Utilizzo di metodi biologici alternativi Utilizzo di metodi biologici alternativi alla sperimentazione animalealla sperimentazione animale

Antonella Ciarelli/Mirella LucianiAntonella Ciarelli/Mirella Luciani

Istituto Zooprofilattico Sperimentale Abruzzo e Molise “G. CaporIstituto Zooprofilattico Sperimentale Abruzzo e Molise “G. Caporale” ale”

9 marzo 20099 marzo 2009

Alternative alla sperimentazione animale nello studio e Alternative alla sperimentazione animale nello studio e rilevazione delle biotossine marinerilevazione delle biotossine marine

The Priciples of Human Experimental TechniqueThe Priciples of Human Experimental Technique(Russel e Burch, 1959) Russel e Burch, 1959)

Il modello delle 3 RIl modello delle 3 R

Rimpiazzamento (Replacement)Rimpiazzamento (Replacement)

Riduzione (Reduction)Riduzione (Reduction)

Raffinamento (Refinement) Raffinamento (Refinement)

Strategia per ottenere il maggior beneficio possibile Strategia per ottenere il maggior beneficio possibile dalla sperimentazione, minimizzando la perdita di vite dalla sperimentazione, minimizzando la perdita di vite animalianimali

Direttiva del Consiglio 86/609/CEEDirettiva del Consiglio 86/609/CEE

Art. 7.2: “Si eviterà di eseguire un esperimento qualora per otArt. 7.2: “Si eviterà di eseguire un esperimento qualora per ottenere tenere il risultato ricercato sia ragionevolmente e praticamente applicil risultato ricercato sia ragionevolmente e praticamente applicabile abile un altro metodo, scientificamente valido, che non implichi l’impun altro metodo, scientificamente valido, che non implichi l’impiego di iego di animali”animali”

Art. 23.1: “La Commissione e gli Stati Membri dovrebbero Art. 23.1: “La Commissione e gli Stati Membri dovrebbero incoraggiare la ricerca intesa a sviluppare e rendere più efficaincoraggiare la ricerca intesa a sviluppare e rendere più efficaci ci tecniche alternative atte a fornire lo steso livello d’informazitecniche alternative atte a fornire lo steso livello d’informazione one degli esperimenti su animali […]”degli esperimenti su animali […]”

Decreto Legislativo 27 gennaio 1992, n. 116Decreto Legislativo 27 gennaio 1992, n. 116

Attuazione della CEE 609/86Attuazione della CEE 609/86

Art. 4.1: “Gli esperimenti […] possono essere eseguiti soltanto Art. 4.1: “Gli esperimenti […] possono essere eseguiti soltanto quando, per ottenere il risultato cercato, non sia possibile impquando, per ottenere il risultato cercato, non sia possibile impiegare iegare un altro metodo scientificamente valido, ragionevolmente e un altro metodo scientificamente valido, ragionevolmente e praticamente applicabile, che non implichi l’uso degli animali”praticamente applicabile, che non implichi l’uso degli animali”

Art. 17.1: “Nella programmazione dei piani di ricerca scientificArt. 17.1: “Nella programmazione dei piani di ricerca scientifica a applicata alla sanità umana e animale ed alla salubrità dell’ambapplicata alla sanità umana e animale ed alla salubrità dell’ambiente, iente, saranno preferiti, ove possibile:saranno preferiti, ove possibile:

a) quelli che non si avvalgono di sperimentazione animale […]”a) quelli che non si avvalgono di sperimentazione animale […]”

Normativa italiana di riferimentoNormativa italiana di riferimento

Applicazioni DL n.116Applicazioni DL n.116Circ. n.32 (26 agosto 1992) Circ. n.32 (26 agosto 1992) Circ. n.17 (5 maggio 1993) Circ. n.17 (5 maggio 1993) Circ. n.18 ( 5 maggio 1993) Circ. n.18 ( 5 maggio 1993) Circ. n.8 (22 aprile 1994) Circ. n.8 (22 aprile 1994) Circ. n.6 (14 maggio 2001)Circ. n.6 (14 maggio 2001)

DM 29 settembre 1995:DM 29 settembre 1995: Riconoscimento titoli di laurea Riconoscimento titoli di laurea idonei ai fini della sperimentazione animale idonei ai fini della sperimentazione animale

Legge n.413/1993: Legge n.413/1993: Norme sull’obiezione di coscienza alla Norme sull’obiezione di coscienza alla sperimentazione animalesperimentazione animale

Raccomandazione CEE 18 giugno 2007Raccomandazione CEE 18 giugno 2007

Linee guida per la sistemazione e tutela degli animali da Linee guida per la sistemazione e tutela degli animali da esperimentoesperimento

Parte generale: sistemazione, alloggio e tutela degli animaliParte generale: sistemazione, alloggio e tutela degli animali

Parti specifiche: informazioni sulle specie più comunemente usatParti specifiche: informazioni sulle specie più comunemente usatee

Proposta di Direttiva CE (Novembre 2008)Proposta di Direttiva CE (Novembre 2008)

Sostiene la strategia globale della Commissione sulla Sostiene la strategia globale della Commissione sulla sperimentazione animalesperimentazione animale

Finalizzata ad assicurare maggiore promozione dello sviluppo Finalizzata ad assicurare maggiore promozione dello sviluppo di metodi alternatividi metodi alternativi

Quali sono i metodi alternativi?Quali sono i metodi alternativi?

Qualunque procedura che sostituisca l’uso degli animali, Qualunque procedura che sostituisca l’uso degli animali, ne riduca il numero e/o ne ottimizzi il benesserene riduca il numero e/o ne ottimizzi il benessere

Metodi biologiciMetodi biologici

Colture di procarioti, cellule, tessuti e organi isolatiColture di procarioti, cellule, tessuti e organi isolati

Vantaggi:Vantaggi: studio di funzioni altamente differenziatestudio di funzioni altamente differenziate,,meccanismi cellulari e molecolarimeccanismi cellulari e molecolari

Svantaggi: Svantaggi: uutilizzo ditilizzo di un un sistema semplificatosistema semplificato, , estrapolazione dei datiestrapolazione dei dati ex vitroex vitro in vivoin vivo

Metodi biologiciMetodi biologici

MTT test: MTT test: valuta la diminuzione di valuta la diminuzione di vitalità cellulare

Microtox: Microtox: valuta il decremento valuta il decremento di luminescenza vitalità cellularedi luminescenza

Metodi chimiciMetodi chimici

Corrositex:Corrositex: valuta l’effetto irritante o corrosivo valuta l’effetto irritante o corrosivo su un modello artificiale di pelle umanasu un modello artificiale di pelle umana

Metodi matematicoMetodi matematico--informaticiinformatici

QSAR (Quantitative Structure Activity RelationshipQSAR (Quantitative Structure Activity Relationship): ): collega la tossicità con la struttura molecolarecollega la tossicità con la struttura molecolare

Ricerca corrente 2006 IZS AM 09/06 Ricerca corrente 2006 IZS AM 09/06

OBIETTIVO: OBIETTIVO:

applicazione di un modello tossicologico applicazione di un modello tossicologico in vitroin vitro che studi gli effetti che studi gli effetti delle delle yessotossineyessotossine ((YTXsYTXs) su linee cellulari confrontando ) su linee cellulari confrontando l’efficienza della nuova metodica diagnostica con il MBAl’efficienza della nuova metodica diagnostica con il MBA

Progetto presentato da: IZS AMProgetto presentato da: IZS AM

Area tematica: Benessere animaleArea tematica: Benessere animale

Resonsabile Scientifico: Prof. G.P. RossiniResonsabile Scientifico: Prof. G.P. Rossini

Procedura di Dosaggio funzionale delle YTXsProcedura di Dosaggio funzionale delle YTXs

Principio del metodo: capacità delle YTXs di indurre una Principio del metodo: capacità delle YTXs di indurre una risposta doserisposta dose--dipendente su colture cellularidipendente su colture cellulari

Procedura Operativa Standard 27 Giugno 2007 Procedura Operativa Standard 27 Giugno 2007 (Dipartimento di Scienze Biomediche, Università di Modena e Regg(Dipartimento di Scienze Biomediche, Università di Modena e Reggio Emilia)io Emilia)

Patent application No PCT/EP01/07487Patent application No PCT/EP01/07487

YESSOTOSSINE (YTXs)YESSOTOSSINE (YTXs)

Polieteri solforati, capaci di causare la morte Polieteri solforati, capaci di causare la morte dei topi da esperimento se iniettate i.p.dei topi da esperimento se iniettate i.p.

MECCANISMI D’AZIONEMECCANISMI D’AZIONE

Citotossicità (apoptosi)Citotossicità (apoptosi)

Interazione canali CaInterazione canali Ca2+ 2+ (movimento transmembrana Ca(movimento transmembrana Ca2+2+))

[cAMP] intracellulare (attivazione Fosfodiesterasi)[cAMP] intracellulare (attivazione Fosfodiesterasi)

Adesione cellulare (accumulo frammento EAdesione cellulare (accumulo frammento E--caderina)caderina)

YTXs: meccanismi d’azioneYTXs: meccanismi d’azione

EE--caderina: glicoproteina transcaderina: glicoproteina trans--membrana che media membrana che media l’adesione cellulare in presenza di Cal’adesione cellulare in presenza di Ca2+2+

YTXs: meccanismi d’azioneYTXs: meccanismi d’azione

YTXs causano l’accumulo citoplasmatico del YTXs causano l’accumulo citoplasmatico del frammento frammento ECRAECRA100100 (E(E--cadherinecadherine--related antigen)related antigen)

Eterodimeri EEterodimeri E--caderina/ECRAcaderina/ECRA100100 sono privi di sono privi di proprietà adesiveproprietà adesive

Dosaggio funzionale YTXsDosaggio funzionale YTXs

Allestimento colture MCFAllestimento colture MCF--7 7

(human caucasian breast adenocarcinoma)(human caucasian breast adenocarcinoma)

Dosaggio funzionale YTXsDosaggio funzionale YTXs

Aggiunta di soluzioni standard di YTXs Aggiunta di soluzioni standard di YTXs (CRM(CRM--YTX YTX calibration solution) calibration solution)

Aggiunta degli estratti diAggiunta degli estratti di Mytilus galloprovincialis Mytilus galloprovincialis (5.b)(5.b)

Incubazione delle cellule per 20 ore a 37°CIncubazione delle cellule per 20 ore a 37°C

Dosaggio funzionale YTXsDosaggio funzionale YTXs

Preparazione degli estratti cellulari mediante lisi con Preparazione degli estratti cellulari mediante lisi con detergentidetergenti

Dosaggio funzionale YTXsDosaggio funzionale YTXs

Separazione elettroforetica degli estratti in Separazione elettroforetica degli estratti in SDSSDS--PAGE PAGE

Trasferimento su membrana di nitrocellulosaTrasferimento su membrana di nitrocellulosa

Dosaggio funzionale YTXsDosaggio funzionale YTXs

Saturazione membranaSaturazione membrana

Incubazione con MoAb anti EIncubazione con MoAb anti E--caderinacaderina

Incubazione con Ab II HRPIncubazione con Ab II HRP--coniugatoconiugato

Rivelazione immunoenzimatica in chemiluminescenzaRivelazione immunoenzimatica in chemiluminescenza

Analisi densitometrica degli elettroferogrammiAnalisi densitometrica degli elettroferogrammi

Dosaggio funzionale YTXsDosaggio funzionale YTXs

EE--caderinacaderina125 125 --

100 100 -- ECRAECRA100100

Determinazione Immunorettività totale (AU) e relativa (IR)Determinazione Immunorettività totale (AU) e relativa (IR)

Calcolo dell’Attività Relativa (AR)Calcolo dell’Attività Relativa (AR)

AR = IR ECRAAR = IR ECRA100 100 / IR ECRA/ IR ECRA100100MAXMAX

Dosaggio funzionale YTXsDosaggio funzionale YTXs

Elaborazione dati con SigmaPlot 11 e creazione di una curva staElaborazione dati con SigmaPlot 11 e creazione di una curva standardndardCurva Standard CRM-YTX (Teramo)

Concentrazione nM

0 1 2 3

Attiv

ità R

elat

iva

-0.2

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

[nM] vs AR

Sigmoide a 5 parametriSigmoide a 5 parametri

Dall’interpolazione dei valori di AR dei campioni incogniti si Dall’interpolazione dei valori di AR dei campioni incogniti si ottiene il valore di ottiene il valore di mgmgeqeqYTX/kg p.e.YTX/kg p.e.

esp# diluizione AU E-cad AU E100 AU S IR E100 IR E100 medi IR E100 max AR AR medi nME ngeq YTX pz.1A 1793,75323 0 1793,75 0,00 0,70 41,57 0,00 0,021B 1960,52743 27,7417 1988,27 1,40 41,57 0,03

2A 60 nM 1965,11736 231,245 2196,36 10,53 9,54 41,57 0,25 0,232B 60 nM 2099,97973 196,3089 2296,29 8,55 41,57 0,21

3A 80 nM 1792,52845 314,4619 2106,99 14,92 13,43 41,57 0,36 0,323B 80 nM 1866,3691 253,0342 2119,40 11,94 41,57 0,29

4A 100 nM 1786,44828 534,1135 2320,56 23,02 22,37 41,57 0,55 0,544B 100 nM 1640,71017 455,1152 2095,83 21,72 41,57 0,52

5A 125 nM 1838,1948 718,8629 2557,06 28,11 30,14 41,57 0,68 0,735B 125 nM 1692,43103 802,8091 2495,24 32,17 41,57 0,77

6A 150 nM 1599,09263 775,244 2374,34 32,65 33,52 41,57 0,79 0,816B 150 nM 1638,39326 858,7201 2497,11 34,39 41,57 0,83

7A 300 nM 1598,60226 1107,64 2706,24 40,93 41,57 41,57 0,98 1,007B 300 nM 1604,14971 1171,302 2775,45 42,20 41,57 1,02

8A 25 1568,17633 81,3944 1649,57 4,93 4,37 41,57 0,12 X1 X1 #VALORE!8B 25 1799,7263 82,52462 1882,25 4,38 41,57 0,11

8C 25 1679,10629 66,2175 1745,32 3,79 41,57 0,09

9A 12,5 1662,2965 282,905 1945,20 14,54 13,85 41,57 0,35 X2 X2 #VALORE!9B 12,5 1914,42625 271,8495 2186,28 12,43 41,57 0,30

9C 12,5 1800,56823 306,8097 2107,38 14,56 41,57 0,35

10A 5 2020,83672 1019,359 3040,20 33,53 33,44 41,57 0,81 X3 X3 #VALORE!10B 5 2071,11701 1015,3 3086,42 32,90 41,57 0,7910C 5 2089,48088 1070,874 3160,36 33,88 41,57 0,82

La nostra esperienzaLa nostra esperienza

Esaminati 2 gruppi di campioniEsaminati 2 gruppi di campioni

Mytilus galloprovincialis Mytilus galloprovincialis

3 negativi MBA3 negativi MBA

4 positivi MBA4 positivi MBA

La nostra esperienzaLa nostra esperienza

NRG IZSAMNRG IZSAM MBA testMBA test

715715

724724

757757

negativonegativo

negativonegativo

negativonegativo

Test iTest in vitron vitro(mg(mgeqeq/kg p.e.)/kg p.e.)

0,5500,550

0,4540,454

0,9000,900

Campioni della costa abruzzeseCampioni della costa abruzzese--molisanamolisana

La nostra esperienzaLa nostra esperienza

NRG IZSAMNRG IZSAM MBA testMBA test

798798 positivopositivo

799799 positivopositivo

809809 positivopositivo

810810 positivopositivo

Test Test in vitroin vitro(mg(mgeqeq/kg p.e.)/kg p.e.)

1,3001,300

1,6301,630

1,4851,485

1,6321,632

LCLC--MS/MSMS/MS(mg(mgeqeq/kg p.e.)/kg p.e.)

1,4401,440

1,8021,802

1,9701,970

1,2221,222

Campioni della costa romagnolaCampioni della costa romagnola

Su due campioni positivi…Su due campioni positivi…

Utilizzo di Precast Gels Midi per elettroforesiUtilizzo di Precast Gels Midi per elettroforesi

Western Blotting mediante iBlotWestern Blotting mediante iBlotTM TM Dry Blotting SystemDry Blotting System

Maggior diluizione MoAb anti EMaggior diluizione MoAb anti E--caderinacaderina

RisultatiRisultati

1:12,51:12,5

Tempo di esecuzione Western Blotting 3 oreTempo di esecuzione Western Blotting 3 ore

Riduzione del quantitativo di MoAb anti ERiduzione del quantitativo di MoAb anti E--caderina caderina (1/64)(1/64)

0 0 YTXs (nM) 300YTXs (nM) 300 1:251:25 1:51:5

RisultatiRisultati

NRGNRGIZSAMIZSAM LCLC--MS/MSMS/MS Test in vitroTest in vitro

(mg(mgeqeq/kg p.e.)/kg p.e.)

1,4401,440 1,3001,300

1,4851,4851,9701,970

798798

809809

Midi SystemMidi System(mg(mgeqeq/kg p.e.)/kg p.e.)

1,5821,582

1,6701,670

I differenti test forniscono risultati confrontabiliI differenti test forniscono risultati confrontabili

BibliografiaBibliografia

Callegari F., Rossini G.P. Yessotoxin inhibit the complete degraCallegari F., Rossini G.P. Yessotoxin inhibit the complete degradation of Edation of E--cadherin. 2008. cadherin. 2008. ToxicologyToxicology, , 244244:133:133--144.144.

Hess P., Grune B., Anderson D. B., Aune T., Botana L. M., CaricaHess P., Grune B., Anderson D. B., Aune T., Botana L. M., Caricato P., van Egmond H.P., to P., van Egmond H.P., Halder M., Hall S., Lawrence J.F., Moffat C., Poletti R., RichmoHalder M., Hall S., Lawrence J.F., Moffat C., Poletti R., Richmond J., Rossini G.P., Seamer nd J., Rossini G.P., Seamer C., Vilageliu J.S. Three Rs Approaches in Marine Biotoxin TestinC., Vilageliu J.S. Three Rs Approaches in Marine Biotoxin Testing. The Report and g. The Report and Recommendation of a joint ECVAM/DG SANCO Workshop (ECVAM WorkshoRecommendation of a joint ECVAM/DG SANCO Workshop (ECVAM Workshop 55). 2006. p 55). 2006. ATLAATLA,, 3434:193:193--224.224.

Panzini G., Lorenzini R.N. Animali experimentation in Italy. LegPanzini G., Lorenzini R.N. Animali experimentation in Italy. Legislation and the islation and the authorization of research protocols. 2004. authorization of research protocols. 2004. Ann Ist Super SanitàAnn Ist Super Sanità, , 4040:205:205--210.210.

Pierotti S., Malaguti C., Milandri A., Poletti R., Rossini G.P. Pierotti S., Malaguti C., Milandri A., Poletti R., Rossini G.P. Functional assay to measure Functional assay to measure Yessotoxins in contaminated mussel samples. 2003. Yessotoxins in contaminated mussel samples. 2003. Anal. BiochAnal. Bioch., ., 312312:208:208--216.216.

Ronzitti G., Rossini G.P. Yessotoxin induces the accumulation ofRonzitti G., Rossini G.P. Yessotoxin induces the accumulation of altered Ealtered E--cadherin dimers cadherin dimers that are not part of adhesive structures in intact cells. 2008. that are not part of adhesive structures in intact cells. 2008. Toxicology,Toxicology, 244244:145:145--156.156.

Se qualcuno sostenesse che, non diversamente che i frutti della Se qualcuno sostenesse che, non diversamente che i frutti della terra, il dio ci ha dato anche gli animali per terra, il dio ci ha dato anche gli animali per il nostro uso, è comunque vero che, sacrificando esseri viventi,il nostro uso, è comunque vero che, sacrificando esseri viventi, si commette contro di loro un’ingiustizia, si commette contro di loro un’ingiustizia,

perché si fa rapina della loro vita....perché si fa rapina della loro vita....

Teofrasto, Metafisica

Io speriamo che me la Io speriamo che me la cavo!!!cavo!!!