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1 2 3
9 10 11 12
6
4 85
7
4
5
8
lana pietra cotone lana lana cotone pietra lana pietra cotone pietra cotone
cotone
lana
pietra
FormaGrandezzaDensità
forma
Densità
grandezza
Diversa grandezza Differente sedimentazioneDifferente velocitàdi rotolamento
4 6 7 85
1 3 4 6 7 8 9 10 11 122 5
Juang RH (2004) BCbasics
Basic Principles of Protein Purification
Ammonium sulfate fractionation
Cell OrganelleHomogenization
MacromoleculeNucleic
acid Carbohydrate (Lipid)
Size Charge Polarity Affinity
Small molecule Cell DebrisProtein
Amino acid, Sugar,
Nucleotides, etc
Gel filtration,SDS-PAGE,Ultrafiltration
Ion exchange,Chromatofocusing,
Disc-PAGE,Isoelectric focusing
Reverse phasechromatography,
HIC,Salting-out
Affinitychromatography,Hydroxyapatite
Juang RH (2004) BCbasics
Schema a Blocchi di un Sistema Cromatografico
RIVELATORE
colonna
pompa
Collettore di frazioniSoluzione di eluizione
Scambio ionico: separazione in funzione della carica
Importanza del pI
• -A pH > pI (almeno una unità) la proteina è carica negativamente e si lega a una resina a scambio anionico (SCAMBIO
ANIONICO).
• -A pH < pI (almeno una unità) la proteina è carica positivamente e si lega a una resina a scambio cationico (SCAMBIO CATIONICO).
Eluizione:
-Variazione di pH-Variazione forza ionica-ioni competitivi
Scambiatrice di anioni:
-pH decrescente-forza ionica crescente-anioni competitivi
Scambiatrice di cationi:
-pH crescente-forza ionica crescente-cationi competitivi
Cromatografia di scambio ionico• VANTAGGI
– Per grandi volumi,– Grandi quantità di proteina
(1-5 g proteina per 100 ml),
– Matrice molto robusta,– Condizioni molto flessibili,
possibili molte variazioni.
• SVANTAGGI– Proteine allo stesso pH e
concentrazioni di sali della colonna.
– Ciò può essere scomodo poiché poi occorre passare in dialisi per togliere i sali.
GEL FILTRAZIONE
Gel filtrazione
Una proteina sconosciuta eluisce a 170 mL:
40,000 Da (40KDa)
Cromatografia di affinità
OH
OH
OH
OOHO
OH
OH
OOH
Resina
Braccio spaziatore Ligando
Cromatografia di affinità
• Un ligando ad alta affinità per la proteina è legato alla matrice
• La proteina di interesse si lega al ligando e viene immobilizzata sulla colonna
• Le altre proteine vengono “lavate” via.
• La proteina di interesse viene eluita usando una soluzione di ligando.
Cromatografia di affinità
• VANTAGGI• Alta affinità, costanti
di dissociazione nell’ordine del mM, nM o anche pM.
• Legame tutto o nulla:• Possibili molte
variazioni (affinity tags)
• SVANTAGGI• L’ingombro sterico spesso
abbassa la capacità• Il braccio spaziatore può
avere influenza sul legame• L’eluizione può richiedere un
eluente specifico
Affinity tags• Gli affinity tags sono si ottengono attraverso la preparazione di proteine
ricombinanti. Alla proteina di interesse è legato un tag che presenta affinità con un ligando:
• TAG– GST – MBP– biotina– Poli-His– Proteina A
• LIGANDO– Glutatione – Maltosio– Avidina– Nichel, Zinco– Anticorpi
• Le proteine contenenti affinity tags sono poi isolati per cromatografia di affinità con i ligandi legati alla colonna.
• Le proteine isolate possono poi venire primate degli affinity tag attraverso proteolisi specifica.
Cromatografia di affinità con anticorpi
Matrici attivate per immobilizzare uno specifico ligando
Protocollo generale di purificazione proteine
Obiettivi:
• Cattura– Isolare, concentrare e stabilizzare la proteina bersaglio
• Purificazione intermedia– Eliminare la maggior parte dei contaminanti
• Polishing– Ottenere la massima purezza possibile
CONTROLLO DELLO STATO DI PURIFICAZIONE MEDIANTE ELETTROFORESI
Gas cromatografia(Cromatografia di ripartizione gas-liquido)
Schema a blocchi di un gascromatografo
Esempio – separazione gas-cromatografica di urina di
paziente con elevata aciduria
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