ACIDI NUCLEICI
DNA: molecola depositaria dell’informazione genetica (lettura dell’informazione attraverso un codice a tre cifre)
RNA: molecola che regola l’espressione genica e permette la decifrazione del codice
DNA ed RNA sono entrambi lunghi POLIMERI di unità monomeriche ripetute (NUCLEOTIDI)
Nucleotide: 1) zucchero a 5 atomi di carbonio (pentoso)2) base azotata eterociclica 3) acido ortofosforico
Legame ZUCCHERO-BASE AZOTATA (legame N-glicosidico)Legame ZUCCHERO-ACIDO ORTOFOSFORICO (legame estere)
legame N-glicosidico
legame estere
Esperimenti che portarono alla scoperta del DNA
come molecola depositaria dell’informazione
genetica
Esperimento di Griffith: dimostrazione dell’esistenza del “principio
trasformante
(1928)
Miscela di batteri virulenti uccisi
al calore e non virulenti vivi
Conclusione:
batteri non
patogeni R
sono stati
trasformati in
batteri
virulenti
patogeni da
un “principio
trasformante”
R
S
S
S
R
S
S + R
Esperimento di Avery, MacLeod e MacCarty: dimostrazione che il
“principio trasformante”
è il DNA (1944)
Conclusione:
Il principio trasformante
è il DNA
Esperimento di Hershey e Chase (1952)
Conclusione:
è il DNA del fago
T2 ad infettare le
cellule batteriche
1950-1953 M. Wilkins e R. Franklin: analisi cristallografica mediante diffrazione ai raggi X
1)Forma elicoidale (doppia elica)2)Diametro costante: 2nm (20 A°)3)Periodicità di strutture: 3.4nm (34 A°)
0,34nm (3.4 A°)
1mm = 1000 µm; 1 µm = 1000 nm; 1nm = 10 A°
-due catene polinucleotidicheavvolte a spirale
-doppia elica avvolta in senso destrorso attorno ad un asse longitudinale
-gli scheletri Z-P sono esterni; le basi sono disposte internamente
-le basi sono perpendicolari all’asse longitudinale
-ponti idrogeno legano le basi delle due catene polinucleotidiche che si fronteggiano
-distanza P-asse longitudinale di 10 A° quindi diametro di 20 A°
1953: Watson-Crick (struttura molecola
DNA
- per rispettare il diametro di 20 A: purina-pirimidina(dimensioni di Cocran)
A=TG=C
(introduzione della complementarietà delle basi)
-Le due emieliche sono antiparallele
-la doppia elica compie un giro completo (360°=passo) ogni 10 coppie di basi. Se le coppie di basi sono separate da intervalli di 3,4A allora 3,4x10= passo di 34A (risultati di Franklin e Wilkins)
-le due emieliche sono sfasate di una distanza pari ai 3/8 del passo
solco maggiore 22A
solco minore 12A
-fissata la sequenza e l’orientamento di una emielical’altra risulta automaticamente determinata
(antiparallele e complementari)
(principio di equivalenza di Chargaff)
5’
3’ 5’
3’
22A12A
Forze che stabilizzano la doppia elica
• Ponti a idrogeno
• Interazioni tra le basi impilate
• Neutralizzazione delle cariche negative (fosfati)
grazie a
-controioni (DNA nudo)
-proteine “tipo istoni” (batteri)
-istoni (eucarioti)
Conformazione Z
-ha proprietà antigeniche (anti-DNA Z Ab)
-tratti di DNA Z sono normalmente intercalati nel DNA B
di cromosomi eucariotici
-presente in alcuni tratti di DNA ricco in citosine metilate
-scheletri Z-P con andamento a zig-zag
-doppia elica avvolta in senso sinistrorso
passo 44,6 A
x passo 12 coppie di basi
solco unico lungo l’intera lunghezza
1) Nucleo di rinaturazione: reazione lenta, dipendente
dalla concentrazione delle due emieliche
> concentrazione
> possibilità d’incontro
1) Allacciamento a cerniera: reazione rapida,
indipendente dalla concentrazione delle due
emieliche
Rinaturazione: raffreddamento lento
Denaturazione e raffreddamento rapido
gomitoli statistici: DNA
perlopiù denaturato, solo
pochi appaiamenti
Proprietà chimico-fisiche
Assorbimento a UV 260 nm:
-C=C-C=C-C=C-C= doppi legami coniugati assorbono
la luce ad una determinata λ
Gli elettroni delocalizzati degli anelli aromatici delle
basi azotate sono eccitabili a 260nm
raffredamento a
20C°
Intervallo di fusione del DNA
50% di DNA risulta denaturato
La Tm dipende dalla
sequenza del DNA :
> GC > sarà la Tm
A 260nm il DNA a singola elica, data l’esposizione delle basi
azotate, assorbe una maggiore quantità di luce del DNA a
doppia elica
raffreddamento lento(effetto ipocromico)
rinaturazione
riscaldamento(effetto
ipercromico)
denaturazione
Denaturazione: effetto ipercromico - gli elettroni liberati dalla rottura
del legame idrogeno sono disponibili ad assorbire luce per eccitarsi
RAFFREDDAMENTO RAPIDO e RAFFREDDAMENTO LENTO
raffreddamentorapido
Il DNA è la molecola depositaria delle informazioni
necessarie alla cellula per svolgere tutte le sue funzioni
-ogni informazione si trova contenuta, sotto forma di
sequenza nucleotidica, all’interno di un circoscritto
segmento di DNA denominato gene
- tutte le informazioni contenute nella molecola di DNA
sono, nell’insieme, definite informazione genetica
Genoma
DNA codificante DNA non codificante(DNA spaziatore, strutturale… )
geni
DNA intergenicoSequenze genichecorrelate
Le dimensioni
del genoma
non riflettono
la complessità
degli organismi
Dimensioni del genoma in organismi diversi
1Kb = 1000bp
1 Mb = 1 milione bp
1 Gb = 1miliardo bp
Curve di rinaturazione del DNA genomico di cellule diverse
Sequenze altamente ripetute: rinaturazione rapida (>possibilità d’incontro)Sequenze mediamente ripetute: rinaturazione meno rapidaSequenze a singola copia: rinaturazione lenta
Il DNA di vitello rinaturaper il 40% più velocemente mentre la restante parte rinaturapiù lentamente di quello di E.coli
L’organizzazione del genoma umano (3.200.000.000 basi, bp): solo una porzione composta da 48.000.000 basi forma prodotti
maturi
RNA• Ribonucleotidi• Uracile al posto della Timina• Per lo più a singolo filamentoTipi di RNA:
Messaggero (mRNA)Ribosomiale (rRNA)Transfer (tRNA)sn- RNA sc-RNAsno-RNAmicro-RNA
Il genoma è ricco di sequenze palindromiche (circa 6%)
Sequenze ripetute e invertite
Funzioni di regolazione-sito di riconoscimento per fattori di trascrizione-sito di riconoscimento per endonucleasi-sito di riconoscimento per proteine di inizio duplicazione
doppia elica a struttura lineare
struttura a croce
Nel DNA i palindromi possono dare origine a due
strutture diverse
sequenza più lunga
non simmetrica
GGGCCNNNNNNNNNNNGGCCC
5’ 3’
Molecole a singola elica: struttura a forcina
GGGCCNNNNNNNNNNNGGCCCCCCGGNNNNNNNNNNNCCGGG 5’3’
5’ 3’
DNA
Il DNA palindromicotrascrive una molecola di RNA a struttura in parte complementare
RNA
emi-elicastampo
5’ 3’G CC G
C GG C
G C
Sequenza NNNNNnon complementare
Molecola di RNA organizzata in
-singolo filamento
-tratti a doppia elica (appaiamento basi complementari)
-anse (appaiamento di basi complementari intervallate da non complementari)
Formazione di tratti a doppia elica intramolecolare
U G G C A U G A G G C U U C AmRNA
Diidrouracile
Ansa, braccio e stelo accettore
G G G
C C C3’OH 5’P
tRNA
mRNA
5’
5’
3’
3’
tripletta
TΨC
Appaiamento di basi non complementari che interagiscono
attraverso legami H tra le basi azotate
Interazioni insolite
implicate nella
stabilizzazione del
ripiegamento
terziario del tRNA
Il problema delle dimensioni del DNA (hDNA)
Cellula somatica umana:- nucleo 5µm Ø- DNA lungo 1,70 m, organizzato in 46 cromosomi
- 100 g di DNA
Virus/Batteri/Uomo
T4 : testa= 80x10-9 mDNA= 60x10-6 m
Batteri: 2-5 µmDNA= 1 mm
Cellula umana: nucleo 5 µmDNA= 1.7 m
Procariote
10 µm
1-2 µm
Eucariote
hDNA 1.7m
e.coliDNA 1.6mm
Cellulaprocariotica/eucariotica ~ 1/10
DNA procariotico/eucariotico ~1/1000
5 µm
E’ necessario ridimensionare il DNA cellulare
Domini indipendenti
• Domini indipendenti delimitati da
RNA
• Il DNA dei singoli domini si avvolge
intorno a proteine basiche
“histone like proteins”: HLP1,
HLP2…
Compattamento del DNA in E.coli: anse superavvolte
DNA circolare
Schema dicompattamento
DNAschematizzato
ripiegato
12nm
superavvolto
59
HLP legano il DNA (1,5mm) e lo compattano in cromosoma di dimensioni minori
DNA cellula procariotica: 50 anse superavvolte
Nella cellula eucariotica, il DNA è
stabilizzato e compattato dalle
proteine istoniche
hDNA: 1,7m/5µµµµm
PM (kDa) n. amminoacidi
- 17/28 200/265
-14 121/155
-15 135
-12 102
Identificazione degli ISTONI Albert KOSSEL, 1884
H1
H2A
H2B
H3
H4
Gli istoni sono proteine basiche (+)
dato l’elevato numero di Lys e Arg nelle code
H1 17000-28000 200-265 27% lisina 2% arginina
H2A 13900 129-155 11% lisina 9% arginina
H2B 13800 121-148 16% lisina 6% arginina
H3 15300 135 10% lisina 15% arginina
H4 11300 102 11% lisina 4% arginina
Tipo di istone PM n. aa % lisina % arginina
Dominio globulare con estremità NH2 e COOH sporgenti
N-TermC-Term
H1
H2A
H2B
H3
H4
Lisina e Arginina determinano la carica positiva degli Istoni
Dominio globulare
poco conservato
molto
conservati
Gli istoni, fatta eccezione per l’H1, si associano in un
ottamero
5 classi di Istoni
2 x H2A2 x H2B2 x H32 x H4
ottamero di istoni
NUCLEOSOMA: ottamero di istoni attorno al quale
il DNA si avvolge a doppio giro
L’ottamero di istoni compatta il DNA, le code istoniche
neutralizzano le cariche negative dei fosfati
Eterocromatina:
-Facoltativa
(attivabile trascrizionalmente)
-Costitutiva
(non attivabile trascrizionalmente)
Phosphorylation Kinases Phosphatases Activation/repression
Si può favorire l’accessibilità al
DNA agendo sulle code istoniche
-Chromatin modifications
a general term referring to the different covalent modifications
that can occur on the NH2-terminal ends of histone proteins.
Such modifications occur predominantly on conserved Lys
residues and include the addition of acetyl or methyl groups.
Le modificazioni istoniche cambiano l’interazione del DNA
con gli istoni e quindi l’accessibilità al DNA
-Chromatin modificationsa general term referring to the different covalent modifications that can occur on the NH2-terminal ends of histone proteins. Such modifications occur predominantly on conserved Lys residues and include the addition of acetyl or methyl groups.
-Chromatin remodellinga general term to reflect processes that alter the positioning and spacing of nucleosomes or the interactions between histones and DNA. These events are often performed by multiprotein complexes that use ATP hydrolysis to remodel the nucleosome (chromatin-remodelingcomplexes).
scaffold proteico
che rimane dopo
rimozione degli
istoni: il DNA
rimane attaccato
all’impalcatura
formando un serie
di lunghe anse
SCAFFOLD PROTEICO DI UN CROMOSOMA
Immagine al microscopio elettronico
Struttura di un cromosoma metafasico
secondo il modello dei domini ad ansa o a loops radiali
Scaffold proteine non istoniche (~ 30)
Le microanse
sporgono di 3-4µm
Le anse di DNA hanno
inizio e termine in punti
contigui dell’impalcatura
Le anse sono unite
all’impalcatura da
brevi tratti di
DNA(DNA/strutturale
altamente ripetitivo)
Scaffold proteine non istoniche
(circa 30)
Le anse di DNA hanno
inizio e termine in punti
contigui dell’impalcatura
Le anse sono
unite
all’impalcatura
da brevi tratti di
DNA
(DNA/strutturale
altamente
ripetitivo)
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HLP legano il DNA (1,5mm)
e lo compattano in
cromosoma di dimensioni
minori
Somiglianza del modello dei domini ad ansa
con il modello di compattamento del DNA
dei batteri
Divisione cellulare e cromosoma metafasico
Il compattamento
organizza i
cromosomi in
unità discrete e
separabili
metafase
interfase profase prometafase
anafase telofase
• Il cariotipo umano manca di cromosomi telocentrici
I cromosomi metafasici possono essere classificati in
base alla posizione del centromero
Ogni specie ha un numero tipico di cromosomi
Nell’uomo: 46 cromosomi (23 di origine paterna e 23 di origine materna)
22 coppie di cromosomi omologhi + 2 cromosomi sessuali (XX o XY)
corredo cromosomicoDIPLOIDE
CORREDO CROMOSOMICO
Nell’uomo il
numero diploide
è 46 e il numero
aploide è 23
XX
XY
I due cromosomi sessuali sono molto diversi tra loro per
FORMA, DIMENSIONI e CONTENUTO
X: cromosoma “grande”, contenente molti geni attivi
Y: cromosoma piccolo, contenente pochi geni molti dei quali
legati alla mascolinità
Posizione del centromero e bandeggio
Lunghezzabracci
Identificazione/classificazione dei cromosomi è facilitata
dal bandeggio
Ogni coppia di omologhi è diversa dalle altre per posizione del centromero, forma, dimensioni, e bandeggio
La Diagnosi Prenatale può rivelare anomalie cromosomiche di struttura e di numero e molti difetti genetici
Allestimento preparati cromosomici
Aggiunta di un agente mitogeno
che induce proliferazione cellulare
Aggiunta di colchicina che
inibisce/disgrega il fuso
Blocco delle
cellule in
metafase
Trattamento con soluzione ipotonica che
richiamando acqua all’interno disperde i cromosomi
e rompe le cellule
Rottura delle cellule e fuoriuscita dei cromosomi
Colorazione del preparato
Allineamento dei cromosomi
omologhi
per forma e bandeggio
braccio
centromero
Posizione del centromero, lunghezza dei bracci, pattern di bandeggio aiutano ad identificare i cromosomi (1, 2, 3….), e ad appaiare gli omologhi
IDENTIFICAZIONE e NUMERAZIONEdei cromosomi omologhi
Assetto cromosomico normale ed aneuploidie
Normale assetto
cromosomico diploide
assetto cromosomico
alterato
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