VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA...
Transcript of VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA...
i
VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA
TINGGI PADA PENETAPAN KADAR ZERUMBONE YANG
DIPEROLEH DARI LEMPUYANG WANGI
(Zingiber aromaticum Vahl )
RISQAH MATHAR
N11109284
PROGRAM STUDI FARMASI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS HASANUDDIN
MAKASSAR
2013
ii
VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI
PADA PENETAPAN KADAR ZERUMBONE YANG DIPEROLEH
DARI LEMPUYANG WANGI (Zingiber aromaticum Vahl )
SKRIPSI
Untuk melengkapi tugas-tugas dan memenuhi syarat-syarat untuk mencapai gelar sarjana
RISQAH MATHAR
N11109284
PROGRAM STUDI FARMASI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS HASANUDDIN
MAKASSAR
2013
iii
VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI PADA
PENETAPAN KADAR ZERUMBONE YANG DIPEROLEH DARI
LEMPUYANG WANGI (Zingiber aromaticum Vahl )
RISQAH MATHAR
N111 09 284
Disetujui oleh :
Pembimbing Utama Pembimbing Pertama Drs. H. Syaharuddin Kasim,M.Si,Apt Dra.Christiana Lethe,M.Si,Apt NIP. 19630801 199003 1 001 NIP . 19481002 198203 2 001
Pada tanggal,………..2013
iv
v
PENGESAHAN
VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI PADA
PENETAPAN KADAR ZERUMBONE YANG DIPEROLEH DARI LEMPUYANG
WANGI (Zingiber aromaticum Vahl )
OLEH
RISQAH MATHAR
N111 09 284
Dipetrahankan Dihadapan Panitia Penguji Skripsi
Fakultas Famasi Universitas Hasanuddin
Pada Tanggal,............................2013
Panitia penguji skripsi 1. Ketua : Dr. Hj.Sartini,M.Si., Apt. (...............)
2. Sektretaris : Dra. Rosany Tayeb, M.Si., Apt. (...............)
3. Anggota (Ex off) : Drs. H.Syaharuddin Kasim, M.Si, Apt (...............)
4. Anggota (Ex off) : Dra.Cristiana Lethe, M.Si, Apt (...............)
5. Anggota : Dra.Ermina Pakki, M.Si, Apt (...............) Mengetahui
Dekan Fakultas Farmasi
Universitas Hasanuddin
Prof. Dr. Elly Wahyudin, DEA., Apt NIP. 19560224 198601 2 001
vi
PERNYATAAN
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi ini adalah karya saya sendiri,
tidak terdapat karya yang pernah diajukan untuk memperoleh gelar kesarjanaan di
suatu perguruan tinggi dan sepanjang pengetahuan saya tidak terdapat karya atau
pendapat yang pernah ditulis atau diterbitkan oleh orang lain, kecuali yang secara
tertulis diacu dalam naskah ini dan disebutkan dalam daftar pustaka.
Apabila dikemudian hari terbukti pernyataan saya ini tidak benar, maka skripsi dan
gelar yang diperoleh batal demi hukum.
Makassar, 25 Juli 2013
Penyusun,
Risqah Mathar
vii
UCAPAN TERIMA KASIH
Alhamdulillah segala rasa syukur terpanjat ke hadirat Allah SWT, berkat
Rahmat dan Karunia-Nya yang dilimpahkan berupa kekuatan tenaga dan fikiran,
sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini. Shalawat dan salam penulis
haturkan kepada Nabi Muhammad SAW yang senantiasa menuntun seluruh umat
manusia ke jalan Allah SWT.
Skripsi ini disusun berdasarkan hasil penelitian penulis dengan judul “ Validasi
Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi pada Penetepan Kadar Zerumbon Yang
Diperoleh dari Lempuyang Wangi (Zingiber aromaticum Vahl ) untuk memenuhi
salah satu syarat mencapai gelar Sarjana Sains program studi Farmasi pada Fakultas
Farmasi Universitas Hasanuddin Makassar.
Dalam penyusunan skripsi ini penulis banyak mendapat dukungan dan
bantuan dari berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis ingin menyampaikan terima
kasih yang setulus-tulusnya dan penghargaan yang setinggi-tingginya kepada bapak
Drs. H. Syaharuddin Kasim, M.Si., Apt dan Ibu Dra. Chiristiana Lethe,M.Si.,Apt selaku
pembimbing yang telah memberikan bimbingan, arahan, beserta saran selama
penyusunan skripsi ini.
viii
Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada :
1. Ibu Prof. Dr. Elly Wahyudin, DEA, Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas
Hasanuddin.
2. Ibu Dr. Sartini.M.Si., Apt, Ibu Dra. Rosany Tayeb, M.Si., Apt dan Ibu Dra.Ermina
Pakki,M.Si., Apt selaku tim penguji skripsi yang memberikan saran dan arahannya.
3. Bapak/Ibu Dosen Fakultas Farmasi Universitas Hasanuddin atas segala Ilmu
pengetahuan yang diberikan selama masa perkuliahan.
4. Bapak/Ibu Staf Fakultas Farmasi Universitas Hasanuddin atas segala fasilitas dan
bantuan lainnya selama masa perkuliahan.
5. Ucapan terima kasih dan penghargaan yang tiada terhingga untuk Umi dan Abi
Tersayang serta saudaraku tercinta, terima kasih atas doa restu dan
pengorbanannya selama ini.
6. Teman-teman S1 farmasi, khususnya Nasriah,Soendaria Intan,Ayu Asyhari,Pratiwi
Syarifuddin dan Suhermawan. Jazakillah khoirant katsiran atas bantuan dan
dukungannya..Teman –teman Zerumbon ,Dian Chikita, Faisah, Angela dan Helmi
Nurliani terima kasih atas bantuan dan dukungannya selama ini .
7.Ucapan terima kasih saya kepada Sufrianto Jufri.SKg yang selalu memberikan
bantuan dan doa serta semangat selama ini.Dan kepada Risna Aspianti S.Kom
terima kasih atas bantuannya selama ini.
Akhirnya semoga karya ini dapat bermanfaat bagi pengembangan ilmu pengetahuan.
Amin Allahumma Amin.
Makassar, 25 Juli 2013
Risqah Mathar
ix
ABSTRAK
Telah dilakukan penelitian validasi metode kromatografi cair kinerja tinggi
pada penetapan kadar zerumbon yang diperoleh dari lempuyang wangi (Zingiber
aromaticum Vahl). Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui validitas metode
kromatografi cair kinerja tinggi pada penetapan kadar senyawa zerumbone dari isolat
lempuyang wangi yang dihasilkan dengan melihat parameter validasi yang meliputi;
presisi, limit kuantitasi,keterulangan, linearitas dan limit deteksi.Sistem kromatografi cair
kinerja tinggi terdiri dari kolom Shim-pack ODS C18 250x 4,6 mm menggunakan fase
gerak metanol pro HPLC dengan laju alir 0,6ul/menit dengan suhu 40oC. Berbagai
parameter dianalisis dengan menggunakan panjang gelombang maksimum 259 nm.
Berdasarkan data penelitian dapat disimpulkan bahwa Metode Kromatografi Cair Kinerja
Tinggi dinyatakan valid pada penetapan kadar zerumbon yang diperoleh dari lempuyang
wangi dengan hasil pengujian linearitas dengan konsentrasi 25,50,100,200,300,400,dan
500 dengan nilai r = 0,997.Hasil persisi sebesar 0,7% untuk pembanding dan 2,5% untuk
sampel.LOD dengan nilai 0,1 ug/ml dan LOQ 0,5ug/ml. Hasil pengujian Keterulangan
nilai Koevisien variasi yaitu 1,15% dan 2,53%.
x
ABSTRACT
Validation studies have been conducted high performance liquid chromatography method to assay zerumbon derived from Zingiber aromaticum Vahl. This study aims to determine the validity of the method of high performance liquid chromatography assay zerumbone compound of fragrant ginger isolates generated by looking at the parameter validation which includes; precision, limit of quantitation, repeatability, linearity and limit deteksi.Sistemkromatografi consists of high-performance liquid column Shim-pack 250X 4.6 mm C18 ODS using methanol mobile phase with a flow rate of HPLC pro 0.6 ul / min. Various parameters were analyzed using the maximum wavelength of 259 nm. Based on data from this study concluded that the method of High Performance Liquid Chromatography declared invalid on zerumbon assay obtained from ginger scented with the test results 25,50,100,200,300,400 linearity with concentration, and 500dengan value of 0.997. Results precision of 0.7 and 2.5% for comparator sampel.LOD% to the value of 0.1 ug / ml and LOQ 0.5 ug / ml. Repeatability test results Koevisien value variation is 1.15% and 2.53%.
xi
DAFTAR ISI
halaman
UCAPAN TERIMA KASIH ................................................................. vi
ABSTRAK ......................................................................................... viii
ABSTRACT ....................................................................................... ix
DAFTAR ISI ...................................................................................... x
DAFTAR TABEL ............................................................................... xiii
DAFTAR GAMBAR ........................................................................... xiv
DAFTAR LAMPIRAN ........................................................................ xv
BAB I PENDAHULUAN ..................................................................... 1
BAB II TINJAUAN PUSTAKA ............................................................ 5
II.1 Uraian Tumbuhan ............................................................ ........... 5
II.1.1 Klasifikasi Tumbuhan ................................................................ 5
II.1.2 Morfologi Tumbuhan ..................................................... ........... 5
II.1.3 Khasiat ..................................................................................... 6
II.1.4 Kandungan kimia ............................................................ ......... 6
II.2 Uraian Tentang Zerumbon.............................. ............................. 7
II.2.1 Terpen........................................................................................ 7
II.2.2 Sesqueterpenoid........................................................................ 7
II.2.3 Zerumbon .................................................................................. 8
II.3. Validasi Metode Analisis.............................................................. 8
II.3.1 Parameter Validasi .................................................................... 9
II.3.1.1Linearitas........ ......................................................................... 9
II.3.1.2 Limit Deteksi .......................................................................... 10
II.3.1.3 Limit Kuantifikasi .................................................................... 11
II.3.1.4 Ketelitian ......................................................................... 11
xii
II.3.1.5 Ketepatan................................................................................ 11
II.3.1.6 Selektivitas............................................................................... 12
II.4. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi .................................................. 12
II.4.1 Instrumen Kromatografi Cair Kinerja Tinggi................................ 13
II.4.2 Bagian Kromatografi Cair Kinerja Tinggi..................................... 13
II.4.2.1 Wadah Fase Gerak.................................................................. 13
II.4.2.2 Fase Gerak ............................................................................. 14
II.4.2.3 Pompa Pada Kromatografi Cir Kinerja Tinggi ......................... 15
II.4.2.4 Kolom dan Fase Diam pada KCKT ......................................... 16
II.4.2.5 Detektor KCKT......................................................................... 17
II.4.2.6 Tempat Injeksi Sampel ............................................................ 20
II.4.2.7 Komputer,Integrator,atau Rekorder.......................................... 21
II.4.3 Jenis-jenis KCKT........................................................................ 21
II.4.3.1. Kromatografi Adsorbsi............................................................. 21
II.4.2.2. Kromatografi Partisi................................................................. 22
II.4.2.3 Kromatografi Penukar Ion........................................................ 22
II.4.2.4. Kromatografi Pasangan Ion.................................................... 23
II.4.2.5. Kromatografi Eksklusi Ukuran................................................. 23
II.5.Derivatisasi pada KCKT................................................................. 24
II.6 Densitometri .................................................................................. 24
BAB III PELAKSANAAN PENELITIAN................................................. 25
III.1 Alat dan Bahan ............................................................................. 25
III.2 Metode Kerja ..................................... .......................................... 25
III.2.1 Pemilihan panjang gelombang .................................................. 25
III.3.Uji Validasi..................................................................................... 26
III.3.1 Penyiapan Larutan Baku Zerumbon............................................ 26
III.3.2 Uji Presisi .................................................................................... 26
xiii
III.3.3.Uji Keterulangan ......................................................................... 27
III.3.4 Uji Linearitas ............................................................................... 27
III.3.5 Uji LOQ dan LOD ....................................................................... 27
III.4 Analisis Data ................................................................................ 27
III.5 Pembahasan Hasil ........................................................................ 28
III.6 Pengambilan Kesimpulan .................................................................. 28
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN..................................................... 29
IV.1 Hasil Penelitian .............................................................................. 29
IV.1.1 Pemilihan Panjang Gelombang Maksimum…............................. 29
IV.1.2 Hasil Pengujian Linearitas .......................................................... 29
IV.1.3 Kurva Baku Linearitas................................................................. 30
IV.1.4 Hasil Pegujian Batas Deteksi dan Kuantitas .............................. 30
IV.1.5 Hasil Pengujian Presisi ............................................................... 31
IV.1.6 Hasil Pengujian Keterulangan Sampel ....................................... 31
IV.1.7 Hasil Pengujian Ketrulangan Pembanding ................................ 32
IV.2 Pembahasan.................................................................................. 32
IV.2.1 Pemilihan Panjang Gelombang Maksimum ................................ 33
IV.2.2 Presisi ......................................................................................... 33
IV.2.3 Linearitas .................................................................................... 34
IV.2.4 Batas Deteksi ............................................................................. 34
IV.2.5 Batas Kuantitas .......................................................................... 35
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ..................................................... 36
V.1 Kesimpulan ..................................................................................... 36
V.2 Saran .............................................................................................. 36
DAFTAR PUSTAKA .............................................................................. 37
xiv
DAFTAR TABEL
Tabel halaman
1.Hasil pengujian linearitas pada panjang gelombang max....................................... 29
2.Hasil Pengujian Batas Deteksi dan Batas Kuantitas .............................................. 30
3.Hasil Pengujian Presisi pada konsentrasi terendah dan konsentrasi tertinggi.......... 31
4. Hasil Pengujian Keterulangan Sampel 200 ppm...................................................... 31
5. Hasil Pengujian Keterulangan Pembanding Zerumbon .......................................... 32
xv
DAFTAR GAMBAR
Gambar halaman
1. Gambar stuktur zerumbone ...................................................................... 8
2.Instrumen dasar kromatografi cair kinerja tinggi ... ................................... 13
3.Injektor pada kromatografi cair kinerja tinggi………………........................ 20
4. Gambar panjang gelombang maksimum ................................................. 28
5. Grafik Data linearitas Zerumbon ............................................................... 30
6. Foto Tanaman lempuyang wangi( Zingiber aromaticum Vahl)................... 39
7. Foto Kromatografi Cair Kinerja Tinggi................ ....................................... 39
xvi
DAFTAR LAMPIRAN
halaman
1. Tanaman Lempuyang wangi ...................................................................... 39
2.Instrumen kromatografi cair kinerja tinggi ... .............................................. 39
3. Skema Kerja Penetapan Kadar Zerumbon dalam sampel dan presisi
metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi.........................……….................. 40
4. Pengujian Linearitas, Batas Deteksi dan Batas Kuantitas Metode
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi.................................................................... 41
5. Pengujian Keterulangan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi............. 42
6. Perhitungan LOD dan LOQ.......................................................................... 43
7. Perhitungan Presisi ..................................................................................... 45
8. Perhitungan Keterulangan .......................................................................... 46
9. Kromatogram Linearitas Dari HPLC............................................................. 47
10.Kromatogram Presisi Konsentrasi Terendah Dari HPLC ........................... 48
11. Kromatogram Presisi Konsentrasi Tertinggi Dari HPLC ............................ 49
12. Kromatogram Keterulangan Sampel Isolat Zerumbon HPLC .................. 50
13. Kromatogram Keterulangan Pembanding Zerumbon HPLC ................... 51
1
BAB I
PENDAHULUAN
Tumbuhan merupakan bahan alam yang banyak digunakan
sebagai obat tradisional dan telah digunakan sejak lama oleh masyarakat
Indonesia, bahkan sampai sekarang pengobatan ini terus berkembang
dan mengalami peningkatan baik untuk pemeliharaan kesehatan maupun
pengobatan gangguan kesehatan(1). Sementara ini banyak orang
beranggapan bahwa penggunaan tanaman obat atau obat tradisional
relatif lebih aman dibandingkan obat sintesis. Obat tradisional dan
tanaman obat banyak digunakan masyarakat menengah ke bawah
terutama dalam upaya preventif, promotif dan rehabilitatif. Salah satu
tanaman yang sering digunakan sebagai obat yaitu dari suku
Zingibericeae (lempuyang wangi)(2).
Tanaman lempuyang wangi termasuk familia atau suku
Zingiberaceae (Tampubolon, 1981). Bagian tumbuhan lempuyang wangi
yang digunakan sebagai obat adalah rimpangnya (rhizoma). Rimpang
lempuyang wangi memiliki aroma yang khas yang disebabkan oleh
komponen kimia yang terkandung di dalam minyak atsiri lempuyang
wangi. Senyawa kimia yang mendominasi susunan minyak atsiri pada
rimpang lempuyang wangi adalah limonen, yang merupakan zat aktif
yang menyebabkan lempuyang wangi mengeluarkan bau sedap yang
khas. Secara tradisional rimpang lempuyang wangi digunakan untuk
mengobati sakit perut, sakit kulit, influenza, anemia, malaria, batuk, dan
2
vertigo. Zerumbon yang merupakan senyawa aktif dalam lempuyang
wangi diduga mempunyai khasiat menyembuhkan berbagai penyakit (Indri
Ambarsari et al 2007). Manju dan Nalini (2005) melaporkan bahwa dalam
rimpang lempuyang wangi yang berperan sebagai zat anti kanker adalah
senyawa sesquiterpene zerumbon(3.4).
Zerumbon merupakan suatu seskuirtepenue berbentuk kristal
golongan terpenoida yang terdiri dari tiga satuan isoprena yang memiliki
bobot molekul (BM) 218 m/z, bersifat nonpolar, volatil dan memiliki
karakteristik sitotoksik yang selektif terhadap garis sel kanker dan garis
sel normal, serta sebagai anti inflamasi dan kemoterapi(2).
Zerumbon telah terbukti sangat ampuh sebagai antikanker dan
antitumor, zerumbon menekan aktivasi NF-kappaB dan
NF-kappaB- diatur ekspresi gen yang disebabkan oleh karsinogen, dan
melaporkan bahwa penghambatan ini dapat memberikan molekul dasar
untuk pencegahan dan pengobatan kanker (Takada et al., 2005). Pada
tahun yang sama juga( Huang 2005) mengidentifikasi bahwa zerumbon
menghambat pertumbuhan P-388D sel dan fragmentasi DNA yang
diinduksi dan secara signifikan memperpanjang hidup P-388D (1)-
bantalan CDF(1) pada tikus. Selain itu juga menghambat pertumbuhan
lini sel leukemia manusia (HL-60 sel) dan Kanker usus besar manusia
(HT-29) in vitro (Kirana et al.,2003). Zerumbon bertindak sebagai
kemoterapi dan sangat ampuh melawan kanker usus besar dan kulit
(Tanaka et al., 2001)(5).
3
Untuk mendukung pengembangan sediaan obat tradisional dari
lempuyang wangi, maka diperlukan suatu metode analisis untuk
menentukan zat aktif dalam tanaman tersebut. Menurut Rohman dan
Ibnu (2007), kriteria yang harus dipenuhi suatu metode analisis yang baik
adalah: Peka (sensitive ) artinya metode harus dapat digunakan untuk
menetapkan kadar senyawa dalam konsentrasi yang kecil. Selektif, artinya
untuk penetapan kadar senyawa tertentu, metod e tersebut tidak banyak
terpengaruh oleh adanya senyawa lain. Tepat ( p[recise ) artinya metode
tersebut menghasilkan suatu hasil analisis yang sama atau hampir sama
dalam satu seri pengukuran (penetapan). Teliti ( accurate ) artinya metode
dapat menghasilkan nilai rata-rata ( mean) yang sangat dekat dengan nilai
sebenarnya (true value). Kasar (rugged) artinya ada perubahan komposisi
pelarut atau variasi lingkungan tidak menyebabkan perubahan hasil
analisis. Praktis artinya metode tersebut mudah dikerjakan serta tidak
banyak memerlukan waktu dan biaya(6,7,8).
Menurut International conference of harmonization (ICH) ada
sepuluh parameter validasi yang dapat dilakukan adalah Presisi, Batas
deteksi, Batas kuantitas, Spesifitas, Linearitas, Kisaran (range),
Ketahanan, Kekasaran dan Kesesuaian sistem (6). Salah satu metode
analisis yang banyak untuk digunakan saat ini adalah kromatografi cair
kinerja tinggi. Kromotografi cair kinerja tingkat tinggi (KCKT). Hampir
semua laboratorium analisis kimia memiliki instrumen KCKT. Kegunaan
umum KCKT adalah untuk pemisahan, pemurnian dan penentuan kadar
4
senyawa obat dalam sediaan farmasetika. Lebih lanjut, KCKT juga dapat
digunakan untuk dentifikasi kualitatif senyawa obat dengan mendasarkan
pada parameter waktu retensi senyawa obat standar dan senyawa obat
dalam sampel(7).
Berdasarkan latar belakang yang telah diuraikan diatas, maka
rumusan masalah yang dapat diambil adalah: “apakah metode
kromatografi cair kinerja tinggi valid untuk digunakan pada penetapan
kadar senyawa zerumbone yang diperoleh dari Lempuyang wangi
(Zingiber aromaticum Vahl) memenuhi uji validasi?
Penelitian ini memiliki tujuan untuk mengetahui validitas metode
kromatografi cair kinerja tinggi pada penetapan kadar senyawa
zerumbone dari ekstrak lembuyang wangi yang dihasilkan dengan
melihat parameter validasi yang meliputi; presisi, keterulangan, limit
kuantitasi, lineritas dan limit deteksi.
Hasil penelitian ini diharapkan dapat diperoleh suatu metode yang
valid dan handal sehingga dapat digunakan sebagai acuan dalam proses
analisis senyawa zerumbon dalam sediaan obat.
5
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
II.1 Uraian Bahan
II.1.1Klasifikasi
Regnum : Plantae
Divisi : Spermathophyta
Anak divisi : Angiospermae
Kelas : Monocotyledonae
Bangsa : Zingiberales
Suku : Zingiberaceae
Marga : Zingiber
Jenis : Zingiber aromaticum Vahl .(9)
II.1.2 Morfologi
Habitat tanaman ini yaitu di semak dengan tinggi kurang lebih 75
cm, mempunyai batang yang semu, lunak, merupakan pelepah daun,
bulat, didalam tanah membentuk rimpang, berwarna hijau. Daun tunggal
berseling, bulat telur dengan ujung meruncing, tepi rata pertulangan
menyirip, panjang kurang lebih 20 cm, lebar 9 cm, warna hijau. Bunga
berbentuk tandan terdapat diujung, rangkai panjang kurang lebih 20 cm,
kelopak bergiigi satu, tajuk berbentuk tabung, putik salu berwarna hijau
kemerah-merahan. Buah kotak ,bulat telur,panjang kurang lebih 12 mm,
diameter 8mm, berwarna merah. Bijinya bulat panjang, diameter kurang
lebih 4mm±.Akar serabut , putih kotor(9).
6
II.1.3Khasiat
Rimpang Zingiber aromaticum berkhasiat sebagai obat masuk
angin,obat sakit perut, obat wasir, obat sesak nafas, obat pilek, obat
radang usus,obat kolera, obat malaria, obat syaraf lemah, obat encok dan
obat cacing,penambah darah dan penambah nafsu makan. Untuk obat
rnasuk angin dipakai ± 10 gram rimpang segar Zingiber aromaticum,
dicuci, diparut, peras kemudian disaring. Hasil saringan ditambah 2
sendok makan madu dan 2 gelas air matang panas, diaduk, diminum
sehari dua kali sama banyak pagi dan sore(9).
II.1.4Kandungan kimia
Kandungan zat dalam rimpang lempuyang wangi antara lain adalah
α -kurkumen, bisabolen, zingiberen, kariofilen, seskuifelandren, zerumbon,
limonen, kamfer, zat pedas gingerol, sogaol, zingeron, paradol,
heksahidroksurkumin, dihidrogingerol. Informasi lain menyebutkan bahwa
kandungan zat dalam rimpang lempuyang wangi antara lain adalah
damar, tanin, resin, pati, gula (BPPT, 2005)(2).
Beberapa senyawa kimia penyusun minyak atsiri dari lempuyang
wangi adalah α-curcumine 1,7-bis(4-hydroxy-3-methoxy-phenyl)hepta-1,6-
diene-3,5-dione (C21H20O 6). Bisabolene 2-methyl-6-(4-methyl-1-c yclohex-
3-enyliden e)-hept-2-ene( C15H 24). Zingiberen 5-(1,5-dimethylhex-4-enyl)-
2-methylcyklohexa-1,3-dien (C15H24O) α-kariofilen 2,6,9-humulatrien, -
humulen, humulen ( C15H24). Zerumbone 2,6,9,9-Tetramethylcycloundeca-
2,6,10-trien-1-one (C15H22O) Limonen 1-methyl-4-prop-1-en-2-yl-
7
cyclohexene ( C10H16) b-linalool 3,7-dimethylocta-1,6-dien-3-ol ( C10H 18O
)Camphor 1,7,7-trimethylnorbornan-2-one ( C10H 16O) Gingerol 5-hydroxy-
1-(4-hydroxy-3-meth oxy-cyclohexyl)-decan-3-one( C17H 32O 4).Paradol 1-
(4-hydroxy-3-methoxy-phenyl)decan-3-one C17H 26O 3) (2).
II.2 Uraian Tentang Zerumbone
II.2.1 Terpen
Kata Terpenoid mencakup sejumlah besar senyawa tumbuhan, dan
istilah ini digunakan untuk menunjukkan bahwa secara biosintesis semua
senyawa tumbuhan itu berasal dari senyawa yang sama. Jadi, semua
terpenoid dari molekul Isoprene CH2=C(CH3)-CH=CH2 dan kerangka
karbonnya dibangun oleh penyambungan dua atau lebih satuan C5.
Kemudian senyawa ini dipilah-pilah menjadi beberapa golongan
berdasarkan jumlah satuan yang terdapat dalam senyawa tersebut :
hemiterpene (C5), monoterpena (C10), seskuiterpena (C15), diterpena
(C20), sesterpena (C25) dan triterpena (C30) (10,17)
II.2.2 Sesquiterpenoid
Sesquiterpenoid adalah senyawa C15, biasanya dianggap berasal
dari tiga satuan isoprene. Seperti Monoterpenoid, Sesquiterpenoid
terdapat sebagai komponen minyak atsiri yang tersuling uap, dan
berperan penting dalam memberi aroma kepada buah dan bunga yang
kita kenal (10,17).
II.2.3 Zerumbon
8
Zerumbon merupakan suatu seskuiterpena berbentuk kristal
golongan terpenoida yang terdiri dari tiga satuan isoprena yang memiliki
bobot molekul(BM) 218 m/z,bersifat nonpolar, volatil, memiliki struktur
keton silang terkonjugasi pada sebelas cincin karbon (3).
Zerumbone memiliki rumus molekul C15H22O dengan berat
molekul 218.3345800, serta titik didih 321oC - 322oC. sinonim dari
Zerumbone berdasarkan data IUPAC adalah 2,6,9,9-
tetramethylcycloundeca-2,6,10-trien-1-one(10).
Gambar 1. Struktur Zerumbone (C15H22O).
II.3 Validasi Metode Analisis
Validasi metode analisis merupakan suatu tahapan penting dalam
penjaminan mutu analisis kuantitatif. Validasi metode menurut United
States Pharmacopeia(USP) dilakukan untuk menjamin bahwa metode
analisis bersifat akurat, spesifik, reprodusibel, dan tahan pada kisaran
analit yang akan dianalisis. Selain itu, validasi metode dilakukan jika
terjadi perubahan kondisi antara kondisi analisis dan kondisi pada saat
validasi metode, atau terjadi perubahan metode dari metode standar.
Beberapa manfaat validasi metode analisis adalah untuk mengevaluasi
9
unjuk kerja suatu metode analisis, menjamin prosedur analisis, menjamin
keakuratan dan kedapatulangan hasil prosedur analisis, dan mengurangi
risiko penyimpangan yang mungkin timbul (6,7).
Validasi menurut Harmita merupakan suatu tindakan penilaian
terhadap parameter tertentu berdasarkan percobaan laboratorium untuk
membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk
penggunaannya. Validasi menurut SK Menkes RI
No.43/Menkes/SK/II/1988 tentang cara pembuatan obat yang baik(CPOB)
merupakan suatu tindakan pembuktian dengan cara yang sesuai bahwa
tiap bahan, prosedur, kegiatan, sistem, perlengkapan, atau mekanisme
yang digunakan dalam produksi dan pengawasan akan senantiasa
mencapai hasil yang diinginkan (Depkes RI 2001). Association of South
East Asian Nation Good Manufacturing Practice (ASEAN GMP)
menyatakan bahwa validasi adalah kegiatan membuktikan dengan pasti
bahwa material, proses, prosedur, aktivitas, sistem, peralatan, atau
mekanisme yang digunakan di pabrik akan mencapai hasil yang
diharapkan pada standar yang konsisten (7).
II.3.1 Parameter Validasi
II.3.1.1.Linearitas
Linearitas menunjukkan kemampuan suatu metode analisis untuk
memperoleh hasil pengujian yang sesuai dengan konsentrasi analit dalam
contoh pada kisaran konsentrasi tertentu. Linearitas suatu metode analisis
adalah ukuran yang menunjukkan tingkat kesesuaian atau korelasi antara
10
kadar analit dan respons detektor, dinyatakan sebagai koefisien korelasi
(r). Respons detektor yang digunakan adalah luas area puncak untuk
instrumen Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. Koefisien korelasi didapat
dengan cara menghitung regresi dari persamaan linearnya, sedangkan
perpotongan dengan sumbu y menyatakan ukuran biasnya. Selang
linearitas adalah selang antara konsentrasi tertinggi dan terendah dari
analit yang dapat ditetapkan menggunakan suatu metode dengan tingkat,
ketelitian, kecermatan, dan koefisien korelasi yang telah dilakukan. Nilair
yang dihasilkan lebih besar atau sama dengan 0.9900(8). Secara
matematis, nilai r dapat dihitung dengan menggunakan rumus dengan
r = koefisien korelasi
xi = konsentrasi analit setiap ulangan
x = konsentrasi analit rerata
yi = luas area puncak setiap ulangan
y = luas area puncak rerata
II.3.1.2.Limit Deteksi
Limit deteksi (LD) adalah konsentrasi analit terendah di dalam
suatu contoh yang dapat dideteksi tetapi tidak harus terkuantitasi pada
kondisi percobaan yang ditetapkan. Umumnya nisbah respons antara
analit:derau adalah 3:1. LD dihitung dari rerata kemiringan garis dan
simpangan baku intersep kurva standar yang diperoleh (10,11).
11
II.3.1.3 Limit Kuantifikasi
Limit kuantifikasi adalah konsentrasi analit terendah yang terdapat
dalam contoh yang dapat diukur secara tepat dan teliti. Limit Kuantifikasi
dapat dihitung sebagai konsentrasi analit yang memiliki respons
analit:derau sebesar 10:1. LK dihitung dari rerata kemiringan garis dan
simpangan baku intersep kurva standar yang diperoleh (10,11).
II.3.1.4.Ketelitian
Ketelitian dapat dinyatakan dengan tiga cara, yaitu
kedapatulangan, ketelitian intermediet, dan ketertiruan. Ketelitian adalah
kesamaan hasil dari tiap individu ketika metode tersebut diterapkan
berulang kali pada berbagai pencuplikan suatu contoh homogen.
Ketelitian diukur dengan menghitung simpangan baku relatif (SBR) dari
lima kali pengukuran ulang. Menurut ICH syarat penerimaan parameter
validasi ini, sebagai berikut: sangat teliti (%SBR 1), teliti (%SBR 1-2),
sedang (%SBR 2-5), dan tidak teliti (%SBR 5)(12,20).
II.3.1.5.Ketepatan
Ketepatan suatu prosedur analisis didefinisikan sebagai kedekatan
hasil yang diterima (baik sebagai nilai teoretis maupun dengan nilai
rujukan yang diterima) dengan nilai yang diperoleh dari hasil pengukuran.
Ketepatan adalah kedekatan nilai hasil percobaan yang diperoleh dari
suatu metode terhadap nilai sebenarnya. Ketepatan diukur dengan
menghitung perolehan kembali (PK) menggunakan metode penambahan
12
standar. Nilai PK bergantung pada matriks contoh, prosedur proses
contoh, dan konsentrasi analit (12,13).
II.3.1.6 Selektivitas (Spesifisitas)
Definisi Selektivitas atau spesifisitas suatu metode adalah
kemampuannya yang hanya mengukur zat tertentu saja secara cermat
dan seksama dengan adanya komponen lain yang mungkin ada dalam
matriks sampel. Selektivitas seringkali dapat dinyatakan sebagai derajat
penyimpangan (degree of bias) metode yang dilakukan terhadap sampel
yang mengandung bahan yang ditambahkan berupa cemaran, hasil urai,
senyawa sejenis, senyawa asing lainnya, dan dibandingkan terhadap hasil
analisis sampel yang tidak mengandung bahan lain yang ditambahkan
(13,14).
II.4. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Kromatografi merupakan tehnik dimana analit atau zat-zat tertentu
terpisah perbedaan kecepatan elusi dikarenakan zat-zat ini melewati
suatu kolom kromatografi. KCKT adalah suatu teknik analisis kromatografi
dengan menggunakan tekanan tinggi yang berguna untuk pemisahan ion
atau molekul terlarut dalam suatu larutan. Teknik ini berkembang untuk
mengatasi kelemahan-kelemahan pemisahan pada kromatografi gas,
seperti senyawa yang relatif tidak tahan panas dan senyawa yang tidak
volatil. KCKT berdasarkan kepolaran kolomnya dibagi menjadi dua, yaitu
fase normal dan terbalik. Kromatografi fase normal menggunakan fase
diam lebih polar daripada fase gerak, sedangkan pada kromatografi fase
13
terbalik, fase gerak lebih polar daripada fase diam. Proses pemisahan
campuran komponen terjadi di dalam kolom, yaitu berdasarkan perbedaan
distribusi masing-masing komponen pada fase diam dan fase gerak. Zat
zat yang berinteraksi kuat dengan fase diam akan tertahan lebih lama
dalam kolom, sedangkan yang berinteraksi lemah akan keluar dengan
cepat dari kolom (7,13,14).
II.4.1 Instrumen Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Instrumen Kromatografi Cair Kinerja Tinggi terdiri atas 6 bagian ,
yakni: wadah fase gerak (reservoir), pompa (pump), tempat injeksi sampel
(injector), kolom (column), detektor (detector) dan perekam (recorder)(18).
Gambar 2. Instrumen dasar kromatografi cair kinerja tinggi
II.4.2 Bagian –bagian Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
II.4.2.1.Wadah Fase Gerak
Wadah fase gerak merupakan wadah untuk menampung fase
gerak yang digunakan selama proses pemisahan dengan KCKT. Wadah
14
ini harus inert atau lembam dan bersih atau tidak bereaksi dengan
komponen fase gerak. Sebagai wadah fase gerak , dapat digunakan
wadah pelarut kosong ataupun labu laboratorium. Wadah ini biasanya
menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter(7,13).
Fase gerak sebelum digunakan harus dilakukan degassing atau
penghilangan gas yang ada pada fase gerak, sebab akan mengacaukan
analisis. Adanya pengotor dalam reagen dapat menyebabkan gangguan
pada sistem kromatografi. Adanya partikel kecil dapat terkumpul dalam
kolom atau dalam tabung yang sempit, sehingga dapat mengakibatkan
suatu kekosongan pada kolom. Karena itu fase gerak sebelum digunakan
harus disaring terlebih dahulu (7).
II.4.2.2.Fase Gerak
Fase gerak atau biasanya disebut eluen terdiri atas satu atau
campuran pelarut bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam
daya elusi dan resolusi. Fase gerak harus berinteraksi dengan fase diam
yang sesuai untuk memisahkan campuran senyawa obat secepat dan
seefisien mungkin. ktiteria pemilihan fase gerak didasarkan pada:
a.Viskositas;pelarut dengan viskositas rendah menghasilkan tekanan
yang lebih rendah dibandingkan pelarut dengan viskositas tinggi pada
kecepatan alir tertentu. Viskositas rendah juga memungkinkan
kromatografi yang lebih cepat karena perpindahan massa berlangsung
lebih cepat.
15
b.Transparansi terhadap UV ;jika detektor UV yang digunankan ,maka
fase gerak harus transparan secara sempurna pada panjang
gelombang yang digunakan.
c.Indeks bias ;hal ini hanya penting jika detektor indeks bias yang
digunakan. Perbedaan indekls bias antara pelarut dengan sampel harus
besar jika kita bekerja dengan batas-batas deteksi tertentu.
d.Titik didih;titik didih fase gerak yang rendah diperlukan jika eluat akan
dilakukan pemrosesan lebih lanjut supaya memudahkan dalam
penguapannya.
e.Kemurnian ;kriteria ini mempunyai makna yang berbeda tergantung
pada penggunaan yang diinginkan ,yakni tidak adanya senyawa yang
mengganggu pada bentuk deteksi yang digunakan ,tidak adanya
senyawa yang menggganggu elusi gradien.
f.Lembam (inert) terkait dengan sennyawa sampel ;fase gerak harus tidak
bereaksi sama sekali dengan campuran sampel .
g.Toksisitas;seorang analis harus menghindari penggunaan produk yang
toksik semaksimal mungkin. Pelarut-pelarut terklorinasi dapat
melepaskan gas fosgen yang sangat toksik.
h.Harga
II.4.2.3.Pompa pada Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Pompa yang cocok digunakan pada KCKT adalah pompa yang
mempunyai syarat sebagai syarat wadah pelarut yakni pompa harus inert
terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah
16
gelas,baja tahan karat, teflon dan batu nilam. Pompa yang digunakan
sebaiknya sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 500psi dan
mampu mengalirkan fese gerak dengan kecepatan alir 3 ml/menit . Untuk
tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase
gerak dengan kecepatan 20 ml/ menit(15).
Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak
adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung
secara tepat, reprodusibel, konstan dan bebas dari gangguan. Ada dua
jenis pompa pada kckt yaitu pompa dengan tekanan konstan , dan pompa
dengan aliranfase gerak yang konstan. Tipe pompa dengan aliran fase
gerak yang konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan tipe pompa
dengan tekanan konstan (7,13,16).
II.4.2.4.Kolom dan Fase Diam pada KCKT
Ada 2 jenis kolom pada KCKT yaitu kolom konvensional dan kolom
mikrobor. Kolom mikrobor mempunyai tiga keuntungan yang utama
dibanding dengan kolom konvensional ,yakni:
a.Komsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil
dibanding dengan kolom konvensional karenapada kolom mikrobor
kecepatan alir fase gerak lebih lambat 10-100 ul/menit.
b.Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor
lebih ideal jika digabung dengan spektrometer massa.
17
c.Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat
,karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel
terbatas misal sampel klinis.
II.4.2.5.Detektor KCKT
Detektor pada KCKT dikelompokkan menjadi dua golongan yaitu
detektor universal( yang mampu mendeteksi zat secara umum,tidak
bersifat spesifik,dan tidak bersifat selektif). Seperti detektor indeks bias
dan detektor spektrometer massa dan golongan detektor yang spesifik
yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif seperti
detektor uv-vis , detektor fluoresensi, dan elektrokimia (7,14,15).
Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai
berikut;
1.Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel
2.Mempunyai sensitifitas yang tinggi ,yakni mampu mendeteksi solut
pada kadar yang sangat kecil.
3.Stabil dalam pengoperasiannya
4.Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan
pelebaran pita.
5.Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada
kisaran yang luas.
6.Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fasegerak
18
Jenis detektor yang digunakan pada KCKT
a.Detektor Spektrofotometer UV-Vis
Detektor jenis ini merupakan detektor yang paling banyak
digunakan dan sangat berguna untuk analisis di bidang farmasi karena
kebanyakan senyawa obat yang mempunyai struktur yang dapat
menyerap sinar UV-Vis. Detektor ini didasarkan pada adanya
penyerapan radiasi ultraviolet (UV) dan sinar tampak (Vis) pada kisaran
panjang gelombang 190-800 nm oleh spesies solut yang mempunyai
struktur-struktur atau gugus-gugus kromoforik. Sel detektor umumnya
berupa tabung dengan diameter 1 nm dan panjang celah optiknya10 nm,
serta diatur sedemikian rupa sehingga mampu menghilangkan pengaruh
indeks bias yang dapat mengubah absorbansi yang terukur(7,16,18)
b.Detektor photodiode-array (PDA)
Detektor UV-Vis merupakan detektor yang paling banyak dipakai,
akan tetapi karena banyak analit yang diukur maka akan ada
kecenderungan puncak-puncak kromatogram yang tidak terdeteksi dan
juga akan ada detektor UV-Vis dengan berbagai keistimewaan. Detektor
ini mampu memberikan kumpulan kromatogram secara simultan pada
panjang gelombang yang berbeda dalam sekali proses (single run).
Selama proses berjalan, suatu kromatogram pada panjang gelombang
yang diinginkan(biasanya antara 190-400) dapat ditampilkan. Dengan
demikian PDA memberikan lebih banyak informasi komposisi sampel
dibanding dengan detektor UV-Vis. Dengan detektor ini, juga diperoleh
19
spektrum UV tiap puncak yang terpisah sehingga dapat dijadikan
sebagai alat yang penting untuk memilih pajang gelombang maksimal
untuk sistem KCKT yang digunakan. Dan akhirnya dengan
membandingkan antara spektra analit dengan spektra seyawa yang
sudah diketahui.(7,16,18)
c. Detektor fluoresensi
Fluoresensi merupakan fenomena luminisensi yang terjadi ketika
suatu seyawa menyerap sinar UV atau visibel lalu mengemisikannya
pada gelombang yang lebih besar. Tidak semua senyawa obat
mempunyai sifat fluoresen sehingga detektor fluoresensi ini sangat
spesifik. Di samping itu, detektor ini juga sangat sensitif dibandingkan
dengan detektor UV.(7,16,18)
d. detektor indeks bias
Detektor indeks bias merupakan detektor yang bersifat universal
yang mampu memberikan respon (signal) pada setiap zat terlarut.
Detektor ini akan direspon setiap perbedaan indeks bias antara analit
(zat terlarut) dengan pelarutnya (fase geraknya). Kelemahan yang
utama detektor ini adalah bahwa indeks bias dipengaruhi oleh suhu,
oleh karena itu suhu fase gerak,kolom, dan detektor harus dikendalikan
secara seksama.(7,16,18)
e. detektor elektrokimia
Banyak senyawa organik (termasuk oleh) dapat dioksidasi atau
direduksi secara elektrokimia pada elektroda yang cocok. Arus yang
20
dihasilkan pada proses ini dapat diperkuat hingga memberikan respon
yang sesuai. Kepekaan detektor elektrokimia pasa umumnya tinggi.
Detektor elektrokimia yang paling banyak digunakan adalah detektor
konduktivitas dan detektor amperometri.(7,16,18)
II.IV.2.6 Tempat Injeksi Sampel (Injector)
Ada 3 jenis macam tempat injeksi sampel atau injektor (injector),
yakni: tempat injeksi sampel syringe (syringe injector), katup sampling
(sampling valve) dan tempat injeksi sampel otomatik (automatic
injector). Tempat injeksi sampel syringe (syringe injector) merupakan
bentuk tempat injeksi sampel atau injektor (injector) yang paling
sederhana(18)
Gambar 3. Katup sampling (sampling valve) atau tempat injeksi sampel manual
(manual injector)
Katup sampling (sampling valve) atau tempat injeksi sampel manual
(manual injector) mengandung 6 katup saluran dilengkapi dengan rotor,
lengkungan sampel (sample loop) dan celah jarum suntik (needle port).
21
Larutan sampel akan disuntikkan kedalam lengkungan sampel (sample
loop) dengan jarum suntik gauge pada posisi “masuk (load)” dan larutan
sampel yang ada di lengkungan sampel (sample loop) kemudian akan
dialirkan ke kolom dengan memutar rotor ke posisi “injek (inject)”. Ukuran
lengkungan sampel (sample loop) eksternal bervariasi antara 6 μL hingga
2 mL (Ornaf dan Dong, 2005). Tempat injeksi sampel otomatik (automatic
injector) atau disebut juga autosampler memiliki prinsip yang mirip, hanya
saja sistem pemasukkan sampelnya bekerja secara otomatis.
II.4.2.7.Komputer ,Integrator,atau Rekorder
Alat pengumpul data seperti komputer ,integrator atau
rekorder,dihubungkan dengan detektor..Alat ini akan mengukur sinyal
elektronik yang dihasilkan oleh detektor lalu memplotkannya sebagai
suatu kromatogram yang selanjutnya dapat dievaluasi oleh seorang
analis(7,19).
II.4.3 Jenis –jenis KCKT
II.4.3.1.Kromatografi Adsorbsi
Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan fase
diam silika gel dan alumina ,meskipun demikian sekitar 90% kromatografi
ini memakai silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan alumina
terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut. Gugus
silanol pada silika mempunyai reaktifitas yang berbeda ,karenanya solut
dapat terikat secara kuat sehingga dapat menyebabkan puncak yang
berekor atau tailing. Fase gerak yang digunakan untuk fase diam silika
22
atau alumina berupa pelarut nonpolar yang ditambah dengan pelarut polar
yang ditambah dengan pelarut polar untuk meningkatkan kemampuan
elusinya sehingga tidak timbul pengekoran puncak ,misalnya n heksan
ditambah metanol (7,15).
II.4.3.2.Kromatografi Partisi
Kromatografi jenis ini disebut juga dengan kromatografi fase terikat
.Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah siika yang dimodifikasi
secara kimawi atau fase terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk
memodifikasi silika adalah hidrokarbo-hidrokarbon non polar seperti fenil.
Fase diam yang paling populer digunakan oktadesisilan dan kebanyakan
pemisahannya adalah fase terbalik. Sebagai fase gerak adalah campuran
metanol atau asetonitril dengan air (15).
II.4.3.3.Kromatografi penukar ion
KCKT penukaran ion menggunakan fase diam yang dapat menukar
kation atau anion suatu fase gerak. Ada penukaran ion yang beredar
dipasaran, meskipun demikian yang paling luas penggunaannya adalah
polistiren resin.. Dalam hal ini, cicin benzen telah tersulfonasi untuk
membentuk penukar ion kation asam sulfonat yang kuat.(B) merupakan
struktur resin penukaran anion dengan matriks polistiren yang berikat
silang satu sama lain yang sama, tetapi dengan gugus tetraalkil amonium
(16).
23
II.4.3.4.Kromatografi pasangan ion
Kromatografi pasangan ion merupakan alternatif kromatografi
penukaran ion. Beberapa masalah dapat dipecahkan dengan kedua
metode ini akan tetapi penukaran ion tidak sebaik dengan kromatografi
pasangan ion untuk pemisahan campuran-campuran yang bersifat
asam,basa dan yang bersifat netral dibawah lingkungan tertentu.
Keuntungan kromatografi pasangan ion untuk pemisahan senyawa
senywa ionik adalah:
a.sistem fase terbalik dapat digunakan untuk pemisahan
b.campuran asam,basa ,netral dan juga molekul-molekul amfoterik dapat
dipisahkan
c.kromatografi pasangan ion juga merupakan pilihan yang baik jika nilai
pka analit serupa dan
d.Selektifitas dapat dipengaruhi oleh pemilihan pasangan ion yang
bermuatan berlawanan.(16,18)
II.4.3.5.Kromatografi Eksklusi Ukuran
Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan
dapat digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan
berat moolekul kurang dari 2000 dalton. Fase diamyang digunakan dapat
berupasilika atau poliimer yang bersifat porus sehingga solut dapat
melewati porus,atau berdifusi lewat fase diam. Molekul solut yang
mempunyai BM yang jauh lebih besar ,akan terelusi terlebih dahilu
24
,kemudian molekul molekul dengan ukuran medium,dan terakhir adalah
molekul yang jauh lebih kecil(7,15).
II.5 Derivatisasi pada KCKT
Derivatisasi melibatkan suatu reaksi kimia antara analit dengan
suatu reagenuntuk mengubah sifat fisika kimia analit. Tujuan utama
penggunaan derivatisasi pada KCKT adalah untuk meningkatkan
deteksi,mengubah struktur molekul merubah matriks sehingga diperoleh
pemisahan yang lebih baik dan menstabilkan analit yang sensitif (7,19).
II.6 Densitometri
Densitometri adalah metode analisis instrumen berdasarkan radiasi
elektromagnetik dengan analit berupa noda pada KLT. Instrument untuk
scanning densitometry menggunakan pengukuran absorban atau
fluorosensi dalam bentuk penerusan atau pantulan. Pertama kali
diperkirakan pertengahan tahun 1960-an (7,17,21).
Instrument densitometri terdiri dari beberapa bagian. Sumber
cahaya menggunakan lampu yang berbeda yang dapat menjangkau
seluruh daerah sinar UV dan sinar tampak dari 200-800 nm. Untuk daerah
sinar tampak digunakan lampu halogen tungsten sedangkan untuk daerah
UV digunakan lampu deuterium. Pancaran xenon atau merkuri intensitas
tinggi ditunjukkan untuk pengukuran fluorosensi. Untuk memilih panjang
gelombang digunakan 15 monokromator atau filter(7,17,21).
25
BAB III
PELAKSANAAN PENELITIAN
III.1 Penyiapan Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah Densitometri
(Camag TLC Scanner 3), erlenmeyer (Pyrex®), labu
tentukur 5 ml, 10 ml, 50 ml (Pyrex®), lampu UV 254 (Camag UV-
Betrachter®), mikropipet volume 0,5 μL (Eppendorf), oven (Memmert),
silika gel 60 F254, timbangan analitik (Mettler Toledo®), vial, kromatografi
cair kinerja tinggi (Zhimadzu®)LC-20AD, syringe UFLC, kolom Shim-pack
ODS C18 250x 4,6 mm, vial autosampler(Thermo®).
Bahan yang digunakan adalah Etil asetat, n heksan, Metanol pro
HPLC,Kertas saring 0,2um PTFE, dan sampel isolat zerumbon dari
rimpang Lempuyang wangi dan Baku kerja Zerumbon.
III.2 Metode Kerja
III.2.1 Pemilihan panjang gelombang maksimum
Penentuan panjang gelombang maksimum zerumbon dilakukan
dengan cara scanning kromatogram larutan kerja pembanding zerumbon
dan larutan sampel. Larutan pembanding dan sampel zerumbon dengan
konsentrasi 200 μg/mL ditotolkan pada lalu kemudian dielusi dengan
eluen heksan : etil (9 : 1). Satu-satunya noda yang terbentuk di-scan pada
panjang gelombang 200-400 nm sehingga diperoleh hasil spektrum UV
zerumbon.
26
III.3 Uji validasi
Parameter validasi yang diukur menurut ICH kategori II adalah
linieritas, presisi, Keterulangan, LOQ dan LOD. Metode ini divalidasi
sesuai dengan pedoman ICH International Conferense of Harmanitation
(10).
III.3.1 Penyiapan Larutan Baku Zerumbon
Pembuatan larutan Zerumbon (1000 ug / ml) adalah dibuat dengan
melarutkan bahan tersebut dalam 100 ml metanol pa. Larutan Stok
zerumbon selanjutnya diencerkan , untuk memberikan konsentrasi akhir
25, 50, 100, 200, 300, 400, dan 500 ug / ml(10).
III.3.2 Uji Presisi
Presisi metode ditentukan oleh persentase koefisien variasi (% CV)
dan persentase relatif error (% RE) masing-masing, sesuai dengan
dilaporkan ICH. Quality Control (QC) sampel yang mengandung 25 dan
500ug / ml untuk penentuan presisi. Enam ulangan pada masing-masing
konsentrasi diukur pada panjang gelombang maximum dan dihitung
simpangan baku dan simpangan baku relatif(10).
III.3.3 Uji Keterulangan
Uji ini dilakukan dengan menghitung simpangan baku dan
simpangan baku relatif pada sampel dengan enam kali ulangan dan pada
baku pembanding dengan enam kali pengulangan. Masing -masing diukur
pada panjang gelombang maksimum (10).
27
III.3.4 Linearitas
Pembuatan larutan zerumbon dengan melarutkan 100 mg
zerumbon dalam metanol (1000 ug/ml). Masing –masing diencerkan dan
dibuat konsentrasi 25, 50, 100, 200, 300, 400 dan 500 ug/ml. Diukur pada
panjang gelombang maksimum. Dihitung koevisien korelasi yang dihitung
dengan regresi linier(10).
III.3.5 LOQ dan LOD
Setelah didapatkan kurva kalibrasi limit of deteksi dan limit of
kuantitatif dihitung secara statistik melalui garis linear dari kurva standar.
Diukur pada panjang gelombang maksimum. Koefisien korelasi (r)
dihitung dari analisis regresi linier (Y=a+bx) (10)
III.4 Analisis Data
Dilakukan pengolahan data yang dihasilkan.
III.5 Pembahasan Hasil
Dilakukan pembahasan terhadap hasil yang telah diperoleh.
III.6 Pengambilan Kesimpulan
Kesimpulan diambil berdasarkan hasil pembahasan.
28
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
IV.1Hasil Penelitian
IV.1.1 Pemilihan panjang gelombang maksimum
Gambar 4. Panjang gelombang hasil scanning panjang gelombang noda sampel
isolat zerumbon konsentrasi 200 μg/mL.
29
Gambar 5. Panjang gelombang hasil scanning panjang gelombang noda baku
pembanding zerumbon konsentrasi 200 μg/mL.
IV.1.2 Hasil pengujian linearitas
Tabel 1.Hasil pengujian linearitas pada panjang gelombang max
No Konsentrasi luas area
1 25 1307027
2 50 1711556
3 100 3424572
4 200 6889084
5 300 10827172
6 400 14339713
7 500 17127984
30
IV.1.3 Kurva Baku linearitas
Gambar 6. Grafik data lineritas
IV.1.4 Hasil Pengujian Batas Deteksi dan Batas Kuantitas
Tabel.2 Hasil Pengujian Batas Deteksi dan Batas Kuantitas
No Konsentrasi
(ppm) Area LOD LOQ
1 25 1307027
0,15μg/ml 0,5 μg/ml
2 50 1711556
3 100 3424572
4 200 6889084
5 300 10827172
6 400 14339713
7 500 17127984
y = 34568x + 16885R² = 0,997
0
5000000
10000000
15000000
20000000
0 100 200 300 400 500 600
luas
are
a
konsentrasi
Kurva Baku Zerumbon
31
IV.1.5 Hasil Pengujian Presisi
Tabel 3.Hasil Pengujian Presisi pada konsentrasi terendah dan konsentrasi tertinggi
IV.1.6 Hasil PengujianKeterulangan sampel zerumbon
Tabel 4.Hasil Pengujian Keterulangan Sampel 200 ppm
Kons(ppm) Luas Area
200 7711701
200 7743751
200 7908344
200 7482907
200 7993373
200 7988510
Rata-rata 7804764,3
SB 198010
SBR (%) 2,53
1.Konsentrasi Terendah
No Luas Area
1 835335
2 825995
3 821358
4 805015
5 828698
6 801544
Rata-Rata 819657,33
SB 5516,9
SBR (%) 0,7
2.Konsentrasi tertinggi
No Luas Area
1 16518907
2 16522967
3 16461605
4 16152679
5 14112360
6 16281756
Rata-Rata 16008379
SB 391948,18
SBR (%) 2,5
32
IV.1.7 Hasil Pengujian Keterulangan Pembanding Zerumbon
Tabel 6.Hasil Pengujian Keterulangan Pembanding Zerumbon
IV.2 Pembahasan.
Menurut International conference of harmonization (ICH) ada
sepuluh parameter validasi yang dapat diuji adalah Presisi, Akurasi,
Batas deteksi, Batas kuantitas, Spesifitas, Linearitas, Kisaran (range),
Ketahanan, Kekasaran dan Kesesuaian Sistem. Namun ICH telah
menyatakan bahwa tidak selamanya parameter untuk mengevaluasi
validasi metode harus diuji, ICH membagi validasi dalam beberapa
kategori sehingga pengujian validasi dari penetapan kadar zerumbon
menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi hanya 5 parameter yang
diuji yaitu presisi, lineritas, batas deteksi, batas kuantitas, dan
keterulangan. Diharapkan parameter ini dapat mewakilli data yang
dibutuhkan untuk uji validasi kategori II. Hasil uji validasi metode
Kons(ppm) Luas Area
200 8281345
200 7985774
200 7801557
200 8072544
200 7739777
200 8262075
Rata-rata 8023845
SB 92554
SBR(%) 1,15
33
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Pada penetapan kadar zerumbon dapat
dinyatakan dalam beberapa parameter sebagai berikut:
IV.2.1Pemilihan panjang gelombang analisis
Panjang gelombang yang dipilih untuk analisis zerumbon adalah
pada panjang gelombang maksimum 260 nm ,karena pada panjang
gelombang inilah zerumbon memberikan serapan yang baik dan
menghasilkan area yang besar. Berdasarkan pada pengujian
menggunakan alat densitometri gelombang yang memberikan serapan
paling bagus.
IV.2.2Presisi
Presisi merupakan kedekatan antara hasil pengujian individu
dalam serangkaian pengukuran terhadap suatu contoh homogen yang
dilakukan. Hal ini berdasarkan pada pengambilan sampel secara
berganda menurut prosedur yang telah ditetapkan.
Berdasarkan hasil perhitungan pada tabel 3, Hasil pengujian presisi
menunjukkan nilai RSD (Relative Standar Deviatin atau simpangan baku
relatif) pada larutan sampel memenuhi persyaratan dimana sangat teliti (
%SBR =1), teliti (%SBR1-2), sedang (%SBR 2-5), dan tidak teliti (%SBR
5) nilai yang didapatkan 1,15% untuk pembanding zerumbon dan 2,5%
untuk sampel dimana angka ini masuk dalam kategori teliti. Hal ini
menunjukkan bahwa instrumen Kromatografi Cair Kinerja Tinggi memiliki
presisi atau ketelitian yang dapat diterima dengan baik.
34
IV.2.3 Linearitas
Linearitas biasanya dinyatakan dalam istilah variansi sekitar arah
garis regresi yang dihitung berdasarkan persamaan matematik data yang
diperoleh dari hasil uji analit dalam sampel dengan berbagai konsentrasi
analit. Berdasarkan perhitungan statistik regresi linear diperoleh nilai
koefisien korelasi untuk larutan zerumbon dengan konsentrasi bervariasi
25, 50, 100, 200, 300, 400, dan 500 ppm Yaitu 0,997 dengan persamaan
garis y=16885+34568x ,dilihat dari nilai r yang diperoleh telah memenuhi
syarat untuk uji linearitas karena menurut ICH linearitas yang dapat
diterima apabila nilai r yang dihasilkan lebih besar atau sama dengan
0,9900.
IV.2.4 Keterulangan
Uji keterulangan dilakukan terhadap larutan pembanding zerumbon
dan sampel isolat zerumbon. dibuat 6 larutan zerumbon yang
konsentrasinya sama yaitu 200 μg/mL. Masing-masing larutan diinjeksikan
sebanyak 10 μL sehingga diperoleh kadar 2 μg/ml, kemudian diukur pada
panjang gelombang maksimum. Dari tabel 4 dan tabel 5 di atas,
berdasarkan luas areanya diperoleh hasil keterulangan yang cukup baik
dengan nilai SBR ≤ 15 % (16) yaitu 1,15% untuk pembanding zerumbon
dan 2,53% untuk sampel isolat zerumbon.
35
IV.2.5 Batas deteksi
Batas deteksi adalah konsentrasi analit terendah dalam sampel
atau dalam matriks yang dapat dideteksi, atau Batas deteksi adalah
jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat dideteksi yang masih
memberikan respon signifikan. Berdasarkan hasil perhitungan pada tabel
2, Hasil pengujian batas deteksi untuk metode penetapan kadar
zerumbon menggunakan instrumen Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
adalah 0,15 ug/ml. Nilai 0,15 ug/ml menandakan bahwa zerumbon sudah
dapat terdeteksi pada konsentrasi tersebut menggunakan alat
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi.
IV.2.6 Batas Kuantitas
Batas kuantitas adalah konsentrasi terendah dalam sampel atau
matriks yang dapat di ukur secara kuantitatif dengan presisi yang dapat
diterima. Berdasarkan hasil perhitungan pada tabel 2 Hasil pengujian
batas kuantitas untuk metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi pada
penetapan kadar zerumbon menunjukkan nilai sebesar 0,5 ug/ml. Nilai
0,5 ug/ml menandakan bahwa pada konsentrasi tersebut zerumbon sudah
dapat diukur secara kuantitatif.
IV.2.7 Hasil Pengukuran Kadar Isolat Zerumbon
Dari hasil analisis kuantitatif terhadap isolat zerumbon yang
dieperoleh dari Lempuyang wangi dengan konsentrasi 200 ppm, yang
positif mengandung zerumbon mempunyai persentase kadar zerumbon
sebesar 99 %.
36
36
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
V.1 Kesimpulan
Berdasarkan data penelitian dapat disimpulkan bahwa Metode
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi dinyatakan valid pada penetapan kadar
zerumbon yang diperoleh dari lempuyang wangi.
V.2 Saran
Sebaiknya dilakukan penelitian validasi metode kromatografi cair
kinerja tinggi pada zerumbon menggunakan parameter yang lain .
37
DAFTAR PUSTAKA
1. Sari.K.Pemanfaatan Obat Tradisional Dengan Pertimbangan Manfaat dan
Keamanannya.JSFK.7 April 2006.pp 1-3
2. Imas Masruroh. Isolasi Senyawa Aktif Dari Bangle Hantu (Zingiber Ottensii Va) Yang Berpotensi Sebagai Antiobesitas. Intitut Pertanian Bogor.Bogor.2011.pp.1-2
3. Indrie Ambarsari, Sarjana dan Budi Hartoyo. Kajian Perbaikan Kualitas Produk Dan Peningkatan Kapasitas Produksi Olahan Lempuyang Wangi Di Kabupaten Blora. Prosiding Seminar. Semarang. 8 November 2007. pp. 58-65
4. Mahfudz L.D,. R. Murwani. Kusumowardani, T.H,. D.X. Hou. Aktivitas Anti Oksidan Dan Anti Tumor Kandungan Tanaman Herbal Indonesia. Majalah Obat Tradisional. 2011. 16(2), 68 – 74
5. Yeap Swee Keong,Norjahan Banu Alithen,Suhaimi Mustafa,Suraini Abdul Azis, Mashitoh Abdul Rahman and Abdul Manaf Ali. Immunomodulatory Effects of zerumbone isolated from Roots Of Zingiber Zerumbet Vol 23. Malaysia. Universiti Putra Malaysia. 2010. Pp.75-82
6. [Online] Bogor Acricultural Universitas From http://www.google.com/ in Access November 23, 2012
7. Ibnu Rohman. Ibnu Gholib Gandjar. Analisis Obat Secara Spektrofotometri dan Kromatografi. Yogyakarta. Pustaka Pelajar. 2012. Pp.468-484
8. Ade Heri Mulyati, Sutanto dan Dewi Apriyani. Validasi Metode Kadar Ambrosol Hidroklorida Dalam Sediaan Tablet Cystelis Secara Kromatgrafi Cair Kinerja Tinggi. Bogor. Universitas Pakuan Bogor. 2011. Pp 1-10
9. Andria Agusta. Minyak Atsiri Tumbuhan Tropika Indonesia. Penerbit ITB.
Bandung. 2000. Hal 111.
10. Eltayeb Elamin M. Ahmad Bustamam Abdul. Adel S. Al-Zubairi. Mohamed Aspollah Sukari. Rasedee Abdullah. African Journal of Biotechnology Vol. 9(8), 22 February, 2010 pp. 1260-1265
11. Harmita. Petunjuk pelaksanaan validasi Metode dan cara perhitungannya. Vol. I, No.3. Departemen Farmasi FMIPA-UI. Jakarta. 2004.Pp 1-19
12. I Kadek Arya Mulyadi. Validasi Metode Analisi Irberastan Dalam Plasma In Vitro Secara Kromotografi Cair Kinerja Tinggi-Fluoresensi. Universitas Indonesia.Jakarta. 2011.Pp25-35
13. Rahma Juwita Zamri. Validasi Metode Penentuan Kadar Apigenin Dalam Ekstrak Seledri Dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. Institut Pertanian Bogor. Bogor. 2008.Pp10-12
38
14. Dwi Baskoro Bimmo. Studi Optimisasi dan Metode Validasi untuk Penentuan Melanin dan Asam Sianurat dalam Sampel Susu Formula dengan HPLC. Universitas Indonesia. Jakarta. 2012
15. Eria Oktavia. Teknik Validasi Metode Analisis Kadar Ketoprofen Secara KromotografiCair Kinerja Tinggi. Balai Besar Penelitian Dan Pengembangan Pascapanen Pertanian. Bogor. 2006
16. Zainal Arifin, Darmono1, Agus Safuan Dan Rina Pratama. Validasi Metode Analisis Logam Copper (Cu) Dan Plumbum (Pb) Dalam Jagung Dengan Cara Spektrofotometer Serapan Atom. Universitas Pancasila. Jakarta 2006.Pp 1-5
17. Asril Damiyanto Hasan. Analisis Kadar Zerumbone Yang Terdapat Pada Rimpang Lempuyang Gajah (Zingiber Zerumbet (L).J.E Smith) Dengan Berbagai Metode Ekstraksi Dan Variasi Cairan Penyari.Universitas Hasanuddin. Makassar. 2011.Pp 7-8
18. Rohman,abdul.Kromatografi Untuk Analisis Obat.Cetakan pertama edisi pertama.Yogyakarta.Pustaka Pelajar.2009.Pp 122-144
19. Endang,Tri Susanti. Optimasi dan Validasi Metode Analisis.Ziduvudin,Lamivudin ,dan Nevirapin Dalam Tablet Generik dan Plasma In Vitro Secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi.Universitas Indonesia .Depok .2012.Pp 20-34
20. Daryadi,Egan.Metode Cepat Kuantifikasi Kuinina Dalam Sediaan Farmasi dan Kulit Kina Secara Spektrofotometri Derivatif Ultraviolet.Insitut Pertanian Bogor.Bogor.Pp 10-25
21. Triana Neni.Analisis Senyawa Zerumbon Yang Diperoleh dari lempuyang wangi,Lempuyang Gajah, Dan Lempuyang Emprit Secara Densitometri dan HPLC.Unhas.Makassar.2013.Pp 20-40
39
LAMPIRAN I
Gambar 6.Tanaman lempuyang wangi( Zingiber aromaticum Vahl)
Gambar 7.Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
40
LAMPIRAN II
SKEMA KERJA
VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI
A. Skema kerja penetapan kadar zerumbon dalam sampel dan
presisi Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
- Presisi
- Sampel dilarutkan dalam metanol
- Masing-masing konsentrasi
Diulang sebanyak 6 kali
- Area sampel
25 ppm sampel isolat zerumbon & 500 ppm sampel isolat
Kromatografi Cair Kinerja
Tinggi
Pengumpulan & Analisis
data
Pembahasan
Kesimpulan
41
LAMPIRAN III
B. Pengujian Linieritas, Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi Metode
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Ditimbang 100 mg dilarutkan kedalam 100
ml metanol (1000 ppm)
Diencerkan dengan konsentrasi 25,50,100,
200, 300,400dan 500 ppm
Masing-masing diukur pada panjang
gelombang maksimum
Zerumbon pembanding
Hasil pengukuran
Analisis Data
Batas
Deteksi
Batas
Kuantitasi
Linearitas
Pembahasan
Kesimpulan
42
LAMPIRAN IV
C. Pengujian Keterulangan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
- Masing-masing ditimbang 2 mg - Masing-masing ditimbang 2 mg
- Dilarutkan dalam 10 ml metanol - Dilarutkan dalam 10 ml metanol
- Dibuat 6 kali replikasi - Dibuat 6 kali replikasi
Sampel isolat
zerumbon 200 ppm
Pembanding zerumbon
200 ppm
Diukur pada panjang gelombang max
Analisis Data
Kesimpulan
43
LAMPIRAN V
Tabel Perhitungan LOD Dan LOQ
Persamaan kurva baku : -16885 + 34568x
S y/x = 𝛴 𝑦−ỹ 2
𝑛−2 1/2
= 302535,47231/2 = 305648,1`
Sb = S y/x / 𝛴 (( x-xrata2 )2)1/2 =302535,4723 / ( 75625)1/2 = 1747
Sa =302535,4723 / 553125 / 5 x (75625) 1/2 = 312434,2
Nilai Y pada batas deteksi ditentukan dengan persamaan.
Y = Yb + 3 Sb
Yb = Nilai a pada persamaan kurva kalibrasi,
NO Y X X^2
X-
Xrata2
(X-
Xrata2)2
area (y dibagi
100) Y taksiran (Y-Ytaksiran)^2
1 1307027 25 625 -200 40000 13070,27 847315 2,113351E+11
2 1711556 50 2500 -175 30625 17115,56 1711515 1,681000E+03
3 3424572 100 10000 -125 15625 34245,72 3439915 2,354076E+08
4 6889084 200 40000 -25 625 68890,84 6896715 5,823216E+07
5 10827172 300 90000 75 5625 108271,72 10353515 2,243510E+11
6 14339713 400 160000 175 30625 143397,13 13810315 2,802622E+11
7 17127984 500 250000 275 75625 171279,84 17267115 1,935744E+10
jumlah 55627108 1575 553125 302535,4723
rata-
rata 7946730 225
44
Sb = Simpangan baku Sb
Y = - 16885 + 3 (1747)
Y = 5253,943
Perhitungan LOD( Batas Deteksi )
LOD = 3 x SD S
LOD = 3 x 1747
34568
LOD = 0,15 ug/ml
Perhitungan LOQ ( Batas Kuantitas)
LOQ = 10 x SD
S
LOQ = 10 x 1747
34568
LOQ = O,5 ug/ml
Perhitungan kadar zerumbon 200ppm
y =a + b×
6869936 = -16885+34568×
× = 6869936 – 16885 =198,2ug/ml
34568
x = 198,2 ug/ml X 100% = 99,1%
200ug/ml
44
LAMPIRAN VI
PERHITUNGAN PRESISI
a. Presisi
1. Konsentrasi Terendah 2. Konsentrasi Tertinggi
SB = 𝛴 𝑥−𝑥 𝑟𝑎𝑡𝑎 2 2
𝑛 − 1 1. SBR =
100 𝑥 5516 ,9
819657 ,33 = 0,7
SBR = 100 𝑥 𝑆𝐷
𝑥 𝑟𝑎𝑡𝑎 −𝑟𝑎𝑡𝑎 2. SBR =
100 𝑥 391948 ,18
16008379 = 2,5
No Luas Area
1 835335
2 825995
3 821358
4 805015
5 828698
6 801544
Rata-Rata 819657,33
SB 5516,9
SBR (%) 0,7
No Luas Area
1 16518907
2 16522967
3 16461605
4 16152679
5 14112360
6 16281756
Rata-Rata 16008379
SB 391948,18
SBR (%) 2,5
45
LAMPIRAN VII
PERHITUNGAN KETERULANGAN
1. Konsentrasi 200 ppm pembanding zerumbon
No Luas Area
1 7711701
2 7743751
3 7908344
4 7482907
5 7993373
6 7988510
Rata-rata 7804764,3
SB 198010
SBR (%) 2,53
2. Konsentrasi 200 ppm pembanding zerumbon
1. SBR = 100 𝑥 198010
7804764 ,3 = 2,5%
2. SBR = 100 𝑥 92554
8023845 = 1,15%
No Luas Area
1 8281345
2 7985774
3 7801557
4 8072544
5 7739777
6 8262075
Rata-rata 8023845
SB 92554
SBR (%) 1,15
46
LAMPIRAN VIII
KROMATOGRAM LINEARITAS DARI HPLC
ko
1. Konsentrasi 25 ppm dengan luas area 1307027 2. Konsentrasi 50 ppm dengan luas area 1711556
3. Konsentrasi 100 ppm dengan luas area 3424572 4.Konsentrasi 200 ppm dengan luas area 6889084
5.Konsentrasi 300 ppm dengan luas area 10827172 6. Konsentrasi 400 ppm dengan luas 14339713
7. Konsentrasi 500 ppm dengan luas 17127984
LAMPIRAN IX
KROMATOGRAM PRESISI KONSENTRASI TERENDAH DARI HPLC
1.Kromatogram presisi Konsentrasi 25 ppm 2.Kromatogram presisi Konsentrasi 25 ppm
3.Kromatogram presisi Konsentrasi 25 ppm 4.Kromatogram presisi Konsentrasi 25 ppm
5.Kromatogram presisi Konsentrasi 25 ppm 6.Kromatogram presisi Konsentrasi 25 ppm
LAMPIRAN X
KROMATOGRAM PRESISI PADA KONSENTRASI TERTINGGI
KKON
1.konsentrasi 500ppm dengan luas area 16518907 2.Konsentrasi 500ppm denganluas area 16522967
3.konsentrasi 500ppm dengan luas area 16461605 4.konsentrasi 500ppm dengan luas area 16152679
5.konsentrasi 500ppm dengan luas area 14112360 6.konsentrasi 500ppm dengan luas area 16281756
LAMPIRAN XI
KROMATOGRAM KETERULANGAN SAMPEL ISOLAT ZERUMBON PADA HPLC
1.Konsentrasi 200 ppm dengan luas area 7743751 2.Konsentrasi 200 ppm dengan luas area
7711701
3.Konsentrasi 200 ppm dengan luas area 7908344 4.Konsentrasi 200 ppm dengan luas
area 7482907
5.Konsentrasi 200 ppm dengan luas area 7993373 6.Konsentrasi 200 ppm dengan luas area
7988510
LAMPIRAN XII
KROMATOGRAM KETERULANGAN PEMBANDING ZERUMBON DARI HPLC
1.Konsentarsi 200 ppm dengan luas area 8281345 2.Konsentrasi 200 ppm dengan luas area
7985774
1.Konsentarsi 200 ppm dengan luas area 8281345
1.Konsentarsi 200 ppm dengan luas area 8281345
3.Konsentarsi 200 ppm dengan luas area 7801557 4.Konsentarsi 200 ppm dengan luas area
8072544
5.Konsentarsi 200 ppm dengan luas area 7739777 6.Konsentarsi 200 ppm dengan luas area 8262075
p