Facoltà di Scienze Matematiche Fisiche e NaturaliCorso di laurea triennale in Scienze Biologiche

Curriculum Biosanitario

Uso delle cellule staminali embrionali come strategia terapeutica per il trapianto renale e la limitazione (risoluzione) del rigetto d'organo

Candidato Relatore Daniela De Rosa Loretta Tuosto

2014/2015

Fisiologia e funzione renale

GLOMERULO: Rete densa di capillari che filtrano il sangue.CAPSULA DI BOWMAN: Cattura il fluido che è stato filtrato fuori dalla circolazione sanguigna e lo trasferisce nei tubuli.TUBULO: Circondato da un singolo strato di cellule specializzate il cui compito è riassorbire acqua ed elettroliti nel sangue

FUNZIONE OMEOSTATI

CA

FUNZIONE ENDOCRIN

A

FUNZIONE ESCRETIVA

Il nefrone è l’unità funzionale del rene

Il trapianto renale CLASSIFICAZIONE

DEI TRAPIANTI

• Trapianto ortotopico• Trapianto eterotopico• Autotrapianto• Isotrapianto• Allotrapianto• Xenotrapianto

Compatibilità dei tessuti

CLASSE I: espresse sulla superficie di tutte le cellule nucleate, fisiologicamente deputate alla presentazione di peptidi antigenici ai linfociti T citotossici CD8+. CLASSE II: espresse sulla membrana di APC (cellule dendritiche, macrofagi, cellule B). Le APC sono fisiologicamente deputate alla presentazione di peptidi antigenici ai linfociti T helper CD4+.

• ANTIGENI ABO• ANTIGENI HLA

I classe HLA-A, HLA-B, HLA-CII classe HLA-DR, -DP-, DQ

Alloriconoscimento

b) INDIRETTA: I frammenti peptidici delle molecole MHC del donatore presentati da MHC II dell’ospite sono riconosciuti come estranei.

a) DIRETTA: I linfociti T del ricevente riconoscono l’MHC intatto del donatore come estraneo.

Il rigetto d’organo

RIGETTO IPERACUTO

RIGETTO ACUTO

RIGETTO CRONICO

Prevenzione e trattamento del rigetto

RIDUZIONE DELL’IMMUNOGENICITA’ Tipizzazione tissutale HLA Tipizzazione del gruppo sanguigno ABO Screening per la presenza di anticorpi preformati Reazione mista linfocitariaIMMUNOSOPPRESSIONE Ciclosporina Tacrolimus Azatiopirina Farmaci antiinfiammatori (corticosteroidi)INDUZIONE DI TOLLERANZA Anergia clonale Apoptosi indotta Sviluppo di linfociti T soppressori / regolatori

• INDIFFERENZIATE • CAPACI DI AUTO RIGENERARSI (self-renewal)• CAPACI DI DIFFERENZIARSI IN TIPI CELLULARI SPECIFICI• CAPACI DI RIPOPOLARE UN TESSUTO in vivo

Cellule staminali

A - le cellule staminali; B - cellule progenitrici; C - cellula differenziata;1 - divisione simmetrica delle cellule staminali; 2 - divisione asimmetrica delle cellule staminali; 3 - divisione progenitore; 4 - terminale di differenziazione

La possibilità di generare organi e tessuti da sostituire a quelli malati a partire da cellule staminali proprie del paziente rappresenta uno dei più recenti obiettivi della medicina rigenerativa.

Classificazione delle staminali

Cellule staminali embrionali

VANTAGGI • Originano cellule

provenienti da tutti e tre i foglietti embrionali.

• Crescita in vitro senza cambiarne fenotipo o cariotipo le rende promettenti per la rigenerazione e per la riparazione dei tessuti.

• Ridotta immunogenicità, piccole quantità di molecole HLA I e nessuna molecola HLA II.

SVANTAGGI • Evoluzione in teratomi.

ICM Oct4, Foxd3

PluripotenzaECTODERMA(tes.nervoso, epiteli e ghiandole, capelli, unghie , cristallino)

MESODERMA(t.osseo, t.muscolare, cuore, vasi ,t. connettivo, pleure, peritoneo, sistema urogenitale)

ENDODERMA(app.digerente, respiratorio, tiroide, paratiroide)

Sviluppo del reneIl rene è un organo di origine

mesodermica

Il MM specificato da Hoxa11, Hoxc11, Hoxd1 , Wt1, per mezzo del rilascio di GDNF promuove l’evaginazione della gemma ureterica, che attraverso FGF2 e BMP7, promuove l’addensamento delle cellule mesenchimali attorno ad essa. GDNF, TGFβ1, BMP4, collagene VIII permettono la ramificazione dell’epitelio Foxb2 permette l’ddensamento pretubulare e il differenziamento in nefroni. Le cellule del cappuccio convertono la vitamina A in acido retinoico per mantenere l’espressione di Ret (recettore GDNF) nella gemma ureterica.

M. Takasato, H. Little et al, mostrano un protocollo che riesce a far differenziare le cellule staminali embrionali umane in tutte quelle necessarie a formare un "mini-organo renale”.

Un rene dalle staminali

MESODERMA IM Hesc ENDODERMA

Reporter “Green Fluorescent Protein”

MIXL1 (segnalatore forte della striscia primitiva)

• Agonista della segnalazione Wnt canonica CHIR99021• Conc.elevate di

BMP4/ATTIVINA a

STRISCIAPRIMITIV

A

I FASE

Analisi di classificazione delle cellule attivate da fluorescenza mostra più del 90 % di cellule GFP -MIXL1+ indotte con alte conc. di BMP4 su basse conc. di attivina A e con alte conc. di CHIR99021.

Livelli di espressione comparativa relativi a SOX17, Brachiury T, e MIXL1 al 3 gg per

proporzioni di BMP4/Attivina A e CHIR99021

II FASE

LPM STRISCIA PRIMITIVA MESODERMA

PM

IM

La prima struttura a formarsi è il dotto nefrico lungo il quale appaiono tre paia di organi escretori: PRONEFRO, MESONEFRO, METANEFRO.

MM GERMOGLIO URETERICO EU

FGF9 GDNFWnt

NEFRONE

FGF FGF9

Co-localizzazione di PAX2 e LHX1

• INDUZIONE BMP/ATTIVINA A • AGONISTA Wnt CHIR99021 +FGF9

MIXL1, LHX1 SPOSR1, PAX2, LHX1 IMSIX2, WT1, GDNF, HOXD11 MMPAX2, CRET, HOXB7 EU

BMP4/ Attivina A + FGF9 + RA + BMP7

Inducono espressione transiente SIX2 e nessuna prova mesenchimale di PAX2.

Agonista della segnalazione canonica Wnt (CHIR99021) e FGF9 inducono espressione

prolungata SIX2 nel MM , espressione PAX2 nel MM e nell’EU.

MIXL1, LHX1 SPOSR1, PAX2, LHX1 IMSIX2, WT1, GDNF, HOXD11 MMGATA3 co-espresso con EU PAX2+

JAG1 CDH6

Prove per l’induzione del nefrone dopo differenziazione CHIR99021 + FGF9 diretta.

Primi nefroni/ vescicole renali

Integrazione ed auto-organizzazione di cellule derivate da hESC indotte con protocollo

CHIR99021 e FGF9.

ECAD⁺, PAX2, AQP2 EUAQP1, SLC3A1, WT1, PAX2⁺ TP circondava l’EU (ECAD ⁺)JAG1 ⁺, ECAD⁺ vescicole renali

Lo studio dei ricercatori M. Takasato, H. Little et al., mostra per la prima volta l’utilizzo di FGF9, dimostratosi cruciale per la sopravvivenza e lo sviluppo in continuo del MM.

La creazione di un rene tramite l’uso di cellule staminali rende risolutivi (ed in ogni caso limitativi) i problemi connessi ai trapianti d’organo.

RIGETTO D’ORGANO LISTE D’ATTESA

DURATA LIMITATAUSO DI IMMUNOSOPRESSIVI MANCANZA D’ORGANI