.
45
Le analisi condotte su SsTrxR(B3) per valutare l’attività enzimatica,
sono state effettuate a 65°C e monitorate cineticamente.
L’attività NADH ossidasica di SsTrxR(B3) è stata determinata
spettrofotometricamente misurando la velocità iniziale di ossidazione
del NADH. La miscela di reazione è stata preparata aggiungendo
0.18 M di FAD, 1mM di NADPH e portata al volume finale di 1 ml in
un tampone contenente 25mM di MES/KOH, pH 5.5. La reazione ha
avuto inizio aggiungendo l’enzima ed è stata monitorata
cineticamente misurando la decrescita del segnale di assorbanza a
340nm. La determinazione della concentrazione di perossido
d’idrogeno prodotto dall’enzima è stata effettuata, dopo aver tenuto
in incubazione la miscela di reazione per 30 minuti a temperatura
ambiente, tramite la misura dell’assorbimento a 500nm e calcolata
dalla curva di calibrazione.
L’attività Tioredossina Reduttasica è stata invece valutata attraverso
due differenti metodi, la riduzione dell’acido 5,5-ditiobis-2-
nitrobenzoico, DTNB e la riduzione della Tioredossina. Nella reazione
di riduzione del DTNB è stata monitorata la produzione di 2-nitro-5-
tiobenzoato (TNB), attraverso la misura dell’incremento del segnale
di assorbanza alla lunghezza d’onda di 412nm. Per misurare l’attività
enzimatica è stato utilizzato un coefficiente di estinzione molare
differente da quello calcolato nel metodo standard di riduzione del
DTNB, determinato utilizzando un tampone contenente 25mM di
Mes/KOH, pH 5.5. La miscela di reazione è stata preparata
aggiungendo 5mM di DTNB, 0.25mM di NADPH, 0.05 MM di FAD,
10mM di EDTA, e portata ad un volume finale di 1ml in un tampone
contenente 25mM di Mes/KOH, pH 5.5. Negli esperimenti di riduzione
della Tioredossina, la miscela di reazione è stata preparata
aggiungendo 0.2mM di EcTrx, 0.05mM di FAD, 2 mM di EDTA, la
quantità appropriata di SsTrxR(B3) e portata ad un volume finale di
1ml in un tampone contenente 25mM di Mes/KOH, pH 5.5. La
reazione è iniziata a partire dall’aggiunta di 0.1 mM di NADPH.
L’attività enzimatica è stata calcolata misurando la decrescita del
46
segnale di assorbanza alla lunghezza d’onda di 340nm e utilizzando
un valore del coefficiente di assorbanza pari a 6220 M-1cm-1. Il
segnale di riferimento dovuto alla stessa miscela di reazione in
assenza dell’enzima è stato registrato in contemporanea e sottratto
al segnale relativo alla reazione di riduzione.
Fig.2.1. Riduzione di DTNB e EcTrx catalizzata da rSsTrxR. La reazione è stata monitorata seguendo il metodo della riduzione di DTNB (isogrammi A, B, C, D) o il metodo della riduzione della Tioredossina (istogrammi E, F). entrambi gli esperimenti sono stati condotti in presenza di rSsTrxR, 20mg/ml, soltanto NADPH(A); NADPH e FAD (50µM)(B); NADH(50µM)(C); NADH e FAD(D); NADPH(100µM) e FAD(E);NADPH; FAD, e EcoliTrx (200µM)(F).
47
Fig.2.2. Reazione di formazione di perossido d’idrogeno per diverse aggiunte di NADH.
NADH + H+ + O2 -> NAD+ + H2O2
L’inibizione dell’attività enzimatica di SsTrxR(B3) è stata misurata in
presenza di specifici inibitori delle TrxR, auranofina e acido azelico, e
altri agenti riducenti (ditiotreitolo, DTT o β-mercaptoetanolo, β-ME).
Le soluzioni stock contenenti 9mM di auranofina, e 7mM di acido
azelaico sono state preparate diluendo i reagenti in soluzioni
contenenti acqua e dimetilsolfossido (DMSO). L’inibizione dell’attività
Tioredossina Reduttasica è stata valutata per entrambi i metodi di
riduzione utilizzati. Ciascun inibitore è stato incubato in presenza
dell’enzima, SsTrxR(B3), per circa 1 minuto a 60°C,
precedentemente all’aggiunta del substrato.
48
2.2 Materiali e metodi
2.2.1 Preparazione e purificazione di SsTrxR(B3) e del derivato di SsTrxR(B3) contenente la selenio metionina
La preparazione della forma ricombinante della Tioredossina
Reduttasi da S.solfataricus, è stata effettuata in collaborazione con i
Proff. M. Masullo e P. Arcari, presso i laboratori del Dipartimento di
Biochimica e Biotecnologie Mediche di Napoli. Di seguito è
brevemente, descritta la procedura utilizzata.
Il vettore di espressione pSsTrxR contenente il gene codificante per
SsTrxR(B3) è stato utilizzato per trasformare ceppi E. coli BL21(DE3),
successivamente fatti crescere a 37°C in Luria-Bertani medium.
L’aggiunta di isopropil-β-D-tiogalattopiranoside (IPTG) ha provocato
una notevole precipitazione di proteina ricombinante insolubile per
cui l’induzione tramite IPTG è stata evitata. Le cellule batteriche sono
state raccolte tramite centrifugazione a 3000*g per 15 minuti a 4 °C
e risospese in 20 ml di un tampone contenente 20mM Tris-HCl pH
7.8, 5mM MgCl2, 50mM KCl e 1 mM PMSF. Le cellule sono state
distrutte attraverso un sistema di rottura cellulare meccanica.
L'omogenato cellulare é stato centrifugato a 100,00*g per circa due
ore ed il sovranatante post-ribosomale ottenuto, é stato trattato per
30 min a 70°C. Dopo aver allontanato mediante centrifugazione le
proteine di E.coli, denaturate dal trattamento termico, il
supernatante è stato dializzato in un tampone contenenente 25mM
Mes/KOH, pH 5.5. Successivamente il campione è stato caricato su
una colonna mono S a scambio cationico collegata ad un sistema
FPLC, operante a temperatura ambiente. L’eluizione è stata condotta
mediante un gradiente di KCl (0-200mM). Le frazioni che mostravano
la presenza di un'unica banda elettroforetica, su gel di
poliacrilammide in condizioni denaturanti (SDS-PAGE; Laemmli,
1970), sono state riunite e concentrante mediante Aquacide II. Dopo
essere stato dializzato in un tampone contenente 20 mM Tris
(pH7.8), e 50% (v/v) glicerolo, il campione è stato conservato a -
49
20°C. In queste condizioni l'attività si è mantenuta per diversi mesi. Il derivato di SsTrxR(B3) contenente la seleniometionina, è stato
preparato facendo crescere il vettore di espressione di E.coli
contenente il gene codificante l’enzima ricombinante, in una coltura
costituita da 1 mg l-1 di vitamine (riboflavina, niacinammide,
piridossine monoidroclorata and tiammine), 0.4% di glucosio, 2 mM
di MgSO4, 0.1 mM di CaCl2, 50 mg l-1 dei seguenti amminoacidi,
fenilalanina, treonina, lisina, isoleucina, leucina e valina, e 60 mg l-1
di selenio-L-metionina.
2.2.2 Cristallizzazione di SsTrxR(B3)
La trattazione teorica della cristallizzazione di proteine è riportata in
dettaglio nell’Appendice I. Di seguito sono descritte brevemente le
condizioni di cristallizzazione di SsTrxR(B3) ricombinante ottenuto
attraverso la procedura appena descritta.
Gli esperimenti di cristallizzazione sono stati condotti a 293K usando i
metodi di cristallizzazione del microbath sott’olio e della diffusione in
fase vapore, hanging drop. Prove preliminari di cristallizzazione sono
state effettuate utilizzando un KIT reperibile in commercio
contenente soluzioni precipitanti a matrice sparsa (Crystal screen kits
I and II, Hampton Research).
Allo scopo di determinare la struttura di SsTrxR(B3) legata al
cofattore nucleotide piridinico, i cristalli di proteina sono stati fatti
crescere aggiungendo alla soluzione precipitante il NADP+. Le
aggiunte del cofattore sono state fatte in modo che il rapporto
stechiometrico molare NADP+/proteina fosse circa pari a 100.
Sono stati ottenuti cristalli adatti per un analisi cristallografica da una
soluzione precipitante contenente 15% (w/v) di monometiletere
polietilenglicole 2000, (PEGmmE 2K), 0.1 M di solfato d’ammonio,
(NH4)2SO4, 50 mM di acetato di sodio. Nelle Figure 2.3 e 2.4 sono
riportate le immagini dei cristalli ottenuti nelle condizioni di
cristallizzazione sopradescritte.
50
Le stesse condizioni di cristallizzazione della forma nativa sono state
utilizzate con successo per ottenere i cristalli del derivato di
SsTrxR(B3) contenente le seleniometionina.
Per prevenire l’ossidazione del derivato, alla soluzione precipitante è
stato aggiunto l’agente riducente DTT (5mM).
Fig.2.3. Cristalli di SsTrxR(B3), Forma I
Fig.2.4. Cristalli di SsTrxR(B3), Forma II
2.2.3 Registrazione ed analisi statistica dei dati cristallografici di SsTrxR(B3)
Dati di diffrazione preliminari sono stati registrati in house a 298 K,
utilizzando un registratore di immagini ad area MacScience Dip
2030b, collegato ad un generatore di radiazioni Cu Kα di lunghezza
d’onda pari a 1.5418 Å, Nonius FR591. Successivamente sono stati
51
raccolti dati a più alta risoluzione presso il sincrotrone di Grenoble, a
100 K (beam-line ID29). I cristalli sono stati congelati aggiungendo
alla soluzione tampone di cristallizzazione, glicerolo al 22% (v/v). I
dati di diffrazione sono stati raccolti utilizzando il metodo della
diffusione anomala, MAD, presso la postazione ID14-4 del
sincrotrone di Grenoble, ESRF.
Sono stati registrati tre differenti set di dati utilizzando i valori di
lunghezza d’onda determinati dallo spettro di assorbimento del
selenio. L’analisi statistica dei dati di diffrazione è stata effettuata
mediante l’utilizzo del programma DENZO (Otwinoski and Minor,
1997).
Fig.2.5. Pattern di diffrazione di SsTrxR(B3)
2.2.4 Risoluzione ed affinamento cristallografico di SsTrxR(B3)
La struttura dell’enzima è stata risolta utilizzando il metodo MAD, che
si basa sul segnale anomalo generato dal selenio presente nel
derivato di SsTrxR(B3) contenente la seleniometionina. Tramite il
programma SOLVE (Terwilliger & Berendzen, 1999) è stato possibile
determinare la posizione del selenio nell’unità asimmetrica e da ciò
dedurre i valori sperimentali degli angoli di fase. I valori delle fasi
sono stati successivamente ottimizzati effettuando delle modifiche
52
della densità elettronica tramite il programma DM (Cowtan & Main,
1998). La costruzione automatica del modello è stata eseguita
utilizzando il programma, ARP/wARP (Perrakis et al., 1999).
2.2.5 Determinazione della stabilità di SsTrxR(B3) mediante la tecnica spettroscopica del Dicroismo
circolare
Tutte le misure spettroscopiche sono state registrate con uno
spettropolarimetro Jasco J-810 provvisto di un sistema Peltier per il
monitoraggio della temperatura (modello PTC-423-S). La
concentrazione delle proteine è stata determinata misurando
l’assorbanza a 280 nm, mediante uno spettrofotometro Jasco J-550.
Le curve di denaturazione indotte da urea e da guanidinio
idrocloruro, GuHCl, a temperatura costante, sono state ottenute
registrando la variazione del segnale CD a 222 nm a 20°C. La curva
di denaturazione termica è stata registrata misurando la variazione
del segnale CD nell’intervallo 40-105°C a λ=200 nm e a λ=222 nm
con una velocità di scansione di 1.0°C min-1
2.2.6 Esperimenti di denaturazione chimica
Entrambi i denaturanti urea e guanidinio idrocloruro (GuHCl) sono
stati acquistati come prodotti ultrapuri dalla ditta Sigma: il cloruro di
guanidinio come soluzione acquosa 8 M, mentre l’urea come solido.
Le soluzioni di urea sono state preparate solubilizzando una quantità
nota nella soluzione tampone, dopo aver essiccato il solido per circa
due ore sotto vuoto su P2O5. Le concentrazioni delle soluzioni sono
state determinate attraverso le misure degli indici di rifrazione (Pace
1986). E’ stato necessario preparare le soluzioni di urea al momento
dell’uso a causa dei fenomeni di decomposizione in ammonio e
cianato. Infatti, già dopo una settimana dalla preparazione della
soluzione lo ione cianato è presente in concentrazioni apprezzabili e
può modificare i gruppi amminici della proteina. Per la costruzione di
ogni curva di denaturazione sono state preparate e analizzate diverse
53
soluzioni con una concentrazione di proteina costante e una
concentrazione crescente di denaturante, compresa tra 0.0 e 9.6 M
di urea o tra 0.0 e 7.0 M di cloruro di guanidinio. In particolare, a 10-
20 µL della soluzione madre di proteina sono stati aggiunti l’agente
denaturante, quindi il tampone fosfato fino al volume finale di 500
µL. Siccome elevate concentrazioni di urea e di cloruro di guanidinio
fanno variare il pH, per ogni singolo campione il pH è stato corretto
aggiungendo opportune quantità di soluzioni concentrate di HCl
oppure di NaOH. Inoltre i campioni sono stati miscelati e incubati per
una notte a 4 °C. Un’incubazione più lunga produce segnali CD e di
fluorescenza sovrapponibili.
2.3 Risultati
2.3.1 Proprietà catalitiche di SsTrxR(B3)
SsTrxR(B3) è in grado di catalizzare l’ossidazione del NADH in
presenza di ossigeno molecolare dando come prodotto di reazione
perossido d’idrogeno. Una concentrazione stechiometrica di H2O2
viene prodotta in seguito alla completa ossidazione del NADH, ciò
implica che l’enzima trasferisce due elettroni equivalenti alla molecola
d’ossigeno. L’enzima per reagire necessita tuttavia della presenza del
cofattore FAD. SsTrxR(B3) è in grado inoltre di catalizzare anche la
reazione di ossidazione del NADPH, ma la velocità di reazione è di
due ordini di grandezza più piccola rispetto all’ossidazione del NADH.
Per quanto concerne l’attività Tioredossina Reduttasica tale attività è
stata misurata sia in presenza che in assenza del cofattore FAD. I
risultati emersi dagli esperimenti condotti per misurare l’attività
catalitica dell’enzima hanno mostrato che il massimo dell’attività si
svolge in presenza di entrambi i cofattori, FAD e NADPH. In sostanza
gli esperimenti condotti hanno dimostrato che l’enzima è dotato di
attività Tioredossina Reduttasica. E’ interessante notare che
SsTrxR(B3) precedentemente identificato come NADH ossidasi fa
54
parte della famiglia delle Tioredossine Reduttasi di classe II ed è
dotato di entrambe le attività catalitiche, NADH-ossidasica,
Tioredossina Reduttasica.
2.3.2 Determinazione della struttura cristallografica di SsTrxR(B3)
I primi risultati degli esperimenti di cristallizzazione effettuati su
SsTrxR(B3) hanno rivelato che l’enzima è in grado di cristallizzare in
condizioni differenti. La qualità dei cristalli è stata migliorata variando
leggermente le concentrazioni della proteina e dell’agente
precipitante rispetto alle condizioni iniziali che avevano determinato
la formazione dei primi cristalli. Cristalli di grosse dimensione di
colore giallo vivo (forma I, vedi figura) si sono formati in una
soluzione contenente etere monometil polietilglicole 2000 12-15%
(w/v) (PEG mmE 2K), 0.1 M di solfato d’ammonio (NH4)2SO4 e 50
mM di acetato (pH 4.6). Cristalli di forma differente invece sono
cresciuti in una soluzione contenente polietilenglicole 4000 8-12%
(w/v), 2-propanolo 3-4% (v/v) e 50 mM HEPES-Na (pH 7.5) (vedi
figura). In entrambi i casi la concentrazione di proteina è compresa
nell’intervallo di 4-9 mg ml-1. Utilizzando il metodo di calcolo del
coefficiente di Matthews (Matthews, 1968) è stato possibile
determinare la presenza di due molecole dimeriche di SsTrxR(B3)
nell’unità asimmetrica nei cristalli di forma I, (Vm = 2.1 Å3 Da-1, con
un contenuto di solvente pari al 41%); mentre nei cristalli di forma II
è presente un solo dimero di SsTrxR(B3) nell’unità asimmetrica (Vm
= 2.7 Å3 Da-1, con un contenuto di solvente pari al 55%). Le due
forma cristalline di SsTrxR(B3) mostrano un elevata differenza per
quanto concerne il grado di mosaicità e il limite di diffrazione. Infatti,
le forme cristalline I e II hanno valori di mosaicità pari
rispettivamente 0.31 e 0.68°. Mediante la luce di sincrotrone presso
ESRF i cristalli di forma I e II hanno diffratto a 1.8 and 2.5 Å di
risoluzione rispettivamente. La migliore qualità dei cristalli di forma I
ha indotto ad effettuare successivi esperimenti di cristallizzazione
55
nelle medesime condizioni per ricristallizzare SsTrxR(B3), in presenza
del cofattore NADP+ ed una forma mutata dell’enzima, C147A.
Tuttavia nonostante sia stato preso tale accorgimento, i parametri di
cella dei cristalli ottenuti in presenza del cofattore, sono risultati
leggermente differenti da quelli determinati per la proteina nativa.
Tale risultato è stato considerato come la prova che il NADP+ è
legato all’enzima.
Differenti tentativi sono stati effettuati per risolvere la struttura
tridimensionale di SsTrxR(B3) mediante il metodo della sostituzione
molecolare a partire dai dati di diffrazione dei cristalli di forma I. In
particolare nell’applicazione del metodo della sostituzione molecolare
sono stati utilizzati come modelli di partenza le strutture di E.coli
TrxR (Protein Data Bank code 1TDF) (Waksman et al., 1994) e
A.thaliana TrxR (PDB code 1VDC) (Dai et al., 1996). Tuttavia
entrambi i tentativi non hanno dato i risultati attesi. Infatti la bassa
identità di sequenza tra i modelli utilizzati e SsTrxR(B3) (33-35 %) e
la presenza di ben quattro molecole all’interno dell’unità asimmetrica
hanno reso piuttosto complicata la risoluzione della struttura.
Dal momento che il metodo della sostituzione molecolare non era
sembrato adatto per la risoluzione della struttura tridimensionale di
SsTrxR(B3), è stato ritenuto opportuno ricorrere ad un altro metodo,
che si basa sulla diffusione anomala (MAD).
L’applicazione del MAD permette, mediante l’utilizzo di dati di
diffrazione registrati a tre diversi valori di lunghezza d’onda, di
effettuare il calcolo degli angoli di fase. La presenza di tre residui di
metionina nella sequenza amminoacidica dell’enzima sembrava infatti
avvalorare il ricorso a questa metodologia alternativa per risolvere la
problematica della determinazione delle fasi. Allo scopo di
determinare il picco di assorbanza e la lunghezza d’onda in
corrispondenza del punto di flesso, è stato registrato lo spettro di
fluorescenza su un singolo cristallo della forma derivata di
SsTrxR(B3) contenente la selenio metionina. Utilizzando il set di dati
di diffrazione registrati ad un valore di lunghezza d’onda ottimizzato
56
per generare la diffusione anomala del selenio, tramite il programma
SOLVE è stato possibile identificare la posizione dei 12 siti contenenti
il selenio che si attendeva di trovare all’interno dell’unità
asimmetrica.
L’arrangiamento di tali siti ha confermato la presenza di due dimeri di
SsTrxR(B3) all’interno dell’unità asimmetrica. Il programma SOLVE
(Terwilliger & Berendzen, 1999) ha inoltre consentito di determinare
il set iniziale di angoli di fase. Successivamente la modifica della
densità elettronica effettuata mediante il programma DM (Cowtan &
Main, 1998) ha prodotto una densità elettronica di eccellente qualità.
A partire da tale densità è stato infine possibile, mediante l’utilizzo
del programma ARP/wARP (Perrakis et al., 1999), ottenere in
maniera automatizzata la maggior parte della struttura dell’enzima. E’
in corso l’affinamento cristallografico del modello .
Fig.2.6. Analisi statistica dei dati cristallografici della proteina nativa, cristalli forma I e forma II (wild tipe); del complesso SsTrxR(B3) e il cofattore NADP+; del derivato di SsTrxR(B3) contenente la selenio metionina.
Crystal data, data collection and refinement statisticsValues given in parenthesis refer to the highest resolution shell.___________________________________________________________________________________________________________________________Crystal Wild-type Complex SeMet derivative C147A
with NADP Peak Edge Remote ____________________________________________________________________________________________________________________________Crystal data and data collection statisticsBeamline ESRF-ID29 ESRF-ID29 ESRF-ID14-4 ESRF-ID29Space Group P212121 P212121 P212121 P212121
Cell parameters (Å) a=76.77 a=76.77 a=76.66 a=76.58b=120.68 b=120.68 b=121.82 b=121.87c=126.85 c=126.85 c=127.82 c=127.84
Resolution (Å) 20-1.8 (1.86-1.80) 20-1.95 (2.02-1.95) 30-1.75 (1.81-1.75) 20-1.5 (1.55-1.50)Wavelength (Å) 0.9756 0.9756 0.97932 0.97956 0.93931 0.9756Mean redundancy 5.9 2.5 3.0 2.3 2.3 8.9Completeness (%) 99.8 (98.4) 89.9 (73.5) 99.6 (98.9) 97.1 (93.8) 95.3 (94.5) 98.9 (91.7)Unique reflections 108800 80365 232089 226693 221362 231790Rmerge
†(%) 5.2 (31.2) 5.3 (33.9) 7.0 (30.8) 6.0 (21.7) 5.3 (22.4) 8.1 (32.6)Mean I/σ(I) 22.3 (5.35) 12.7 (2.8) 22.1 (3.8) 18.8 (3.8) 18.9 (3.7) 32.9 (6.7)
Current refinement statisticsResolution range (Å) 20.0-1.80 20.0-1.9 20.0-1.75 20.0-1.5Rfactor/Rfree 0.197/0.234 0.286/0.31 0.228/0.249 0.205/0.218Number of monomers (u.a.) 4 4 4 4Number of water molecules 300 345 355Root mean square deviationsBonds 0.01479 0.006182 0.01945Angles (°) 1.611 1.1458 1.8637____________________________________________________________________________________________________________________________
_†Rmerge= Σ hΣi |I(h,i)-<I(h)>|/ Σ hΣi I(h,i), where I(h,i) is the intensity of the ith measurement of reflection h and <I(h)> is the mean value of the intensity of reflection h. For the SeMet derivative the Rmerge value has been calculated considering the Bijovet pairs individually.
57
2.3.4 Confronto della struttura di SsTrxR e EcTrxR
Per indagare sulle differenti proprietà funzionali e strutturali mostrate
da SstrxR(B3) rispetto altre TrxR di struttura nota, è stata comparata
la struttura dell’enzima con quella di EcTrxR, attraverso la
sovrapposizione di diverse regioni che costituiscono il singolo
monomero. In linea generale sembra che, nonostante l’enzima
presenti una bassa identità di sequenza con EcTrxR, la loro struttura
terziaria globale risulti essere piuttosto simile. Sovrapponendo i
domini strutturali contenenti il FAD, la posizione occupata dal NADPH
è piuttosto differente nelle due molecole. Tuttavia è sufficiente la
semplice rotazione del NADPH domain per sovrapporre i due domini.
La sovrapposizione dei quattro domini presenti nell’unità asimmetrica
mostra che il NADPH domain ha una struttura maggiormente
disordinata rispetto al FAD domain e tale osservazione è deducibile
dalla non ottimale sovrapposizione dei quattro domini contenenti il
sito di legame per il NADPH. Le osservazione riscontrate da queste
analisi strutturali sembrano avvalorare l’ipotesi che il NADPH domain
sia piuttosto flessibile in SsTrxR(B3).
58
Fig.2.7. Analisi comparativa del monomero strutturale di TrxR. Sovrapposizione dei due differenti monomeri presenti nell’unità asimmetrica di SsTrxRB3 (A) e EcoliTrxR. SsTrxRB3 è il monomero in rosso e TrxR e E. coliTrxR è il monomero in verde
59
Fig.2.8. Sovrapposizione dei FAD domain dei quattro monomeri presenti nell’unità
asimmetrica di SsTrxR(B3).
2.3.5 Descrizione della struttura complessiva di SsTrxR(B3)
All’interno dell’unità asimmetrica dei cristalli di forma I, sono presenti
due molecole di proteina dimerica. Ciascun monomero è costituito da
due distinti domini, caratterizzati da uno stato foldato piuttosto
simile. Un dominio contiene il sito di legame per NADPH, l’altro il sito
di legame per il FAD. I due domini sono caratterizzati dai motivi di
struttura secondaria α-elica e foglietto β. Il FAD è localizzato in una
regione nascosta e presenta una conformazione non facilmente
accessibile per l’ossidazione da parte del NADPH. Il sito attivo è
60
localizzato nel dominio contenente il sito di legame per il NADPH,
così come riscontrato nella Tioredossina Reduttasi da E.coli, e si
trova nelle vicinanze dell’anello isoallossazinico, infatti dista di circa 4
Å. Tale osservazione conferma che l’enzima è nello stato FO, ossia
nella conformazione adatta per promuovere l’ossidazione del FAD.
Il dominio contenente il FAD sembra apparentemente molto più
ordinato rispetto al dominio che lega il nucleotide piridinico. Infatti
tale dato emerge chiaramente dall’analisi dei fattori termici B dei due
domini, effettuata riportando in un grafico la variazione dei fattori B
rispetto ai residui amminoacidici che costituiscono la catena
principale della proteina.
Il dominio contenente il FAD sembra essere responsabile del
processo di dimerizzazione, infatti tale dominio si posizione
all’interfaccia tra i due monomeri stabilendo la maggior parte delle
interazioni.
Il dominio contenete il NADPH invece sembra svolgere un ruolo
importante nel processo di stabilizzazione del dimero. Tuttavia il
numero piuttosto basso di interazioni all’interfaccia tra i due domini
che caratterizzano ciascun monomero potrebbe spiegare il maggiore
disordine che presenta il dominio contenente il sito di legame per il
NADPH e quindi una maggiore mobilità in corrispondenza di tale
regione della struttura. Infatti il discreto numero di interazioni forti
con il dominio contenente il FAD potrebbe conferire maggiore
flessibilità al dominio contenente il NADPH. Infatti, così come
osservato nella Tioredossina Reduttasi da E.coli, la transizione tra lo
stato FO allo stato FR può avvenire soltanto in seguito alla rotazione
del NADPH domain rispetto al FAD domain. La variazione
conformazionale che comporta il riarrangiamento strutturale dei due
domini, sembra essere il meccanismo base per lo svolgimento
dell’attività enzimatica delle Tioredossine Reduttasi di classe II.
61
Fig.2.9. Struttura tridimensinale del dimero di SsTrxR(B3)
62
Fig.2.10. Fattori termici B in funzione del numero di residui amminoacidici
2.3.6 Descrizione del sito attivo
La mappa di densità elettronica calcolata in prossimità del sito attivo
ottenuta eliminando dalla struttura le coordinate relative al FAD ed ai
residui circostanti, mostra che il FAD si lega all’enzima assumendo
una conformazione piuttosto allungata e si impacchetta nelle
vicinanze del ponte disolfuro. La presenza del ponte disolfuro tra i
due residui di cisteina 144 e 147 è chiaramente deducibile dalla
distanza misurata tra i due atomi di zolfo cisteinici pari a circa 2 Å.
Tuttavia non è stato possibile definire a livello ottimale la densità
elettronica dell’anello isoallossazinico nei due monomeri. Infatti nella
figura riportata in basso è stato inserito l’anello isoalossazinico
all’interno della cavità e modellato nella posizione attesa per le
Tioredossine Reduttasi di classe II. Tuttavia poiché la densità
elettronica non descrive tale anello si è dedotto che nella proteina
nativa il FAD è disordinato e potrebbe trovarsi all’esterno della cavità.
Al contrario dall’analisi della mappa di densità elettronica del mutante
di SsTrxR(B3), C147A, che descrive il sito attivo, il FAD è
chiaramente visibile e l’anello isoalossazinico è ben delineato dalla
densità elettronica. Il FAD è molto più ordinato nella struttura del
63
mutante piuttosto che nella proteina nativa, e occupa la posizione
assunta all’interno di altre TrxR di struttura nota. Probabilmente nel
caso della proteina nativa le dimensioni ridotte della cavità
impongono all’anello isoallossazinico di spostarsi verso l’esterno, e
questo differente comportamento si traduce in un maggiore disordine
a livello locale.
64
.
Fig.2.11. Mappa Omit (Fo-Fc) della molecola di FAD legata alla proteina native SsTrxR(B3). L’anello isoallossazinico è localizzato nella posizione tipica osservata nelle tioredossine reduttasi da eucarya. Nella figura sono mostrati i residui cisteinici che formano il ponte disolfuro.
Cys144Cys147
65
Fig.2.12. Mappa omit (Fo-Fc ) della molecola di FAD legata al mutante SsTrxR(B3) C147A. Sono inoltre rappresentati i residui Cys144 and Ala147.
66
2.3.7 Struttura cristallografica del complesso SsTrxR-NADPH
La struttura risolta dell’enzima nativo a differenza di EcTrxR non
presenta la densità elettronica che attesta la presenza del cofattore
piridinico NADPH. Di conseguenza per ottenere i cristalli del
complesso SsTrxR(B3)-NADPH è stata aggiunta alla soluzione
precipitante il cofattore nucleotidico. Dall’analisi della struttura
cristallografica di SsTrxR(B3)-NADPH emerge chiaramente che
l’anello nicotinamminico è situato a circa 18 Å dall’anello
isoallossazinico, per cui l’elevata distanza tra i due cofattori
impedisce il trasferimento elettronico.
Fig.2.13. Struttura cristallografica del complesso SsTrxR e NADP
67
2.3.8 Analisi del contenuto di struttura secondaria
Lo spettro CD di SsTrxR(B3) misurato nel lontano UV mostra
chiaramente che l’enzima è dotato degli elementi di struttura
secondaria α-elica e β-sheet. Infatti il massimo a 195 mn ed il
minimo a 222 nm sono caratteristici di una struttura di tipo αβ.
Fig.2.14. Caratterizzazione spettroscopica di SsTrxRB3: spettro CD lontano UV.
f
2.3.9 Analisi della stabilità termica
La stabilità termica di SsTrxR(B3) è stata analizzata mediante lo
studio delle variazioni dello spettro CD a λ=200 nm e λ=222 nm
nell’intervallo 40-105°C. Queste due lunghezze d’onda sono scelte
190 200 210 220 230 240 250-15
-10
-5
0
5
10
15
20
25
[ϑ] (
deg c
m2 dm
ol-1)1
0-3
Wavelenght (nm)
68
per ottenere informazioni sull’effetto della temperatura sia sulle
regioni ad α-elica ([θ]220) che β-sheet ([θ]200) della proteina.
Poiché la denaturazione termica dell’enzima ha determinato la
precipitazione di SsTrxR(B3), non è stato possibile effettuare studi
termodinamici, tuttavia tali esperimenti hanno dimostrato che
l’enzima è stabile anche a temperatura superiore ai 90 °C.
Fig.2.15. Caratterizzazione spettroscopica di SsTrxRB3: spettro di denaturazione
termica.
2.3.10 Denaturazione chimica
Per valutare ulteriormente la stabilità conformazionale di SsTrxR(B3),
sono stati effettuati esperimenti di denaturazione chimica utilizzando
due diversi agenti denaturanti, GuHCl e urea. In particolare sono
stati registrati gli spettri CD di SsTrxR(B3) a temperatura ambiente
per diverse miscele proteine-agente denaturante (urea e cloruro di
guanidinio) a concentrazione variabile (2-8 M). L’analisi degli spettri
CD ha rivelato che in presenza dell’ urea l’enzima conserva la sua
stabilità anche per concentrazioni di agente denaturante superiori a 8
M. Al contrario in presenza di GuHCl, l’enzima non presenta un grado
di stabilità elevato. Infatti la proteina comincia a perdere il suo stato
foldato a partire da concentrazioni di GuHCL pari a 3 M. In
50 60 70 80 90 100-9
-8
-7
-6
-5
-4
-3
[ϑ] 22
2 (d
eg cm
2 dmol
-1)10
-3
Temperature (°C)
69
particolare la concentrazione di denaturante misurata a metà del
processo di transizione è pari a 2.9 M. L’esperimento conferma il
comportamento tipico delle proteine termostabili e il fatto che
l’enzima comincia a denaturare a valori bassi di concentrazione di
GuHCl potrebbe stare ad indicare che le interazioni elettrostatiche,
fortemente contrastate dalla presenza di GuHCl, giocano un ruolo
chiave nel processo di stabilizzazione termica di SsTrxR(B3).
Fig.2.16.a. Spettro CD registrato nel lontano UV della proteina nativa trattata con soluzioni diversamente concentrate di urea .
Fig.2.16.b. Spettro CD registrato nel lontano UV della proteina nativa trattata con
soluzioni diversamente concentrate di cloruro di guanidinio (GuHCl)
170 180 190 200 210 220 230 240 250 260
-15
-10
-5
0
5
10
15
20
25
[ϑ] (
deg
cm2 dm
ol-1)1
0-3
Wavewlenght (nm)
0M Urea 5M Urea 6M Urea 7M Urea 8M Urea 9M Urea
190 200 210 220 230 240 250-15
-10
-5
0
5
10
15
20
25
[ϑ] (
deg
cm2 dm
ol-1)1
0-3
wavelenght (nm)
0 M GuHCl 1.5 M 2.0 M 3.2 M 3.8 M 4.5 M 5.5 M 6.0 M
70
Fig.2.16.c. Curva di denaturazione termica indotta da cloruro di guanidinio ottenuta
riportando la variazione di ellitticità molare a 222 nm in funzione della concentrazione di
GuHCl.
Da un’indagine strutturale approfondita è emerso che all’interfaccia
tra i due domini si trova un numero elevato di residui carichi che
formano un vero e proprio cluster dalla funzione probabilmente
stabilizzante, al contrario di quanto avviene in EcTrxR dove le uniche
interazioni forti interdominio riscontrate sono costituite da due legami
a idrogeno.
0 1 2 3 4 5
-12
-10
-8
-6
-4
-2
0
[GuHCl]1/2= 2.9 M
[ϑ] 22
2 (de
g cm
2 dmol
-1)1
0-3
[GuHCl] (M)
71
Ponti salini in SsTrxR(B3):
Lys124 - Glu46
Arg125 - Glu54
Arg125 - Glu54
Arg126 - Asp250
Fig.2.17. Cluster di ponti salini identificati in SsTrxR(B3)
2.3.11 Ponti salini e stabilità termica
Dagli studi riportati nel presente capitolo sembra che l’elevata
stabilità termica di SsTrxR(B3) sia strettamente legata alla presenza
di un numero elevato di ponti salini all’interno della struttura
tridimensionale dell’enzima rispetto alla omologa proteina mesofila
appartenente ad E.coli. Tale dato è in perfetto accordo con le ipotesi
più recenti, che sulla base di indagini di tipo statistico ed empirico,
tentano di spiegare i fattori determinanti della stabilità termica di
proteine appartenenti ad organismi termofili.
72
Negli ultimi anni essendosi intensificati gli studi su proteine
appartenenti sia ad organismi termofili che ipertermofili, il numero di
sequenze e informazioni strutturali su questa classe di proteine è tale
da aver permesso diversi studi comparativi di tipo statistico su set
piuttosto estesi di dati. In particolare sono stati pubblicati diversi
lavori che si basano sull’esame comparativo tra set di proteine
termofile e set di omologhe mesofile, al fine di individuare i
determinanti strutturali alla base della termostabilità.
I risultati ottenuti hanno rivelato che tra i determinanti strutturali che
conferiscono la termostabilità, un ruolo di primaria importanza
sembra essere svolto dai ponti salini. L’interazione tra coppie ioniche
si ha essenzialmente quando due atomi di carica opposta,
appartenenti a residui amminoacidici carichi ( l’ossigeno del carbonile
di Asp e Glu e l’azoto amminico di Arg, Lys,e Hys) si posizionano
l’uno di fronte all’altro ad una distanza di circa 4 Å.
Gli studi comparativi tra proteine termofile e le omologhe mesofile
descritti in diversi lavori pubblicati, convergono ad uno stesso
risultato: un aumento sensibile di ponti salini tra residui carichi polari
si osserva maggiormente in proteine termofile rispetto alle omologhe
mesofile. Tuttavia tale aumento non è dovuto ad una maggiore
presenza di residui carichi all’interno della sequenza di enzimi
termostabili ma ad una diversa organizzazione strutturale.
É necessario sottolineare che il ruolo dei ponti salini a livello di
stabilizzazione strutturale è ancora oggetto di controversie. In molti
studi infatti i ponti salini determinano la termostabilità ed il confronto
tra proteine termofile e mesofile sembra confermare tale ipotesi. In
altri casi al contrario studi teorici sembrano dimostrare che i ponti
salini destabilizzano lo stato nativo delle proteine. La ragione
principale dell’effetto destabilizzante dei ponti salini sta nel fatto che
la formazione di coppie ioniche all’interno delle proteine ha come
effetto la desolvatazione, che è una conseguenza energeticamente
sfavorevole, in quanto non c’è alcuna compensazione in seguito
all’interazione debole tra residui carichi.
73
Tuttavia, a temperature elevate l’effetto penalizzante della
desolvatazione dei residui carichi in proteine allo stato foldato, è
estremamente ridotto. Dunque i ponti salini nel caso di proteine
termofile hanno un ruolo stabilizzante.
Infine benché tale ipotesi sia confermata da un numero notevole di
analisi comparative, è opportuno ricordare che la maggior parte di
questi studi si basano soltanto sulla struttura delle proteine ed inoltre
non in tutte le proteine termofile analizzate si registra un aumento
del numero di ponti salini rispetto le omologhe mesofile.
Infatti molti altri fattori possono intervenire nel processo di
stabilizzazione termica di proteine termostabili, come ad esempio la
composizione amminoacidica della sequenza, il numero ed il tipo di
legami ad idrogeno per ciascun residuo, l’estensione della regione
idrofobica, le dimensioni e la natura dell’area superficiale accessibile
al solvente, le ridotte dimensioni dei loops che connettono elementi
di struttura secondaria, una maggiore rigidità della struttura
globulare, etc.
L’ effetto di ognuno di questi fattori ed il peso che hanno nei processi
di stabilizzazione termica può variare a seconda del percorso
evolutivo seguito dalle diverse proteine per migliorare la loro
stabilità.
2.4 Conclusioni
Gli studi strutturali condotti sull’enzima SsTrxR(B3) appartenente
all’organismo ipertermofilo Sulfolobus solfataricus, costituiscono il
primo passo compiuto verso la comprensione delle relazione
esistente tra la struttura e la funzione di questa classe di proteine
appartenente al dominio degli archaea.
Gli studi biochimici condotti sull’enzima hanno rivelato proprietà
interessanti.
SsTrxR(B3) possiede due attività enzimatiche ben distinte, l’attività
NADPH-ossidasi e l’attività Tioredossina Reduttasica.
74
L’enzima presenta quindi un’intensa attività catalitica a differenza
delle altre due molecole simili identificate e caratterizzate in
Sulfolobus solfataricus, SsTrxR(B1) e SsTrxR(B2).
Infatti mentre il ruolo biologico di SsTrxR(B2) non è ancora stato
chiarito in quanto gli stessi esperimenti biochimici hanno dimostrato
che l’enzima non è in grado di catalizzare il trasferimento elettronico
dal NADPH al substrato ne tantomeno svolge un attività NADH-
ossidasi, SsTrxR(B1) non può essere classificato come Tioredossina
Reduttasi. Infatti quest’ultima affermazione è dovuta all’assenza del
motivo strutturale CxxC nel sito attivo di SsTrxR(B1), nonostante
l’enzima abbia un attività NADH-ossidasica dipendente dal FAD.
Gli studi strutturali effettuati su SsTrxR(B3) hanno consentito di
fornire alcune elucidazioni per quanto concerne le relazioni struttura-
funzionalità, e struttura-termostabilità di questo enzima.
La determinazione strutturale di SstrxR(B3) costituisce la prima
struttura di TrxR appartenente ad un organismo archaea. L’enzima è
un dimero e ciascun monomero è costituito da due domini, NADH
domain e FAD domain caratterizzati dai motivi di struttura secondari
α-elica e foglietto β.
L’analisi della struttura tridimensionale dell’enzima ha rivelato che
SstrxR(B3) è nello stato FO, ossia nella conformazione adatta per
promuovere l’ossidazione del FAD.
Il dominio contenente il FAD sembra essere più stabile del NADH
domain, ed è stato ipotizzato che possa essere responsabile del
processo di dimerizzazione. L’altro dominio invece sembra svolgere
un ruolo chiave nel processo di stabilizzazione dimerica.
Tuttavia l’assenza di un numero elevato di interazioni forti
all’interfaccia tra i domini sembra spiegare il maggiore disordine del
NADH domain, infatti soltanto un’elevata flessibilità di tale dominio,
così come riscontrato nella Tioredossina Reduttasi appartenete ad
E.coli, può consentire all’enzima di svolgere la propria funzione
biologica.
75
Infatti il passaggio dalla stato FO allo stato FR può avvenire soltanto
in seguito ad una rotazione del NADPH domain rispetto al FAD
domain che attraverso l’avvicinamento del NADPH al FAD puo’
consentire il trasferimento elettronico.
In sostanza, benché SsTrxR(B3) appartenga ad un organismo
ipertermofilo, è una molecola piuttosto flessibile poiché il passaggio
da una conformazione all’altra è il meccanismo alla base del processo
catalitico.
La presenza di interazioni favorevoli all’interfaccia tra i domini,
costituiti essenzialmente da ponti salini, consente l’esplicarsi di tale
meccanismo.
L’analisi della stabilità termica effettuata attraverso la tecnica del
dicroismo circolare ha rivelato altri aspetti interessanti concernenti il
ruolo svolto dai ponti salini all’interno di SsTrxR(B3).
Infatti esperimenti di denaturazione chimica pur confermando
l’elevata stabilità dell’enzima hanno rivelato il ruolo chiave
dell’interazione tra le coppie ioniche, per quanto concerne la
termostabilità. Infatti negli esperimenti descritti nei paragrafi
precedenti, è emerso che l’enzima denatura soltanto in presenza di
un denaturante forte, il cloruro di guanidinio, che generalmente ha
un effetto destabilizzante, interferendo negativamente con le
interazioni elettrostatiche intramolecolari.
76
CAPITOLO 3
DETERMINAZIONE CRISTALLOGRAFICA DI
SsTrxA2
3.1 Introduzione
Le tioredossine costituiscono una classe di proteine molto studiata
per il ruolo fondamentale che svolgono all’interno degli organismi
viventi. Le Trx sono proteine ubiquitarie di piccole dimensioni che
partecipano ad un numero svariato di reazioni di riduzione
nell’ambiente cellulare.
Le Trx vengono considerate le principali fonti di attività disolfuro
reduttasica responsabile del mantenimento dello stato ridotto delle
proteine all’interno della cellula.
Il sistema redox che opera attraverso la Tioredossina (Trx), costituito
dalla Tioredossina stessa, dalla Tioredossina Reduttasi (TrxR), e dal
NADPH, è presente in tutti gli organismi a partire dai batteri fino ad
arrivare all’uomo.
L’attività ditiolo-disolfuro ossidoreduttasica che caratterizza queste
proteine è dovuta essenzialmente alla presenza nel loro sito attivo
del motivo strutturale CXXC, altamente conservato nei vari
organismi.
Queste proteine sono state identificate e caratterizzate
principalmente nei domini eucarya, eubacteria e la sequenza
amminoacidica che circonda il sito attivo sembra altamente
conservata all’interno delle diverse specie.
77
Sono state identificate due forme principali di Trx, denominate in vari
modi, a seconda dell’organismo a cui appartengono. Tuttavia nelle
piante esitono due forme addizionali di tioredossine, identificate
come trxm e trxf entrambe localizzate nel cloroplasto.
Le tioredossine delle diverse specie presentano una percentuale di
identità di sequenza che va dal 27% al 69% rispetto alla
Tioredossina di E.coli dimostrando come tutte le tioredossine
presentino la stessa struttura tridimensionale. Infatti, contengono
tutte il “thioredoxin domain” costituito da un core centrale di cinque
β-foglietti circondati da quattro α-eliche ed, inoltre, risultano
caratterizzate dalla presenza del tetrapeptide –Cys-Gly-Pro-Cys-
dotato di attività redox.
In tutti i casi, le reazioni catalizzate dalla Tioredossina risultano
essere reversibili e portano alla formazione o alla rottura di legami
disolfuro in base al potenziale redox del suo substrato. Ad esempio, il
basso potenziale redox della Tioredossina isolata da E.coli assicura
che la specie Trx-(SH)2 sia il maggiore riducente di ditioli all’interno
del citosol.
Negli ultimi trenta anni gli studi funzionali-strutturali sulle
Tioredossine si sono altamente intensificati, infatti il numero di
strutture tridimensionali risolte di Trx dai diverse organismi è
piuttosto elevato.
Tuttavia mentre gli studi condotti sulle tioredossine da bacteria ed
eucarya sono piuttosto avanzati, si stanno compiendo ancora i primi
passi per quanto riguarda le indagini sperimentali sulle tioredossine
appartenenti al dominio degli archaea.
Sembra infatti che il sistema NADH-Tioredossina Reduttasi all’interno
di tali organismi sia piuttosto complesso.
Attualmente sono in corso studi funzionali-strutturali sulle proteine
ad attività ditiolo-disolfuro appartenenti ad organismi archaea quali
ad esempio Sulfulobus solfataricus e Sulfulobus tokodaii.
oltanto di recente infatti, studi di genomica condotti sull’organismo
ipertermofilo S.solfataricus, hanno rivelato la presenza di diversi geni
78
che codificano per differenti sistemi proteici, Tioredossina-
Tioredossina Reduttasi. In particolare sono state identificate due
tioredossine (SsTrxA1 e SsTrxA2) e tioredossine reduttasi(SsTrxRB2
e SsTrxRB3), oltre che una proteina contenente il motivo strutturale
conservato CXXC, con elevata identità di sequenza con le altre TrxR(
SsTrxRB1).
Inoltre la recente ipotesi che nell’organismo Sulfolobus solfataricus la
proteina disolfuro isomerasi (PDO) potrebbe essere il substrato della
SsTrxR anziché SsTrxA1 e SsTrxA2, rendono lo scenario ancora più
complicato.
Dall’allineamento di sequenza con proteine omologhe è risultato che
SsTrxA2 presenta un’elevata identità di sequenza con la Trx
appartenente all’archeobatterio sulfolobus tokodaii e la Tioredossina,
trxm del cloroplasto da spinacio pari rispettivamente a 90% e 45%.
Al contrario è piuttosto bassa l’identità di sequenza con EcTrx che è
solo del 30%.
Allo scopo di fornire alcuni chiarimenti sulle proprietà degli enzimi
che costituiscono il sistema NADH-Tioredossina Reduttasi
dall’archaeon S.solfataricus, nel presente capitolo verranno presentati
i risultati degli studi funzionali e strutturali condotti sulla Tioredossina
SsTrxA2.
3.1.1 La Tioredossina da E.Coli
La struttura cristallografica della Tioredossina di E. coli è stata risolta
da Katti et al, a 2.8 Å di risoluzione. Dalla struttura cristallografica, è
emerso che il primo residuo di cisteina del sito redox attivo, la Cys
32, risulta essere localizzata vicino al punto in cui ha inizio un motivo
strutturale ad α-elica, ed è localizzata in una regione esposta della
proteina. Il suo pKa di 7.1, molto più basso se confrontato con quello
di una cisteina libera (pKa=8.7, a pH neutro), le conferisce una alta
reattività e risulta essere influenzato dalla vicinanza dell’Asp-26.
Inoltre, sono stati condotti studi NMR sulla struttura tridimensionale
di EcTrx nello stato ridotto e ossidato, ed è stato così dimostrato
79
come la differenza tra le due forme sia davvero sottile, implicando
soltanto un locale cambio conformazionale all’interno ed intorno al
sito attivo.
Riguardo alle modalità con cui possa avvenire la reazione di catalisi,
si ipotizza che, a pH neutro, l’atomo di zolfo reattivo della Cys-32
potrebbe formare un legame a idrogeno con l’atomo di idrogeno del
gruppo SH della Cys-35.
La Cys-32, sotto forma di tiolato, determina un attacco nucleofilo sul
ponte disolfuro della proteina substrato, generando un ponte
disolfuro misto enzima-substrato che viene scisso dalla Cys-35 per
liberare la proteina substrato nello stato ridotto.
Alla fine della reazione, la Tioredossina ossidata viene riportata nella
forma ridotta dalla Tioredossina Reduttasi e dal NADPH.
C’è da sottolineare come, in prossimità del sito attivo, siano presenti
residui aminoacidici idrofobici o non polari quali Gli-33, Pro-34, Ile-
75, Pro-76, Gli-92 e Ala-93, che potrebbero essere importanti per
favorire l’interazione proteina-proteina.
3.1.2 Trxm del cloroplasto da spinacio
L’analisi dei genomi di E.coli, del lievito, di cellule animali e umane,
ha rivelato la presenza di due tipi funzionali di Tioredossina, Trx1,
Trx2. Le piante al contrario contengono due tipi in più di tioredossine
collocate nello stesso comparto cellulare, il cloroplasto, denominate
rispettivamente, trxm e trxf. Contrariamente a quanto riscontrato per
trxm, è risultato che la sequenza di trxf presenta una bassa identità
sia con altre tioredossine che con la stessa trxm.
Nel paragrafo presente vengono esposti i risultati del lavoro di
caratterizzazione strutturale effettuata mediante il metodo
cristallografico, della Tioredossina m, trxm, del cloroplasto da
spinacio.
La struttura nativa cristallografica, in forma ossidata di trxm è stata
determinata a 2.1 Å di risoluzione, mediante il metodo della
80
sostituzione molecolare, utilizzando come modello di partenza la
Tioredossina da E.Coli, EcTrx. La struttura tridimensionale di trxm è
molto simile a quella di EcTrx, infatti l’identità di sequenza tra le due
molecole è pari al 46%.
Lo stato foldato di trxm è quello tipico della tioredossine note, infatti
è caratterizzato da 5 foglietti β sorretti da quattro a-eliche, che
costituiscono il thioredoxin domain. Come le altre tioredossine, trxm
è un agente riducente molto efficiente. La sua attività ditiolo-
disolfuro ossido reduttasi è in gran parte dovuta al suo sito attivo,
che presenta il motivo strutturale altamente conservato
caratterizzato dalla sequenza –Trp-Cys-Gly-Pro-Cys- e alle proprietà
peculiari dei due residui cisteinici. L’efficienza è dovuta in parte al
basso valore del pKa del residuo di cisteina più esposto ( Cys32 in
E.coli trx, Cys37 in Trxm).
Come riscontrato negli studi effettuati sulla EcTrx, il meccanismo alla
base dei processi di riduzione è oggetto di diverse controversie.
Probabilmente sono diversi i fattori che determinano l’attività di tali
proteine, uno di questi è la natura chimica dei residui che si trovano
nelle vicinanze del sito attivo. Un altro importante aspetto che
influisce sulla reattività della tioredossine è l’accessibilità al solvente
della cisteina su menzionata. Per quanto concerne invece il secondo
residuo di cisteina (Cys35 in EcTrx, Cys40 in Trxm), al contrario,
questo si trova collocato in una regione nascosta dove l’accessibilità
al solvente è negata; il pKa di tale residuo è di circa quattro ordini di
grandezza più alto di quello fisiologico, e risulta sostanzialmente un
residuo non reattivo.
Trxm presenta tuttavia un potenziale di riduzione medio molto simile
a quello delle altre tioredossine note.
L’analisi strutturale del sito attivo di trxm ha rivelato che presenta
una geometria molto simile a quello di Ectrx, di conseguenza è stato
possibile ipotizzare che le due molecole abbiano lo stesso
meccanismo di reazione. In seguito a tale ipotesi il meccanismo di
reazione ipotizzato per trxm è quello esposto di seguito.
81
Il residuo di acido aspartico altamente conservato nelle diverse
tioredossine, che corrisponde a Asp26 in EcTrx, Asp31 in trxm,
agisce come accettore di elettroni nel processo di deprotonazione
della cisteina inattiva (Cys 35 in EcTrx, Cys40 in trxm) e rilascia un
protone ad una molecola d’acqua di solvente situata nella vicinanze.
In entrambe le strutture considerate, EcTrx e Trxm, il residuo di
aspartico si trova all’interno di una cavità che ospita una molecola
d’acqua. Alla pari di quanto è stato osservato per EcTrx, anche nel
caso di trxm, il passaggio dalla forma ossidata alla forma ridotta
comporta soltanto una lieve variazione conformazionale.
La sturttura globulare di Trxm è monomerica, tuttavia all’interno del
cristallo sono state individuate due molecole per unità asimmetrica
che non presentano alcuna interazione di natura covalente. Tale dato
sembra essere confermato dagli studi NMR effettuati su tale
molecola.
82
Fig.3.1. Struttura tridimensionale di Trxm del cloroplasto da spinacio
3.2 Materiali e metodi
3.2.1 Preparazione e purificazione di SsTrxA2
Il vettore di espressione pSsTrx-A2 contenente il gene codificante per
SsTrxA2 è stato utilizzato per trasformare ceppi E. coli BL21(DE3),
successivamente fatti crescere a 37°C in Luria-Bertani medium. Dopo
induzione con isopropil-β-D-tiogalattopiranoside (IPTG), le cellule
sono state fatte crescere per circa tre ore. Le cellule batteriche sono
state raccolte tramite centrifugazione a 3000*g per 15 minuti a 4 °C
e risospese in 20 ml di un tampone contenente 20mM Tris-HCl pH
7.8, 5mM MgCl2, 50mM KCle 1 mM PMSF. La rottura delle cellule è
stata effettuata tramite un sistema di rottura cellulare meccanica.
L'omogenato cellulare é stato centrifugato a 100,00*g per circa due
83
ore ed il sovranatante post-ribosomale ottenuto é stato sottoposto
per 30 min ad un temperatura di 70°C. Dopo aver allontanato
mediante centrifugazione le proteine di E.coli, denaturate dal
trattamento termico, il supernatante è stato dializzato in un tampone
contenente 25mM Mes/KOH, pH 5.5. Successivamente il campione è
stato caricato su una colonna mono S a scambio cationico collegata
ad un sistema FPLC operante a temperatura ambiente. L’eluizione è
stata condotta mediante un gradiente di KCl (0-200mM). L’eluizione
di SstrxA2 è avvenuta ad una concentrazione di KCl pari a 25mM. Le
frazioni che mostravano la presenza di un'unica banda
elettroforetica, su gel di poliacrilammide in condizioni denaturanti
(SDS-PAGE; Laemmli, 1970), sono state riunite e concentrante
mediante Aquacide II. Dopo essere stato dializzato in un tampone
contenente 20 mM il campione è stato conservato a -20°C. In queste
condizioni l'attività si è mantenuta per diversi mesi. La proteina
presentava un peso molecolare di 15 kDa, tuttavia effettuando la
purificazione in essenza di PMSF è stata ottenuta la forma troncata di
SsTrxA2, dal peso molecolare di circa 12 kDa, corrispondente al
Thioredoxin domain.
3.2.2 Attività enzimatica di SsTrxA2
Gli esperimenti di determinazione dell’attività enzimatica di SsTrxA2
sono stati condotti presso i laboratori del Dipartimento di Biochimica
e Biotecnologie Mediche di Napoli. L’attività tioredossinica è stata
determinata tramite il metodo turbidimetrico di riduzione
dell’insulina, utilizzando come donatori di riducenti equivalenti, sia
DTT che il complesso NADH-Tioredossina Reduttasi. La velocità
iniziale della reazione di riduzione è stata dedotta dalla parte lineare
della curva di assorbanza misurata a 650nm nell‘intervallo 0,1-0,4.
84
3.2.3 Determinazione del potenziale redox di riduzione
Il potenziale redox del sistema Tioredossina-NADH-Tioredossina
Reduttasi è stato determinato a 60 °C misurando la variazione del
segnale di assorbanza a 340nm. Per effettuare tale esperimenti 10-
36µM di SsTrxA2 sono stati miscelati con 50 µM di NADPH portando
la miscela ad un volume finale di 1ml in un tampone contenente
25mM di MES/KOH e 2mM EDTA, pH 5.5. La reazione è iniziata in
seguito all’aggiunta di 2 µM di SsTrxR-B3. Quando il segnale di
assorbanza si è stabilizzato intorno un valore basso, è stato aggiunto
alla miscela di reazione un eccesso di NADP+ (1200 µM), e la
reazione è stata monitorata fino a quando il segnale di assorbanza ha
raggiunto un livello alto mantenendosi costante a 340nm. Il
potenziale di riduzione è stato calcolato dall’equazione di Nernst a
partire dai valori di concentrazione delle specie ridotte ed ossidate sia
della tioredossine che delle specie elettron-donatore. Per la
risoluzione dell’equazione è stato inoltre utilizzato come valore di
potenziale di riduzione del NADP+, quello calcolato a pH 5.5, risultato
pari a -271 mV. Il potenziale di riduzione riportato costituisce il valore
medio calcolato su 3-4 determinazioni e la varianza dei valori
misurati in ogni singola determinazione non ha superato il 4%.
3.2.4 Misura della termofilicità
Un campione contenente 50 µM SsTrxA2 in un tampone costituito da
100mM di fosfato di potassio, 2 mM di EDTA, pH 7.0, è stato
sottoposto a differenti temperature. A intervelli di tempo prestabiliti,
è stata misurata l’attività enzimatica residua utilizzando il metodo di
riduzione dell’insulina in presenza di DTT come specie elettron-
donatore. A partire dall’equazione At/Ao=-kT, è stata calcolata la
costante cinetica alla temperatura di inattivazione termica. Ao
rappresenta l’attività del campione che non ha subito trattamento
85
termico, At è l’attivtà misurata al tempo T di trattamento termico e K
è la costante cinetica del processo di inattivazione termica. L’energia
di attivazione del processo di inattivazione termica è stata calcolata
dalla curva di Arrhenius ottenuta riportando il logaritmo naturale
della costante cinetica in funzione della temperatura.
3.2.5 Cristallizzazione di SsTrxA2
La trattazione teorica della cristallizzazione di proteine è riportata in
dettaglio nell’Appendice I. Di seguito sono descritte brevemente le
condizioni di cristallizzazione di SsTrxA2 ricombinante ottenuto
attraverso la procedura appena descritta. Gli esperimenti di
cristallizzazione sono stati condotti a 293K usando i metodi di
cristallizzazione del microbath sott’olio e della diffusione in fase
vapore, hanging drop. Prove preliminari di cristallizzazione sono state
effettuate utilizzando un KIT reperibile in commercio contenente
soluzioni precipitanti a matrice sparsa (Crystal screen kits I and II,
Hampton Research).
Cristalli singoli adatti per una analisi cristallografica, sono stati
ottenuti dalla sola forma troncata di SsTrxA2, thioredoxin domain,
utilizzando un intervallo di concentrazione di proteina compreso tra
4-9 mg ml-1 e una soluzione precipitante contenente PEG3350 18-
22% (w/v), 0.2 M (NH4)I (fig.1(a)). Nelle Figure 3.2 e 3.3 sono
riportate le immagine dei cristalli ottenuti nelle condizioni di
cristallizzazione sopradescritte
86
Fig.3.2. Cristalli di SsTrxA2, forma troncata, Thioredoxin domain
Fig.3.3. Cristalli di SsTrxA2, forma intatta, full lenght
3.2.6 Registrazione ed analisi statistica dei dati cristallografici di SsTrxA2
Dati di diffrazione sono stati registrati in house a 298 K, utilizzando
un CCD Saturn 944 collegato ad un generatore di radiazioni CuKα
87
MicroMax 007HF(RIGAKU) di lunghezza d’onda pari a 1.5418 Å. I
cristalli sono stati congelati aggiungendo alla soluzione tampone di
cristallizzazione, glicerolo al 22% (v/v), per evitare processi di
decadimento del cristallo. I dati di diffrazione sono stati raccolti a
1.83 Å e processati mediante l’utilizzo del programma HKL2000.
Fig.3.4. Pattern di diffrazione di SsTrxA2 (thioredoxin domain)
Fig.3.5. Analisi statistica dei dati cristallografici di SsTrxA2 (thioredoxin domain)
88
3.2.7 Risoluzione ed affinamento cristallografico di SsTrxA2
La struttura tridimensionale di SsTrxA2 è stata risolta utilizzando
come modello di partenza la struttura della Tioredossina m del
cloroplasto da spinacio (trxm), che presenta un indentità di sequenza
del 45%. Il programma ARP/wARP(Perrakis et al., 1999) è stato in
grado di tracciare automaticamente la maggior parte della struttura
di SsTrxA2 (tioredoxin domain). L’affinamento cristallografico è stato
effettuate mediante il programma CNS.
3.2.8 Determinazione della stabilità di SsTrxA2 mediante la tecnica spettroscopica del Dicroismo
circolare
La concentrazione delle proteine è stata determinata misurando
l’assorbanza a 280 nm, mediante uno spettrofotometro Jasco J-550.
Tutte le misure spettroscopiche sono state registrate con uno
spettropolarimetro Jasco J-810 provvisto di un sistema Peltier per il
monitoraggio della temperatura (modello PTC-423-S). Le curve di
denaturazione indotte da urea e da GuHCl, a temperatura costante,
sono state ottenute registrando la variazione del segnale CD a 222
nm a 20°C. La curva di denaturazione termica è stata registrata
misurando la variazione del segnale CD nell’intervallo 40-105°C a
λ=200 nm e a λ=222 nm con una velocità di scansione di 1.0°C min-
1.
89
3.2.9 Esperimenti di denaturazione chimica
Entrambi i denaturanti urea e guanidinio idrocloruro (GuHCl) sono
stati acquistati come prodotti ultrapuri dalla ditta Sigma: il cloruro di
guanidinio come soluzione acquosa 8 M, mentre l’urea come solido.
Le soluzioni di urea sono state preparate solubilizzando una quantità
nota nella soluzione tampone, dopo aver essiccato il solido per circa
due ore sotto vuoto su P2O5. Le concentrazioni delle soluzioni sono
state determinate attraverso le misure degli indici di rifrazione (Pace
1986). E’ stato necessario preparare le soluzioni di urea al momento
dell’uso a causa dei fenomeni di decomposizione in ammonio e
cianato. Infatti, già dopo una settimana dalla preparazione della
soluzione lo ione cianato è presente in concentrazioni apprezzabili e
può modificare i gruppi amminici della proteina. Per la costruzione di
ogni curva di denaturazione sono state preparate e analizzate diverse
soluzioni con una concentrazione di proteina costante e una
concentrazione crescente di denaturante, compresa tra 0.0 e 9.6 M
di urea o tra 0.0 e 7.0 M di cloruro di guanidinio. In particolare, a 10-
20 µL della soluzione madre di proteina sono stati aggiunti l’agente
denaturante, quindi il tampone fosfato fino al volume finale di 500
µL. Siccome elevate concentrazioni di urea e di cloruro di guanidinio
fanno variare il pH, per ogni singolo campione il pH è stato corretto
aggiungendo opportune quantità di soluzioni concentrate di HCl
oppure di NaOH. Inoltre i campioni sono stati miscelati e incubati per
una notte a 4 °C. Un’incubazione più lunga produce segnali CD e di
fluorescenza sovrapponibili.
3.2.10 Analisi della struttura secondaria
Per indagare sugli aspetti molecolari che conferiscono la particolare
stabilità di proteine appartenenti ad organismi estremofili sono stati
fatti allineamenti di sequenza mediante il programma BLAST per
90
valutare eventuali delezioni o inserzioni di residui amminoacidi che
possono determinare cambiamenti nella struttura secondaria. In
particolare la sequenza amminoacidica di SsTrxA2 è stata confrontata
con quella di tioredossine da organismi mesofili e sono state valutate
nel particolare le differenze tra le sequenze di SsTrxA2, trxm, EcTrx.
91
3.3 Risultati
3.3.1 Proprietà biochimiche di SsTrxA2
La forma intatta di SsTrxA2 purificata, come determinato dalla banda
presente su gel SDS, presenta un peso molecolare di 15 kDa (forma
full lenght). Tuttavia esperimenti di purificazione effettuati
omettendo l’aggiunta di PMSF hanno consentito l’ottenimento
soltanto della forma troncata di SsTrxA2, caratterizzata dal solo
thioredoxin domain. Questo dato è stato ulteriormente confermato
da successivi esperimenti di spettrometria di massa a cui sono state
sottoposte entrambe le forme ottenute.
I risultati di questi esperimenti hanno dimostrato che la forma intatta
di SsTrxA2 presenta una massa molecolare di 15517 Da, un valore
coincidente con quello deducibile dalla sequenza amminoacidica
(15518 Da).
La forma troncata di SstrxA2 invece presenta un peso molecolare di
12522 Da coincidente con la regione compresa tra i residui Lys26-
Glu135.
La massa molecolare determinata attraverso cromatografia a
scambio ionico, effettuata per la forma troncata di SsTrxA2,
mediante una colonna Superdex 75, ha invece rivelato un peso
molecolare pari a 24 kDa. Il metodo cromatografico è stato applicato
in presenza dell’agente riducente β-mercaptoetanolo. Questo dato
confrontato con quanto rilevato per le proteine mesofile, che
sottoposte allo stesso esperimento, presentavano un peso
molecolare nettamente inferiore, indica che SsTrxA2 (thioredoxin
domain) è un omodimero e il legame covalente tra i due monomeri
non è costituito dal ponte disolfuro.
92
L’attività di SsTrxA2 è stata valutata tramite il metodo nefelometrico
valutando la riduzione di insulina in presenza o del DTT o della
Tioredossina Reduttasi.
SstrxA2 è in grado di trasferire elettroni dal DTT all’insulina
determinando la sua riduzione seguita dalla conseguente
precipitazione. Il tempo in cui ha inizio la reazioni dipende
direttamente dal pH. Per una concentrazione di SsTrxA2 pari a 10µM
la riduzione dell’insulina ha inizio a 2.2 min e 3.9 min per valori di pH
pari 7.0 e 5.5. La stessa reazione è stata seguita in presenza di
SsTrxR(B3), e NADPH come elettron donatore. In questo caso
SsTrxA2 ha catalizzato la reazioni di trasferimento elettronico dal
NADPH all’insulina, ma la velocità d’inizio reazione è risultata più alta
rispetto a quella registrata in presenza del DTT. In presenza di DTT è
stato osservato che il massimo di attività di SsTrxA2 si registra a pH
7, mentre in presenza di SsTrxR(B3) e NADPH, la massima efficienza
catalitica si svolge a pH acido, 5.5. Inoltre gli stessi esperimenti
condotti utilizzando la specie troncata di SstrxA2 (thioredoxin
domain), hanno rivelato che nonostante abbia la stessa attività
reduttasica della forma intatta, presenta un’attività ossidante
leggermente inferiore. Ad ogni modo gli esperimenti condotti per
misurare il potenziale di riduzione oltre a dimostrare che il
trasferimento elettronico tra SsTrxA2 e SsTrxR(B3) è altamente
reversibile, confermano l’appartenenza di SsTrxA2 al sistema NADH-
Tioredossina Reduttasi.
3.3.2 Il potenziale redox di SsTrxA2
Il trasferimento elettronico tra la Tioredossina e la Tioredossina
Reduttasi è un processo altamente reversibile. Tale osservazione
infatti è stata dimostrata aggiungendo alla miscela di reazione,
descritta nella sezione materiali e metodi, un eccesso di NADP+,
successivamente alla completa ossidazione del NADPH catalizzata
dalla Tioredossina Reduttasi SsTrxR(B3) a T=60° e pH 5.5. Con
93
questa procedura è stato possibile calcolare il potenziale di riduzione
dall’equazione di Nernst all’equilibrio. I valori del potenziale di
riduzione determinati per la forma intatta e la forma troncata di
SsTrxA2 sono risultati leggermente diversi, pari rispettivamente a -
168 mV e -175 mM.
3.3.3 Inattivazione termica di SsTrxA2
L’inattivazione termica di SsTrxA2 è stata valutata misurando l’attività
residua di riduzione dell’insulina mediante DTT, dopo aver esposto la
proteina purificata a diverse temperature. I risultati di tali
esperimenti hanno confermato che SsTrxA2 è un proteina molto
stabile, infatti una perdita significativa dell’attività enzimatica è stata
riscontrata soltanto dopo aver esposto l’enzima a trattamento
termico per diverse ore, in un intervallo di temperatura compreso tra
92 e 99°C. É’ stato successivamente osservato, effettuando gli stessi
esperimenti sulla Tioredossina SsTrxA1, che SsTrxA2 è leggermente
più stabile di SsTrxA1, infatti a 92°C la due temperature medie di
inattivazione termica risultano pari a 20.5 h e 56.6 h rispettivamente.
Il processo d’inattivazione dal punto di vista cinetico può essere
descritto da un equazione di primo ordine. Tale risultato ha
consentito l’analisi dei dati attraverso l’utilizzo dell’equazione di
Arrhenius. Dalla retta di Arrhenius è stato infatti possibile
determinare l’energia di attivazione del processo che per SsTrxA2 è
risultata pari a 292 KJ/mol.
3.3.4 Determinazione della struttura cristallografica di SsTrxA2
Prove di cristallizzazione preliminari, effettuate su SsTrxA2 utilizzando
kit disponibili in commercio, hanno rivelato che esistono diverse
condizioni chimico-fisiche che determinano la formazione di cristalli di
94
SsTrxA2. In particolare tutti gli esperimenti che hanno mostrato un
apparente successo avevano un elemento in comune: la presenza del
polietilenglicole (PEG) come agente precipitante. Tuttavia in tutti casi
in cui sono stati ottenuti cristalli si è tentato di migliorare la qualità
degli stessi variando leggermente le concentrazioni della proteina e
dell’agente precipitante rispetto alle condizioni iniziali. Le prove di
cristallizzazione sono state effettuate su entrambe le forme purificate
di SsTrxA2, la forma intatta (full lenght) e la forma troncata
(thioredoxin domain). Tuttavia soltanto i cristalli ottenuti a partire
dalla forma troncata sono risultati quelli adatti per un analisi
cristallografica. I cristalli di SsTrxA2 (thioredoxin domain) si sono
formati da una soluzione contenente 18-22%(w/v) di PEG3350 e 0.2
M di NH4I. La concentrazione di proteina era nell’intervallo 4-9mg ml-
1. In tre giorni i cristalli hanno raggiunto le dimensioni finali di
0.05×0.05×0.5mm3.
I dati diffrazione sono stati raccolti a 1.83 Å di risoluzione utilizzando
una sorgente convenzionale di radiazioni X. Dal calcolo del
coefficiente di Matthews è risultata la presenza di un singolo
omodimero di SsTrxA2 all’interno dell’unità asimmetrica (Vm=1.95 Å3
Da-1; il contenuto di solvente pari al 37%). Le stesse condizioni di
cristallizzazioni effettuate utilizzando SsTrxA2 (full lenght) hanno
consentito la formazione di cristalli non singoli della forma intatta,
ma i tentativi di migliorare la loro qualità hanno avuto come esito un
insuccesso. Tale risultato ha avvalorato l’ipotesi che la presenza del
frammento N-terminale, che presenta di norma uno stato non
foldato, ha un impatto negativo sul processo di crescita di cristalli
ordinati. La struttura tridimensionale di SsTrxA2 (forma troncata) è
stata risolta con il metodo della sostituzione molecolare, utilizzando
come modello di partenza la struttura della Tioredossina m del
cloroplasto da spinacio (trxm), che presenta un’indentità di sequenza
del 45%. Il programma ARP/wARP (Perrakis et al., 1999) è stato in
grado di tracciare automaticamente la maggior parte della struttura
di SsTrxA2 (tioredoxin domain). L’affinamento cristallografico è stato
95
effettuato mediante il programma CNS. Il cristallo di SsTrxA2
appartiene al gruppo spaziale P2 e la presenza di un dimero
all’interno dell’unità asimmetrica è in disaccordo con quanto rivelato
per strutture note di altre tioredossine. Dall’ osservazione della
densità elettronica è emerso che in prossimità del sito attivo
dell’enzima, costituito dal motivo strutturale altamente conservato
nelle diverse tioredossine, Cys-Ala-Pro-Cys, è chiaramente visibile il
ponte disolfuro tra i due residui cisteinici.
Fig.3.6. Struttura tridimensionale del monomero di SsTrxA2 (thioredoxin domain)
3.3.5 Descrizione della struttura complessiva di SsTrxA2
La struttura tridimensionale di SsTrxA2 presenta alcune delle
caratteristiche tipiche delle tioredossine a struttura nota, isolate e
caratterizzate nei diversi organismi. Si tratta tuttavia della prima
96
struttura risolta di Tioredossina appartenente ad un organismo
estremofilo. L’enzima essendo in forma troncata mostra i motivi di
struttura secondaria tipici del thioredoxin domain. Infatti la molecola
è costituita essenzialmente da quattro α-eliche, e cinque foglietti β
disposti in modo tale da formare una struttura globale piuttosto
compatta. La regione N-terminale essendo non strutturata e
possedendo un elevata flessibilità, è delineata correttamente nella
mappa di densità elettronica, soltanto a partire dal residuo di valina
34. La regione C-terminale allo stesso modo è stata identificata fino
al residuo di leucina 134. La struttura cristallina di SsTrxA2 è in
forma ossidata, infatti è chiaramente visibile la densità elettronica
che descrive il ponte disolfuro formato dai residui di cisteina che
costituiscono il sito attivo.
La struttura globulare di SsTrxA2 è un omodimero, tuttavia se
confrontata con altre tioredossine in forma dimerica, non presenta le
stesse interazioni.
Fig.3.7. Omodimero di SsTrxA2
97
3.3.6 Descrizione del sito attivo
Il sito attivo di SsTrxA2 è costituito dal motivo strutturale altamente
conservato dato dalla sequenza Cys-Ala-Pro-CYs. Il gruppo cisteinico
nucleofilo e quello invece nascosto al solvente corrispondono ai
residui numero 60 e 63 lungo la sequenza di SsTrxA2. La mappa di
densità elettronica delinea chiaramente il ponte disolfuro formato dai
due residui.
Il sito attivo è localizzato sulla superficie di un loop ubicato nella zona
terminale dello strand β2 che precede una lunga α-elica. In accordo
a quanto riscontrato nella sequenza di altre tioredossine appartenenti
ai diversi organismi, nelle vicinanze del sito attivo sono localizzati
diversi residui carichi che potrebbero svolgere un ruolo chiave sia nel
meccanismo di reazione sia nel determinare le differenti proprietà
delle tioredossine.
In particolare, il residuo di aspartico in posizione 56, che risulta
ampiamente conservato, sembra avere un ruolo fondamentale nei
processi ossido-riduttivi che coinvolgono le tioredossine
3.3.7 Confronto della struttura di SsTrxA2 e EcTrx, Trxm
Dalle sovrapposizioni della catena principale di SstrxA2-Trxm e
SstTrxA2-e.coliTrx, effettuate mediante l’utilizzo del programma di
grafica molecolare O, è emerso che nonostante i motivi di struttura
secondaria che costituiscono il thioreoxin domain siano
sostanzialmente gli stessi, in corrispondenza di alcune tratti della
catena la sovrapposizione non è ottimale. In particolare la
sovrapposizione di SsTrxA2 e EcTrx ha rivelato che la struttura di
SsTrxA2 è molto più compatta, infatti l’enzima ha una conformazione
meglio strutturata a causa di una maggiore estensione dei motivi di
struttura secondaria. La sovrapposizione tra SsTrxA2 e Trxm ha
98
determinato valori accettabili della deviazione quadratica media solo
in corrispondenza di alcuni tratti della catena. Le eliche α2 e α3 e i
foglietti β1 e β3 presentano le stesse dimensioni e sono
sostanzialmente conservati, al contrario le differenze sostanziali sono
in corrispondenza delle regioni occupate dai loops. In particolare in
SsTrxA2 è assente il loop che collega in motivi strutturali α1 e β2,
mentre il loop che connette l’elica α2 e il foglietto β3 è più corto.
Anche in questo caso la struttura di SsTrxA2 rispetto a quella di trxm
risulta essere più strutturata e maggiormente compatta.
3.3.8 Analisi del contenuto di struttura secondaria
Lo spettro CD di SsTrxA2 misurato nel lontano UV mostra
chiaramente che l’enzima è dotato degli elementi di struttura
secondaria α-elica e β-sheet. Infatti il massimo a 195 mn ed il
minimo a 222 nm sono caratteristici di una struttura di tipo αβ.
3.3.9 Analisi della stabilità termica
La stabilità termica di SsTrxA2 è stata analizzata mediante lo studio
delle variazioni dello spettro CD a λ=200 nm e λ=222 nm
nell’intervallo 40-105°C. Queste due lunghezze d’onda sono scelte
per ottenere informazioni sull’effetto della temperatura sia sulle
regioni ad α-elica ([θ]220) che β-sheet ([θ]200) della proteina. In
queste condizioni, il processo di denaturazione termica non provoca
alcuna variazione conformazionale, in quanto la proteina mantiene il
suo stato foldato anche se sottoposta per diverse ore a temperature
superiori ai 105°C. Questa osservazione sperimentale conferma
l’elevata termostabilità di SsTrxA2.
99
Fig.3.8. Caratterizzazione spettroscopica di SsTrxA2: spettro CD lontano UV.
3.3.10 Denaturazione chimica
Per valutare ulteriormente la stabilità confomazionale di SsTrxA2,
sono stati effettuati esperimenti di denaturazione chimica utilizzando
due diversi agenti denaturanti, GuHCl e urea. In particolare sono
stati registrati gli spettri CD di SsTrxA2 a temperature ambiente per
miscele diverse proteine-agente denaturante (urea e cloruro di
guanidinio) a concentrazione variabile (2-8 M). L’analisi degli spettri
CD ha rivelato che, in presenza dell’ urea, l’enzima conserva la sua
stabilità anche per concentrazioni di agente denaturante superiori a 8
M. In presenza di GuHCl, l’enzima comincia a perdere il suo stato
foldato a per valori di concentrazione di GuHCL superiori a 4 M. Il
dato conferma ulteriormente l’elevata termostabilità dell’enzima che
è infatti in grado di mantenere il suo stato foldato anche in presenza
di concentrazioni discrete di un agente denaturante forte.
L’esperimento sembra dimostrare che la termostabilità dell’enzima,
non sia dovuta alla presenza dei ponti salini come invece è stato
riscontrato nel caso di SsTrxA2. Infatti poiché il numero di ponti salini
190 200 210 220 230 240 250-15
-10
-5
0
5
10
15
20
[ϑ] (
deg
cm2 dm
ol-1)1
0-3
Wavelenght (nm)
100
presenti nella struttura di SsTrxA2 è piuttosto basso si pensa che la
termostabilità sia dovuta ad altri determinanti strutturali.
Fig.3.9. Spettro CD registrato nel lontano UV della proteina nativa trattata con soluzioni
diversamente concentrate di cloruro di guanidinio (GuHCl)
3.3.11 Stabilità termica
Negli ultimi anni gli studi avviati per indagare su quali siano le
caratteristiche della sequenza e i fattori strutturali che determinano
la termostabilità di proteine da organismi termofili ed ipertermofili,
sembrano dimostrare che in taluni casi un aumento della rigidità
conformazionale di queste proteine rispetto alle loro omologhe sia
uno dei tanti sistemi escogitati per l’adattamento alla alte
temperature. In molti casi tale rigidità è dovuta all’assenza di loop
nella zona superficiale della molecola e/o una riduzione della loro
estensione, che conseguentemente ad un aumento dei motivi di
struttura secondaria, conferiscono una maggiore strutturazione. I
risultati ottenuti dagli studi strutturali condotti su SsTrxA2, sembrano
190 200 210 220 230 240 250-15
-10
-5
0
5
10
15
20
[ϑ] (
deg
cm2 dmol-1
)10-3
Wavelenght (nm)
GuHCl 0M GuHCl 5MGuHCl 6MGuHCl 7M
190 200 210 220 230 240 250-15
-10
-5
0
5
10
15
20
190 200 210 220 230 240 250-15
-10
-5
0
5
10
15
20
[ϑ] (
deg
cm2 dmol-1
)10-3
Wavelenght (nm)
GuHCl 0M GuHCl 5MGuHCl 6MGuHCl 7M
101
essere in linea con tale ipotesi, in quanto la ridotta dimensione dei
loops rispetto alle omologhe mesofile si può annoverare come uno
dei fattori che conferiscono l’elevata stabilità. Tale ipotesi sembra
trovare conferma da alcuni studi comparativi effettuati tra SsTrxA2 e
la Tioredossina estratta da un organismo ipertermofilo che vive in
giappone, Sulfolobus tokodaii che presentano un identità di sequenza
pari a circa al 90%. Nella fase terminale del presente progetto
essendo stata pubblicata la struttura cristallografica di un mutante di
StTrx, K53E, (Ming H. et al 2007) sono stati fatti degli studi per
rilevare le differenze e similitudini che le due proteine presentano a
livello strutturale. La determinazione della struttura cristallografica di
StTrxK53E (Val37-Glu154), mostra che l’enzima presenta il solo
tioredoxin domain tipico delle tioredossine , caratterizzato dai motivi
strutturali α/β. Tuttavia l’enzima sembra avere un numero molto
elevato di ponti salini rispetto alle omologhe mesofile, collocati
essenzialmente nella zona superficiale della molecola. In particolare i
ponti salini individuati sono cinque e sembra che entrambi siano
responsabili dell’elevata stabilità dell’enzima. Al contrario nonostante
SsTrxA2 e StTrxK53E abbiano un numero notevole di similitudini a
livello di struttura secondaria e terziaria, alcuni dei ponti salini
identificati in StTrxK53E non sono stati riscontrati in SsTrxA2, oppure
se presenti non mostrano una geometria perfettamente corretta.
Questo dato sembra condurre nuovamente all’ipotesi precedente, gli
enzimi termostabili escogitano diverse strategie per conservare la
loro stabilità, e nel presente esempio sembra emergere che
nonostante le due proteine ipertermofile siano molto simili usano
sistemi differenti per conservare la loro integrità strutturale a
temperature elevate.
3.4 Conclusioni
SsTrxA2 risulta essere un enzima piuttosto interessante non soltanto
per le sue proprietà biochimiche ma anche per le proprietà
102
strutturali. Dai risultati sperimentali presentati nel presente capitolo è
stato confermato che l’enzima è il substrato di SsTrxR(B3) quindi
prende parte al meccanismo redox NADPH-Tioredossina Reduttasi.
SsTrxA2, presenta le caratteristiche di base tipiche della tioredossine
note, è infatti una proteina ubiquitaria a basso peso molecolare di
15517Da, costituita dal tioredoxin domain ed un estensione N-
terminale dotata di una certa flessibilità. Tale dato trova evidenza
sperimentale nel fatto che sono stati ottenuti cristalli adatti per un
analisi cristallografica, soltanto per quanto concerne la forma
tronacata di SsTrxA2 (thioredoxin domain). Evidentemente il
frammento mancante non essendo strutturato, quindi maggiormente
flessibile, interferisce con il processo di formazione di cristalli
ordinati.
Per quanto concerne la struttura quaternaria, a differenza di quanto
riscontrato per le altre tioredossine, SsTrxA2 è un omodimero. Sono
state avanzate diverse ipotesi per spiegare il significato strutturale-
funzionale della dimerizzazione. Ad esempio nella Tioredossina
umana, la dimerizzazione è necessaria per la regolazione della
funzione biologica. Nell’organismo termofilo, Thermus thermophilus,
invece la formazione del dimero è importante per l’attività
enzimatica.
Lo stato dimerico di SsTrxA2 potrebbe avvalorare la recente ipotesi
che il reale substrato di SsTrxR(B3) sia la proteina PDO anziché Trx,
poiché tale conformazione potrebbe rendere difficile l’interazione
TrxR-Trx. Tuttavia i dati biochimici hanno dimostrato che SsTrxR(B3)
riduce SsTrxA2 per cui il dibattito resta ancora aperto.
SsTrxA2 si caratterizza inoltre per la sua elevata termostabilità, infatti
è capace di conservare la propria attività enzimatica anche a
temperature al di sopra dei 90°C. Dal confronto con la struttura di
Trx da Sulfolobus tokodaii, che presenta un’identità di sequenza pari
al 90%, il cui lavoro di cristallizzazione è stato pubblicato nella fase
terminale di questi studi, è emerso che nonostante i due enzimi
presentano un’elevata similitudine a livello di struttura secondaria e
103
terziaria, i determinanti strutturali della termostabilità non sembrano
essere gli stessi.
Infatti in StTrx sono stati individuati 5 ponti salini considerati come i
motivi chiave dell’elevata stabilità dell’enzima. Al contrario la maggior
parte di queste interazioni non sono conservate in SsTrxA2, o se
presenti non si dispongono in una geometria corretta. In base a tale
riscontro sembra quindi che la termostabilità di SsTrxA2 non possa
spiegarsi come dovuta alla presenza dei ponti salini ma piuttosto è
attribuibile ad una maggiore strutturazione, dovuta all’aumento dei
motivi di struttura secondaria, alla riduzione o assenza di alcuni loops
rispetto alle proteine con cui è stata messa a confronto.
104
CAPITOLO 4
DETERMINAZIONE CRISTALLOGRAFICA DI
SsTrxA1
4.1 Introduzione
L’analisi del genoma di S.solfataricus ha rivelato che il sitema redox
NADH-reduttasico di questo organismo è piuttosto complesso. Infatti
successivamente alla caratterizzazione della Tioredossina Reduttasi,
SsTrxR(B3), sono stati espressi altri geni codificani per una seconda
Tioredossina Reduttasi SsTrxR(B2) e due tioredossine SsTrxA2,
SsTrxA1. Entrambi i geni sono stati clonati attraverso un vettore
procariota e successivamente sono state caratterizzate le proteine
purificate. SsTrxR(B2), a differenza di SsTrxR(B3) che presenta due
funzioni, non possiede attività Tioredossina-reduttasica. Sembra
quindi che SsTrxR(B3), al di là dell’apparente ridondanza all’interno
del sistema, abbia due differenti substrati SsTrxA2, SsTrxA1.
I due enzimi, SsTrxA2, SsTrxA1, sono piuttosto differenti, infatti
presentano un’identità di sequenza pari a circa il 40%. Tuttavia si
distinguono non soltanto per le loro proprietà strutturali, ma anche
per quanto concerne la loro attività biologica e termostabilità. Infatti
SsTrxA2 è leggermente più attiva e stabile di SsTrxA1. Nel presente
capitolo verranno presentati i risultati degli studi cristallografici
condotti su SsTrxA1, avviati essenzialmente per capire il ruolo di tale
enzima all’interno del sistema redox di Sulfolous solfataricus, e per
valutare se la proteina abbia escogitato una strategia differente o
105
simile rispetto a SstrxR(B3) e SsTrxA2, per adattarsi all’estreme
temperature.
4.2 Materiali e metodi
4.2.1 Preparazione e purificazione di SsTrxA1
La preparazione della forma ricombinante della Tioredossina, TrxA1,
da S.solfataricus, è piuttosto simile alla procedura utilizzata nel caso
di SsTrxA2. Il vettore di espressione pSsTrx-A1 contenente il gene
codificante per SsTrxA1 è stato utilizzato per trasformare ceppi E.coli
BL21(DE3), successivamente fatti crescere a 37°C in Luria-Bertani
medium. Dopo induzione con isopropil-β-D-tiogalattopiranoside
(IPTG), le cellule sono state fatte crescere per circa tre ore. Le cellule
batteriche sono state raccolte tramite centrifugazione a 3000*g per
15 minuti a 4 °C e risospese in 20 ml di un tampone contenente
20mM Tris-HCl pH 7.8, 5mM MgCl2, 50mM KCl e 1 mM PMSF. La
rottura delle cellule è stata effettuata tramite un sistema di rottura
cellulare meccanica. L'omogenato cellulare é stato centrifugato a
100,00*g per circa due ore ed il sovranatante post-ribosomale
ottenuto é stato sottoposto per 30 min ad un temperatura di 70°C.
Dopo aver allontanato mediante centrifugazione le proteine di E. coli,
denaturate dal trattamento termico, il supernatante è stato dializzato
in un tampone contenenente 25mM Mes/KOH, pH 5.5.
Successivamente il campione è stato caricato su una colonna mono S
a scambio cationico collegata ad un sistema FPLC operante a
temperatura ambiente. L’eluizione è stata condotta mediante un
gradiente di KCl (0-200mM). L’eluizone di SstrxA1 è avvenuta ad una
concentrazione di KCl pari a 60mM. Le frazioni che mostravano la
presenza di un'unica banda elettroforetica, su gel di poliacrilammide
in condizioni denaturanti (SDS-PAGE; Laemmli, 1970), sono state
riunite e concentrante mediante Aquacide II. Dopo essere stato
dializzato in un tampone contenente 20 mM a -20°C. In queste
condizioni l'attività si è mantenuta per diversi mesi. La proteina
106
presentava un peso molecolare di 15kDa, tuttavia effettuando la
purificazione in essenza di PMSF è stata ottenuta la forma troncata di
SsTrxA1, dal peso molecolare di circa 12 kDa, corrispondente al
Thioredoxin domain.
4.2.2 Attività enzimatica di SsTrxA1
Gli esperimenti di determinazione dell’attività enzimatica di SsTrxA1
sono stati condotti presso i laboratori del Dipartimento di Biochimica
e Biotecnologie Mediche di Napoli. L’attività tioredossinica è stata
determinata tramite il metodo di turbidimetrico di riduzione
dell’insulina, utilizzando come donatori di riducenti equivalenti, sia
DTT che il complesso NADH-Tioredossina Reduttasi. La velocità
iniziale della reazione di riduzione è stata dedotta dalla parte lineare
della curva di assorbanza misurata a 650nm nell‘intervallo 0,1-0,4.
4.2.3 Determinazione del potenziale redox di riduzione
Il potenziale redox del sistema Tioredossina-Tioredossina Reduttasi è
stato determinato a 60 °C misurando la variazione del segnale di
assorbanza a 340nm. Per effettuare tale esperimenti 10-36 µM di
SsTrxA1 sono stati miscelati con 50 µM di NADPH portando la
miscela ad un volume finale di 1ml in un tampone contenente 25mM
di MES/KOH e 2mM EDTA, pH 5.5. La reazione è iniziata in seguito
all’aggiunta di 2 µM di SsTrxR-B3. Quando il segnale di assorbanza si
è stabilizzato intorno un valore basso, è stato aggiunto alla miscela di
reazione un eccesso di NADP+ (1200 µM), e la reazione è stata
monitorata fino a quando il segnale di assorbanza ha raggiunto un
livello alto mantenendosi costante a 340nm. Il potenziale di riduzione
è stato calcolato dall’equazione di Nernst a partire dai valori di
concentrazione delle specie ridotte ed ossidate sia della tioredossine
107
che delle specie elettron-donatore. Per la risoluzione dell’equazione è
stato inoltre utilizzato come valore di potenziale di riduzione del
NADP+, quello calcolato a pH 5.5, risultato pari a -271 mV. Il
potenziale di riduzione riportato costituisce il valore medio calcolato
su 3-4 determinazioni e la varianza dei valori misurati in ogni singola
determinazione non ha superato il 4%.
4.2.4 Misura della termofilicità
Un campione contenente 50 µM SsTrxA1 in un tampone costituito da
100mM di fosfato di potassio, 2 mM di EDTA, pH 7.0, è stato
sottoposto a differenti temperature. A intervalli di tempo prestabiliti,
è stata misurata l’attività enzimatica residua utilizzando il metodo di
riduzione dell’insulina in presenza di DTT come specie elettron-
donatore. A partire dall’equazione At/Ao=-kt, è stata calcolata la
costante cinetica alla temperatura di inattivazione termica. Ao
rappresenta l’attività del campione che non ha subito trattamento
termico, At è l’attivtà misurata al tempo t di trattamento termico e k
è la costante cinetica del processo di inattivazione termica. L’energia
di attivazione del processo di inattivazione termica è stata calcolata
dalla curva di Arrhenius ottenuta riportando il logaritmo naturale
della costante cinetica in funzione della temperatura.
4.2.5 Cristallizzazione di SsTrxA1
La trattazione teorica della cristallizzazione di proteine è riportata in
dettaglio nell’Appendice I. Di seguito sono descritte brevemente le
condizioni di cristallizzazione di SsTrxA1 ricombinante ottenuto
attraverso la procedura appena descritta. Gli esperimenti di
cristallizzazione sono stati condotti a 293K usando i metodi di
cristallizzazione del microbath sott’olio e della diffusione in fase
108
vapore, hanging drop. Prove preliminari di cristallizzazione sono state
effettuate utilizzando un KIT reperibile in commercio contenente
soluzioni precipitanti a matrice sparsa (Crystal screen kits I and II,
Hampton Research). Cristalli singoli adatti per una analisi
cristallografica, sono stati ottenuti dalla sola forma troncata di
SsTrxA1, thioredoxin domain, utilizzando un intervallo di
concentrazione di proteina compreso tra 4-9 mg ml-1 e una soluzione
precipitante contenente PEG4000 30% (w/v), 0.2 M (NH4)SO4 (fig.
4.1). In Figura 4.1 è riportata un’immagine dei cristalli ottenuti nelle
condizioni di cristallizzazione sopradescritte.
Fig.4.1. Cristalli di SsTrxA1
4.2.6 Registrazione ed analisi statistica dei dati cristallografici di SsTrxA1
Dati di diffrazione sono stati registrati in house a 298 K, utilizzando
un CCD Saturn 944 collegato ad un generatore di radiazioni CuKα
MicroMax 007HF(RIGAKU) di lunghezza d’onda pari a 1.5418 Å. I
cristalli sono stati congelati aggiugendo alla soluzione tampone di
cristallizzazione glicerolo al 22% (v/v) per evitare processi di
109
decadimento radiattivo. I dati di diffrazione sono stati raccolti a 1.90
Å e processati mediante l’utilizzo del programma HKL2000.
Fig.4.2. Analisi statistica dei dati cristallografici di SsTrxA1.
4.2.7 Affinamento cristallografico di SsTrxA1
La struttura tridimensionale di SsTrxA1 è stata risolta utilizzando il
programma PHASER avvalendosi della struttura di SsTrxA2 come
modello di partenza, che presenta un’identità di sequenza del 40%.
E’ in corso l’affinamento cristallografico.
4.2.8 Determinazione della stabilità di SsTrxA1 mediante la tecnica spettroscopica del Dicroismo
circolare
La concentrazione delle proteine è stata determinata misurando
l’assorbanza a 280 nm, mediante uno spettrofotometro Jasco J-550.
110
Tutte le misure spettroscopiche sono state registrate con uno
spettropolarimetro Jasco J-810 provvisto di un sistema Peltier per il
monitoraggio della temperatura (modello PTC-423-S). Le curve di
denaturazione indotte da urea e da GuHCl, a temperatura costante,
sono state ottenute registrando la variazione del segnale CD a 222
nm a 20°C. La curva di denaturazione termica è stata registrata
misurando la variazione del segnale CD nell’intervallo 40-105°C a
λ=200 nm e a λ=222 nm con una velocità di scansione di 1°C min-1..
4.2.9 Esperimenti di denaturazione chimica
Entrambi i denaturanti urea e guanidinio idrocloruro (GuHCl) sono
stati acquistati come prodotti ultrapuri dalla ditta Sigma: il cloruro di
guanidinio come soluzione acquosa 8 M, mentre l’urea come solido.
Le soluzioni di urea sono state preparate solubilizzando una quantità
nota nella soluzione tampone, dopo aver essiccato il solido per circa
due ore sotto vuoto su P2O5. Le concentrazioni delle soluzioni sono
state determinate attraverso le misure degli indici di rifrazione (Pace
1986). E’ stato necessario preparare le soluzioni di urea al momento
dell’uso a causa dei fenomeni di decomposizione in ammonio e
cianato. Infatti, già dopo una settimana dalla preparazione della
soluzione lo ione cianato è presente in concentrazioni apprezzabili e
può modificare i gruppi amminici della proteina. Per la costruzione di
ogni curva di denaturazione sono state preparate e analizzate diverse
soluzioni con una concentrazione di proteina costante e una
concentrazione crescente di denaturante, compresa tra 0.0 e 9.6 M
di urea o tra 0.0 e 7.0 M di cloruro di guanidinio. In particolare, a 10-
20 µL della soluzione concentrata di proteina sono stati aggiunti
l’agente denaturante, quindi il tampone fosfato fino al volume finale
di 500 µL. Siccome elevate concentrazioni di urea e di cloruro di
guanidinio fanno variare il pH, per ogni singolo campione il pH è
111
stato corretto aggiungendo opportune quantità di soluzioni
concentrate di HCl oppure di NaOH. Inoltre i campioni sono stati
miscelati e incubati per una notte a 4 °C. Un’incubazione più lunga
produce segnali CD e di fluorescenza sovrapponibili.
4.3 Risultati
4.3.1 Proprietà biochimiche di SsTrxA1
La forma intatta di SstrxA1 purificata, come determinato dalla banda
presente su gel SDS, presenta un peso molecolare di circa 15 kDa
(forma full lenght). Esperimenti di purificazione effettuati omettendo
l’aggiunta di PMSF hanno consentito l’ottenimento soltanto della
forma troncata di SstrxA1, caratterizzata dal solo thioredoxin domain.
Questo dato è stato ulteriormente confermato da successivi
esperimenti di spettrometria di massa a cui sono state sottoposte
entrambe le forme ottenute. I risultati di questi esperimenti hanno
dimostrato che la forma intatta di SsTrxA1 presenta una massa
molecolare di 15517 Da, un valore coincidente con quello deducibile
dalla sequenza amminoacidica (15037 Da). Lo spettro di massa
misurato per la forma troncata di SstrxA1 invece presenta tre bande
distinte corrispondenti alle masse di 12421, 12580 e 12607 Da
coincidenti con le masse delle regioni compresa tra i residui Gly23-
Lys132, Lys24-Lys132, Lys25-Lys132. La massa molecolare
determinata attraverso cromatografia a scambio ionico, effettuata
per la forma troncata di SsTrxA1, mediante una colonna Superdex
75, ha invece rivelato un peso molecolare pari a 24 kDa. Il metodo
cromatografico è stato applicato in presenza dell’agente riducente β-
mercaptoetanolo. Questo dato confrontato con quanto rilevato per le
proteine mesofile, che sottoposte allo stesso esperimento,
presentavano un peso molecolare nettamente inferiore, indica che
SsTrxA1 (thioredoxin domain) è un omodimero e il legame covalente
112
tra i due monomeri non è costituito dal ponte disolfuro. L’attività di
SsTrxA1 è stata valutata tramite il metodo nefelometrico valutando la
riduzione di insulina in presenza o del DTT o della Tioredossina
Reduttasi. SstrxA1 è in grado di trasferire elettroni dal DTT
all’insulina determinando la sua riduzione seguita dalla conseguente
precipitazione. Il tempo in cui ha inizio la reazioni dipende
direttamente dal pH. Per una concentrazione di SsTrxA1 pari a 10µM
la riduzione dell’insulina ha inizio a 3.5 min e 7.0 min per valori di pH
pari 7.0 e 5.5. La stessa reazione è stata seguita in presenza di
SsTrxR(B3), e NADPH come elettron donatore. In questo caso
SstrxA1 ha catalizzato la reazione di trasferimento elettronico dal
NADPH all’insulina, ma la velocità d’inizio reazione è risultata più alta
rispetto a quella registrata in presenza del DTT. In presenza di DTT è
stato osservato che il massimo di attività di SstrxA1 si registra a pH
7, mentre in presenza di SsTrxR(B3) e NADPH, la massima efficienza
catalitica si svolge a pH acido, 5.5. Tuttavia benchè l’efficienza
catalitica di SstrxA1 sia inferiore a quella di SstrxA2, l’enzima
presenta una maggiore affinità per il substrato. Gli stessi esperimenti
condotti utilizzando la specie troncata di SstrxA1 (thioredoxin
domain), hanno rivelato che nonostante abbia la stessa attività
reduttasica della forma intatta, presenta un’attività ossidante
leggermente inferiore.
4.3.2 Il potenziale redox di SsTrxA1
Il trasferimento elettronico tra la Tioredossina e la Tioredossina
Reduttasi è un processo altamente reversibile. Tale osservazione
infatti è stata dimostrata aggiungendo alla miscela di reazione,
descritta nella sezione materiali e metodi, un eccesso di NADP+,
successivamente alla completa ossidazione del NADPH catalizzata
dalla Tioredossina Reduttasi SsTrxR(B3) a T=60°e pH 5.5. Con
113
questa procedura è stato possibile calcolare il potenziale di riduzione
dall’equazione di Nernst all’equilibrio. I valori del potenziale di
riduzione determinati per la forma intatta e la forma troncata di
SsTrxA1 sono risultati leggermente diversi, pari rispettivamente a -
149 mV e -160 mM. Ad ogni modo gli esperimenti condotti per
misurare il potenziale di riduzione oltre a dimostrare che il
trasferimento elettronico tra SstrxA1 e SsTrxR(B3) è altamente
reversibile, confermano l’appartenenza di SstrxA1 al sistema NADH-
Tioredossina Reduttasi.
4.3.3 Inattivazione termica di SsTrxA1
L’inattivazione termica di SsTrxA1 è stata valutata misurando l’attività
residua di riduzione dell’insulina mediante DTT, dopo aver esposto la
proteina purificata a diverse temperature. I risultati di tali
esperimenti hanno confermato che SsTrxA1 è un proteina molto
stabile, infatti una perdita significativa dell’attività enzimatica è stata
riscontrata soltanto dopo aver esposto l’enzima a trattamento
termico per diverse ore in un intervallo di temperatura compreso tra
92 e 99°C. E’ stato osservato che SsTrxA1, è leggermente meno
stabile di SsTrxA2, infatti a 92°C la due temperature medie di
inattivazione termica risultano pari a 20.5 h e 56.6 h per SsTrxA1 e
SsTrxA2. Il processo d’inattivazione dal punto di vista cinetico può
essere descritto da un’equazione di primo ordine. Tale risultato ha
consentito l’analisi dei dati attraverso l’utilizzo dell’equazione di
Arrhenius. Dalla retta di Arrhenius è stato infatti possibile
determinare l’energia di attivazione del processo che per SsTrxA1 è
risultata pari a 227 kJ/mol.
114
4.3.4 Determinazione della struttura cristallografica di SsTrxA1
Prove di cristallizzazione preliminari, effettuate su SsTrxA1 utilizzando
kit disponibili in commercio, hanno rivelato che esistono diverse
condizioni chimico-fisiche che determinano la formazione di cristalli di
SsTrxA1. Tuttavia tutti gli esperimenti che hanno mostrato un
apparente successo avevano un elemento in comune: la presenza del
polietilenglicole(PEG) come agente precipitante. Tuttavia in tutti casi
in cui sono stati ottenuti cristalli, sono stati osservati due differenti
fenomeni: in un primo caso la formazione di pochi cristalli singoli di
grosse dimensioni avveniva accanto a precipitati cristallini, in un
secondo caso era presente un solo cristallo singolo all’interno della
goccia contenete la soluzione precipitante. Le prove di
cristallizzazione sono state effettuate su entrambe le forme purificate
di SsTrxA1 ottenute, la forma intatta (full lenght) e la forma troncata
(thioredoxin domain). Tuttavia soltanto i cristalli ottenuti a partire
dalla forma troncata sono risultati quelli adatti per un analisi
cristallografica. I cristalli di SsTrxA1 (thioredoxin domain) si sono
formati da una soluzione contenente 30%(w/v) di PEG4000 e 0.2 M
di NH4SO4. La concentrazione di proteina era nell’intervallo 4-9mg ml-
1. In tre giorni i cristalli hanno raggiunto le dimensioni finali di
0.2×0.15×0.05mm3. i dati diffrazione sono stati raccolti a 1.90 A di
risoluzione utilizzando una sorgente convenzionale di radiazioni X.
Dal calcolo del coefficiente di Matthews è risultato in un caso la
presenza di tre monomeri di SsTrxA1 all’interno dell’unità
asimmetrica (Vm=2.63 Å3 Da-1; il contenuto di solvente pari al
53.2%), nell’altro caso, quattro monomeri (Vm=1.97 Å3 Da-1; il
contenuto di solvente pari al 39.6%). Le stesse condizioni di
cristallizzazioni utilizzando SsTrxA1 (full lenght) hanno determinato la
formazione di pochi cristalli singoli senza però alcun potere
diffrangente. Tale risultato ha avvalorato l’ipotesi che la presenza del
115
frammento N-terminale, che presenta di norma uno stato non
foldato, ha un impatto negativo sul processo di crescita di cristalli
ordinati.
La struttura tridimensionale di SsTrxA1 (forma troncata) è stata
risolta con il metodo della sostituzione molecolare, utilizzando come
modello di partenza la struttura di SsTrxA2. La struttura preliminare
ottenuta mediante l’utilizzo del programma PHASER sembra
confermare che nell’unità asimmetrica vi siano tre monomeri. E’ in
corso L’affinamento cristallografico di SsTrxA1.
4.3.5 Analisi della stabilità termica
La stabilità termica di SsTrxA1 è stata analizzata mediante lo studio
delle variazioni dello spettro CD a λ=200 nm e λ=222 nm
nell’intervallo 40-105°C. Queste due lunghezze d’onda sono scelte
per ottenere informazioni sull’effetto della temperatura sia sulle
regioni ad α-elica ([θ]220) che β-sheet ([θ]200) della proteina. In
queste condizioni, il processo di denaturazione termica non provoca
alcuna variazione conformazionale, in quanto la proteina mantiene il
suo stato foldato anche se sottoposta per diverse ore a temperature
superiori ai 105°C. Questa osservazione sperimentale conferma
l’elevata termostabilità di SsTrxA1.
190 200 210 220 230 240 250
-10
-5
0
5
10
15
20
25
[ ϑ] (
deg
cm2 dm
ol-1)1
0-3
wavelenght (nm)
Fig.4.3. Caratterizzazione spettroscopica di SsTrxA2: spettro CD lontano UV.
116
4.3.6 Denaturazione chimica
Per valutare ulteriormente la stabilità confomazionale di SsTrxA1,
sono stati effettuati esperimenti di denaturazione chimica utilizzando
due diversi agenti denaturanti, GuHCl e urea. In particolare sono
stati registrati gli spettri CD di SsTrxA1 a temperature ambiente per
miscele diverse proteine-agente denaturante (urea e cloruro di
guanidinio) a concentrazione variabile (2-8 M). L’analisi degli spettri
CD ha rivelato che in presenza dell’ urea l’enzima conserva la sua
stabilità anche per concentrazioni di agente denaturante superiori a 8
M. In presenza di GuHCl, l’enzima comincia a perdere il suo stato
foldato a per valori di concentrazione di GuHCL superiori a 4 M. Il
dato conferma ulteriormente l’elevata termostabilità dell’enzima che
è infatti in grado di mantenere il suo stato foldato anche in presenza
di concentrazioni discrete di un agente denaturante forte.
190 200 210 220 230 240 250
-10
-5
0
5
10
15
20
25
[ϑ] (
deg
cm2 dm
ol-1)1
0-3
wavelenght (nm)
0M GuHCl 2M 3M 4M 5M 6M 7M
Fig.4.4. Spettro CD registrato nel lontano UV della proteina nativa trattata con soluzioni
diversamente concentrate di cloruro di guanidinio (GuHCl)
4.4 Conclusioni
Gli studi condotti su SsTrxA1 hanno consentito in via preliminare di
rilevare le differenze e le similitudini che l’enzima presenta nei
117
confronti della sua omologa SsTrxA2. In particolare sia gli studi
biochimici che strutturali hanno dimostrato che i due enzimi anche se
appartengono allo stesso organismo e sono coinvolte nel medesimo
processo redox, presentano proprietà differenti. In particolare gli
esperimenti condotti per valutare le loro caratteristiche biochimiche
hanno rivelato, che i due enzimi hanno due diverse strategie per
raggiungere l’efficienza catalitica. Entrambe le proteine sono in grado
di ridurre l’insulina in presenza del DTT come specie elettron-
donatore. Inoltre gli esperimenti condotti per misurare l’attività
reduttasica usando NADPH/SsTrxR(B3), hanno confermato che sia
SsTrxA1 che SsTrxA2 appartengono al sistema redox NADPH-
Tioredossina Reduttasi. Inoltre per entrambe l’attività catalitica
dipende dal pH, infatti raggiungono il massimo dell’attività a pH 7
quando viene utilizzato il DTT, a pH 5.5 in presenza di
NADPH/SsTrxR(B3). Tuttavia l’ esperimento in presenza di
NADPH/SsTrxR(B3) ha rivelato che mentre SsTrxA1 raggiunge un
elevata efficienza catalitica attraverso una maggiore affinità per il
substrato, SsTrxA2 possiede una velocità di catalisi più elevata.
Ulteriori differenze sono state riscontrate nella determinazione del
potenziale redox. Risulta infatti che SstrxA1 ha un potere ossidante
leggermente inferiore rispetto a SsTrxA2.
Per quanto concerne la stabilità, è stato osservato che entrambe le
proteine sono altamente stabili anche se sottoposte per diverse ore a
temperature superiori ai 90°C. Inoltre anche se mostrano lo stesso
comportamento nel processo di inattivazione termica, ossia
mantengono la loro struttura nativa senza alcuna transizione
conformazionale a seguito di un trattamento termico prolungato,
SsTrxA1 risulta essere leggermente meno stabile di SsTrxA2.
Per quanto concerne la struttura di SsTrxA1, i primi risultati
confermano che nonostante presenta diverse similitudini con SsTrxA2
a livello di struttura secondaria, si differenzia notevolmente. La
stessa ipotesi trova conferma nel diverso comportamento mostrato
dai due enzimi durante i processi di cristallizzazione. La formazione
118
dei cristalli di SsTrxA1 ha richiesto un tempo leggermente più lungo
rispetto a SsTrxA2, e anche se i cristalli erano di dimensioni maggiori
e presentavano una morfologia regolare, spesso si sono dimostrati
inadatti per analisi cristallografiche. Probabilmente l’enzima data la
sua minore stabilità rispetto SstrxA2, più spesso ha incontrato
maggiori difficoltà nel processo di formazione di cristalli ordinati.
Le indagini strutturali attualmente in corso su SsTrxA1 si prefiggono
di ottenere ulteriori chiarimenti sulle proprietà funzionali-strutturali
dell’enzima, ed eventualmente individuare se SsTrxA1 ha escogitato
diverse strategie per l’adattamento alle alte temperature.
119
CAPITOLO 5
CONCLUSIONI E PROSPETTIVE
La caratterizzazione molecolare e strutturale del sistema NADH-
Tioredossina Reduttasi all’interno di S.solfataricus, che costituisce
l’obiettivo del presente progetto, è stata avviata non soltanto per
dare un significato razionale all’apparente ridondanza riscontrata in
tale organismo, ma soprattutto per determinare il ruolo svolto dalle
diverse molecole che partecipano a tale processo.
Nel genoma di S.solfataricus sono state identificate due tioredossine
(SsTrxA1 e SsTrxA2) e in base all’omologia di sequenza tre diverse
Tioredossine Reduttasi SsTrxR(B1), SsTrxR(B2) e SsTrxR(B3).
Inizialmente è stata caratterizzata la Tioredossina Reduttasi,
SsTrxR(B3), della quale in questo lavoro sono stati condotti studi
cristallografici che hanno reso nota la sua struttura tridimensionale.
Gli esperimenti biochimici effettuati sugli enzimi precedentemente
menzionati all’interno di questo paragrafo, hanno consentito di
conoscere il ruolo svolto dai tre enzimi oggetto del presente studio
SsTrxR(B3), SsTRxA1 e SsTrxA2.
Infatti i risultati raggiunti hanno dimostrato che SsTrxA1 e SsTrxA2
sono i reali substrati di SsTrxR(B3).
Al contrario invece ancora non è stata chiarita la funzione biologica di
SsTrxR(B2) che non è in grado di catalizzare il trasferimento
elettronico dal NADPH alla Tioredossina.
Per quanto concerne SsTrxR(B1) sembra che non possa classificarsi
come Tioredossina Reduttasi, poiché pur se presenta un attività
NADH-ossidasi FAD dipendente, non contiene il motivo strutturale
CXXC.
Tutti i cinque enzimi sono stati ottenuti attraverso espressione
eterologa e l’ottenimento di un ammontare appropriato di
120
SsTrxR(B3), SsTRxA1 e SsTrxA2 in forma purificata, ha consentito di
effettuare con successo esperimenti di cristallizzazione.
La determinazione cristallografica della struttura terziaria di
SsTrxR(B3), SsTRxA1 e SsTrxA2 ha permesso di rilevare similitudini e
differenze con proteine omologhe appartenenti ad altre specie, e in
accordo con i risultati ottenuti dagli studi spettroscopici effettuati con
la tecnica del dicroismo circolare, di individuare i determinanti
strutturali che conferiscono l’elevata stabilità alle alte temperature.
La determinazione cristallografica e spettroscopica di SstrxR(B3) ha
mostrato che l’ enzima presenta proprietà specifiche, che attestano
alcune differenze in termini strutturali-funzionali, rispetto alle
proteine omologhe mesofile.
SstrxR(B3) possiede due differenti attività, un attività Tioredossina
Reduttasica e un attività NADH-ossidasica. Tuttavia per quanto
concerne l’attività Tioredossina Reduttasica, l’enzima sembra avere
due diversi substrati Trx, SsTrxA1 e SsTrxA2, e PDO.
La caratterizzazione strutturale di SstrxR(B3) ha mostrato che a
differenza di quanto osservato in struttura note di tioredossine
reduttasi da eucarya-bacteria, la proteina nativa presenta un diverso
modo di legare il cofattore FAD. Infatti l’anello isoallossazinico è
molto più esposto e tale osservazione potrebbe spiegare l’attività
aggiuntiva presentata dall’enzima, ossia la capacità di legare e di
ossidare il NADPH.
La stessa ipotesi trova conferma da ulteriori studi strutturali condotti
su di un mutante di SsTrxR(B3), ottenuto sostituendo il residuo di
cisteina 147, con un residuo di alanina, C147A. Infatti il mutante, che
presenta una larga cavità in prossimità del sito attivo, ha un attività
marginale NADPH-ossidasica. In altre parole una maggiore
esposizione del cofattore FAD, rende disponibile l’anello
isoallossazinico della molecola per altre reazioni.
121
Gli esperimenti di denaturazione condotti sull’enzima hanno poi
rivelato interessanti proprietà che concernono l’elevata stabilità di
SsTrxR(B3).
In particolare la denaturazione dell’enzima in presenza di basse
concentrazioni dell’ agente denaturante, cloruro di guanidinio, GuHCl,
monitorata tramite registrazione di spettri CD a temperatura
ambiente, ha dimostrato che le interazioni elettrostatiche presenti
nella struttura interna, largamente contrastate nelle condizioni
sperimentali sopra descritte, hanno un ruolo fondamentale nei
processi di stabilizzazione termica.
In particolare le analisi strutturali condotte su SsTrxR(B3), hanno
dimostrato la presenza di un certo numero di coppie ioniche
all’interfaccia tra i due domini che caratterizzano la molecola, il
NADPH domain e il FAD domain.
Le interazioni elettrostatiche coinvolgono quattro residui
amminoacidici consecutivi carichi positivamente (Lys124, Arg125,
Arg126, and Lys 127) e altrettanti residui carichi negativamente, che
non sono conservati nella sequenza della Tioredossina Reduttasi da
E.coli.
Le forme ricombinanti purificate di SsTrxA1 e SstrxA2 sono state
ottenute sia in forma intatta (15kDa), che in forma troncata (12kDa);
entrambe le forme presentano una struttura omodimerica sia in
condizioni non denaturanti che in presenza di un agente riducente.
La perdita del frammento N-terminale in SsTrxA1 e SsTrxA2 potrebbe
essere dovuta ad un taglio proteolitico, che avviene piuttosto
velocemente se il processo di purificazione viene effettuato in
assenza degli inibitori di proteasi. Infatti in presenza di tali inibitori la
formazione delle forme troncate richiede tempi molto più lunghi.
Tuttavia non può essere escluso che la regione N-terminale possa
essere un peptide segnale, nonostante non sia stata individuata
omologia di sequenza con la regione canonica localizzata.
122
Riguardo la struttura quaternaria entrambe le proteine SsTrxA1 e
SstrxA2, formano un omodimero, una caratteristica riscontrata in un
numero piuttosto limitato di Trx sia da bacteria che eucarya. Tuttavia
sono state avanzate diverse ipotesi per spiegare il significato della
dimerizzazione. Per esempio nella Tioredossina umana la
dimerizzazione è necessaria affinchè la proteina possa svolgere la
propria funzione biologica. In Thermus thermophilus la formazione
del dimero è importante per l’attività. Infine in Saccharamyces
cerevisiae la forma dimerica della Tioredossina 2 è stata ottenuta a
concentrazioni millimolari utilizzate negli esperimenti di
cristallizzazione.
Così come atteso, SsTrxA1 e SsTrxA2, sono proteine dotate di un
eccezionale termostabilità infatti la loro inattivazione è stata rilevata
soltanto dopo averle esposte a temperature superiori ai 90°C per un
tempo piuttosto lungo.
Il processo di inattivazione termica segue una cinetica del primo
ordine per tutte le diverse temperature a cui sono state sottoposte, è
emerso che SsTrxA2 è leggermente più stabile di SsTrxA1. Questo
dato è stato ulteriormente confermato dall’analisi della energia di
attivazione del processo di inattivazione termica che risulta più bassa
per SsTrxA1 (227 KJ/mol) se confrontata con quella determinata per
SsTrxA2 (292 KJ/mol). Questi valori risultano essere molto simili a
quelli riportati per altri enzimi appartenenti a S.solfataricus.
Le forme purificate di SsTrxA1 e SsTrxA2, sono in grado di ridurre
l’insulina in presenza di DTT che agisce come specie elettron-
donatore. Questi risultati sono in contrasto con quanto riportato in
un lavoro recentemente pubblicato, dove si asserisce che le forme
His-tag di SsTrxA1 e SsTrxA2 non sono attive nel processo di
trasferimento elettronico all’insulina bovina. Per verificare che
SsTrxA1 e SsTrxA2 appartengono al sistema Tioredossina-
Tioredossina Reduttasi, nel metodo di precipitazione dell’insulina, le
due proteine sono state utilizzate come substrato di SsTrxR(B3), in
123
presenza di NADPH, come specie elettron donatore. I risultati
riportati confermano l’ipotesi precedentemente descritta, che è stata
ulteriormente avvalorata del fatto che il massimo dell’attività
reduttasica si osserva a pH 7 in presenza di DTT, a pH 5.5 quando
vengono invece impiegati per la reazione SsTrxR(B3) e NADPH.
Inoltre, in accordo con quanto riscontrato in un lavoro precedente, il
massimo dell’attività NADH-ossidasi di SsTrxR(B3) si svolge a pH
acido. La determinazione del potenziale redox, indica che SsTrxA1 ha
un potere ossidante leggermente superiore a SsTrxA2.
Inoltre gli stessi esperimenti condotti su entrambe le forma troncate,
dimostrano che in tale stato SsTrxA1 e SsTrxA2 hanno potere
ossidante leggermente inferiore rispetto alle forme intatte,
nonostante presentano la stessa attività reduttasica nei confronti del
substrato, l’insulina umana.
In sintesi i dati ottenuti dagli esperimenti per la determinazione del
potenziale di riduzione, indicano che il trasferimento elettronico tra
SsTrxR(B3), SsTrxA1 o SsTrxA2, è altamente reversibile ed è
associabile ad un processo ciclico che conferma il meccanismo alla
base del sistema redox Tioredossina-Tioredossina Reduttasi in
S.solfataricus.
Per quanto concerne le indagini avviate per la comprensione dei
determinati strutturali che determinano l’elevata stabilità dei tre
enzimi, i risultati ottenuti confermano l’ipotesi secondo la quale
ciascun enzima segue un percorso evolutivo differente per preservare
la sua integrità strutturale alle alte temperature.
In particolare confrontando i risultati ottenuti dagli studi strutturali su
SsTrxR(B3) e SsTrxA2, è emerso che le due proteine pur
appartenendo allo stesso organismo, per rispondere alle diverse
esigenze dettate dal loro specifico ruolo biologico, hanno adottato
diverse strategie per resistere alle alte temperature.
124
E’ stato osservato infatti che SsTrxR(B3) deve la sua stabilità ad un
numero elevato di ponti salini rispetto alle omologhe mesofile che si
collocano all’interno della struttura e in particolare all’interfaccia tra i
due domini strutturali, NADH domain e FAD domain.
Infatti è proprio la presenza di interazioni ioniche favorevoli a livello
di interfaccia interdominio che consente alla molecola una maggiore
flessibilità, dato ulteriormente confermato dal maggiore grado di
disordine posseduto dal NADPH domain. Infatti, così come
riscontrato nella TrxR da Ecoli, è proprio la liberta di rotazione di tale
dominio che determina la variazione conformazionale necessaria per
lo svolgimento dell’attività catalitica di tipo redox esplicata
dall’enzima.
In SsTrxA2 al contrario, è stata osservata una notevole rigidità
strutturale. Inoltre anche il confronto tra la forma ossidata e la forma
ridotta di altre Trx a struttura nota, dimostra che nel passaggio da
uno stato all’altro non avviene alcuna variazione conformazionale
significativa.
Il maggiore grado di strutturazione che si traduce in una maggiore
compattezza della struttura quaternaria, dovuto essenzialmente
all’aumentare dell’estensione dei motivi di struttura secondaria ed ad
una diminuzione della dimensione dei loops, rispetto alla proteine
omologhe mesofile, rappresenta un’ulteriore strategia adottata dalle
proteine termofile per resistere alle alte temperature.
Infatti SsTrxA2, essendo una proteine di piccole dimensioni che
facilmente può collocarsi nelle vicinanze della specie di cui è il
substrato e alla luce della funzione biologica a cui deve attendere,
non necessita di alcuna flessibilità a livello strutturale per conseguire
il suo scopo.
L’insieme dei risultati sopra esposti evidenzia la particolarità del
sistema oggetto di questo studio. Tuttavia la sua complessità è
gradualmente crescente in funzione del numero e del tipo di
125
informazioni che nel corso dei vari studi si vanno man mano
acquisendo.
I risultati ottenuti fino a questo momento indicano che
l’individuazione dei ruoli delle diverse molecole implicate nel processo
redox, non può essere frutto di tentativi né tanto meno si può basare
soltanto su una semplice analisi delle omologie di sequenza. È
necessario dunque, per un’approfondita caratterizzazione del
processo, proseguire con la caratterizzazione strutturale delle singole
proteine e dei complessi che queste formano durante i processi di
catalisi.
126
Appendice I
La cristallizzazione
Informazioni sulla struttura di proteine possono essere ottenute
utilizzando diverse metodologie chimico-fisiche. L’NMR, ad esempio,
è comunemente utilizzato per la determinazione della struttura di
proteine a basso peso molecolare (≤ 30-50 kDa), esiste, comunque,
un’unica tecnica, non subordinata alla dimensione delle proteine, che
fornisce una descrizione dettagliata della struttura di una
macromolecola, la cristallografia ai raggi X. Requisito fondamentale
per la sua applicabilità è la necessità di ottenere cristalli proteici di
buona qualità. La cristallizzazione rappresenta, quindi, uno stadio
critico nella determinazione strutturale di una proteina per la
difficoltà intrinseca di ottenere cristalli singoli di dimensioni e
caratteristiche adatte a soddisfare tale scopo. Utili informazioni
possono essere tratte dalle seguenti pagine web:
http://www-structmed.cimr.cam.ac.uk-Course-Crystals-Theory-
phase_methods.html.
A.I.1 I cristalli proteici
In un cristallo di un composto covalente a basso peso molecolare
l’impacchettamento delle molecole è spesso molto elevato, e le
energie reticolari ad esso associato sono dell’ordine di qualche decina
di Kcal/mole. Nel caso dei cristalli proteici il comune concetto di
cristallo deve essere leggermente modificato, nel senso che al suo
interno sono distinguibili due fasi ben definite: una fase proteica,
127
realmente ordinata, e rispondente ai criteri di ordine e periodicità di
un cristallo reale, ed una fase di solvente caratterizzata dal completo
disordine strutturale tipico dei liquidi. A tali cristalli competono
energie reticolari particolarmente basse. La crescita di cristalli di
proteine globulari lascia, infatti, degli interstizi reticolari di notevoli
dimensioni, che rimangono aperti al solvente che circonda il cristallo.
La quantità di solvente può variare dal 25 al 80% (Malkin et al.,
1995, McPherson, 1999). La macromolecola, all’interno di un reticolo
cristallino interagisce con le molecole vicine mediante un
limitatissimo numero d’interazioni deboli, quali legami ad idrogeno,
diretti o mediati da molecole d’acqua, interazioni dipolo-dipolo,
contatti di van der Waals, che interessano i residui esposti alla
superficie della proteina. Pertanto, la maggior parte della superficie è
esposta al solvente. Si viene così a creare un sistema di canali di
solvente che, percorrendo il cristallo nel suo intero volume,
mantengono le molecole in una condizione ambientale non molto
diversa da quella di una proteina in soluzione. Oltre a ciò, i pori pieni
di solvente dei cristalli macromolecolari sono abbastanza ampi da
permettere la diffusione di composti che interagiscono con la
macromolecola: atomi pesanti, analoghi di substrati, coenzimi,
inibitori, ligandi, farmaci ecc. Di conseguenza un cristallo di proteina
può servire per studiare le interazioni con ligandi.
Siccome i cristalli proteici contengono in genere una quantità molto
elevata e variabile di solvente, spesso è difficile valutare il numero di
molecole contenute nell’unità asimmetrica (u.a.). Per questo motivo
è spesso utile ricorrere al calcolo del parametro VM, che rappresenta
il volume della cella per unità di peso molecolare di proteina
(Matthews, 1968). Sperimentalmente Matthews trovò che il VM
assume valori distribuiti nell’intervallo 1.62-3.53 Å3 Da-1, pari ad un
contenuto di solvente compreso tra il 30 ed il 70%. Noto il volume
della cella, il peso molecolare della proteina in esame ed il valore di Z
128
(=prodotto delle molecole contenute nell’u.a. per la molteplicità del
gruppo spaziale), il calcolo di VM è immediato attraverso la relazione:
VM=Vcella/(P.M.xZ)
Da un punto di vista pratico, utilizzando questa formula si varia il
valore di Z in modo da ottenere valori accettabili di VM. Ottenuto il
VM, la frazione di solvente sarà:
Vsolvente(%) = (1-1.23/VM)
La presenza di un alto contenuto di solvente nei cristalli di
proteina assume degli aspetti anche negativi; la presenza di un
elevato contenuto di solvente è la causa della riduzione dell’ordine
cristallino e ciò limita la risoluzione dell’analisi diffrattometrica.
Infatti, il dettaglio con il quale è possibile determinare le posizioni
atomiche è strettamente dipendente dal grado di ordine del cristallo.
A.I.2 Principi generali della cristallizzazione di proteine
Le difficoltà maggiori che s’incontrano per la cristallizzazione di
macromolecole biologiche, derivano dalle loro proprietà dinamiche e
dalla maggiore complessità molecolare delle proteine rispetto alle
molecole più piccole.
Da un punto di vista termodinamico il processo di cristallizzazione
è entropicamente sfavorito, ciò che consente il processo è
l’instaurarsi di nuove interazioni intermolecolari che rende il termine
entalpico positivo. Per i sistemi biologici, che si trovano generalmente
in soluzione acquosa, il minimo dell’energia libera è rappresentato
dalla totale solvatazione; in soluzioni molto concentrate dove vi è una
quantità insufficiente d’acqua per mantenere l’idratazione, le
molecole possono interagire fra loro formando un aggregato amorfo
o possono cristallizzare. Per indurre la cristallizzazione è, dunque,
129
necessario portare il sistema lentamente verso uno stato di minima
solubilità fino a raggiungere un certo grado di soprasaturazione, in
questo modo, nel sistema ci sarà maggiore possibilità d’interazioni fra
molecole vicine. Una soluzione è portata alla soprasaturazione
mediante l’alterazione delle sue proprietà chimico-fisiche: la
temperatura, il pH e la forza ionica. Tale scopo si raggiunge
attraverso l’aggiunta alla soluzione proteica di agenti precipitanti;
quelli comunemente più utilizzati sono il polietilenglicole (PEG), alcuni
alcoli e i sali. La cristallizzazione di proteine è in ogni modo ancora
oggi una metodologia empirica. Non esistono condizioni generali che
favoriscono la crescita dei cristalli, i molti parametri che influenzano
la solubilità delle proteine e le interazioni intermolecolari sono nella
maggior parte dei casi difficilmente quantificabili. Un requisito
essenziale per la cristallizzazione di una proteina consiste nell’avere
un campione di purezza elevata; difatti la presenza di impurezze
spesso impedisce la formazione di cristalli ordinati. Infine, variando le
condizioni come la temperatura, il pH o il solvente può cambiare la
conformazione, la carica o il grado di solvatazione della proteina.
Inoltre, le proteine sono molto sensibili e se esposte a condizioni
particolari possono denaturarsi o degradarsi.
La cristallizzazione richiede tre importanti stadi: i) la nucleazione;
ii) la crescita del cristallo dopo la nucleazione; iii) l’interruzione della
crescita. Riportando la concentrazione di proteina in funzione della
concentrazione di agente precipitante è possibile tracciare la curva di
solubilità per una proteina (Figura A.I.1); al di sopra di questa curva
si estende la zona di sovrasaturazione che si suddivide a sua volta in
due zone, la zona metastabile e la zona labile. A questo punto è
essenziale chiarire il significato del termine nucleo critico. Una volta
raggiunta la soprasaturazione molti nuclei si formano, ma non tutti
sono stabili. Parecchi di essi, infatti, si ridisciolgono così rapidamente
come si formano. Un nucleo critico o stabile è un aggregato che
continua a crescere per formare un cristallo. Nella zona labile, a
130
maggiore soprasaturazione, si formano spontaneamente nuclei critici
che determinano una crescita veloce del cristallo non garantendo in
questo modo la disposizione ordinata auspicabile per un cristallo di
proteina. Al contrario nella zona metastabile, i nuclei critici
consentono la crescita del cristallo in tempi più lunghi e questa è la
condizione che favorisce la formazione di strutture cristalline con
maggiore grado d’ordine (McPherson, 1999).
A.I.3 Tecniche di cristallizzazione
Il processo di cristallizzazione consiste nel creare un sistema in cui
la soluzione proteica risulti sovrasatura e permetta così
l’aggregazione ordinata della proteina con conseguente
cristallizzazione.
Di seguito, sono brevemente descritte le diverse tecniche che sono
state utilizzate in questo lavoro di tesi per indurre la cristallizzazione
di proteine. Il modo più semplice e tradizionale per ottenere la
supersaturazione è la tecnica del microbatch, che prevede il
mescolamento diretto della soluzione proteica e della soluzione
precipitante in provette chiuse ermeticamente. Le gocce di 2-10 µl di
miscela proteina-precipitante della soluzione sono ricoperte da un
olio trasparente che impedisce l’evaporazione del solvente dalla
goccia. Di solito, il punto di saturazione, necessario per indurre la
nucleazione, è determinato osservando la comparsa di una torbidità
in seguito all’aggiunta di una quantità nota di precipitante, il
microbatch può essere, quindi, utile per analizzare la solubilità della
proteina presa in esame.
Figura A.I.1: Tipica curva di solubilità per una proteina.
131
In altri casi le condizioni desiderate sono raggiunte gradualmente,
come ad esempio in tecniche di dialisi o diffusione in fase vapore.
La tecnica che si basa sull’equilibrio mediante diffusione in fase
vapore è attualmente la più utilizzata. In particolare, esistono due
modi per realizzare questa tecnica: l’hanging-drop (goccia sospesa;
figura A.I.2) e la sitting-drop (goccia seduta; figura A.I.3) (Luft and
DeTitta, 1992). Nel primo caso, gocce di 4-10 µl di soluzione di
proteina-precipitante, in concentrazione più bassa di quella
necessaria per la soprasaturazione, sono poste su vetrini che
capovolti chiudono dei serbatoi contenenti le varie soluzioni
precipitanti (~1ml) a concentrazione più alta della goccia, necessaria
per la cristallizzazione. In genere, l’equilibrio si raggiunge per
evaporazione dell’acqua dalla goccia, con conseguente graduale
raggiungimento del punto di soprasaturazione.
Figura A.I.2: Apparato hanging-drop
Nella sitting-drop la goccia è, invece, adagiata su un vetrino posto
all’interno del pozzetto. La diffusione in fase vapore ha il vantaggio di
utilizzare piccole quantità di proteina ed, inoltre, permette di variare
Proteina 2µl + Reservoir 2µl Vetrino & grasso siliconato
132
le condizioni, una volta preparate le prove, modificando la
concentrazione dell’agente precipitante nel serbatoio.
Figura A.I.3: Apparato sitting-drop
Vetrino & grasso siliconato
Proteina 2µl + Reservoir 2µl
133
Appendice II
Registrazione ed analisi dei dati di diffrazione
A.II.1. Strategie per raccolta dati: tecniche di criocongelamento
Il primo passo dell’analisi di diffrazione ai raggi X di cristalli di
proteina è quello di ottenere delle misure d’intensità dallo spettro di
diffrazione. Questi valori devono essere quanto più è possibile
accurati e numerosi, e rappresentano i dati sperimentali sui quali
tutta la successiva analisi è basata.
Le macromolecole biologiche pongono particolari problemi per
quanto riguarda la raccolta di dati di diffrazione. A differenza di
quanto avviene per i composti a basso peso molecolare, nel caso
delle proteine l’intensità media dei raggi diffratti è molto bassa.
Infatti, a causa della flessibilità conformazionale intrinseca delle
macromolecole biologiche e la mancanza di rigidità nei contatti di
reticolo all’interno di struttura cristalline altamente idratate, gli
spostamenti quadratici medi dalle posizioni atomiche di equilibrio (i
fattori termici B) sono usualmente molto alti. Il risultato è di avere
vibrazioni termiche piuttosto elevate, disordine statico tra possibili
conformazioni locali e variazioni statistiche nella struttura all’interno
di differenti celle elementari. Queste proprietà fisiche producono una
rapida diminuzione delle intensità di diffrazione con il crescere di
sin��
Infine, la raccolta deve avvenire il più rapidamente possibile, in modo
da minimizzare gli effetti di decadimento del cristallo causato
134
dall’esposizione ai raggi X. I fotoni della radiazione incidente, urtando
le molecole nel cristallo, producono l’espulsione di elettroni e l’inizio,
quindi, di reazioni chimiche, con conseguente perdita progressiva di
ordine e di diminuzione di risoluzione.
E’ ormai sempre più frequente nella cristallografia ai raggi X su
proteine l’utilizzo della sorgente di radiazione di sincrotrone al posto
di convenzionali generatori ad anodo rotante. L’utilizzo di tale
sorgente ha il vantaggio di ridurre notevolmente i tempi di raccolta,
permettendo di migliorare notevolmente il numero e la qualità dei
dati di diffrazione.
La radiazione di sincrotrone, generata mediante l’accelerazione di
particelle cariche (elettroni o positroni), è caratterizzata da elevata
intensità e brillanza (fotoni emessi per unità di area della sorgente).
L’inserzione di magneti, nel percorso delle particelle cariche, impone
particolari traiettorie che consentono la produzione di radiazioni
molto intense. Infatti, la potenza del fascio prodotto aumenta
sensibilmente al diminuire del raggio di curvatura della traiettoria
indotta dai campi magnetici.
L’inconveniente della radiazione di sincrotrone, che deriva proprio
dalla sua elevata energia, è il notevole incremento dei fenomeni di
decadimento del cristallo, che rende indispensabili le tecniche di
criocongelamento. Tali tecniche prevedono l’utilizzo di N2 gassoso a
temperature dell’ordine dei 100 K. A temperature criogeniche, i
radicali liberi prodotti dalla radiazione incidente, non sono in grado di
diffondere nel cristallo e rimangono, pertanto, confinati nel luogo di
formazione. L’utilizzo della bassa temperatura può, inoltre, migliorare
la risoluzione poiché riduce i moti vibrazionali degli atomi e di
conseguenza il fattore di spostamento atomico B.
Poiché è presente acqua sia all’interno del cristallo di proteina che
nel solvente che lo circonda, è indispensabile prevenire la formazione
di ghiaccio durante la procedura di criocongelamento. La formazione
di cristalli di ghiaccio potrebbe indurre uno stress meccanico che
135
danneggia il cristallo di proteina ed, inoltre, produrrebbe diffrazione,
interferendo con lo spettro derivante dal cristallo proteico. Prima di
essere sottoposto a congelamento, il cristallo deve, quindi, essere
trasferito dalla soluzione stabilizzante (soluzione con una
concentrazione di agente precipitante leggermente superiore a quella
della soluzione madre) ad una soluzione crioprotettiva. I
crioprotettori sono delle sostanze che, a basse temperature, sono
capaci di ridurre la velocità di nucleazione del ghiaccio favorendo la
formazione di una fase vetrosa dell’acqua. Il trasferimento del
cristallo nella soluzione crioprotettiva può però perturbare il delicato
equilibrio di forze esistenti all’interno del cristallo, provocando
l’aumento di disordine o persino la rottura del cristallo. Questo
effetto va minimizzato attraverso l’opportuna scelta dell’agente
crioprotettivo e della sua concentrazione.
A.II.2 Registrazione dei dati di diffrazione: sistema di rivelazione
Nella registrazione di dati di diffrazione di proteine è necessario
disporre di un rivelatore in grado di registrare il maggior numero di
riflessi diffratti. In particolare, la linea di diffrazione utilizzata al
sincrotrone di Grenoble (ESRF) si avvale di un rivelatore CCD
(coupled charge device ), che è un rivelatore a semiconduttore. I
rivelatori a semiconduttore sono essenzialmente camere a
ionizzazione stato-solido dove l’impatto di fotoni produce coppie
elettroni buchi. Il CCD è fatto in modo tale da immagazzinare gli
elettroni prodotti durante l’esposizione in ciascun pixel, e in fase di
lettura gli elettroni sono trasferiti nei pixel adiacenti fino a
raggiungere il bordo del rivelatore dove sono conteggiati. Poiché i
CCD commerciali sono troppo piccoli per le applicazioni in
diffrattometria, si usano degli accoppiatori tra schermo a fosfori e
136
rivelatore CCD con fasci di fibre ottiche che fanno convergere i fasci
di fotoni luminosi sul CCD. Tale sistema consente di raccogliere, con
accuratezza e simultaneamente, un gran numero di riflessi, con bassi
tempi di esposizione dell’ordine di secondi.
La strategia di registrazione dei dati deve prevedere la corretta
valutazione di alcuni parametri per ottimizzare la procedura quali la
distanza cristallo-rivelatore, l’angolo d’oscillazione ∆ϕ, il tempo
d’esposizione. La distanza cristallo-rivelatore, deve essere abbastanza
piccola affinché si possano raccogliere i riflessi alla massima
risoluzione consentita dal potere diffrangente del cristallo e, nello
stesso tempo, abbastanza elevata in modo da evitare la
sovrapposizione dei riflessi spazialmente vicini. L’intervallo angolare
d’oscillazione, ∆ϕ, deve essere grande abbastanza da minimizzare i
tempi di esposizione, ma allo stesso tempo deve essere
sufficientemente limitato da evitare di sovrapposizioni di riflessi sul
rivelatore. Il tempo di esposizione è scelto in modo tale da avere una
discreta accuratezza anche per i riflessi più deboli, ma un tempo
troppo lungo, oltre a generare fenomeni di decadimento del cristallo,
può provocare la saturazione dei riflessi intensi. L’ottimizzazione di
questi parametri richiede la conoscenza della cella elementare e del
gruppo spaziale cui appartiene il cristallo, di conseguenza per
acquisire tali dati è effettuato un test preliminare su poche immagini
di diffrazione.
A.II.3 Elaborazione dei dati di diffrazione
Lo stadio successivo alla raccolta dei dati di diffrazione consiste
nell’elaborazione dei dati raccolti, in modo da ottenere l’indicizzazione
dei picchi, l’integrazione delle intensità dei riflessi e lo scalaggio dei
riflessi. In particolare, la procedura per l’analisi dei dati può essere
suddivisa in tre parti:
137
1. Determinazione dell’orientazione iniziale del cristallo, della
cella elementare e dell’ipotetico gruppo spaziale. L’orientazione del
cristallo è misurata rispetto ad una terna di assi destrogira costituita
da un asse X parellelo al fascio di luce, Z parallelo all’asse di
rotazione del cristallo e Y ortogonale ai primi due. Occorre analizzare
tre immagini di rotazione, e per ognuna di esse il programma crea un
file contenente le coordinate (X,Y) e le intensità di tutti i riflessi.
L’orientazione del cristallo, i parametri di cella ed il gruppo spaziale
sono determinati utilizzando di solito una singola o poche immagini di
diffrazione, per rotazioni pari ad 1°. La scelta del sistema cristallino
ricade su quella a più alta simmetria associata e con indice di
penalità più basso. Tutti i parametri sono, in seguito, affinati per
permettere una più accurata predizione del pattern di diffrazione.
2. Generazione di una lista di riflessi e integrazioni delle loro
intensità. Per ogni riflesso si misura l’intensità attraverso un reticolo
che comprende il riflesso e una porzione di fondo (background). Per
ciascun riflesso si esegue l’integrazione del picco con la relativa
deviazione standard.
3. Una volta integrate le intensità si prosegue allo scalaggio dei dati.
I riflessi equivalenti per simmetria devono essere, infatti, ordinati e
raggruppati, ed in seguito è calcolata una costante di scala per ogni
immagine di rotazione. In questa fase sono, quindi, minimizzate le
differenze sistematiche tra i riflessi equivalenti (misura ripetute o
equivalenti per simmetria) con fattori di scala, tenendo conto per
ciascun riflesso della sua posizione sul rilevatore. Dalle intensità dei
dati sarà possibile ricavare una lista di fattori di struttura |F(h,k,l)|,
soltanto dopo aver anche apportato le correzioni di Lorentz, di
polarizzazione e di assorbimento.
I fattori di scala sono calcolati per ciascuna immagine minimizzando
la funzione:
Φ��Σhiwhi(Ihi - <Ih>/khi)2
138
rispetto a Khi. In questa equazione Ihi è la i-esima misura
dell’intensità del riflesso h; khi è il fattore di scala per quella
osservazione con il relativo fattore di temperatura:
Khi=kiexp(2Bisen2θ/�2)
whi è il peso per ciascuna osservazione:
whi=1/�2(Ihi)
I dati cristallografici sono analizzati valutando la consistenza
interna delle intensità dei riflessi equivalenti. L’accordo interno è
misurato mediante un indice R:
Rmerge=ΣhΣi(|Ihi-<Ih>|)/ΣhΣiIhi
dove <Ih> rappresenta il valore medio calcolato su tutti i riflessi
equivalenti.
Per misurare la qualità dei dati raccolti si calcola la completezza e la
molteplicità. La completezza di un set di dati diffratti ad una data
risoluzione si definisce nel modo seguente:
C=numero di riflessi unici/numero di riflessi teorici
Dove con il termine "unici” si definiscono tutti quei riflessi in grado di
generare l’intero set di dati mediante l’applicazione delle operazioni
di simmetria.
In realtà non sempre è possibile misurare il numero totale di riflessi
unici, quindi la completezza è utile per comprendere se la raccolta
dati sia stata effettuata in modo accurato.
La molteplicità si definisce:
M=numero di riflessi osservati/numero di riflessi unici
La molteplicità indica il numero medio di volte che un riflesso è stato
misurato.
139
Appendice III
Metodi di risoluzione strutturale
A.III.I La Risoluzione della struttura
Le analisi strutturali condotte mediante cristallografia prevedono il
calcolo della densità elettronica delle molecole in esame. In principio,
le densità elettroniche potrebbero essere direttamente ricavate,
mediante l’operazione matematica della trasformata di Fourier, dai
fattori di struttura osservati mediante:
(1) [ ]∑ +++−=
hkl
hklilzkyhxiehklFV
xyz )()(2)(1)( απρ
dove V è il volume della cella elementare, |F(h,k,l)| è il modulo del
fattore di struttura e �(h,k,l) la sua fase. Purtroppo dalla misura
sperimentale delle intensità diffratte di ciascun riflesso con indici h,k,l
è possibile conoscere solo i moduli dei fattori di struttura:
|Fhkl|∝(Ihkl)1/2
Il problema principale per il calcolo dei fattori di struttura consiste
nella difficoltà di determinarne la fase. Esistono, tuttavia, numerose
tecniche che possono consentire di risolvere il “problema della fase”.
Tra le più utilizzate, c’è quella della sostituzione molecolare (MR),
della sostituzione isomorfa multipla (MIR), e della diffrazione
anomala a lunghezza d’onda multipla (MAD). L’MR, di solito, può
offrire delle soluzioni nel momento in cui si dispone di un modello
140
tridimensionale di partenza completo che possieda un’identità di
sequenza ≥40% con la proteina la cui struttura si vuole determinare.
In assenza di informazioni strutturali sulla molecola in esame o nel
caso in cui il MR fallisca, è possibile affrontare il problema della fase
diffondendo nel cristallo atomi pesanti, capaci di influenzare il
diagramma di diffrazione: metodo MIR e/o MAD. Il MIR e il MAD
sono, infatti, noti anche come i metodi de novo.
In quest’appendice sono brevemente riassunti i principi generali dei
metodi di sostituzione molecolare (MR) e di diffrazione anomala a
lunghezza d’onda multipla (MAD), utilizzate per la determinazione
strutturale del fattore di scambio. Per una trattazione più
approfondita e rigorosa si rimanda ai numerosi testi che trattano
l’argomento (Giacovazzo C., Oxford University Press, 2002; Drenth
J., Springer Verlag, 1999). Infine utili informazioni possono essere
tratte dalle seguenti pagine web:
http://www.structumed.cimr.cam.ac.uk/Course/MolRep/molrep.html
http://eagle.mmid.med.ualberta.ca/tutorials/MR/Mr.html
A.III.2 Il metodo della sostituzione molecolare (MR)
Come accennato in precedenza, per poter applicare tecniche di
sostituzione molecolare è necessario disporre di un modello
strutturale sufficientemente simile alla molecola in esame. Diverse
possono essere le fonti di questi modelli di partenza: i) stessa
proteina determinata in un diverso gruppo spaziale, ii) una proteina
omologa, iii) un modello della proteina ottenuto mediante NMR o
mediante tecniche di modellistica molecolare, iv) frammenti o domini
estratti da altre proteine. E’ evidente che le probabilità di successo
della tecnica aumentano all’aumentare della similarità del modello di
partenza e della struttura in esame. Ovviamente i risultati
141
dipenderanno anche dalla qualità dei dati di diffrazione disponibili.
Alquanto difficoltosa può essere l’utilizzazione di modelli derivati
mediante NMR. Le strutture determinate all’NMR sono spesso di
ridotte dimensioni molecolari ed, inoltre, esse vengono determinate
mediante informazioni strutturali a corto raggio, questo può talvolta
provocare significative distorsioni nell’orientazione relativa di regioni
distanti della proteina. Infine, non esiste nelle strutture NMR un
criterio per la valutazione della bontà della struttura locale della
proteina che sia equivalente al fattore di vibrazione termica delle
strutture cristalline.
Una volta scelto il modello esso potrà essere collocato nella cella
elementare della proteina di cui si vuole determinare la struttura e le
coordinate del modello così modificate potranno essere usate per
calcolare un insieme di fasi approssimate che, combinate con i valori
osservati dei fattori di struttura, permettono il calcolo di una densità
elettronica da cui ricavare informazioni per modificare ed aggiustare
il modello stesso.
Più precisamente, supposto che le due molecole siano pressoché
identiche e che differiscano per orientazione e posizione, si tratterà di
determinare le 6 variabili che definiscono la rotazione e la posizione,
che portano i punti equivalenti delle due molecole in coincidenza. La
chiave per trovare una soluzione a questo problema a 6 variabili è
quella di separare le tre variabili della rotazione dalle tre della
traslazione, dividendo la ricerca in due operazioni sostanzialmente
distinte. Se si definiscono i punti equivalenti delle due molecole con i
vettori posizionali x1 e x2 riferiti ad un sistema di assi ortogonali, la
notazione algebrica è
x1=[C] x2 + t
dove [C] è una matrice di rotazione e t è il vettore che definisce la
traslazione.
La determinazione dell’orientazione e della posizione del modello
richiede il calcolo della funzione Patterson mediante trasformata di
Fourier del quadrato del modulo del fattore di struttura:
142
P(x, y, z)=(1/V) Σhkl|Fhkl|2cos[2�(hx+ky+lz)]
Non essendo richiesta per il calcolo della Patterson
alcun’informazione relativa alla fase, essa può essere ottenuta dai
soli dati sperimentali (moduli dei fattori di struttura). Questa funzione
rappresenta l’insieme dei vettori delle distanze fra gli atomi; essa
presenta dei massimi all’estremo di ogni vettore che unisce coppie di
atomi all’interno della cella elementare. In ogni funzione Patterson di
cristalli molecolari si possono distinguere due insiemi di massimi: i
picchi corrispondenti ai vettori intramolecolari (“self vectors”) e i
picchi corrispondenti ai vettori intermolecolari (“cross vectors”).
L’insieme dei “cross vectors” ha una struttura centrata sull’origine
definita dalla struttura molecolare in esame, la sua orientazione
dipende dall’orientazione delle singole molecole nella cella
elementare ed è contenuto entro la massima distanza molecolare
(raggio interno, rint) a partire dall’origine della Patterson. La struttura
dell’insieme dei “cross vectors” e la sua posizione sono dipendenti
dall’orientazione delle molecole e dalle distanze intermolecolari. La
maggior parte di essi cadono al di fuori della sfera di raggio rint. La
funzione Patterson è particolarmente complessa. Infatti, se N è il
numero degli atomi che costituisce la molecola, la Patterson
presenterà N (N-1)+1 picchi. Per questo motivo non può essere
direttamente interpretata.
A.III.2.1 La funzione di rotazione
La funzione Patterson di due molecole molto simili avranno due
insiemi di “self vectors” simili come struttura ma con diversa
orientazione. E’, quindi, possibile definire un sistema di parametri
rotazionali che permettono il confronto fra le due Patterson,
misurando il grado di sovrapposizione dei due insiemi di self vectors,
quando la Patterson del modello è fatta ruotare sistematicamente
sull’altra relativa alla proteina incognita (Rossmann e Blow, 1962). La
143
sovrapposizione è valutata attraverso un’integrazione che definisce la
funzione di rotazione:
R[C]=∫V Pcryst(u) Pmod(Cu)du
dove C è la matrice di rotazione, Pcryst(u) e Pmod(Cu)
rappresentano le Patterson del cristallo e del modello, calcolate
rispettivamente dalle intensità sperimentali dei riflessi e dalle
coordinate del modello posto in una cella cristallina priva di elementi
di simmetria (P1). Questa cella artificiale priva di elementi di
simmetria avrà dimensioni tali da garantire al suo interno solo i
vettori intramolecolari. La Pmod(Cu) viene ruotata rispetto la sua
posizione originaria e l’integrale è esteso a tutto il volume V,
generalmente una sfera centrata sull’origine della Patterson. La
funzione di rotazione, R[C], assumerà dei massimi quando i picchi
delle due Patterson si sovrappongono, in pratica quando i vettori
intramolecolari (nel cristallo e nel modello) sono orientati nello stesso
modo.
E’ importante scegliere i limiti della risoluzione a cui estendere le
funzioni Patterson ed il volume d’integrazione della R[C] in modo da
ottimizzare i risultati. Se le due molecole fossero identiche potrebbe
essere vantaggioso estendere la Patterson alla più alta risoluzione
possibile, in pratica ciò non è mai vero e, quindi, conviene lavorare
con dati raccolti ad una risoluzione non troppo alta (5-8 Å). Conviene
omettere i dati a bassa risoluzione, poiché essi sono fortemente
influenzati dal solvente. La scelta del raggio del volume
d’integrazione è determinata dalla dimensione della molecola, dalla
sua forma e dall’impacchettamento nel cristallo, in quanto occorre
includere lo spazio dei vettori in cui la presenza dei “self vectors” è
alta ed omettere dove è minima, evitando d’includere i “cross
vectors”. Per una molecola globulare in genere è consigliato il 50-
60% del diametro della molecola.
Infine, a causa delle differenze inevitabili tra le sequenze
amminoacidiche del modello e della proteina in esame è utile
omettere nel modello le catene laterali.
144
A.III.2.2 La funzione di traslazione
Una volta che sono stabilite le relazioni rotazionali tra le due
molecole, devono essere trovate le altre tre variabili che ne
determinano la posizione relativa. Il problema non si pone per il
gruppo spaziale P1, nel quale la molecola può essere posizionata in
un punto qualsiasi della cella (origine degli assi arbitraria). Negli altri
gruppi spaziali, quando il modello è traslatao all’interno della cella, le
molecole simmetricamente correlate si muovono di conseguenza e
variano i corrispondenti vettori intermolecolari. Anche nella ricerca
traslazionale si confrontano le funzioni Patterson del modello e della
molecola in esame. In questo caso si utilizzano le informazioni
provenienti dai “cross vectors”, per cui viene usata l’intera funzione
di Patterson. Quando tutte le molecole nella cella, correlate dalle
operazioni di simmetria cristallografica, sono nella corretta posizione,
la mappa Patterson calcolata si sovrapporrà esattamente a quella
osservata (Rossmann and Arnold, 2001). Anche questo procedimento
è svolto per tentativi, esplorando tutte le posizioni della molecola
relativamente agli elementi di simmetria presenti, e definite dal
vettore intermolecolare t.
La funzione di traslazione è molto sensibile all’accuratezza della
ricerca rotazionale. Se gli angoli ottenuti dalla funzione di rotazione
non sono accurati diventa molto difficile trovare una soluzione
consistente. Il successo della ricerca traslazionale può essere
valutato calcolando l’indice di disaccordo cristallografico tra i moduli
dei fattori di struttura calcolati e quelli osservati. Alternativamente, si
può misurare la correlazione tra fattori di struttura osservati Fo e
calcolati Fc, mediante il coefficiente di correlazione:
145
Sono disponibili numerosi programmi per applicare il metodo della
sostituzione molecolare. AMoRe (Automated Molecular Replacement)
è, probabilmente, il programma più comunemente usato, essendo
particolarmente rapido e semplice da utilizzare (Navaza, 1994). Alla
fine dell’applicazione del metodo della sostituzione molecolare si
ottiene un modello di partenza approssimato; da questo è possibile
calcolare un insieme di fasi iniziali, che, combinate con le ampiezze
osservate dei fattori di struttura, permettono il calcolo della densità
elettronica.
A.III.3 La diffrazione anomala a λ multipla (MAD)
La tecnica del MAD sfrutta il fenomeno fisico della dispersione
anomala (scattering anomalo) che accade, quando la soglia di
assorbimento di alcuni atomi del cristallo è vicina alla lunghezza
d’onda incidente (James R. W, 1965). Solitamente gli atomi di cui
sono costituite proteine (H, C, N, O) non assorbono nella regione dei
raggi X (~1 Å). Si possono, in ogni modo, inserire nella proteina
atomi con proprietà di diffusione anomala inserendo, ad esempio,
atomi di selenio al posto di residui di metionina con la selenio-
metionina (Se-Met), mediante tecniche di biologia molecolare.
Empiricamente si ritiene che sia necessario un contenuto minimo nel
cristallo di un residuo ordinato di metionina ogni 150 residui. Inoltre,
anche i metalli di transizione (Fe, Co, Ni, Cu, Zn), intrinseci di molte
metallo-proteine, possono essere sfruttati nella metodologia MAD, se
presentano transizioni elettroniche caratteristiche intorno alla
lunghezza d’onda della radiazione X.
146
In anni recenti due eventi congiunti hanno dato un grande impulso
all’uso della tecnica MAD, rendendola uno strumento di uso corrente
per la determinazione della fase in strutture macromolecolari nuove.
Da un lato le tecniche della biologia molecolare permettono di
clonare ed esprimere proteine che contengono diffusori anomali,
dall’altro, l’uso routinario e generalizzato della radiazione di
sincrotrone permette di scegliere la lunghezza d’onda opportuna per
effettuare le misure.
Una proprietà fondamentale della teoria di diffrazione è la legge di
Friedel, secondo la quale i fattori di struttura delle riflessioni
centrosimmetriche hanno uguale modulo e fase opposta: |F(-h,-k,-
l)|=|F(h,k,l)|. Questa legge non vale nei casi di dispersione anomala,
dove, questi riflessi ora non sono più uguali in intensità, F(-h,-k,-
l)≠F*(h,k,l), e, pertanto, essi sono noti come coppie di Bijovet.
Questo risultato è attribuibile alla perturbazione che subisce la
diffusione della luce in seguito all’assorbimento dell’energia nella
fascia dei raggi X, da un diffusore anomalo. In effetti, il fenomeno
della diffusione anomala può essere spiegato tenendo conto che gli
elettroni sono attratti dai nuclei da forze di richiamo (soprattutto gli
elettroni dei metalli pesanti sono sottoposti ad una forte carica
nucleare) e si comportano come oscillatori con frequenze
caratteristiche per ogni specie atomica. Quando una di queste
frequenze è vicina a quella della radiazione incidente (energia
sufficiente da permettere la transizione elettronica), gli elettroni
entrano in risonanza e lo scattering ne risulta perturbato. Al fattore di
scattering normale (fo) dobbiamo, pertanto, aggiungere due
correzioni: la correzione dispersiva indicata generalmente f'
(correzione reale) e la correzione derivante dall’assorbimento indicata
if’’ (correzione complessa).
F(λ) = fo + f'(λ) + if''(λ)
Entrambe le correzioni, nelle vicinanze delle frequenze critiche,
dipendono fortemente dalla lunghezza d’onda incidente. Spettri di
assorbimento teorici e fattori di scattering anomali possono essere
147
derivati da calcoli quanto-meccanici su atomi isolati, ma i valori non
sono accurati in prossimità della soglia di assorbimento. Pertanto, la
correzione complessa, if’’, è derivata sperimentalmente da uno
spettro di fluorescenza di assorbimento atomico sul cristallo da
analizzare (Figura A.III.1); mentre f' è derivato da f’’ mediante
trasformazione analitica (attraverso la relazione di Kramers-Kroning).
E’ importante notare che è essenziale, nel caso di proteine sostituite
con Se-Met, preservare lo stato di ossidazione dell’atomo di selenio
(ossidazione a selenossidi), poiché eterogeneità introdotte da diversi
stati di ossidazione possono ridurre le componenti caratteristiche del
segnale MAD. A tal scopo è opportuno conservare le seleno-proteine
in soluzioni contenenti agenti riducenti (ditiotreitolo, β-
mercaptoetanolo).
Dall’effetto anomalo si possono ottenere informazioni sulla fase;
pertanto, è importante selezionare opportunamente la lunghezza
d’onda in modo da massimizzare le differenze tra le coppie di Bijvoet.
Questo spiega il motivo per cui si ricorre alle linee di diffrazione del
sincrotrone che permettono di selezionare la lunghezza d’onda della
radiazione desiderata. A differenza del MIR, il MAD offre la possibilità
di ottenere vari set di dati con lo stesso cristallo. Generalmente si
eseguono tre raccolte dati a diverse lunghezze d’onda: λ1,
rappresenta la frequenza di assorbimento, in cui è massima la
differenza misurata tra le coppie di Bijvoet (picco di assorbimento in
cui f’’ ha un valore massimo); λ2, a valori vicini alla frequenza di
assorbimento (punto di flesso della curva relativa ad f’’); ed, infine,
λ3, a valori lontani dall’assorbimento (correzione reale e complessa
trascurabile) (Figura A.III.1). In questo modo si ottengono dati con e
senza il contributo dello scattering anomalo. Comunque, è utile
ricordare che le differenze che vogliamo osservare sono di solito
molto piccole e necessitano di dati molto accurati. Per questo motivo
sono essenziali una gran ridondanza ed un’elevata completezza di
dati di diffrazione.
148
I dati raccolti sono utilizzati per ricavare le posizioni dei diffusori
anomali. In seguito, nota la posizione di quest’ultimi, si risale alle fasi
richieste.
Figura A.III.1: Variazione di f’’ e f' in funzione della lunghezza
d’onda (keV = 12.398/λ in Å) per una proteina contente Se-
metionina alla soglia di assorbimento K. Il massimo di f’’ corrisponde
alla soglia di assorbimento (λ1).
A.III.3.1Trattazione matematica del MAD
La seguente discussione si basa sulla trattazione matematica del
MAD secondo Karle (1980) modificata da Hendrickson per la
determinazione strutturale di proteine (1990). Nella figura A.III.2 è
rappresentato in modo schematico il diagramma dei fattori di
struttura per una generica riflessione h (h=forma abbreviata per
h,k,l) da parte di un cristallo proteico che contiene uno scatteratore
λ2
λ3 λ1
149
anomalo. Il fattore di struttura totale Fh per una generica riflessione
h è dato da:
Fh=FBA + a
dove FBA è il fattore di struttura non anomalo o normale uguale alla
somma FB+FA, in FB cui è il contributo normale al fattore di struttura
da parte degli atomi normali, FA è il contributo non anomalo da parte
degli atomi anomali (cioè ad una lunghezza d’onda lontana dalla
soglia di assorbimento); a rappresenta il contributo degli scatteratori
anomali alla diffusione anomala dipendente dalla lunghezza d’onda,
questo valore è pari a (f'/fo x FA) + (if’’/fo x FA) in cui fo è la
componente normale alla diffusione, mentre f' e f’’ sono le correzioni
reali ed anomale alla diffusione rispettivamente. ΦBA è l’angolo di
fase del vettore FBA, ΦA del vettore FA e Φa del vettore a. ∆Φ= ΦBA +
(180°-ΦA)=180°+ (ΦBA-ΦA). Per la regola dei coseni e trascurando
varie operazioni matematiche si ottiene la relazione finale a tre
incognite:
|Fh|2=|FBA| + p|FA|2 + |FBA| x |FA| x [qcos(ΦBA - ΦA) + rsin(ΦBA -
ΦA)]
in cui p, q, r sono tre grandezze dipendenti dalla lunghezza d’onda e
sono note sperimentalmente dalle curve di diffusione anomala. Le
due incognite |FBA| e |FA| sono indipendenti dalla lunghezza d’onda e
sono uguali per la legge di Friedel tranne che per il segno di (ΦBA-ΦA)
(terza incognita). Pertanto, da un set di tre dati raccolti a tre
lunghezze d’onda è possibile determinare il valore di queste incognite
per ciascun riflesso. Per il calcolo della densità elettronica è, però,
necessario conoscere il valore della fase ΦBA. Questo è ottenuto dopo
aver determinato la posizione degli atomi anomali da un mappa
Patterson con coefficienti |FA|2, dalla quale si ottiene a sua volta il
contribuito alla fase ΦA ed, infine, dalla differenza (ΦBA - ΦA) è
possibile ottenere il valore ΦBA.
150
Figura A.III.2: Rappresentazione schematica nello spazio vettoriale
del fattore di struttura totale (Fh) per una generica riflessione h da
parte di un cristallo contenente un atomo anomalo. Vedere il testo
per la discussione. La figura è adattata dal testo J. Drenth (1999).
Per un generico riflesso h
151
Appendice IV
Affinamento strutturale
A.IV.1 Principi generali dell’affinamento strutturale
Come già detto in precedenza (paragrafo A.III.1), la risoluzione di
una struttura cristallina è basata sul calcolo della densità elettronica
a partire dai fattori di struttura osservati, mediante l’impiego
dell’antitrasformata di Fourier:
[ ]∑ +++−=hkl
hklilzkyhxiehklFV
xyz )()(2)(1)( απρ (1)
Una volta ottenuto il primo modello strutturale, è necessario
conoscere con accuratezza le coordinate degli atomi e i parametri
termici (x, y, z, B). La struttura di partenza, ottenuta mediante i
metodi di risoluzione strutturale (MR, MAD, MIR), contiene, infatti,
degli errori per cui è necessario ricorrere alle procedure
d’affinamento. Per affinamento cristallografico s’intende il processo
iterativo di modifica del modello che permette di minimizzare le
differenze tra i dati di diffrazione sperimentali e quelli calcolati. Il
metodo dei minimi quadrati è utilizzato a questo scopo e consiste
nella ricerca dell’insieme dei parametri {x} che minimizza la funzione
φ:
φ=Σhklwhkl(|Fo(hkl)|-k|Fc (hkl) {x}|)2 (2)
152
dove {x} rappresenta l’insieme delle coordinate atomiche e dei fattori
di spostamento atomico di tutti gli atomi del modello, k è una
costante che mette su scala comune i fattori di struttura, ed il peso
statistico whkl =1/σi2, dove σi è l’errore sulla misura di |Fo(hkl)|.
Il problema principale connesso all’affinamento cristallografico di
macromolecole biologiche è la limitata estensione dei dati di
diffrazione disponibili in rapporto all’elevato numero di parametri da
determinare. A causa della flessibilità delle proteine e dei deboli
contatti tra le molecole presenti all’interno del cristallo, gli
spostamenti quadratici medi delle posizioni atomiche sono
generalmente molto alti. Questo produce una rapida diminuzione
dell’intensità dei riflessi con l’incremento della risoluzione, limitando
così il numero di osservazioni misurabili. La povertà di dati associata
all’alto numero di parametri tipico delle strutture proteiche, costituite
da molti atomi, restringe il grado di sovradeterminazione, ciò
rappresenta un aspetto importante nel processo d’affinamento. Ad
esempio, i parametri da determinare per ogni atomo sono le 3
coordinate di posizione, x,y,z, all’interno della cella e il parametro di
spostamento atomico che, nel caso di un moto isotropo, è descritto
da un solo parametro B; mentre nel caso di un moto anisotropo è
caratterizzato da 6 parametri che individuano l’ellissoide di
vibrazione. Mentre il numero di osservazioni indipendenti per
parametro è tipicamente compreso tra 7 e 10 per piccole molecole
organiche, esso si riduce a circa 2 nel caso di proteine per le quali
siano stati registrati dati intorno a 2 Å di risoluzione. Ciò significa che
la struttura molecolare non può essere determinata dai soli dati di
diffrazione.
Per seguire la bontà di un affinamento cristallografico si tiene conto
dell’indice di disaccordo R:
R-factor=(Σhkl||Fo(hkl)|_k|Fc(hkl)||)/Σhkl|Fo(hkl)|
153
A.IV.2 Affinamento dei minini quadrati con costrizioni e restrizioni
Un modo per migliorare la situazione di sottodeterminazione è di
ridurre il numero di parametri variabili (affinamento tipo constrained)
o d’incrementare il numero di osservazioni indipendenti (affinamento
tipo restrained).
Nel primo caso è assegnata una geometria rigida ad un gruppo di
atomi (ad esempio gli atomi di un anello aromatico), cosicché sono
affinati i soli parametri relativi all’intero gruppo di atomi piuttosto che
i parametri individuali dei singoli atomi. Poiché le lunghezze di
legame e i valori angolari dei residui ammminoacidici sono noti,
questa procedura è applicata nell’affinamento di strutture proteiche
dove, assumendo che il legame peptidico può essere considerato
planare, risulta necessaria per l’affinamento solo la determinazione
dei due angoli diedri ψ e φ.
Questo approccio risolve il problema della sottoderminazione, ma
spesso diviene troppo rigido ed il raggio di convergenza, che è
rappresentato dal massimo spostamento permesso per la correzione
della posizione errata di un atomo, diventa troppo piccolo.
Nell’affinamento di tipo restrained, il numero di osservazioni è
incrementato trattando alcuni parametri stereochimici (distanze di
legame, angoli di legame, angoli diedri, planarità di anelli aromatici,
chiralità, interazioni di non legame) come equazioni osservazionali;
sono, quindi, necessarie conoscenze stereochimiche derivate da studi
su molecole piccole. In questo tipo di affinamento le caratteristiche
stereochimiche non sono fissate a valori specifici, come nel metodo
constrained, ma sono vincolate in intervalli di valori realistici. Insieme
154
al parametro cristallografico, φ, nell’affinamento con restrains, sono,
dunque, minimizzati anche termini del tipo:
ε(x) =Σiwi(gi(ideale) – gi
(modello) (x))2
dove gi(ideale) rappresentano i valori ideali dei paramentri calcolati da
strutture di molecole piccole, gi(modello) sono i valori dei parametri
calcolati a partire dal modello approssimato e wi è il peso applicato a
ciascuna funzione. Il numero totale di equazioni da inserire
nell’affinamento sarà uguale al numero di parametri restrained.
La funzione da minimizzare, non è una funzione lineare dei
parametri, di conseguenza essa viene linearizzata mediante
espansione in serie di Taylor, utilizzando un valore iniziale
approssimato per i parametri. Le equazioni risultanti, possono essere
risolte con uno dei metodi di risoluzione di sistemi di equazioni
lineari, che fanno uso di matrici di coefficienti. Infatti, nel caso delle
macromolecole biologiche le matrici trattate hanno milioni di
elementi, ognuno dei quali è dato dalla somma di migliaia di termini;
per rendere la manipolazione delle matrici meno proibitiva sono
indispensabili delle approssimazioni appropriate, rese possibili dalla
presenza di molti elementi di matrice non diagonali che possono
essere trascurati. Le matrici normali sparse hanno elementi diversi da
zero in blocchi diagonali e conservano elementi non diagonali che
coinvolgono correlazioni dovute a vincoli stereochimici. In questi
ultimi blocchi non diagonali si trascura il contributo dei fattori di
struttura.
Nell’affinamento con restrains è attribuito un peso statistico, wA, che
serve a determinare quale dei due parametri, quello cristallografico,
φ, o quello stereochimico, ε(x), condizionano maggiormente la
procedura (Q=φ+ wAε(x)). Una sovrastima delle restrizioni
geometriche, comporterà, ad esempio, un modello
stereochimicamente perfetto associato ad un elevato R-factor,
mentre una loro sottostima darà origine ad un modello con un buon
fattore R-factor, ma con lunghezze ed angoli di legame irragionevoli.
155
Per l’affinamento della struttura di una proteina il valore di R-factor è
generalmente compreso tra 0.15-0.23. E’ tuttavia possibile
interpretare in modo erroneo la densità elettronica cosicché anche un
modello scorretto può essere affinato con buoni valori dell’indice di
disaccordo. Pertanto sono necessari criteri alternativi per stimare la
qualità di una procedura di affinamento. Tra questi, l’R-free misura
l’accordo tra le ampiezze dei fattori di struttura osservati e quelli
calcolati per un set di riflessi, denominato “test set” che è omesso
dall’affinamento. L’R-free viene calcolato su un set di riflessi, pari a
circa il 5-10% dei riflessi totali, selezionato in maniera casuale. Ci si
attende un andamento correlato dei valori R-factor e R-free cosicché,
se ad un certo punto dell’affinamento il valore di R-free aumenta, ciò
indica un peggioramento delle fasi, anche se nel frattempo il valore
di R-factor diminuisce.
La bontà dell’affinamento cristallografico viene anche valutata
considerando la stereochimica della molecola. A questo scopo, per
verificare che un modello sia corretto è utile misurare la deviazione
standard quadratica media delle lunghezze e degli angoli di legame
rispetto ai valori assunti da tali parametri nelle molecole più piccole.
Affinché il modello sia corretto dal punto di vista conformazionale
bisogna tenere conto del fatto che il legame ammidico deve essere
sostanzialmente planare, e che gli angoli di rotazione interna intorno
ai legami N-Cα e Cα–C’devono assumere i valori consentiti dalle
mappe Ramachandran (Venkatachalam and Ramachandran, 1969).
Va ricordato che, essendo Q una funzione non lineare dei
parametri che vogliamo trovare, l’affinamento iterativo del metodo
con i minimi quadrati converge inevitabilmente a minimi relativi.
Diventano quindi necessari degli interventi manuali in modo da
correggere gli errori che sono più grandi del raggio di convergenza
dell’affinamento. Pertanto si alternano cicli di affinamento con
ispezioni di mappe Fourier, che sono mappe di densità elettronica,
ρ(xyz), calcolate a partire dalle fasi del modello secondo l’equazione
(1).
156
Generalmente si usano mappe Fourier differenza, calcolate in zone
ristrette nel modello utilizzando coefficienti (⏐Fo(hkl)⏐-⏐Fc(hkl)⏐)
oppure (2⏐Fo(hkl)⏐-⏐Fc(hkl)⏐), dove ⏐Fo(hkl)⏐ sono le ampiezze dei
fattori di struttura osservati e ⏐Fc(hkl)⏐ sono le ampiezze dei fattori
di struttura calcolati per un modello da cui è stato omesso il
frammento in considerazione (da cui il nome omit di queste mappe),
evitando in questo modo, il condizionamento degli errori nel modello
in quella zona.
157
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