La consulenza genetica

nelle malattie mitocondriali

Valeria Tiranti-Isabella Moroni 4° Convegno Nazionale Mitocon, 22-25 maggio 2014

Tivoli Terme

Nelle malattie mitocondriali la corretta funzionalità della catena respiratoria (RC) e del sistema della fosforilazione

ossidativa (OXPHOS) è compromessa.

Ampio spettro di presentazioni cliniche: qualsiasi sintomo,

qualsiasi organo o tessuto, qualsiasi età.

Le malattie mitocondriali sono considerate il disordine metabolico più frequente.

Prevalenza stimata ca. 1:5000-8500 nati.

Gli organi più colpiti sono quelli che hanno maggior fabbisogno energetico

(cervello, muscoli, cuore).

COMPLEX IV COMPLEX III

COMPLEX II

COMPLEX I ATP SYNTHASE

DNA mitocondriale

7 subunità 2 subunità 1 subunità 3 subunità

+ 72 subunità codificate da nDNA.

Più di un migliaio di geni nucleari sono coinvolti nella corretta funzionalità del sistema OXPHOS.

Le malattie mitocondriali possono essere sporadiche, trasmesse per via matrilineare o come carattere autosomico (recessiva, dominante o X-linked).

Malattia Mitocondriale

Mutazioni mtDNA

Mutazioni geni nucleari

Sporadica macrodelezioni

Mendeliana con alterazioni del mtDNA

Mendeliana con difetti biochimici

senza alterazioni del mtDNA

Deplezione del mtDNA

Delezioni multiple del mtDNA

Difetto singolo

complesso

Difetti multipli

Difetti di comunicazione

tra genomi

Matrilineare mutazioni puntiformi

In ogni cellula sono presenti migliaia di molecole di mtDNA. Quando una mutazione colpisce il mtDNA nella stessa cellula coesistono due

popolazioni di mtDNA in percentuale variabile (eteroplasmia).

La mutazione causa la malattia quando la percentuale di molecole mutate supera la soglia critica (diversa per mutazione, età e tessuto).

Mutazioni del mtDNA (matrilineare)

Eteroplasmia

Mutazione 30% nessun fenotipo

Mutazione 70% malattia

Omoplasmia

Mamma con mutazione

Papà senza mutazione

Figli con

mutazione

Mamma senza mutazione

Papà con mutazione

Figli senza

mutazione

Zygote of a heteroplasmic mother carrying 20% mutant mtDNA

Mother with mild or no symptoms

Her primary oogonia

Small number of mother’s mitochondria, selected randomly,

goes into each early egg cell

Her mature oocytes

80% mutant

50% mutant

20% mutant

Contribution from mother

+

+

+

=

=

=

Sperm cells (no mtDNA contribution)

Contribution from father

Possible outcome

Child with severe disease?

Child with no disease?

Child with mild disease?

heteroplasmic mother

her oogonia mitochondrial bottleneck

her offspring

healthy

mitochondrial proliferation

STOP!

Single deletions are usually NOT transmitted

Heteroplasmic single deletion

eg, KSS/PEO

homoplasmic mother

her offspring

(usually) healthy (usually) sick

Mutation is necessary but not

sufficient to produce the disease phenotype

Homoplasmic point mutation

eg, LHON mitochondrial bottleneck

mitochondrial proliferation

her oogonia

Mutazioni in geni nucleari: ereditarietà

Autosomica recessiva

Portatore sano

Portatrice sana

Affetta

Sano

Portatrice sana

Portatore sano

Autosomica dominante

Affetto Sana

Affetta

Affetto

Sana

Sano

Sano XY

Portatrice sana XX

Affetto XY

Sana XX

Portatrice sana XX

Sano XY

Legata al cromosoma X

Criticità nella diagnosi prenatale (DP) delle malattie mitocondriali

La DP è complicata nel caso di mutazioni eteroplasmiche: -la % di mutazione dovrebbe essere la stessa nei tessuti extra-embrionali e nel feto -la % di mutazione non dovrebbe cambiare nel tempo -correlazione tra % mutazione e severità di fenotipo difficile

Mutazioni mtDNA

Mutazioni geni nucleari

Se il gene è noto la DP su villi coriali (9-12 settimane) o amniociti (14-16 settimane) è affidabile

Il tipo di ereditarietà consente di stabilire il rischio di ricorrenza

DP è affidabile per mutazione NARP 8993T>G :<20% soggetto sano =60% soggetto probabilmente affetto >80% soggetto affetto E per mutazioni de novo

Adattato da Nesbitt et al, EJHG, 2014

L’esperienza inglese dal 2007 ad oggi: 17 mtDNA e 45 geni nucleari

Come prevenire la trasmissione di una malattia legata a mutazioni del mtDNA

Donazione di ovociti da soggetto sano e fertilizzazione in vitro da parte di spermatozoi del partner: il bimbo sarà geneticamente simile al padre ma non alla madre

DP può essere un’opzione in: -mutazioni de novo: madre sana e senza mutazione in diversi tessuti analizzati -mutazioni con chiara correlazione genotipo/fenotipo (es. NARP 8993) Diagnosi genetica pre-impianto Trasferimento del genoma nucleare

La diagnosi Genetica pre-impianto Alternativa alla DP: gli ovociti sono fertilizzati in vitro, vengono effettuate delle

biopsie di cellule quando l’embrione è formato da 8 cellule, gli embrioni sani sono trasferiti nell’utero materno.

Analisi è facilitata dalla presenza di un alto numero di copie del mtDNA Criticità: quanto la % di mutazione dei blastomeri riflette quella dell’intero

embrione E’ stata effettuata per diverse mutazioni: 3243A>G, 8993T>G, 8344A>G.

Embrione 1 Embrione 2 Embrione 3 Embrione 4 Embrione 5

Embrione 1

Embrione 3 adattato da Smeets H, Reproductive BioMedicine 2013

Trasferimento nucleare nelle patologie del mtDNA

metafase II trasferimento fuso mitotico fusione e fertilizzazione

fertilizzazione trasferimento pronuclei fusione adattato da Smeets H, Reproductive BioMedicine 2013

Trasferimento fuso mitotico

Trasferimento pronuclei

Conclusioni

DP può essere un’opzione in: -mutazioni de novo e mutazioni ricorrenti che rispettano criteri precisi La diagnosi pre-impianto è l’opzione preferita per ridurre il rischio per

molte portatrici di mutazioni eteroplasmiche. Il limite è la capacità di produrre ovociti con basse % di mutazione; può essere un problema per mutazioni in alta %

Sia DP che la diagnosi pre-impianto sono tecniche accettate nella pratica clinica

Il trasferimento del genoma nucleare è una tecnica ancora sperimentale e sarà necessario dimostrarne la sicurezza anche nell’uomo.

Lo screening prenatale non invasivo mediante sequenziamento di mtDNA fetale presente nel sangue materno è tecnicamente possibile grazie al sequenziamento massivo ma i risultati possono essere di difficile interpretazione.

Fecondazione assistita: la legge 40 dal 2004 a oggi, cosa cambia? Limitazioni all’analisi dell’embrione: non previsto dalla legge ma inserito nelle Linee guida del ministero della Salute del 2004. A seguito della sentenza 398 del Tar del 21/1/2008 è stata eliminata la limitazione alla sola analisi osservazionale. Divieto di produzione di più di tre embrioni previsto dall’articolo 14, comma 2: è stato eliminato dalla sentenza della Corte Costituzionale 151/2009. Obbligo di contemporaneo impianto di tutti gli embrioni prodotti previsto dall’articolo 14, comma 2: è stato eliminato dalla sentenza della Corte Costituzionale 151/2009 Limitazione della deroga al divieto di crioconservazione degli embrioni per i soli casi di «grave e documentata causa di forza maggiore relativo allo stato di salute della donna non prevedibile al momento della fecondazione» previsto dall’art. 14 comma 3: è stato modificato dalla sentenza della Corte costituzionale 151/2009 che ha chiarito esplicitamente che «il trasferimento degli embrioni, da realizzare non appena possibile, deve essere effettuato senza pregiudizio della salute della donna». Divieto di diagnosi pre-impianto per le sole coppie infertili portatrici di malattie genetiche: è da considerare non sussistente sia in relazione all’annullamento delle Linee guida ministeriali che introducevano la sola possibilità di analisi osservazionale dell’embrione (sentenza del Tar Lazio 398/2008) sia in virtù della giurisprudenza consolidata (13 tra sentenze e ordinanze dei Tribunali italiani) con un’interpretazione conforme alla Costituzione degli art. 13 e 14 della legge 40 e in relazione alla legge 194/78. Divieto di accesso alle coppie fertili ma portatrici di patologie genetiche, previsto dall’art. 5, che consente l’accesso alla PMA solo per i soggetti con problemi di infertilità e sterilità : questione il cui divieto è stato ritenuto illegittimo da 4 sentenze di tribunali italiani (Salerno e Roma) nonché dalla pronuncia definitiva di condanna della Corte europea per i diritti dell’uomo del 29 agosto 2012 emessa nei confronti dell’Italia. La decisione europea è stata eseguita nel 2013 dopo autorizzazione del tribunale di Roma. La Consulta ha ritenuto questa norma incostituzionale 9 aprile 2014. Divieto di fecondazione eterologa e cioè di donazione dei gameti previsto dall’art. 4 comma 3: eliminato dalla Consulta.

LA COMUNICAZIONE DELLA DIAGNOSI

Dare la diagnosi di malattia mitocondriale alla famiglia di un bambino affetto implica non solo comunicare tutto ciò che riguarda la sintomatologia, le possibilità di evoluzione, il trattamento e la prognosi, ma parlare del significato di una malattia genetica

Si apre uno scenario spesso vissuto come un viaggio nuovo e difficile, che richiede un particolare e delicato rapporto di fiducia ed alleanza tra il medico e la famiglia che deve essere accompagnata anche lungo questo percorso……

La caratterizzazione del difetto genetico specifico è indispensabile per definire

• il rischio di ricorrenza

• l’identificazione di altri familiari affetti

OBIETTIVO SPESSO MOLTO DIFFICILE NONOSTANTE LA DISPONIBILITA’ DELLE NUOVE TECNICHE DIAGNOSTICHE

Se il difetto genetico è noto

Se il difetto genetico non è definito

I test genetici coinvolgono non soltanto il paziente, ma anche tutta la famiglia di origine e la sua discendenza. Un corretto approccio a queste tematiche richiede la collaborazione integrata di competenze professionali diverse, che vanno dallo specialista neurologo, al genetista molecolare, al genetista medico.

Problematiche diverse

Consulenza genetica

Patologia a difetto genetico non definito

- incertezza della prognosi

- timore di non potere adottare trattamenti adeguati e specifici

- necessità di sottoporre il bambino a ripetuti esami diagnostici

- impossibilità di planning per rischio di ricorrenza

Rischio di ricorrenza

Estrema variabilità: da 0 % per casi de novo, 25 % nei casi AR, a 100 % se trasmissione matrilineare

più frequenti nell’infanzia patologie AR da mutazioni in

geni nucleari

Fondamentale raccolta anamnesi familiare e ricostruzione albero genealogico per orientare il rischio di ricorrenza

Casi a difetto non definito %

Sospetto OPA1 AD Consanguineità e LS probabile AR

Maschi affetti, femmine sane/lievi probabile X-linked

Possibile trasmissione matrilineare

Patologia a difetto noto

1. rischio di ricorrenza definibile 2. possibilità di prospettare diagnosi

prenatale 3. possibilità di estendere analisi a

familiari a rischio con possibile espressione fenotipica differente

Ma…… notevoli differenze se difetto in gene nucleare (nDNA) o mitocondriale (mtDNA)

il rischio di ricorrenza segue le leggi di Mendel, e varia in modo prevedibile Trasmissione Autosomica Dominante

50 %

Trasmissione Autosomica Recessiva

25 %

Mutazioni in geni nucleari (nDNA)

X-linked

25%

Sono frequentemente associate ad una notevole variabilità della sintomatologia all'interno della stessa famiglia Accanto a soggetti affetti da sintomi gravi, vi sono spesso parenti materni che hanno percentuali basse o molto basse di mutazione, e manifestano solo sintomi minori o sono completamente asintomatici, ma la prognosi non è sempre definibile. La diagnosi prenatale è complicata dalla distribuzione variabile della mutazione nei diversi tessuti.

Mutazioni nel DNA mitocondriale (mtDNA)

IN PRATICA…….

• I maschi portatori di mutazioni del mtDNA non trasmettono la malattia ai figli.

• Le donne con PEO o con sindrome di Kearns-Sayre in cui venga documentata una delezione del DNA mitocondriale, non trasmettono la malattia ai figli, tranne che in casi assolutamente eccezionali.

• Nelle famiglie in cui venga documentata una mutazione puntiforme del DNA mitocondriale, tutte le donne in linea materna devono essere considerate a rischio di avere un figlio affetto il rischio varia da 0 a 100%.

MELAS e MERRF la diagnosi prenatale per queste mutazioni è complessa perché: - la mutazione su amniociti o villi coriali non corrisponde a quella degli altri tessuti fetali - il grado di mutazione riscontrato sui tessuti prenatali può modificarsi in utero o dopo la nascita a causa della segregazione mitotica

NARP/MILS diagnosi prenatale possibile per < 30 % di mutazione T8993G o T8993C nel campione; diversi tessuti hanno stessa % mutazione

LHON mutazione prevalentemente omoplasmica: le madri trasmettono sempre la mutazione, ma il fenotipo non è prevedibile diagnosi prenatale non è informativa

Diagnosi prenatale

• Quando il difetto è noto ed è noto lo stato di portatore dei genitori; consiste nell’analisi genetica su campione di villi coriali o amniociti entro le prime settimane di gravidanza

Esecuzione in Centri specializzati per prelievo e preparazione del campione ed invio ai Laboratori diagnostici specialistici La diagnosi prenatale basata sulla sola valutazione biochimica della catena respiratoria può dare risultati falsi negativi perché alcuni difetti possono non essere espressi nei CVS/amniociti o avere elevata attività residua in CSV/amniociti E’ affidabile solo nel caso di mutazioni del DNA nucleare e mutazione NARP

Laboratorio Neurogenetica Molecolare INNCB

2009-2013 31 esami

Numero casi Età materna aa

media (range)

Villi coriali/amniociti

Tempo di refertazione gg

media (range)

RISULTATO negativo

RISULTATO positivo

RISULTATO portatore

Mito

cond

riali

6 35 (31-41) 6/0 3,1

(1-4) 2 4 no

Nuc

lear

i

25 32 (21-42) 23/2 4,64

(1-22) 5 7 13

Diagnosi pre-impianto • Consente la selezione di embrioni non-affetti per l’impianto in utero • Prevede trattamenti di stimolazione ormonale per la donna al fine di

produrre un numero elevato di ovociti, che devono poi essere aspirati ed uniti ai gameti per la fecondazione in vitro; l’embrione viene quindi introdotto in utero

• nelle mutazioni del mtDNA ha comunque significativi limiti dovuti all’elevato carico mutazionale in un’alta % di ovociti • la Legislazione italiana ancora attualmente non consente diagnosi genetica pre-impianto per le coppie fertili

Estensione ai familiari asintomatici

Nel caso in cui in un soggetto affetto venga individuata la mutazione causativa, sia del mtDNA che del DNA nucleare, lo screening può essere esteso ai familiari attraverso una semplice analisi del DNA

Inoltre: nelle mutazioni di mtDNA la % di mutazione non sempre è correlata a gravità dei sintomi, ed è quindi difficile prevedere l’evoluzione clinica

Da considerare: - per molte malattie non sono al momento disponibili efficaci strategie terapeutiche o preventive - tuttavia alcune possono essere trattate meglio se diagnosticate in stadi clinici precoci o pre-clinici - Possibili implicazioni psicologiche, familiari e sociali un test genetico presintomatico con risultato positivo può implicare discriminazione sociale e lavorativa, esclusione da assicurazioni vita e malattia etc …

Conclusioni

Il ruolo del medico che effettua consulenza genetica è di offrire in modo chiaro e completo tutte le conoscenze disponibili che permettano alla famiglia di fare scelte consapevoli

UO Neuropsichiatria Infantile Isabella Moroni Anna Ardissone Silvia Genitrini Claudia Gandioli

UO Neurogenetica Molecolare

Valeria Tiranti Barbara Garavaglia Eleonora Lamantea Federica Invernizzi Daniele Ghezzi Costanza Lamperti

Graziella Uziel

Massimo Zeviani

GRAZIE