VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA...

70
i VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI PADA PENETAPAN KADAR ZERUMBONE YANG DIPEROLEH DARI LEMPUYANG WANGI (Zingiber aromaticum Vahl ) RISQAH MATHAR N11109284 PROGRAM STUDI FARMASI FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS HASANUDDIN MAKASSAR 2013

Transcript of VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA...

Page 1: VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA ...digilib.unhas.ac.id/uploaded_files/temporary/Digital...Tinggi dinyatakan valid pada penetapan kadar zerumbon yang diperoleh dari lempuyang

i

VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA

TINGGI PADA PENETAPAN KADAR ZERUMBONE YANG

DIPEROLEH DARI LEMPUYANG WANGI

(Zingiber aromaticum Vahl )

RISQAH MATHAR

N11109284

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS HASANUDDIN

MAKASSAR

2013

Page 2: VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA ...digilib.unhas.ac.id/uploaded_files/temporary/Digital...Tinggi dinyatakan valid pada penetapan kadar zerumbon yang diperoleh dari lempuyang

ii

VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

PADA PENETAPAN KADAR ZERUMBONE YANG DIPEROLEH

DARI LEMPUYANG WANGI (Zingiber aromaticum Vahl )

SKRIPSI

Untuk melengkapi tugas-tugas dan memenuhi syarat-syarat untuk mencapai gelar sarjana

RISQAH MATHAR

N11109284

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS HASANUDDIN

MAKASSAR

2013

Page 3: VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA ...digilib.unhas.ac.id/uploaded_files/temporary/Digital...Tinggi dinyatakan valid pada penetapan kadar zerumbon yang diperoleh dari lempuyang

iii

VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI PADA

PENETAPAN KADAR ZERUMBONE YANG DIPEROLEH DARI

LEMPUYANG WANGI (Zingiber aromaticum Vahl )

RISQAH MATHAR

N111 09 284

Disetujui oleh :

Pembimbing Utama Pembimbing Pertama Drs. H. Syaharuddin Kasim,M.Si,Apt Dra.Christiana Lethe,M.Si,Apt NIP. 19630801 199003 1 001 NIP . 19481002 198203 2 001

Pada tanggal,………..2013

Page 4: VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA ...digilib.unhas.ac.id/uploaded_files/temporary/Digital...Tinggi dinyatakan valid pada penetapan kadar zerumbon yang diperoleh dari lempuyang

iv

Page 5: VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA ...digilib.unhas.ac.id/uploaded_files/temporary/Digital...Tinggi dinyatakan valid pada penetapan kadar zerumbon yang diperoleh dari lempuyang

v

PENGESAHAN

VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI PADA

PENETAPAN KADAR ZERUMBONE YANG DIPEROLEH DARI LEMPUYANG

WANGI (Zingiber aromaticum Vahl )

OLEH

RISQAH MATHAR

N111 09 284

Dipetrahankan Dihadapan Panitia Penguji Skripsi

Fakultas Famasi Universitas Hasanuddin

Pada Tanggal,............................2013

Panitia penguji skripsi 1. Ketua : Dr. Hj.Sartini,M.Si., Apt. (...............)

2. Sektretaris : Dra. Rosany Tayeb, M.Si., Apt. (...............)

3. Anggota (Ex off) : Drs. H.Syaharuddin Kasim, M.Si, Apt (...............)

4. Anggota (Ex off) : Dra.Cristiana Lethe, M.Si, Apt (...............)

5. Anggota : Dra.Ermina Pakki, M.Si, Apt (...............) Mengetahui

Dekan Fakultas Farmasi

Universitas Hasanuddin

Prof. Dr. Elly Wahyudin, DEA., Apt NIP. 19560224 198601 2 001

Page 6: VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA ...digilib.unhas.ac.id/uploaded_files/temporary/Digital...Tinggi dinyatakan valid pada penetapan kadar zerumbon yang diperoleh dari lempuyang

vi

PERNYATAAN

Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi ini adalah karya saya sendiri,

tidak terdapat karya yang pernah diajukan untuk memperoleh gelar kesarjanaan di

suatu perguruan tinggi dan sepanjang pengetahuan saya tidak terdapat karya atau

pendapat yang pernah ditulis atau diterbitkan oleh orang lain, kecuali yang secara

tertulis diacu dalam naskah ini dan disebutkan dalam daftar pustaka.

Apabila dikemudian hari terbukti pernyataan saya ini tidak benar, maka skripsi dan

gelar yang diperoleh batal demi hukum.

Makassar, 25 Juli 2013

Penyusun,

Risqah Mathar

Page 7: VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA ...digilib.unhas.ac.id/uploaded_files/temporary/Digital...Tinggi dinyatakan valid pada penetapan kadar zerumbon yang diperoleh dari lempuyang

vii

UCAPAN TERIMA KASIH

Alhamdulillah segala rasa syukur terpanjat ke hadirat Allah SWT, berkat

Rahmat dan Karunia-Nya yang dilimpahkan berupa kekuatan tenaga dan fikiran,

sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini. Shalawat dan salam penulis

haturkan kepada Nabi Muhammad SAW yang senantiasa menuntun seluruh umat

manusia ke jalan Allah SWT.

Skripsi ini disusun berdasarkan hasil penelitian penulis dengan judul “ Validasi

Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi pada Penetepan Kadar Zerumbon Yang

Diperoleh dari Lempuyang Wangi (Zingiber aromaticum Vahl ) untuk memenuhi

salah satu syarat mencapai gelar Sarjana Sains program studi Farmasi pada Fakultas

Farmasi Universitas Hasanuddin Makassar.

Dalam penyusunan skripsi ini penulis banyak mendapat dukungan dan

bantuan dari berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis ingin menyampaikan terima

kasih yang setulus-tulusnya dan penghargaan yang setinggi-tingginya kepada bapak

Drs. H. Syaharuddin Kasim, M.Si., Apt dan Ibu Dra. Chiristiana Lethe,M.Si.,Apt selaku

pembimbing yang telah memberikan bimbingan, arahan, beserta saran selama

penyusunan skripsi ini.

Page 8: VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA ...digilib.unhas.ac.id/uploaded_files/temporary/Digital...Tinggi dinyatakan valid pada penetapan kadar zerumbon yang diperoleh dari lempuyang

viii

Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada :

1. Ibu Prof. Dr. Elly Wahyudin, DEA, Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas

Hasanuddin.

2. Ibu Dr. Sartini.M.Si., Apt, Ibu Dra. Rosany Tayeb, M.Si., Apt dan Ibu Dra.Ermina

Pakki,M.Si., Apt selaku tim penguji skripsi yang memberikan saran dan arahannya.

3. Bapak/Ibu Dosen Fakultas Farmasi Universitas Hasanuddin atas segala Ilmu

pengetahuan yang diberikan selama masa perkuliahan.

4. Bapak/Ibu Staf Fakultas Farmasi Universitas Hasanuddin atas segala fasilitas dan

bantuan lainnya selama masa perkuliahan.

5. Ucapan terima kasih dan penghargaan yang tiada terhingga untuk Umi dan Abi

Tersayang serta saudaraku tercinta, terima kasih atas doa restu dan

pengorbanannya selama ini.

6. Teman-teman S1 farmasi, khususnya Nasriah,Soendaria Intan,Ayu Asyhari,Pratiwi

Syarifuddin dan Suhermawan. Jazakillah khoirant katsiran atas bantuan dan

dukungannya..Teman –teman Zerumbon ,Dian Chikita, Faisah, Angela dan Helmi

Nurliani terima kasih atas bantuan dan dukungannya selama ini .

7.Ucapan terima kasih saya kepada Sufrianto Jufri.SKg yang selalu memberikan

bantuan dan doa serta semangat selama ini.Dan kepada Risna Aspianti S.Kom

terima kasih atas bantuannya selama ini.

Akhirnya semoga karya ini dapat bermanfaat bagi pengembangan ilmu pengetahuan.

Amin Allahumma Amin.

Makassar, 25 Juli 2013

Risqah Mathar

Page 9: VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA ...digilib.unhas.ac.id/uploaded_files/temporary/Digital...Tinggi dinyatakan valid pada penetapan kadar zerumbon yang diperoleh dari lempuyang

ix

ABSTRAK

Telah dilakukan penelitian validasi metode kromatografi cair kinerja tinggi

pada penetapan kadar zerumbon yang diperoleh dari lempuyang wangi (Zingiber

aromaticum Vahl). Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui validitas metode

kromatografi cair kinerja tinggi pada penetapan kadar senyawa zerumbone dari isolat

lempuyang wangi yang dihasilkan dengan melihat parameter validasi yang meliputi;

presisi, limit kuantitasi,keterulangan, linearitas dan limit deteksi.Sistem kromatografi cair

kinerja tinggi terdiri dari kolom Shim-pack ODS C18 250x 4,6 mm menggunakan fase

gerak metanol pro HPLC dengan laju alir 0,6ul/menit dengan suhu 40oC. Berbagai

parameter dianalisis dengan menggunakan panjang gelombang maksimum 259 nm.

Berdasarkan data penelitian dapat disimpulkan bahwa Metode Kromatografi Cair Kinerja

Tinggi dinyatakan valid pada penetapan kadar zerumbon yang diperoleh dari lempuyang

wangi dengan hasil pengujian linearitas dengan konsentrasi 25,50,100,200,300,400,dan

500 dengan nilai r = 0,997.Hasil persisi sebesar 0,7% untuk pembanding dan 2,5% untuk

sampel.LOD dengan nilai 0,1 ug/ml dan LOQ 0,5ug/ml. Hasil pengujian Keterulangan

nilai Koevisien variasi yaitu 1,15% dan 2,53%.

Page 10: VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA ...digilib.unhas.ac.id/uploaded_files/temporary/Digital...Tinggi dinyatakan valid pada penetapan kadar zerumbon yang diperoleh dari lempuyang

x

ABSTRACT

Validation studies have been conducted high performance liquid chromatography method to assay zerumbon derived from Zingiber aromaticum Vahl. This study aims to determine the validity of the method of high performance liquid chromatography assay zerumbone compound of fragrant ginger isolates generated by looking at the parameter validation which includes; precision, limit of quantitation, repeatability, linearity and limit deteksi.Sistemkromatografi consists of high-performance liquid column Shim-pack 250X 4.6 mm C18 ODS using methanol mobile phase with a flow rate of HPLC pro 0.6 ul / min. Various parameters were analyzed using the maximum wavelength of 259 nm. Based on data from this study concluded that the method of High Performance Liquid Chromatography declared invalid on zerumbon assay obtained from ginger scented with the test results 25,50,100,200,300,400 linearity with concentration, and 500dengan value of 0.997. Results precision of 0.7 and 2.5% for comparator sampel.LOD% to the value of 0.1 ug / ml and LOQ 0.5 ug / ml. Repeatability test results Koevisien value variation is 1.15% and 2.53%.

Page 11: VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA ...digilib.unhas.ac.id/uploaded_files/temporary/Digital...Tinggi dinyatakan valid pada penetapan kadar zerumbon yang diperoleh dari lempuyang

xi

DAFTAR ISI

halaman

UCAPAN TERIMA KASIH ................................................................. vi

ABSTRAK ......................................................................................... viii

ABSTRACT ....................................................................................... ix

DAFTAR ISI ...................................................................................... x

DAFTAR TABEL ............................................................................... xiii

DAFTAR GAMBAR ........................................................................... xiv

DAFTAR LAMPIRAN ........................................................................ xv

BAB I PENDAHULUAN ..................................................................... 1

BAB II TINJAUAN PUSTAKA ............................................................ 5

II.1 Uraian Tumbuhan ............................................................ ........... 5

II.1.1 Klasifikasi Tumbuhan ................................................................ 5

II.1.2 Morfologi Tumbuhan ..................................................... ........... 5

II.1.3 Khasiat ..................................................................................... 6

II.1.4 Kandungan kimia ............................................................ ......... 6

II.2 Uraian Tentang Zerumbon.............................. ............................. 7

II.2.1 Terpen........................................................................................ 7

II.2.2 Sesqueterpenoid........................................................................ 7

II.2.3 Zerumbon .................................................................................. 8

II.3. Validasi Metode Analisis.............................................................. 8

II.3.1 Parameter Validasi .................................................................... 9

II.3.1.1Linearitas........ ......................................................................... 9

II.3.1.2 Limit Deteksi .......................................................................... 10

II.3.1.3 Limit Kuantifikasi .................................................................... 11

II.3.1.4 Ketelitian ......................................................................... 11

Page 12: VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA ...digilib.unhas.ac.id/uploaded_files/temporary/Digital...Tinggi dinyatakan valid pada penetapan kadar zerumbon yang diperoleh dari lempuyang

xii

II.3.1.5 Ketepatan................................................................................ 11

II.3.1.6 Selektivitas............................................................................... 12

II.4. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi .................................................. 12

II.4.1 Instrumen Kromatografi Cair Kinerja Tinggi................................ 13

II.4.2 Bagian Kromatografi Cair Kinerja Tinggi..................................... 13

II.4.2.1 Wadah Fase Gerak.................................................................. 13

II.4.2.2 Fase Gerak ............................................................................. 14

II.4.2.3 Pompa Pada Kromatografi Cir Kinerja Tinggi ......................... 15

II.4.2.4 Kolom dan Fase Diam pada KCKT ......................................... 16

II.4.2.5 Detektor KCKT......................................................................... 17

II.4.2.6 Tempat Injeksi Sampel ............................................................ 20

II.4.2.7 Komputer,Integrator,atau Rekorder.......................................... 21

II.4.3 Jenis-jenis KCKT........................................................................ 21

II.4.3.1. Kromatografi Adsorbsi............................................................. 21

II.4.2.2. Kromatografi Partisi................................................................. 22

II.4.2.3 Kromatografi Penukar Ion........................................................ 22

II.4.2.4. Kromatografi Pasangan Ion.................................................... 23

II.4.2.5. Kromatografi Eksklusi Ukuran................................................. 23

II.5.Derivatisasi pada KCKT................................................................. 24

II.6 Densitometri .................................................................................. 24

BAB III PELAKSANAAN PENELITIAN................................................. 25

III.1 Alat dan Bahan ............................................................................. 25

III.2 Metode Kerja ..................................... .......................................... 25

III.2.1 Pemilihan panjang gelombang .................................................. 25

III.3.Uji Validasi..................................................................................... 26

III.3.1 Penyiapan Larutan Baku Zerumbon............................................ 26

III.3.2 Uji Presisi .................................................................................... 26

Page 13: VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA ...digilib.unhas.ac.id/uploaded_files/temporary/Digital...Tinggi dinyatakan valid pada penetapan kadar zerumbon yang diperoleh dari lempuyang

xiii

III.3.3.Uji Keterulangan ......................................................................... 27

III.3.4 Uji Linearitas ............................................................................... 27

III.3.5 Uji LOQ dan LOD ....................................................................... 27

III.4 Analisis Data ................................................................................ 27

III.5 Pembahasan Hasil ........................................................................ 28

III.6 Pengambilan Kesimpulan .................................................................. 28

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN..................................................... 29

IV.1 Hasil Penelitian .............................................................................. 29

IV.1.1 Pemilihan Panjang Gelombang Maksimum…............................. 29

IV.1.2 Hasil Pengujian Linearitas .......................................................... 29

IV.1.3 Kurva Baku Linearitas................................................................. 30

IV.1.4 Hasil Pegujian Batas Deteksi dan Kuantitas .............................. 30

IV.1.5 Hasil Pengujian Presisi ............................................................... 31

IV.1.6 Hasil Pengujian Keterulangan Sampel ....................................... 31

IV.1.7 Hasil Pengujian Ketrulangan Pembanding ................................ 32

IV.2 Pembahasan.................................................................................. 32

IV.2.1 Pemilihan Panjang Gelombang Maksimum ................................ 33

IV.2.2 Presisi ......................................................................................... 33

IV.2.3 Linearitas .................................................................................... 34

IV.2.4 Batas Deteksi ............................................................................. 34

IV.2.5 Batas Kuantitas .......................................................................... 35

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ..................................................... 36

V.1 Kesimpulan ..................................................................................... 36

V.2 Saran .............................................................................................. 36

DAFTAR PUSTAKA .............................................................................. 37

Page 14: VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA ...digilib.unhas.ac.id/uploaded_files/temporary/Digital...Tinggi dinyatakan valid pada penetapan kadar zerumbon yang diperoleh dari lempuyang

xiv

DAFTAR TABEL

Tabel halaman

1.Hasil pengujian linearitas pada panjang gelombang max....................................... 29

2.Hasil Pengujian Batas Deteksi dan Batas Kuantitas .............................................. 30

3.Hasil Pengujian Presisi pada konsentrasi terendah dan konsentrasi tertinggi.......... 31

4. Hasil Pengujian Keterulangan Sampel 200 ppm...................................................... 31

5. Hasil Pengujian Keterulangan Pembanding Zerumbon .......................................... 32

Page 15: VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA ...digilib.unhas.ac.id/uploaded_files/temporary/Digital...Tinggi dinyatakan valid pada penetapan kadar zerumbon yang diperoleh dari lempuyang

xv

DAFTAR GAMBAR

Gambar halaman

1. Gambar stuktur zerumbone ...................................................................... 8

2.Instrumen dasar kromatografi cair kinerja tinggi ... ................................... 13

3.Injektor pada kromatografi cair kinerja tinggi………………........................ 20

4. Gambar panjang gelombang maksimum ................................................. 28

5. Grafik Data linearitas Zerumbon ............................................................... 30

6. Foto Tanaman lempuyang wangi( Zingiber aromaticum Vahl)................... 39

7. Foto Kromatografi Cair Kinerja Tinggi................ ....................................... 39

Page 16: VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA ...digilib.unhas.ac.id/uploaded_files/temporary/Digital...Tinggi dinyatakan valid pada penetapan kadar zerumbon yang diperoleh dari lempuyang

xvi

DAFTAR LAMPIRAN

halaman

1. Tanaman Lempuyang wangi ...................................................................... 39

2.Instrumen kromatografi cair kinerja tinggi ... .............................................. 39

3. Skema Kerja Penetapan Kadar Zerumbon dalam sampel dan presisi

metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi.........................……….................. 40

4. Pengujian Linearitas, Batas Deteksi dan Batas Kuantitas Metode

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi.................................................................... 41

5. Pengujian Keterulangan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi............. 42

6. Perhitungan LOD dan LOQ.......................................................................... 43

7. Perhitungan Presisi ..................................................................................... 45

8. Perhitungan Keterulangan .......................................................................... 46

9. Kromatogram Linearitas Dari HPLC............................................................. 47

10.Kromatogram Presisi Konsentrasi Terendah Dari HPLC ........................... 48

11. Kromatogram Presisi Konsentrasi Tertinggi Dari HPLC ............................ 49

12. Kromatogram Keterulangan Sampel Isolat Zerumbon HPLC .................. 50

13. Kromatogram Keterulangan Pembanding Zerumbon HPLC ................... 51

Page 17: VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA ...digilib.unhas.ac.id/uploaded_files/temporary/Digital...Tinggi dinyatakan valid pada penetapan kadar zerumbon yang diperoleh dari lempuyang

1

BAB I

PENDAHULUAN

Tumbuhan merupakan bahan alam yang banyak digunakan

sebagai obat tradisional dan telah digunakan sejak lama oleh masyarakat

Indonesia, bahkan sampai sekarang pengobatan ini terus berkembang

dan mengalami peningkatan baik untuk pemeliharaan kesehatan maupun

pengobatan gangguan kesehatan(1). Sementara ini banyak orang

beranggapan bahwa penggunaan tanaman obat atau obat tradisional

relatif lebih aman dibandingkan obat sintesis. Obat tradisional dan

tanaman obat banyak digunakan masyarakat menengah ke bawah

terutama dalam upaya preventif, promotif dan rehabilitatif. Salah satu

tanaman yang sering digunakan sebagai obat yaitu dari suku

Zingibericeae (lempuyang wangi)(2).

Tanaman lempuyang wangi termasuk familia atau suku

Zingiberaceae (Tampubolon, 1981). Bagian tumbuhan lempuyang wangi

yang digunakan sebagai obat adalah rimpangnya (rhizoma). Rimpang

lempuyang wangi memiliki aroma yang khas yang disebabkan oleh

komponen kimia yang terkandung di dalam minyak atsiri lempuyang

wangi. Senyawa kimia yang mendominasi susunan minyak atsiri pada

rimpang lempuyang wangi adalah limonen, yang merupakan zat aktif

yang menyebabkan lempuyang wangi mengeluarkan bau sedap yang

khas. Secara tradisional rimpang lempuyang wangi digunakan untuk

mengobati sakit perut, sakit kulit, influenza, anemia, malaria, batuk, dan

Page 18: VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA ...digilib.unhas.ac.id/uploaded_files/temporary/Digital...Tinggi dinyatakan valid pada penetapan kadar zerumbon yang diperoleh dari lempuyang

2

vertigo. Zerumbon yang merupakan senyawa aktif dalam lempuyang

wangi diduga mempunyai khasiat menyembuhkan berbagai penyakit (Indri

Ambarsari et al 2007). Manju dan Nalini (2005) melaporkan bahwa dalam

rimpang lempuyang wangi yang berperan sebagai zat anti kanker adalah

senyawa sesquiterpene zerumbon(3.4).

Zerumbon merupakan suatu seskuirtepenue berbentuk kristal

golongan terpenoida yang terdiri dari tiga satuan isoprena yang memiliki

bobot molekul (BM) 218 m/z, bersifat nonpolar, volatil dan memiliki

karakteristik sitotoksik yang selektif terhadap garis sel kanker dan garis

sel normal, serta sebagai anti inflamasi dan kemoterapi(2).

Zerumbon telah terbukti sangat ampuh sebagai antikanker dan

antitumor, zerumbon menekan aktivasi NF-kappaB dan

NF-kappaB- diatur ekspresi gen yang disebabkan oleh karsinogen, dan

melaporkan bahwa penghambatan ini dapat memberikan molekul dasar

untuk pencegahan dan pengobatan kanker (Takada et al., 2005). Pada

tahun yang sama juga( Huang 2005) mengidentifikasi bahwa zerumbon

menghambat pertumbuhan P-388D sel dan fragmentasi DNA yang

diinduksi dan secara signifikan memperpanjang hidup P-388D (1)-

bantalan CDF(1) pada tikus. Selain itu juga menghambat pertumbuhan

lini sel leukemia manusia (HL-60 sel) dan Kanker usus besar manusia

(HT-29) in vitro (Kirana et al.,2003). Zerumbon bertindak sebagai

kemoterapi dan sangat ampuh melawan kanker usus besar dan kulit

(Tanaka et al., 2001)(5).

Page 19: VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA ...digilib.unhas.ac.id/uploaded_files/temporary/Digital...Tinggi dinyatakan valid pada penetapan kadar zerumbon yang diperoleh dari lempuyang

3

Untuk mendukung pengembangan sediaan obat tradisional dari

lempuyang wangi, maka diperlukan suatu metode analisis untuk

menentukan zat aktif dalam tanaman tersebut. Menurut Rohman dan

Ibnu (2007), kriteria yang harus dipenuhi suatu metode analisis yang baik

adalah: Peka (sensitive ) artinya metode harus dapat digunakan untuk

menetapkan kadar senyawa dalam konsentrasi yang kecil. Selektif, artinya

untuk penetapan kadar senyawa tertentu, metod e tersebut tidak banyak

terpengaruh oleh adanya senyawa lain. Tepat ( p[recise ) artinya metode

tersebut menghasilkan suatu hasil analisis yang sama atau hampir sama

dalam satu seri pengukuran (penetapan). Teliti ( accurate ) artinya metode

dapat menghasilkan nilai rata-rata ( mean) yang sangat dekat dengan nilai

sebenarnya (true value). Kasar (rugged) artinya ada perubahan komposisi

pelarut atau variasi lingkungan tidak menyebabkan perubahan hasil

analisis. Praktis artinya metode tersebut mudah dikerjakan serta tidak

banyak memerlukan waktu dan biaya(6,7,8).

Menurut International conference of harmonization (ICH) ada

sepuluh parameter validasi yang dapat dilakukan adalah Presisi, Batas

deteksi, Batas kuantitas, Spesifitas, Linearitas, Kisaran (range),

Ketahanan, Kekasaran dan Kesesuaian sistem (6). Salah satu metode

analisis yang banyak untuk digunakan saat ini adalah kromatografi cair

kinerja tinggi. Kromotografi cair kinerja tingkat tinggi (KCKT). Hampir

semua laboratorium analisis kimia memiliki instrumen KCKT. Kegunaan

umum KCKT adalah untuk pemisahan, pemurnian dan penentuan kadar

Page 20: VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA ...digilib.unhas.ac.id/uploaded_files/temporary/Digital...Tinggi dinyatakan valid pada penetapan kadar zerumbon yang diperoleh dari lempuyang

4

senyawa obat dalam sediaan farmasetika. Lebih lanjut, KCKT juga dapat

digunakan untuk dentifikasi kualitatif senyawa obat dengan mendasarkan

pada parameter waktu retensi senyawa obat standar dan senyawa obat

dalam sampel(7).

Berdasarkan latar belakang yang telah diuraikan diatas, maka

rumusan masalah yang dapat diambil adalah: “apakah metode

kromatografi cair kinerja tinggi valid untuk digunakan pada penetapan

kadar senyawa zerumbone yang diperoleh dari Lempuyang wangi

(Zingiber aromaticum Vahl) memenuhi uji validasi?

Penelitian ini memiliki tujuan untuk mengetahui validitas metode

kromatografi cair kinerja tinggi pada penetapan kadar senyawa

zerumbone dari ekstrak lembuyang wangi yang dihasilkan dengan

melihat parameter validasi yang meliputi; presisi, keterulangan, limit

kuantitasi, lineritas dan limit deteksi.

Hasil penelitian ini diharapkan dapat diperoleh suatu metode yang

valid dan handal sehingga dapat digunakan sebagai acuan dalam proses

analisis senyawa zerumbon dalam sediaan obat.

Page 21: VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA ...digilib.unhas.ac.id/uploaded_files/temporary/Digital...Tinggi dinyatakan valid pada penetapan kadar zerumbon yang diperoleh dari lempuyang

5

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

II.1 Uraian Bahan

II.1.1Klasifikasi

Regnum : Plantae

Divisi : Spermathophyta

Anak divisi : Angiospermae

Kelas : Monocotyledonae

Bangsa : Zingiberales

Suku : Zingiberaceae

Marga : Zingiber

Jenis : Zingiber aromaticum Vahl .(9)

II.1.2 Morfologi

Habitat tanaman ini yaitu di semak dengan tinggi kurang lebih 75

cm, mempunyai batang yang semu, lunak, merupakan pelepah daun,

bulat, didalam tanah membentuk rimpang, berwarna hijau. Daun tunggal

berseling, bulat telur dengan ujung meruncing, tepi rata pertulangan

menyirip, panjang kurang lebih 20 cm, lebar 9 cm, warna hijau. Bunga

berbentuk tandan terdapat diujung, rangkai panjang kurang lebih 20 cm,

kelopak bergiigi satu, tajuk berbentuk tabung, putik salu berwarna hijau

kemerah-merahan. Buah kotak ,bulat telur,panjang kurang lebih 12 mm,

diameter 8mm, berwarna merah. Bijinya bulat panjang, diameter kurang

lebih 4mm±.Akar serabut , putih kotor(9).

Page 22: VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA ...digilib.unhas.ac.id/uploaded_files/temporary/Digital...Tinggi dinyatakan valid pada penetapan kadar zerumbon yang diperoleh dari lempuyang

6

II.1.3Khasiat

Rimpang Zingiber aromaticum berkhasiat sebagai obat masuk

angin,obat sakit perut, obat wasir, obat sesak nafas, obat pilek, obat

radang usus,obat kolera, obat malaria, obat syaraf lemah, obat encok dan

obat cacing,penambah darah dan penambah nafsu makan. Untuk obat

rnasuk angin dipakai ± 10 gram rimpang segar Zingiber aromaticum,

dicuci, diparut, peras kemudian disaring. Hasil saringan ditambah 2

sendok makan madu dan 2 gelas air matang panas, diaduk, diminum

sehari dua kali sama banyak pagi dan sore(9).

II.1.4Kandungan kimia

Kandungan zat dalam rimpang lempuyang wangi antara lain adalah

α -kurkumen, bisabolen, zingiberen, kariofilen, seskuifelandren, zerumbon,

limonen, kamfer, zat pedas gingerol, sogaol, zingeron, paradol,

heksahidroksurkumin, dihidrogingerol. Informasi lain menyebutkan bahwa

kandungan zat dalam rimpang lempuyang wangi antara lain adalah

damar, tanin, resin, pati, gula (BPPT, 2005)(2).

Beberapa senyawa kimia penyusun minyak atsiri dari lempuyang

wangi adalah α-curcumine 1,7-bis(4-hydroxy-3-methoxy-phenyl)hepta-1,6-

diene-3,5-dione (C21H20O 6). Bisabolene 2-methyl-6-(4-methyl-1-c yclohex-

3-enyliden e)-hept-2-ene( C15H 24). Zingiberen 5-(1,5-dimethylhex-4-enyl)-

2-methylcyklohexa-1,3-dien (C15H24O) α-kariofilen 2,6,9-humulatrien, -

humulen, humulen ( C15H24). Zerumbone 2,6,9,9-Tetramethylcycloundeca-

2,6,10-trien-1-one (C15H22O) Limonen 1-methyl-4-prop-1-en-2-yl-

Page 23: VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA ...digilib.unhas.ac.id/uploaded_files/temporary/Digital...Tinggi dinyatakan valid pada penetapan kadar zerumbon yang diperoleh dari lempuyang

7

cyclohexene ( C10H16) b-linalool 3,7-dimethylocta-1,6-dien-3-ol ( C10H 18O

)Camphor 1,7,7-trimethylnorbornan-2-one ( C10H 16O) Gingerol 5-hydroxy-

1-(4-hydroxy-3-meth oxy-cyclohexyl)-decan-3-one( C17H 32O 4).Paradol 1-

(4-hydroxy-3-methoxy-phenyl)decan-3-one C17H 26O 3) (2).

II.2 Uraian Tentang Zerumbone

II.2.1 Terpen

Kata Terpenoid mencakup sejumlah besar senyawa tumbuhan, dan

istilah ini digunakan untuk menunjukkan bahwa secara biosintesis semua

senyawa tumbuhan itu berasal dari senyawa yang sama. Jadi, semua

terpenoid dari molekul Isoprene CH2=C(CH3)-CH=CH2 dan kerangka

karbonnya dibangun oleh penyambungan dua atau lebih satuan C5.

Kemudian senyawa ini dipilah-pilah menjadi beberapa golongan

berdasarkan jumlah satuan yang terdapat dalam senyawa tersebut :

hemiterpene (C5), monoterpena (C10), seskuiterpena (C15), diterpena

(C20), sesterpena (C25) dan triterpena (C30) (10,17)

II.2.2 Sesquiterpenoid

Sesquiterpenoid adalah senyawa C15, biasanya dianggap berasal

dari tiga satuan isoprene. Seperti Monoterpenoid, Sesquiterpenoid

terdapat sebagai komponen minyak atsiri yang tersuling uap, dan

berperan penting dalam memberi aroma kepada buah dan bunga yang

kita kenal (10,17).

II.2.3 Zerumbon

Page 24: VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA ...digilib.unhas.ac.id/uploaded_files/temporary/Digital...Tinggi dinyatakan valid pada penetapan kadar zerumbon yang diperoleh dari lempuyang

8

Zerumbon merupakan suatu seskuiterpena berbentuk kristal

golongan terpenoida yang terdiri dari tiga satuan isoprena yang memiliki

bobot molekul(BM) 218 m/z,bersifat nonpolar, volatil, memiliki struktur

keton silang terkonjugasi pada sebelas cincin karbon (3).

Zerumbone memiliki rumus molekul C15H22O dengan berat

molekul 218.3345800, serta titik didih 321oC - 322oC. sinonim dari

Zerumbone berdasarkan data IUPAC adalah 2,6,9,9-

tetramethylcycloundeca-2,6,10-trien-1-one(10).

Gambar 1. Struktur Zerumbone (C15H22O).

II.3 Validasi Metode Analisis

Validasi metode analisis merupakan suatu tahapan penting dalam

penjaminan mutu analisis kuantitatif. Validasi metode menurut United

States Pharmacopeia(USP) dilakukan untuk menjamin bahwa metode

analisis bersifat akurat, spesifik, reprodusibel, dan tahan pada kisaran

analit yang akan dianalisis. Selain itu, validasi metode dilakukan jika

terjadi perubahan kondisi antara kondisi analisis dan kondisi pada saat

validasi metode, atau terjadi perubahan metode dari metode standar.

Beberapa manfaat validasi metode analisis adalah untuk mengevaluasi

Page 25: VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA ...digilib.unhas.ac.id/uploaded_files/temporary/Digital...Tinggi dinyatakan valid pada penetapan kadar zerumbon yang diperoleh dari lempuyang

9

unjuk kerja suatu metode analisis, menjamin prosedur analisis, menjamin

keakuratan dan kedapatulangan hasil prosedur analisis, dan mengurangi

risiko penyimpangan yang mungkin timbul (6,7).

Validasi menurut Harmita merupakan suatu tindakan penilaian

terhadap parameter tertentu berdasarkan percobaan laboratorium untuk

membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk

penggunaannya. Validasi menurut SK Menkes RI

No.43/Menkes/SK/II/1988 tentang cara pembuatan obat yang baik(CPOB)

merupakan suatu tindakan pembuktian dengan cara yang sesuai bahwa

tiap bahan, prosedur, kegiatan, sistem, perlengkapan, atau mekanisme

yang digunakan dalam produksi dan pengawasan akan senantiasa

mencapai hasil yang diinginkan (Depkes RI 2001). Association of South

East Asian Nation Good Manufacturing Practice (ASEAN GMP)

menyatakan bahwa validasi adalah kegiatan membuktikan dengan pasti

bahwa material, proses, prosedur, aktivitas, sistem, peralatan, atau

mekanisme yang digunakan di pabrik akan mencapai hasil yang

diharapkan pada standar yang konsisten (7).

II.3.1 Parameter Validasi

II.3.1.1.Linearitas

Linearitas menunjukkan kemampuan suatu metode analisis untuk

memperoleh hasil pengujian yang sesuai dengan konsentrasi analit dalam

contoh pada kisaran konsentrasi tertentu. Linearitas suatu metode analisis

adalah ukuran yang menunjukkan tingkat kesesuaian atau korelasi antara

Page 26: VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA ...digilib.unhas.ac.id/uploaded_files/temporary/Digital...Tinggi dinyatakan valid pada penetapan kadar zerumbon yang diperoleh dari lempuyang

10

kadar analit dan respons detektor, dinyatakan sebagai koefisien korelasi

(r). Respons detektor yang digunakan adalah luas area puncak untuk

instrumen Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. Koefisien korelasi didapat

dengan cara menghitung regresi dari persamaan linearnya, sedangkan

perpotongan dengan sumbu y menyatakan ukuran biasnya. Selang

linearitas adalah selang antara konsentrasi tertinggi dan terendah dari

analit yang dapat ditetapkan menggunakan suatu metode dengan tingkat,

ketelitian, kecermatan, dan koefisien korelasi yang telah dilakukan. Nilair

yang dihasilkan lebih besar atau sama dengan 0.9900(8). Secara

matematis, nilai r dapat dihitung dengan menggunakan rumus dengan

r = koefisien korelasi

xi = konsentrasi analit setiap ulangan

x = konsentrasi analit rerata

yi = luas area puncak setiap ulangan

y = luas area puncak rerata

II.3.1.2.Limit Deteksi

Limit deteksi (LD) adalah konsentrasi analit terendah di dalam

suatu contoh yang dapat dideteksi tetapi tidak harus terkuantitasi pada

kondisi percobaan yang ditetapkan. Umumnya nisbah respons antara

analit:derau adalah 3:1. LD dihitung dari rerata kemiringan garis dan

simpangan baku intersep kurva standar yang diperoleh (10,11).

Page 27: VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA ...digilib.unhas.ac.id/uploaded_files/temporary/Digital...Tinggi dinyatakan valid pada penetapan kadar zerumbon yang diperoleh dari lempuyang

11

II.3.1.3 Limit Kuantifikasi

Limit kuantifikasi adalah konsentrasi analit terendah yang terdapat

dalam contoh yang dapat diukur secara tepat dan teliti. Limit Kuantifikasi

dapat dihitung sebagai konsentrasi analit yang memiliki respons

analit:derau sebesar 10:1. LK dihitung dari rerata kemiringan garis dan

simpangan baku intersep kurva standar yang diperoleh (10,11).

II.3.1.4.Ketelitian

Ketelitian dapat dinyatakan dengan tiga cara, yaitu

kedapatulangan, ketelitian intermediet, dan ketertiruan. Ketelitian adalah

kesamaan hasil dari tiap individu ketika metode tersebut diterapkan

berulang kali pada berbagai pencuplikan suatu contoh homogen.

Ketelitian diukur dengan menghitung simpangan baku relatif (SBR) dari

lima kali pengukuran ulang. Menurut ICH syarat penerimaan parameter

validasi ini, sebagai berikut: sangat teliti (%SBR 1), teliti (%SBR 1-2),

sedang (%SBR 2-5), dan tidak teliti (%SBR 5)(12,20).

II.3.1.5.Ketepatan

Ketepatan suatu prosedur analisis didefinisikan sebagai kedekatan

hasil yang diterima (baik sebagai nilai teoretis maupun dengan nilai

rujukan yang diterima) dengan nilai yang diperoleh dari hasil pengukuran.

Ketepatan adalah kedekatan nilai hasil percobaan yang diperoleh dari

suatu metode terhadap nilai sebenarnya. Ketepatan diukur dengan

menghitung perolehan kembali (PK) menggunakan metode penambahan

Page 28: VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA ...digilib.unhas.ac.id/uploaded_files/temporary/Digital...Tinggi dinyatakan valid pada penetapan kadar zerumbon yang diperoleh dari lempuyang

12

standar. Nilai PK bergantung pada matriks contoh, prosedur proses

contoh, dan konsentrasi analit (12,13).

II.3.1.6 Selektivitas (Spesifisitas)

Definisi Selektivitas atau spesifisitas suatu metode adalah

kemampuannya yang hanya mengukur zat tertentu saja secara cermat

dan seksama dengan adanya komponen lain yang mungkin ada dalam

matriks sampel. Selektivitas seringkali dapat dinyatakan sebagai derajat

penyimpangan (degree of bias) metode yang dilakukan terhadap sampel

yang mengandung bahan yang ditambahkan berupa cemaran, hasil urai,

senyawa sejenis, senyawa asing lainnya, dan dibandingkan terhadap hasil

analisis sampel yang tidak mengandung bahan lain yang ditambahkan

(13,14).

II.4. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Kromatografi merupakan tehnik dimana analit atau zat-zat tertentu

terpisah perbedaan kecepatan elusi dikarenakan zat-zat ini melewati

suatu kolom kromatografi. KCKT adalah suatu teknik analisis kromatografi

dengan menggunakan tekanan tinggi yang berguna untuk pemisahan ion

atau molekul terlarut dalam suatu larutan. Teknik ini berkembang untuk

mengatasi kelemahan-kelemahan pemisahan pada kromatografi gas,

seperti senyawa yang relatif tidak tahan panas dan senyawa yang tidak

volatil. KCKT berdasarkan kepolaran kolomnya dibagi menjadi dua, yaitu

fase normal dan terbalik. Kromatografi fase normal menggunakan fase

diam lebih polar daripada fase gerak, sedangkan pada kromatografi fase

Page 29: VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA ...digilib.unhas.ac.id/uploaded_files/temporary/Digital...Tinggi dinyatakan valid pada penetapan kadar zerumbon yang diperoleh dari lempuyang

13

terbalik, fase gerak lebih polar daripada fase diam. Proses pemisahan

campuran komponen terjadi di dalam kolom, yaitu berdasarkan perbedaan

distribusi masing-masing komponen pada fase diam dan fase gerak. Zat

zat yang berinteraksi kuat dengan fase diam akan tertahan lebih lama

dalam kolom, sedangkan yang berinteraksi lemah akan keluar dengan

cepat dari kolom (7,13,14).

II.4.1 Instrumen Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Instrumen Kromatografi Cair Kinerja Tinggi terdiri atas 6 bagian ,

yakni: wadah fase gerak (reservoir), pompa (pump), tempat injeksi sampel

(injector), kolom (column), detektor (detector) dan perekam (recorder)(18).

Gambar 2. Instrumen dasar kromatografi cair kinerja tinggi

II.4.2 Bagian –bagian Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

II.4.2.1.Wadah Fase Gerak

Wadah fase gerak merupakan wadah untuk menampung fase

gerak yang digunakan selama proses pemisahan dengan KCKT. Wadah

Page 30: VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA ...digilib.unhas.ac.id/uploaded_files/temporary/Digital...Tinggi dinyatakan valid pada penetapan kadar zerumbon yang diperoleh dari lempuyang

14

ini harus inert atau lembam dan bersih atau tidak bereaksi dengan

komponen fase gerak. Sebagai wadah fase gerak , dapat digunakan

wadah pelarut kosong ataupun labu laboratorium. Wadah ini biasanya

menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter(7,13).

Fase gerak sebelum digunakan harus dilakukan degassing atau

penghilangan gas yang ada pada fase gerak, sebab akan mengacaukan

analisis. Adanya pengotor dalam reagen dapat menyebabkan gangguan

pada sistem kromatografi. Adanya partikel kecil dapat terkumpul dalam

kolom atau dalam tabung yang sempit, sehingga dapat mengakibatkan

suatu kekosongan pada kolom. Karena itu fase gerak sebelum digunakan

harus disaring terlebih dahulu (7).

II.4.2.2.Fase Gerak

Fase gerak atau biasanya disebut eluen terdiri atas satu atau

campuran pelarut bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam

daya elusi dan resolusi. Fase gerak harus berinteraksi dengan fase diam

yang sesuai untuk memisahkan campuran senyawa obat secepat dan

seefisien mungkin. ktiteria pemilihan fase gerak didasarkan pada:

a.Viskositas;pelarut dengan viskositas rendah menghasilkan tekanan

yang lebih rendah dibandingkan pelarut dengan viskositas tinggi pada

kecepatan alir tertentu. Viskositas rendah juga memungkinkan

kromatografi yang lebih cepat karena perpindahan massa berlangsung

lebih cepat.

Page 31: VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA ...digilib.unhas.ac.id/uploaded_files/temporary/Digital...Tinggi dinyatakan valid pada penetapan kadar zerumbon yang diperoleh dari lempuyang

15

b.Transparansi terhadap UV ;jika detektor UV yang digunankan ,maka

fase gerak harus transparan secara sempurna pada panjang

gelombang yang digunakan.

c.Indeks bias ;hal ini hanya penting jika detektor indeks bias yang

digunakan. Perbedaan indekls bias antara pelarut dengan sampel harus

besar jika kita bekerja dengan batas-batas deteksi tertentu.

d.Titik didih;titik didih fase gerak yang rendah diperlukan jika eluat akan

dilakukan pemrosesan lebih lanjut supaya memudahkan dalam

penguapannya.

e.Kemurnian ;kriteria ini mempunyai makna yang berbeda tergantung

pada penggunaan yang diinginkan ,yakni tidak adanya senyawa yang

mengganggu pada bentuk deteksi yang digunakan ,tidak adanya

senyawa yang menggganggu elusi gradien.

f.Lembam (inert) terkait dengan sennyawa sampel ;fase gerak harus tidak

bereaksi sama sekali dengan campuran sampel .

g.Toksisitas;seorang analis harus menghindari penggunaan produk yang

toksik semaksimal mungkin. Pelarut-pelarut terklorinasi dapat

melepaskan gas fosgen yang sangat toksik.

h.Harga

II.4.2.3.Pompa pada Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Pompa yang cocok digunakan pada KCKT adalah pompa yang

mempunyai syarat sebagai syarat wadah pelarut yakni pompa harus inert

terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah

Page 32: VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA ...digilib.unhas.ac.id/uploaded_files/temporary/Digital...Tinggi dinyatakan valid pada penetapan kadar zerumbon yang diperoleh dari lempuyang

16

gelas,baja tahan karat, teflon dan batu nilam. Pompa yang digunakan

sebaiknya sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 500psi dan

mampu mengalirkan fese gerak dengan kecepatan alir 3 ml/menit . Untuk

tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase

gerak dengan kecepatan 20 ml/ menit(15).

Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak

adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung

secara tepat, reprodusibel, konstan dan bebas dari gangguan. Ada dua

jenis pompa pada kckt yaitu pompa dengan tekanan konstan , dan pompa

dengan aliranfase gerak yang konstan. Tipe pompa dengan aliran fase

gerak yang konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan tipe pompa

dengan tekanan konstan (7,13,16).

II.4.2.4.Kolom dan Fase Diam pada KCKT

Ada 2 jenis kolom pada KCKT yaitu kolom konvensional dan kolom

mikrobor. Kolom mikrobor mempunyai tiga keuntungan yang utama

dibanding dengan kolom konvensional ,yakni:

a.Komsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil

dibanding dengan kolom konvensional karenapada kolom mikrobor

kecepatan alir fase gerak lebih lambat 10-100 ul/menit.

b.Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor

lebih ideal jika digabung dengan spektrometer massa.

Page 33: VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA ...digilib.unhas.ac.id/uploaded_files/temporary/Digital...Tinggi dinyatakan valid pada penetapan kadar zerumbon yang diperoleh dari lempuyang

17

c.Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat

,karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel

terbatas misal sampel klinis.

II.4.2.5.Detektor KCKT

Detektor pada KCKT dikelompokkan menjadi dua golongan yaitu

detektor universal( yang mampu mendeteksi zat secara umum,tidak

bersifat spesifik,dan tidak bersifat selektif). Seperti detektor indeks bias

dan detektor spektrometer massa dan golongan detektor yang spesifik

yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif seperti

detektor uv-vis , detektor fluoresensi, dan elektrokimia (7,14,15).

Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai

berikut;

1.Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel

2.Mempunyai sensitifitas yang tinggi ,yakni mampu mendeteksi solut

pada kadar yang sangat kecil.

3.Stabil dalam pengoperasiannya

4.Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan

pelebaran pita.

5.Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada

kisaran yang luas.

6.Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fasegerak

Page 34: VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA ...digilib.unhas.ac.id/uploaded_files/temporary/Digital...Tinggi dinyatakan valid pada penetapan kadar zerumbon yang diperoleh dari lempuyang

18

Jenis detektor yang digunakan pada KCKT

a.Detektor Spektrofotometer UV-Vis

Detektor jenis ini merupakan detektor yang paling banyak

digunakan dan sangat berguna untuk analisis di bidang farmasi karena

kebanyakan senyawa obat yang mempunyai struktur yang dapat

menyerap sinar UV-Vis. Detektor ini didasarkan pada adanya

penyerapan radiasi ultraviolet (UV) dan sinar tampak (Vis) pada kisaran

panjang gelombang 190-800 nm oleh spesies solut yang mempunyai

struktur-struktur atau gugus-gugus kromoforik. Sel detektor umumnya

berupa tabung dengan diameter 1 nm dan panjang celah optiknya10 nm,

serta diatur sedemikian rupa sehingga mampu menghilangkan pengaruh

indeks bias yang dapat mengubah absorbansi yang terukur(7,16,18)

b.Detektor photodiode-array (PDA)

Detektor UV-Vis merupakan detektor yang paling banyak dipakai,

akan tetapi karena banyak analit yang diukur maka akan ada

kecenderungan puncak-puncak kromatogram yang tidak terdeteksi dan

juga akan ada detektor UV-Vis dengan berbagai keistimewaan. Detektor

ini mampu memberikan kumpulan kromatogram secara simultan pada

panjang gelombang yang berbeda dalam sekali proses (single run).

Selama proses berjalan, suatu kromatogram pada panjang gelombang

yang diinginkan(biasanya antara 190-400) dapat ditampilkan. Dengan

demikian PDA memberikan lebih banyak informasi komposisi sampel

dibanding dengan detektor UV-Vis. Dengan detektor ini, juga diperoleh

Page 35: VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA ...digilib.unhas.ac.id/uploaded_files/temporary/Digital...Tinggi dinyatakan valid pada penetapan kadar zerumbon yang diperoleh dari lempuyang

19

spektrum UV tiap puncak yang terpisah sehingga dapat dijadikan

sebagai alat yang penting untuk memilih pajang gelombang maksimal

untuk sistem KCKT yang digunakan. Dan akhirnya dengan

membandingkan antara spektra analit dengan spektra seyawa yang

sudah diketahui.(7,16,18)

c. Detektor fluoresensi

Fluoresensi merupakan fenomena luminisensi yang terjadi ketika

suatu seyawa menyerap sinar UV atau visibel lalu mengemisikannya

pada gelombang yang lebih besar. Tidak semua senyawa obat

mempunyai sifat fluoresen sehingga detektor fluoresensi ini sangat

spesifik. Di samping itu, detektor ini juga sangat sensitif dibandingkan

dengan detektor UV.(7,16,18)

d. detektor indeks bias

Detektor indeks bias merupakan detektor yang bersifat universal

yang mampu memberikan respon (signal) pada setiap zat terlarut.

Detektor ini akan direspon setiap perbedaan indeks bias antara analit

(zat terlarut) dengan pelarutnya (fase geraknya). Kelemahan yang

utama detektor ini adalah bahwa indeks bias dipengaruhi oleh suhu,

oleh karena itu suhu fase gerak,kolom, dan detektor harus dikendalikan

secara seksama.(7,16,18)

e. detektor elektrokimia

Banyak senyawa organik (termasuk oleh) dapat dioksidasi atau

direduksi secara elektrokimia pada elektroda yang cocok. Arus yang

Page 36: VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA ...digilib.unhas.ac.id/uploaded_files/temporary/Digital...Tinggi dinyatakan valid pada penetapan kadar zerumbon yang diperoleh dari lempuyang

20

dihasilkan pada proses ini dapat diperkuat hingga memberikan respon

yang sesuai. Kepekaan detektor elektrokimia pasa umumnya tinggi.

Detektor elektrokimia yang paling banyak digunakan adalah detektor

konduktivitas dan detektor amperometri.(7,16,18)

II.IV.2.6 Tempat Injeksi Sampel (Injector)

Ada 3 jenis macam tempat injeksi sampel atau injektor (injector),

yakni: tempat injeksi sampel syringe (syringe injector), katup sampling

(sampling valve) dan tempat injeksi sampel otomatik (automatic

injector). Tempat injeksi sampel syringe (syringe injector) merupakan

bentuk tempat injeksi sampel atau injektor (injector) yang paling

sederhana(18)

Gambar 3. Katup sampling (sampling valve) atau tempat injeksi sampel manual

(manual injector)

Katup sampling (sampling valve) atau tempat injeksi sampel manual

(manual injector) mengandung 6 katup saluran dilengkapi dengan rotor,

lengkungan sampel (sample loop) dan celah jarum suntik (needle port).

Page 37: VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA ...digilib.unhas.ac.id/uploaded_files/temporary/Digital...Tinggi dinyatakan valid pada penetapan kadar zerumbon yang diperoleh dari lempuyang

21

Larutan sampel akan disuntikkan kedalam lengkungan sampel (sample

loop) dengan jarum suntik gauge pada posisi “masuk (load)” dan larutan

sampel yang ada di lengkungan sampel (sample loop) kemudian akan

dialirkan ke kolom dengan memutar rotor ke posisi “injek (inject)”. Ukuran

lengkungan sampel (sample loop) eksternal bervariasi antara 6 μL hingga

2 mL (Ornaf dan Dong, 2005). Tempat injeksi sampel otomatik (automatic

injector) atau disebut juga autosampler memiliki prinsip yang mirip, hanya

saja sistem pemasukkan sampelnya bekerja secara otomatis.

II.4.2.7.Komputer ,Integrator,atau Rekorder

Alat pengumpul data seperti komputer ,integrator atau

rekorder,dihubungkan dengan detektor..Alat ini akan mengukur sinyal

elektronik yang dihasilkan oleh detektor lalu memplotkannya sebagai

suatu kromatogram yang selanjutnya dapat dievaluasi oleh seorang

analis(7,19).

II.4.3 Jenis –jenis KCKT

II.4.3.1.Kromatografi Adsorbsi

Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan fase

diam silika gel dan alumina ,meskipun demikian sekitar 90% kromatografi

ini memakai silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan alumina

terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut. Gugus

silanol pada silika mempunyai reaktifitas yang berbeda ,karenanya solut

dapat terikat secara kuat sehingga dapat menyebabkan puncak yang

berekor atau tailing. Fase gerak yang digunakan untuk fase diam silika

Page 38: VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA ...digilib.unhas.ac.id/uploaded_files/temporary/Digital...Tinggi dinyatakan valid pada penetapan kadar zerumbon yang diperoleh dari lempuyang

22

atau alumina berupa pelarut nonpolar yang ditambah dengan pelarut polar

yang ditambah dengan pelarut polar untuk meningkatkan kemampuan

elusinya sehingga tidak timbul pengekoran puncak ,misalnya n heksan

ditambah metanol (7,15).

II.4.3.2.Kromatografi Partisi

Kromatografi jenis ini disebut juga dengan kromatografi fase terikat

.Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah siika yang dimodifikasi

secara kimawi atau fase terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk

memodifikasi silika adalah hidrokarbo-hidrokarbon non polar seperti fenil.

Fase diam yang paling populer digunakan oktadesisilan dan kebanyakan

pemisahannya adalah fase terbalik. Sebagai fase gerak adalah campuran

metanol atau asetonitril dengan air (15).

II.4.3.3.Kromatografi penukar ion

KCKT penukaran ion menggunakan fase diam yang dapat menukar

kation atau anion suatu fase gerak. Ada penukaran ion yang beredar

dipasaran, meskipun demikian yang paling luas penggunaannya adalah

polistiren resin.. Dalam hal ini, cicin benzen telah tersulfonasi untuk

membentuk penukar ion kation asam sulfonat yang kuat.(B) merupakan

struktur resin penukaran anion dengan matriks polistiren yang berikat

silang satu sama lain yang sama, tetapi dengan gugus tetraalkil amonium

(16).

Page 39: VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA ...digilib.unhas.ac.id/uploaded_files/temporary/Digital...Tinggi dinyatakan valid pada penetapan kadar zerumbon yang diperoleh dari lempuyang

23

II.4.3.4.Kromatografi pasangan ion

Kromatografi pasangan ion merupakan alternatif kromatografi

penukaran ion. Beberapa masalah dapat dipecahkan dengan kedua

metode ini akan tetapi penukaran ion tidak sebaik dengan kromatografi

pasangan ion untuk pemisahan campuran-campuran yang bersifat

asam,basa dan yang bersifat netral dibawah lingkungan tertentu.

Keuntungan kromatografi pasangan ion untuk pemisahan senyawa

senywa ionik adalah:

a.sistem fase terbalik dapat digunakan untuk pemisahan

b.campuran asam,basa ,netral dan juga molekul-molekul amfoterik dapat

dipisahkan

c.kromatografi pasangan ion juga merupakan pilihan yang baik jika nilai

pka analit serupa dan

d.Selektifitas dapat dipengaruhi oleh pemilihan pasangan ion yang

bermuatan berlawanan.(16,18)

II.4.3.5.Kromatografi Eksklusi Ukuran

Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan

dapat digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan

berat moolekul kurang dari 2000 dalton. Fase diamyang digunakan dapat

berupasilika atau poliimer yang bersifat porus sehingga solut dapat

melewati porus,atau berdifusi lewat fase diam. Molekul solut yang

mempunyai BM yang jauh lebih besar ,akan terelusi terlebih dahilu

Page 40: VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA ...digilib.unhas.ac.id/uploaded_files/temporary/Digital...Tinggi dinyatakan valid pada penetapan kadar zerumbon yang diperoleh dari lempuyang

24

,kemudian molekul molekul dengan ukuran medium,dan terakhir adalah

molekul yang jauh lebih kecil(7,15).

II.5 Derivatisasi pada KCKT

Derivatisasi melibatkan suatu reaksi kimia antara analit dengan

suatu reagenuntuk mengubah sifat fisika kimia analit. Tujuan utama

penggunaan derivatisasi pada KCKT adalah untuk meningkatkan

deteksi,mengubah struktur molekul merubah matriks sehingga diperoleh

pemisahan yang lebih baik dan menstabilkan analit yang sensitif (7,19).

II.6 Densitometri

Densitometri adalah metode analisis instrumen berdasarkan radiasi

elektromagnetik dengan analit berupa noda pada KLT. Instrument untuk

scanning densitometry menggunakan pengukuran absorban atau

fluorosensi dalam bentuk penerusan atau pantulan. Pertama kali

diperkirakan pertengahan tahun 1960-an (7,17,21).

Instrument densitometri terdiri dari beberapa bagian. Sumber

cahaya menggunakan lampu yang berbeda yang dapat menjangkau

seluruh daerah sinar UV dan sinar tampak dari 200-800 nm. Untuk daerah

sinar tampak digunakan lampu halogen tungsten sedangkan untuk daerah

UV digunakan lampu deuterium. Pancaran xenon atau merkuri intensitas

tinggi ditunjukkan untuk pengukuran fluorosensi. Untuk memilih panjang

gelombang digunakan 15 monokromator atau filter(7,17,21).

Page 41: VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA ...digilib.unhas.ac.id/uploaded_files/temporary/Digital...Tinggi dinyatakan valid pada penetapan kadar zerumbon yang diperoleh dari lempuyang

25

BAB III

PELAKSANAAN PENELITIAN

III.1 Penyiapan Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah Densitometri

(Camag TLC Scanner 3), erlenmeyer (Pyrex®), labu

tentukur 5 ml, 10 ml, 50 ml (Pyrex®), lampu UV 254 (Camag UV-

Betrachter®), mikropipet volume 0,5 μL (Eppendorf), oven (Memmert),

silika gel 60 F254, timbangan analitik (Mettler Toledo®), vial, kromatografi

cair kinerja tinggi (Zhimadzu®)LC-20AD, syringe UFLC, kolom Shim-pack

ODS C18 250x 4,6 mm, vial autosampler(Thermo®).

Bahan yang digunakan adalah Etil asetat, n heksan, Metanol pro

HPLC,Kertas saring 0,2um PTFE, dan sampel isolat zerumbon dari

rimpang Lempuyang wangi dan Baku kerja Zerumbon.

III.2 Metode Kerja

III.2.1 Pemilihan panjang gelombang maksimum

Penentuan panjang gelombang maksimum zerumbon dilakukan

dengan cara scanning kromatogram larutan kerja pembanding zerumbon

dan larutan sampel. Larutan pembanding dan sampel zerumbon dengan

konsentrasi 200 μg/mL ditotolkan pada lalu kemudian dielusi dengan

eluen heksan : etil (9 : 1). Satu-satunya noda yang terbentuk di-scan pada

panjang gelombang 200-400 nm sehingga diperoleh hasil spektrum UV

zerumbon.

Page 42: VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA ...digilib.unhas.ac.id/uploaded_files/temporary/Digital...Tinggi dinyatakan valid pada penetapan kadar zerumbon yang diperoleh dari lempuyang

26

III.3 Uji validasi

Parameter validasi yang diukur menurut ICH kategori II adalah

linieritas, presisi, Keterulangan, LOQ dan LOD. Metode ini divalidasi

sesuai dengan pedoman ICH International Conferense of Harmanitation

(10).

III.3.1 Penyiapan Larutan Baku Zerumbon

Pembuatan larutan Zerumbon (1000 ug / ml) adalah dibuat dengan

melarutkan bahan tersebut dalam 100 ml metanol pa. Larutan Stok

zerumbon selanjutnya diencerkan , untuk memberikan konsentrasi akhir

25, 50, 100, 200, 300, 400, dan 500 ug / ml(10).

III.3.2 Uji Presisi

Presisi metode ditentukan oleh persentase koefisien variasi (% CV)

dan persentase relatif error (% RE) masing-masing, sesuai dengan

dilaporkan ICH. Quality Control (QC) sampel yang mengandung 25 dan

500ug / ml untuk penentuan presisi. Enam ulangan pada masing-masing

konsentrasi diukur pada panjang gelombang maximum dan dihitung

simpangan baku dan simpangan baku relatif(10).

III.3.3 Uji Keterulangan

Uji ini dilakukan dengan menghitung simpangan baku dan

simpangan baku relatif pada sampel dengan enam kali ulangan dan pada

baku pembanding dengan enam kali pengulangan. Masing -masing diukur

pada panjang gelombang maksimum (10).

Page 43: VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA ...digilib.unhas.ac.id/uploaded_files/temporary/Digital...Tinggi dinyatakan valid pada penetapan kadar zerumbon yang diperoleh dari lempuyang

27

III.3.4 Linearitas

Pembuatan larutan zerumbon dengan melarutkan 100 mg

zerumbon dalam metanol (1000 ug/ml). Masing –masing diencerkan dan

dibuat konsentrasi 25, 50, 100, 200, 300, 400 dan 500 ug/ml. Diukur pada

panjang gelombang maksimum. Dihitung koevisien korelasi yang dihitung

dengan regresi linier(10).

III.3.5 LOQ dan LOD

Setelah didapatkan kurva kalibrasi limit of deteksi dan limit of

kuantitatif dihitung secara statistik melalui garis linear dari kurva standar.

Diukur pada panjang gelombang maksimum. Koefisien korelasi (r)

dihitung dari analisis regresi linier (Y=a+bx) (10)

III.4 Analisis Data

Dilakukan pengolahan data yang dihasilkan.

III.5 Pembahasan Hasil

Dilakukan pembahasan terhadap hasil yang telah diperoleh.

III.6 Pengambilan Kesimpulan

Kesimpulan diambil berdasarkan hasil pembahasan.

Page 44: VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA ...digilib.unhas.ac.id/uploaded_files/temporary/Digital...Tinggi dinyatakan valid pada penetapan kadar zerumbon yang diperoleh dari lempuyang

28

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

IV.1Hasil Penelitian

IV.1.1 Pemilihan panjang gelombang maksimum

Gambar 4. Panjang gelombang hasil scanning panjang gelombang noda sampel

isolat zerumbon konsentrasi 200 μg/mL.

Page 45: VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA ...digilib.unhas.ac.id/uploaded_files/temporary/Digital...Tinggi dinyatakan valid pada penetapan kadar zerumbon yang diperoleh dari lempuyang

29

Gambar 5. Panjang gelombang hasil scanning panjang gelombang noda baku

pembanding zerumbon konsentrasi 200 μg/mL.

IV.1.2 Hasil pengujian linearitas

Tabel 1.Hasil pengujian linearitas pada panjang gelombang max

No Konsentrasi luas area

1 25 1307027

2 50 1711556

3 100 3424572

4 200 6889084

5 300 10827172

6 400 14339713

7 500 17127984

Page 46: VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA ...digilib.unhas.ac.id/uploaded_files/temporary/Digital...Tinggi dinyatakan valid pada penetapan kadar zerumbon yang diperoleh dari lempuyang

30

IV.1.3 Kurva Baku linearitas

Gambar 6. Grafik data lineritas

IV.1.4 Hasil Pengujian Batas Deteksi dan Batas Kuantitas

Tabel.2 Hasil Pengujian Batas Deteksi dan Batas Kuantitas

No Konsentrasi

(ppm) Area LOD LOQ

1 25 1307027

0,15μg/ml 0,5 μg/ml

2 50 1711556

3 100 3424572

4 200 6889084

5 300 10827172

6 400 14339713

7 500 17127984

y = 34568x + 16885R² = 0,997

0

5000000

10000000

15000000

20000000

0 100 200 300 400 500 600

luas

are

a

konsentrasi

Kurva Baku Zerumbon

Page 47: VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA ...digilib.unhas.ac.id/uploaded_files/temporary/Digital...Tinggi dinyatakan valid pada penetapan kadar zerumbon yang diperoleh dari lempuyang

31

IV.1.5 Hasil Pengujian Presisi

Tabel 3.Hasil Pengujian Presisi pada konsentrasi terendah dan konsentrasi tertinggi

IV.1.6 Hasil PengujianKeterulangan sampel zerumbon

Tabel 4.Hasil Pengujian Keterulangan Sampel 200 ppm

Kons(ppm) Luas Area

200 7711701

200 7743751

200 7908344

200 7482907

200 7993373

200 7988510

Rata-rata 7804764,3

SB 198010

SBR (%) 2,53

1.Konsentrasi Terendah

No Luas Area

1 835335

2 825995

3 821358

4 805015

5 828698

6 801544

Rata-Rata 819657,33

SB 5516,9

SBR (%) 0,7

2.Konsentrasi tertinggi

No Luas Area

1 16518907

2 16522967

3 16461605

4 16152679

5 14112360

6 16281756

Rata-Rata 16008379

SB 391948,18

SBR (%) 2,5

Page 48: VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA ...digilib.unhas.ac.id/uploaded_files/temporary/Digital...Tinggi dinyatakan valid pada penetapan kadar zerumbon yang diperoleh dari lempuyang

32

IV.1.7 Hasil Pengujian Keterulangan Pembanding Zerumbon

Tabel 6.Hasil Pengujian Keterulangan Pembanding Zerumbon

IV.2 Pembahasan.

Menurut International conference of harmonization (ICH) ada

sepuluh parameter validasi yang dapat diuji adalah Presisi, Akurasi,

Batas deteksi, Batas kuantitas, Spesifitas, Linearitas, Kisaran (range),

Ketahanan, Kekasaran dan Kesesuaian Sistem. Namun ICH telah

menyatakan bahwa tidak selamanya parameter untuk mengevaluasi

validasi metode harus diuji, ICH membagi validasi dalam beberapa

kategori sehingga pengujian validasi dari penetapan kadar zerumbon

menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi hanya 5 parameter yang

diuji yaitu presisi, lineritas, batas deteksi, batas kuantitas, dan

keterulangan. Diharapkan parameter ini dapat mewakilli data yang

dibutuhkan untuk uji validasi kategori II. Hasil uji validasi metode

Kons(ppm) Luas Area

200 8281345

200 7985774

200 7801557

200 8072544

200 7739777

200 8262075

Rata-rata 8023845

SB 92554

SBR(%) 1,15

Page 49: VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA ...digilib.unhas.ac.id/uploaded_files/temporary/Digital...Tinggi dinyatakan valid pada penetapan kadar zerumbon yang diperoleh dari lempuyang

33

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Pada penetapan kadar zerumbon dapat

dinyatakan dalam beberapa parameter sebagai berikut:

IV.2.1Pemilihan panjang gelombang analisis

Panjang gelombang yang dipilih untuk analisis zerumbon adalah

pada panjang gelombang maksimum 260 nm ,karena pada panjang

gelombang inilah zerumbon memberikan serapan yang baik dan

menghasilkan area yang besar. Berdasarkan pada pengujian

menggunakan alat densitometri gelombang yang memberikan serapan

paling bagus.

IV.2.2Presisi

Presisi merupakan kedekatan antara hasil pengujian individu

dalam serangkaian pengukuran terhadap suatu contoh homogen yang

dilakukan. Hal ini berdasarkan pada pengambilan sampel secara

berganda menurut prosedur yang telah ditetapkan.

Berdasarkan hasil perhitungan pada tabel 3, Hasil pengujian presisi

menunjukkan nilai RSD (Relative Standar Deviatin atau simpangan baku

relatif) pada larutan sampel memenuhi persyaratan dimana sangat teliti (

%SBR =1), teliti (%SBR1-2), sedang (%SBR 2-5), dan tidak teliti (%SBR

5) nilai yang didapatkan 1,15% untuk pembanding zerumbon dan 2,5%

untuk sampel dimana angka ini masuk dalam kategori teliti. Hal ini

menunjukkan bahwa instrumen Kromatografi Cair Kinerja Tinggi memiliki

presisi atau ketelitian yang dapat diterima dengan baik.

Page 50: VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA ...digilib.unhas.ac.id/uploaded_files/temporary/Digital...Tinggi dinyatakan valid pada penetapan kadar zerumbon yang diperoleh dari lempuyang

34

IV.2.3 Linearitas

Linearitas biasanya dinyatakan dalam istilah variansi sekitar arah

garis regresi yang dihitung berdasarkan persamaan matematik data yang

diperoleh dari hasil uji analit dalam sampel dengan berbagai konsentrasi

analit. Berdasarkan perhitungan statistik regresi linear diperoleh nilai

koefisien korelasi untuk larutan zerumbon dengan konsentrasi bervariasi

25, 50, 100, 200, 300, 400, dan 500 ppm Yaitu 0,997 dengan persamaan

garis y=16885+34568x ,dilihat dari nilai r yang diperoleh telah memenuhi

syarat untuk uji linearitas karena menurut ICH linearitas yang dapat

diterima apabila nilai r yang dihasilkan lebih besar atau sama dengan

0,9900.

IV.2.4 Keterulangan

Uji keterulangan dilakukan terhadap larutan pembanding zerumbon

dan sampel isolat zerumbon. dibuat 6 larutan zerumbon yang

konsentrasinya sama yaitu 200 μg/mL. Masing-masing larutan diinjeksikan

sebanyak 10 μL sehingga diperoleh kadar 2 μg/ml, kemudian diukur pada

panjang gelombang maksimum. Dari tabel 4 dan tabel 5 di atas,

berdasarkan luas areanya diperoleh hasil keterulangan yang cukup baik

dengan nilai SBR ≤ 15 % (16) yaitu 1,15% untuk pembanding zerumbon

dan 2,53% untuk sampel isolat zerumbon.

Page 51: VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA ...digilib.unhas.ac.id/uploaded_files/temporary/Digital...Tinggi dinyatakan valid pada penetapan kadar zerumbon yang diperoleh dari lempuyang

35

IV.2.5 Batas deteksi

Batas deteksi adalah konsentrasi analit terendah dalam sampel

atau dalam matriks yang dapat dideteksi, atau Batas deteksi adalah

jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat dideteksi yang masih

memberikan respon signifikan. Berdasarkan hasil perhitungan pada tabel

2, Hasil pengujian batas deteksi untuk metode penetapan kadar

zerumbon menggunakan instrumen Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

adalah 0,15 ug/ml. Nilai 0,15 ug/ml menandakan bahwa zerumbon sudah

dapat terdeteksi pada konsentrasi tersebut menggunakan alat

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi.

IV.2.6 Batas Kuantitas

Batas kuantitas adalah konsentrasi terendah dalam sampel atau

matriks yang dapat di ukur secara kuantitatif dengan presisi yang dapat

diterima. Berdasarkan hasil perhitungan pada tabel 2 Hasil pengujian

batas kuantitas untuk metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi pada

penetapan kadar zerumbon menunjukkan nilai sebesar 0,5 ug/ml. Nilai

0,5 ug/ml menandakan bahwa pada konsentrasi tersebut zerumbon sudah

dapat diukur secara kuantitatif.

IV.2.7 Hasil Pengukuran Kadar Isolat Zerumbon

Dari hasil analisis kuantitatif terhadap isolat zerumbon yang

dieperoleh dari Lempuyang wangi dengan konsentrasi 200 ppm, yang

positif mengandung zerumbon mempunyai persentase kadar zerumbon

sebesar 99 %.

Page 52: VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA ...digilib.unhas.ac.id/uploaded_files/temporary/Digital...Tinggi dinyatakan valid pada penetapan kadar zerumbon yang diperoleh dari lempuyang

36

Page 53: VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA ...digilib.unhas.ac.id/uploaded_files/temporary/Digital...Tinggi dinyatakan valid pada penetapan kadar zerumbon yang diperoleh dari lempuyang

36

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

V.1 Kesimpulan

Berdasarkan data penelitian dapat disimpulkan bahwa Metode

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi dinyatakan valid pada penetapan kadar

zerumbon yang diperoleh dari lempuyang wangi.

V.2 Saran

Sebaiknya dilakukan penelitian validasi metode kromatografi cair

kinerja tinggi pada zerumbon menggunakan parameter yang lain .

Page 54: VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA ...digilib.unhas.ac.id/uploaded_files/temporary/Digital...Tinggi dinyatakan valid pada penetapan kadar zerumbon yang diperoleh dari lempuyang

37

DAFTAR PUSTAKA

1. Sari.K.Pemanfaatan Obat Tradisional Dengan Pertimbangan Manfaat dan

Keamanannya.JSFK.7 April 2006.pp 1-3

2. Imas Masruroh. Isolasi Senyawa Aktif Dari Bangle Hantu (Zingiber Ottensii Va) Yang Berpotensi Sebagai Antiobesitas. Intitut Pertanian Bogor.Bogor.2011.pp.1-2

3. Indrie Ambarsari, Sarjana dan Budi Hartoyo. Kajian Perbaikan Kualitas Produk Dan Peningkatan Kapasitas Produksi Olahan Lempuyang Wangi Di Kabupaten Blora. Prosiding Seminar. Semarang. 8 November 2007. pp. 58-65

4. Mahfudz L.D,. R. Murwani. Kusumowardani, T.H,. D.X. Hou. Aktivitas Anti Oksidan Dan Anti Tumor Kandungan Tanaman Herbal Indonesia. Majalah Obat Tradisional. 2011. 16(2), 68 – 74

5. Yeap Swee Keong,Norjahan Banu Alithen,Suhaimi Mustafa,Suraini Abdul Azis, Mashitoh Abdul Rahman and Abdul Manaf Ali. Immunomodulatory Effects of zerumbone isolated from Roots Of Zingiber Zerumbet Vol 23. Malaysia. Universiti Putra Malaysia. 2010. Pp.75-82

6. [Online] Bogor Acricultural Universitas From http://www.google.com/ in Access November 23, 2012

7. Ibnu Rohman. Ibnu Gholib Gandjar. Analisis Obat Secara Spektrofotometri dan Kromatografi. Yogyakarta. Pustaka Pelajar. 2012. Pp.468-484

8. Ade Heri Mulyati, Sutanto dan Dewi Apriyani. Validasi Metode Kadar Ambrosol Hidroklorida Dalam Sediaan Tablet Cystelis Secara Kromatgrafi Cair Kinerja Tinggi. Bogor. Universitas Pakuan Bogor. 2011. Pp 1-10

9. Andria Agusta. Minyak Atsiri Tumbuhan Tropika Indonesia. Penerbit ITB.

Bandung. 2000. Hal 111.

10. Eltayeb Elamin M. Ahmad Bustamam Abdul. Adel S. Al-Zubairi. Mohamed Aspollah Sukari. Rasedee Abdullah. African Journal of Biotechnology Vol. 9(8), 22 February, 2010 pp. 1260-1265

11. Harmita. Petunjuk pelaksanaan validasi Metode dan cara perhitungannya. Vol. I, No.3. Departemen Farmasi FMIPA-UI. Jakarta. 2004.Pp 1-19

12. I Kadek Arya Mulyadi. Validasi Metode Analisi Irberastan Dalam Plasma In Vitro Secara Kromotografi Cair Kinerja Tinggi-Fluoresensi. Universitas Indonesia.Jakarta. 2011.Pp25-35

13. Rahma Juwita Zamri. Validasi Metode Penentuan Kadar Apigenin Dalam Ekstrak Seledri Dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. Institut Pertanian Bogor. Bogor. 2008.Pp10-12

Page 55: VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA ...digilib.unhas.ac.id/uploaded_files/temporary/Digital...Tinggi dinyatakan valid pada penetapan kadar zerumbon yang diperoleh dari lempuyang

38

14. Dwi Baskoro Bimmo. Studi Optimisasi dan Metode Validasi untuk Penentuan Melanin dan Asam Sianurat dalam Sampel Susu Formula dengan HPLC. Universitas Indonesia. Jakarta. 2012

15. Eria Oktavia. Teknik Validasi Metode Analisis Kadar Ketoprofen Secara KromotografiCair Kinerja Tinggi. Balai Besar Penelitian Dan Pengembangan Pascapanen Pertanian. Bogor. 2006

16. Zainal Arifin, Darmono1, Agus Safuan Dan Rina Pratama. Validasi Metode Analisis Logam Copper (Cu) Dan Plumbum (Pb) Dalam Jagung Dengan Cara Spektrofotometer Serapan Atom. Universitas Pancasila. Jakarta 2006.Pp 1-5

17. Asril Damiyanto Hasan. Analisis Kadar Zerumbone Yang Terdapat Pada Rimpang Lempuyang Gajah (Zingiber Zerumbet (L).J.E Smith) Dengan Berbagai Metode Ekstraksi Dan Variasi Cairan Penyari.Universitas Hasanuddin. Makassar. 2011.Pp 7-8

18. Rohman,abdul.Kromatografi Untuk Analisis Obat.Cetakan pertama edisi pertama.Yogyakarta.Pustaka Pelajar.2009.Pp 122-144

19. Endang,Tri Susanti. Optimasi dan Validasi Metode Analisis.Ziduvudin,Lamivudin ,dan Nevirapin Dalam Tablet Generik dan Plasma In Vitro Secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi.Universitas Indonesia .Depok .2012.Pp 20-34

20. Daryadi,Egan.Metode Cepat Kuantifikasi Kuinina Dalam Sediaan Farmasi dan Kulit Kina Secara Spektrofotometri Derivatif Ultraviolet.Insitut Pertanian Bogor.Bogor.Pp 10-25

21. Triana Neni.Analisis Senyawa Zerumbon Yang Diperoleh dari lempuyang wangi,Lempuyang Gajah, Dan Lempuyang Emprit Secara Densitometri dan HPLC.Unhas.Makassar.2013.Pp 20-40

Page 56: VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA ...digilib.unhas.ac.id/uploaded_files/temporary/Digital...Tinggi dinyatakan valid pada penetapan kadar zerumbon yang diperoleh dari lempuyang

39

LAMPIRAN I

Gambar 6.Tanaman lempuyang wangi( Zingiber aromaticum Vahl)

Gambar 7.Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Page 57: VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA ...digilib.unhas.ac.id/uploaded_files/temporary/Digital...Tinggi dinyatakan valid pada penetapan kadar zerumbon yang diperoleh dari lempuyang

40

LAMPIRAN II

SKEMA KERJA

VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

A. Skema kerja penetapan kadar zerumbon dalam sampel dan

presisi Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

- Presisi

- Sampel dilarutkan dalam metanol

- Masing-masing konsentrasi

Diulang sebanyak 6 kali

- Area sampel

25 ppm sampel isolat zerumbon & 500 ppm sampel isolat

Kromatografi Cair Kinerja

Tinggi

Pengumpulan & Analisis

data

Pembahasan

Kesimpulan

Page 58: VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA ...digilib.unhas.ac.id/uploaded_files/temporary/Digital...Tinggi dinyatakan valid pada penetapan kadar zerumbon yang diperoleh dari lempuyang

41

LAMPIRAN III

B. Pengujian Linieritas, Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi Metode

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Ditimbang 100 mg dilarutkan kedalam 100

ml metanol (1000 ppm)

Diencerkan dengan konsentrasi 25,50,100,

200, 300,400dan 500 ppm

Masing-masing diukur pada panjang

gelombang maksimum

Zerumbon pembanding

Hasil pengukuran

Analisis Data

Batas

Deteksi

Batas

Kuantitasi

Linearitas

Pembahasan

Kesimpulan

Page 59: VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA ...digilib.unhas.ac.id/uploaded_files/temporary/Digital...Tinggi dinyatakan valid pada penetapan kadar zerumbon yang diperoleh dari lempuyang

42

LAMPIRAN IV

C. Pengujian Keterulangan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

- Masing-masing ditimbang 2 mg - Masing-masing ditimbang 2 mg

- Dilarutkan dalam 10 ml metanol - Dilarutkan dalam 10 ml metanol

- Dibuat 6 kali replikasi - Dibuat 6 kali replikasi

Sampel isolat

zerumbon 200 ppm

Pembanding zerumbon

200 ppm

Diukur pada panjang gelombang max

Analisis Data

Kesimpulan

Page 60: VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA ...digilib.unhas.ac.id/uploaded_files/temporary/Digital...Tinggi dinyatakan valid pada penetapan kadar zerumbon yang diperoleh dari lempuyang

43

LAMPIRAN V

Tabel Perhitungan LOD Dan LOQ

Persamaan kurva baku : -16885 + 34568x

S y/x = 𝛴 𝑦−ỹ 2

𝑛−2 1/2

= 302535,47231/2 = 305648,1`

Sb = S y/x / 𝛴 (( x-xrata2 )2)1/2 =302535,4723 / ( 75625)1/2 = 1747

Sa =302535,4723 / 553125 / 5 x (75625) 1/2 = 312434,2

Nilai Y pada batas deteksi ditentukan dengan persamaan.

Y = Yb + 3 Sb

Yb = Nilai a pada persamaan kurva kalibrasi,

NO Y X X^2

X-

Xrata2

(X-

Xrata2)2

area (y dibagi

100) Y taksiran (Y-Ytaksiran)^2

1 1307027 25 625 -200 40000 13070,27 847315 2,113351E+11

2 1711556 50 2500 -175 30625 17115,56 1711515 1,681000E+03

3 3424572 100 10000 -125 15625 34245,72 3439915 2,354076E+08

4 6889084 200 40000 -25 625 68890,84 6896715 5,823216E+07

5 10827172 300 90000 75 5625 108271,72 10353515 2,243510E+11

6 14339713 400 160000 175 30625 143397,13 13810315 2,802622E+11

7 17127984 500 250000 275 75625 171279,84 17267115 1,935744E+10

jumlah 55627108 1575 553125 302535,4723

rata-

rata 7946730 225

Page 61: VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA ...digilib.unhas.ac.id/uploaded_files/temporary/Digital...Tinggi dinyatakan valid pada penetapan kadar zerumbon yang diperoleh dari lempuyang

44

Sb = Simpangan baku Sb

Y = - 16885 + 3 (1747)

Y = 5253,943

Perhitungan LOD( Batas Deteksi )

LOD = 3 x SD S

LOD = 3 x 1747

34568

LOD = 0,15 ug/ml

Perhitungan LOQ ( Batas Kuantitas)

LOQ = 10 x SD

S

LOQ = 10 x 1747

34568

LOQ = O,5 ug/ml

Perhitungan kadar zerumbon 200ppm

y =a + b×

6869936 = -16885+34568×

× = 6869936 – 16885 =198,2ug/ml

34568

x = 198,2 ug/ml X 100% = 99,1%

200ug/ml

Page 62: VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA ...digilib.unhas.ac.id/uploaded_files/temporary/Digital...Tinggi dinyatakan valid pada penetapan kadar zerumbon yang diperoleh dari lempuyang

44

LAMPIRAN VI

PERHITUNGAN PRESISI

a. Presisi

1. Konsentrasi Terendah 2. Konsentrasi Tertinggi

SB = 𝛴 𝑥−𝑥 𝑟𝑎𝑡𝑎 2 2

𝑛 − 1 1. SBR =

100 𝑥 5516 ,9

819657 ,33 = 0,7

SBR = 100 𝑥 𝑆𝐷

𝑥 𝑟𝑎𝑡𝑎 −𝑟𝑎𝑡𝑎 2. SBR =

100 𝑥 391948 ,18

16008379 = 2,5

No Luas Area

1 835335

2 825995

3 821358

4 805015

5 828698

6 801544

Rata-Rata 819657,33

SB 5516,9

SBR (%) 0,7

No Luas Area

1 16518907

2 16522967

3 16461605

4 16152679

5 14112360

6 16281756

Rata-Rata 16008379

SB 391948,18

SBR (%) 2,5

Page 63: VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA ...digilib.unhas.ac.id/uploaded_files/temporary/Digital...Tinggi dinyatakan valid pada penetapan kadar zerumbon yang diperoleh dari lempuyang

45

LAMPIRAN VII

PERHITUNGAN KETERULANGAN

1. Konsentrasi 200 ppm pembanding zerumbon

No Luas Area

1 7711701

2 7743751

3 7908344

4 7482907

5 7993373

6 7988510

Rata-rata 7804764,3

SB 198010

SBR (%) 2,53

2. Konsentrasi 200 ppm pembanding zerumbon

1. SBR = 100 𝑥 198010

7804764 ,3 = 2,5%

2. SBR = 100 𝑥 92554

8023845 = 1,15%

No Luas Area

1 8281345

2 7985774

3 7801557

4 8072544

5 7739777

6 8262075

Rata-rata 8023845

SB 92554

SBR (%) 1,15

Page 64: VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA ...digilib.unhas.ac.id/uploaded_files/temporary/Digital...Tinggi dinyatakan valid pada penetapan kadar zerumbon yang diperoleh dari lempuyang

46

Page 65: VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA ...digilib.unhas.ac.id/uploaded_files/temporary/Digital...Tinggi dinyatakan valid pada penetapan kadar zerumbon yang diperoleh dari lempuyang

LAMPIRAN VIII

KROMATOGRAM LINEARITAS DARI HPLC

ko

1. Konsentrasi 25 ppm dengan luas area 1307027 2. Konsentrasi 50 ppm dengan luas area 1711556

3. Konsentrasi 100 ppm dengan luas area 3424572 4.Konsentrasi 200 ppm dengan luas area 6889084

5.Konsentrasi 300 ppm dengan luas area 10827172 6. Konsentrasi 400 ppm dengan luas 14339713

7. Konsentrasi 500 ppm dengan luas 17127984

Page 66: VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA ...digilib.unhas.ac.id/uploaded_files/temporary/Digital...Tinggi dinyatakan valid pada penetapan kadar zerumbon yang diperoleh dari lempuyang

LAMPIRAN IX

KROMATOGRAM PRESISI KONSENTRASI TERENDAH DARI HPLC

1.Kromatogram presisi Konsentrasi 25 ppm 2.Kromatogram presisi Konsentrasi 25 ppm

3.Kromatogram presisi Konsentrasi 25 ppm 4.Kromatogram presisi Konsentrasi 25 ppm

5.Kromatogram presisi Konsentrasi 25 ppm 6.Kromatogram presisi Konsentrasi 25 ppm

Page 67: VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA ...digilib.unhas.ac.id/uploaded_files/temporary/Digital...Tinggi dinyatakan valid pada penetapan kadar zerumbon yang diperoleh dari lempuyang

LAMPIRAN X

KROMATOGRAM PRESISI PADA KONSENTRASI TERTINGGI

KKON

1.konsentrasi 500ppm dengan luas area 16518907 2.Konsentrasi 500ppm denganluas area 16522967

3.konsentrasi 500ppm dengan luas area 16461605 4.konsentrasi 500ppm dengan luas area 16152679

5.konsentrasi 500ppm dengan luas area 14112360 6.konsentrasi 500ppm dengan luas area 16281756

Page 68: VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA ...digilib.unhas.ac.id/uploaded_files/temporary/Digital...Tinggi dinyatakan valid pada penetapan kadar zerumbon yang diperoleh dari lempuyang

LAMPIRAN XI

KROMATOGRAM KETERULANGAN SAMPEL ISOLAT ZERUMBON PADA HPLC

1.Konsentrasi 200 ppm dengan luas area 7743751 2.Konsentrasi 200 ppm dengan luas area

7711701

3.Konsentrasi 200 ppm dengan luas area 7908344 4.Konsentrasi 200 ppm dengan luas

area 7482907

5.Konsentrasi 200 ppm dengan luas area 7993373 6.Konsentrasi 200 ppm dengan luas area

7988510

Page 69: VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA ...digilib.unhas.ac.id/uploaded_files/temporary/Digital...Tinggi dinyatakan valid pada penetapan kadar zerumbon yang diperoleh dari lempuyang

LAMPIRAN XII

KROMATOGRAM KETERULANGAN PEMBANDING ZERUMBON DARI HPLC

1.Konsentarsi 200 ppm dengan luas area 8281345 2.Konsentrasi 200 ppm dengan luas area

7985774

1.Konsentarsi 200 ppm dengan luas area 8281345

1.Konsentarsi 200 ppm dengan luas area 8281345

3.Konsentarsi 200 ppm dengan luas area 7801557 4.Konsentarsi 200 ppm dengan luas area

8072544

5.Konsentarsi 200 ppm dengan luas area 7739777 6.Konsentarsi 200 ppm dengan luas area 8262075

Page 70: VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA ...digilib.unhas.ac.id/uploaded_files/temporary/Digital...Tinggi dinyatakan valid pada penetapan kadar zerumbon yang diperoleh dari lempuyang

p