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Università di Modena e Reggio Emilia MicroRNA and Lung Cancer CLINICA DI MALATTIE DELLAPPARATO...
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MicroRNA and Lung CancerMicroRNA and Lung Cancer
CLINICA DI MALATTIE DELL’APPARATO CLINICA DI MALATTIE DELL’APPARATO RESPIRATORIORESPIRATORIO
Università degli Studi di Modena e Reggio EmiliaUniversità degli Studi di Modena e Reggio Emilia
Journal ClubJournal Club
Università di Modena e Reggio EmiliaUniversità di Modena e Reggio Emilia
CLINICA DI MALATTIE DELL’APPARATO RESPIRATORIO
Università degli Studi di Modena e Reggio Emilia
MicroRNA and Lung Cancer
Matthias Eder, Michaela Scherr
New Engl J Med 2005; June 9; 23:2446-2448
Università di Modena e Reggio EmiliaUniversità di Modena e Reggio Emilia
MicroRNA and Lung CancerMicroRNA and Lung Cancer
• RAS e tumore polmonareRAS e tumore polmonare
• microRNA: definizione e funzionemicroRNA: definizione e funzione
• Ruolo dei microRNA nel tumore polmonareRuolo dei microRNA nel tumore polmonare
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MicroRNA and Lung CancerMicroRNA and Lung Cancer
• RAS e tumore polmonareRAS e tumore polmonare
• microRNA: definizione e funzionemicroRNA: definizione e funzione
• Ruolo dei microRNA nel tumore polmonareRuolo dei microRNA nel tumore polmonare
LA TRASFORMAZIONE NEOPLASTICALA TRASFORMAZIONE NEOPLASTICA
OncogeniOncogeni
OncosoppressoriOncosoppressoriOnOn
OffOff OncosoppressoriOncosoppressori
OncogeniOncogeni
OffOff
OnOn
1)1) Mutazioni puntiformiMutazioni puntiformi
2)2) Amplificazione genicaAmplificazione genica
3)3) Traslocazioni cromosomicheTraslocazioni cromosomiche
4)4) delezionidelezioni
ONCOGENE: carattere dominanteONCOGENE: carattere dominante
ONCOSOPPRESSORE: carattere recessivoONCOSOPPRESSORE: carattere recessivo
Chronology of genetic and molecular lesionsChronology of genetic and molecular lesions
C.Brambilla; Eur Respir J 2003; 21 Suppl.39, 36s-44sC.Brambilla; Eur Respir J 2003; 21 Suppl.39, 36s-44s
Normal Hyperplasia Metaplasia Dysplasia ISC CarcinomaNormal Hyperplasia Metaplasia Dysplasia ISC Carcinoma
3p-3p-
9p-9p-
17p-17p-
AneuploidyAneuploidy
P53 mutP53 mut
Ras mutRas mut
Telomerase + FHITTelomerase + FHIT
RbRb
MAJOR MOLECULAR ALTERATIONS IN LUNG CANCERMAJOR MOLECULAR ALTERATIONS IN LUNG CANCER
Proto-oncogenes and growth stimulation
Putative autocrine loops GRP/GRP receptor HGF/MET
SCF/KIT NDF/ERBB
RAS mutation <1 15-20
MYC amplification 15-30 5-10
Other molecular changes
BCL-2 expression 75-95 10-35
Telomerase activity 100 80-85
SCLC (%) NSCLC (%)
Clinics in chest medicine, march 2002 vol.23; n1:83
Codifica per 3 proteine di 21-kD (H-Ras, N-Ras, K-Ras) che allo stato attivo Codifica per 3 proteine di 21-kD (H-Ras, N-Ras, K-Ras) che allo stato attivo legano GTP e allo stato inattivo legano GDPlegano GTP e allo stato inattivo legano GDP
Ruolo di GTPasi intrinseca a ras (p21 ) nel ritorno allo stato di Ruolo di GTPasi intrinseca a ras (p21 ) nel ritorno allo stato di quiescenza della proteinaquiescenza della proteina
Attivazione dell’oncogene K-ras mediante mutazione puntiforme al codone Attivazione dell’oncogene K-ras mediante mutazione puntiforme al codone 12 (occasionalmente: 13 e 61) avviene nel 30% degli adenocarcinomi del 12 (occasionalmente: 13 e 61) avviene nel 30% degli adenocarcinomi del polmonepolmone
La mutazione è correlata all’abitudine tabagicaLa mutazione è correlata all’abitudine tabagica
Am J Respir Crit Car Med vol 161.pp 1355-1367, 2000
RASRAS
rasras
MUTAZIONE DI KRAS MUTAZIONE DI KRAS
Inactive KRAS
active KRAS
Inactive KRAS
GDPGDP
GTPGTPGDPGDP
GAP
Downstream signal transduction cascadeDownstream signal transduction cascade
++
Mutant Mutant KRAS KRAS activeactive
++
GTPGTP
GAP
Drugs that block specific downstream signals
Drugs that inhibit mutant KRAS expression or
function
Clinics in Chest Medicine , march 2002 Vol 23 n°1:83
Ras e stimoli proliferativiRas e stimoli proliferativi
RasRas
PDGFRPDGFR EGFREGFR
AF-6AF-6 RGLRGL PI3KPI3K RafRaf Rin1Rin1 MekkMekk Nore1Nore1
Gap JunctionsGap Junctions PLDPLD AktAkt MAPKMAPK BCRBCR JNKJNK ??
Effetti biologiciEffetti biologici
IntegrineIntegrine
GPCRGPCR
IL-2RIL-2R
Cellular Signalling 2000; 12: 425-434Cellular Signalling 2000; 12: 425-434
Mutazione di K-RAS identificata in circa il 30% degli adenocarcinomi Mutazione di K-RAS identificata in circa il 30% degli adenocarcinomi polmonaripolmonari
Associata a riduzione della sopravvivenza nei pazienti affetti da neoplasia Associata a riduzione della sopravvivenza nei pazienti affetti da neoplasia polmonare NSCLCpolmonare NSCLC
la presenza di mutazione di K-RAS è associata a resistenza al trattamento la presenza di mutazione di K-RAS è associata a resistenza al trattamento con gefitinibcon gefitinib
Journal of Clinica Oncol 2005;23:3227-3234
RASRAS
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MicroRNA and Lung CancerMicroRNA and Lung Cancer
• RAS e tumore polmonareRAS e tumore polmonare
• microRNA: definizione e funzionemicroRNA: definizione e funzione
• Ruolo dei microRNA nel tumore polmonareRuolo dei microRNA nel tumore polmonare
MicroRNAMicroRNA
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• Piccoli frammenti di RNA (lunghezza 21-25 nucleotidi) non codificanti
• Regolazione negativa della trascrizione genica mediante ibridazione a sequenze complementari nella regione 3’ (3’UTR) del mRNA target
• Meccanismo simile nelle piante e negli animali
• Alcuni miRNA sono alterati nelle neoplasie
MicroRNA: sintesiMicroRNA: sintesi
RISC: RNA-induced silencing complex
Nature 2005;435:745-746
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Interazione tra microRNA e mRNA targetInterazione tra microRNA e mRNA targetJournal of Cell Biology 2002; 156:17-21
Cell 2004; 116:281-297
Funzione dei microRNAFunzione dei microRNA
RISCRISC
RISCRISC3’ UTR mRNA3’ UTR mRNA 3’ UTR mRNA3’ UTR mRNA
Clivaggio Clivaggio dell’mRNAdell’mRNA
Inibizione della Inibizione della trascrizione trascrizione
proteicaproteica
microRNAmicroRNA
microRNAmicroRNA
Copyright ©2004 by the National Academy of Sciences
Calin, George Adrian et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 2999-3004
Fig. 1. Correlation between FRAs and miRs
Sito fragile:regione cromosomica soggetta a rottura spontanea o indotta
Copyright ©2004 by the National Academy of Sciences
Calin, George Adrian et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 2999-3004
Fig. 3. MiRs as cancer players
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MicroRNA and Lung CancerMicroRNA and Lung Cancer
• RAS e tumore polmonareRAS e tumore polmonare
• microRNA: definizione e funzionemicroRNA: definizione e funzione
• Ruolo dei microRNA nel tumore polmonareRuolo dei microRNA nel tumore polmonare
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Let-7Let-7
• lethal-7 (let-7) è un membro della famiglia dei miRNAlethal-7 (let-7) è un membro della famiglia dei miRNA
• La mutazione di let-7 non permette l’uscita dal ciclo La mutazione di let-7 non permette l’uscita dal ciclo cellulare comportando divisione delle cellule in modelli cellulare comportando divisione delle cellule in modelli sperimentali sperimentali
• Nell’uomo sono stati identificati geni codificanti per Nell’uomo sono stati identificati geni codificanti per let-7 che mappano regioni delete nelle neoplasielet-7 che mappano regioni delete nelle neoplasie
• la iperespressione di let-7 ha inibito la cerscita di linee la iperespressione di let-7 ha inibito la cerscita di linee cellulari di tumore polmonarecellulari di tumore polmonare
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microRNA e tumore polmonaremicroRNA e tumore polmonare
• Takamizawa J. Takamizawa J. Reduced expression of the let-7 Reduced expression of the let-7 microRNA in human lung cancer in association with microRNA in human lung cancer in association with shortened postoperative survivalshortened postoperative survival. Cancer Res 2004; . Cancer Res 2004; 64:3573-375664:3573-3756
• Johnson SM. Johnson SM. RAS is regulated by the let-7 microRNA RAS is regulated by the let-7 microRNA family.family. Cell 2005;120:635-647 Cell 2005;120:635-647
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microRNA e tumore polmonaremicroRNA e tumore polmonare
• Takamizawa J. Takamizawa J. Reduced expression of the let-7 Reduced expression of the let-7 microRNA in human lung cancer in association with microRNA in human lung cancer in association with shortened postoperative survivalshortened postoperative survival. Cancer Res 2004; . Cancer Res 2004; 64:3573-375664:3573-3756
• Johnson SM. Johnson SM. RAS is regulated by the let-7 microRNA RAS is regulated by the let-7 microRNA family.family. Cell 2005;120:635-647 Cell 2005;120:635-647
Analisi della espressione di let-7 nel tumore polmonareAnalisi della espressione di let-7 nel tumore polmonare
Northen blot in linee cellulari di neoplasie polmonari
Northen blot in neoplasie polmonari in vivo
HNLEC = human normal lung epithelial cell lines
20 linee cellulari di neoplasia polmonare
5S rRNA = controllo
Takamizawa J; Cancer Reesearch 2004; 64:3753-3756Takamizawa J; Cancer Reesearch 2004; 64:3753-3756
Sopravvivenza di NSCLC in base all’espressione di let-7Sopravvivenza di NSCLC in base all’espressione di let-7
143 NSCLCReal-Time Reverse Transcription-PCR
Hierarchical ClusteringcDNA primer
cDNA primer
105 adk
Takamizawa J; Cancer Reesearch 2004; 64:3753-3756Takamizawa J; Cancer Reesearch 2004; 64:3753-3756
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microRNA e tumore polmonaremicroRNA e tumore polmonare
• Takamizawa J. Takamizawa J. Reduced expression of the let-7 Reduced expression of the let-7 microRNA in human lung cancer in association with microRNA in human lung cancer in association with shortened postoperative survivalshortened postoperative survival. Cancer Res 2004; . Cancer Res 2004; 64:3573-375664:3573-3756
• Johnson SM. Johnson SM. RAS is regulated by the let-7 microRNA RAS is regulated by the let-7 microRNA family.family. Cell 2005;120:635-647 Cell 2005;120:635-647
LA PRESENZA DI let-7 INFLUENZA LA ESPRESSIONE DI RAS
Cellule HeLa let-7 + transfettate con oligonucleotidi antisenso inibenti
Quantificazione della immunofluorescenza di RAS
Cellule HepG2 trasfettate con let-7
Quantificazione della immunofluorescenza di RAS
Controllo negativo
Controllo negativo
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let-7 E’ SCARSAMENTE ESPRESSO NEL TUMORE POLMONARE
NAT: normal adjacent tissue
Northen blot
20 neoplasie:polmone, colon,mammella
3 Ca squamocellulari
Eder, M. et al. N Engl J Med 2005;352:2446-2448
MicroRNA-Mediated Regulation of RAS Expression in Caenorhabditis elegans and Humans
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MicroRNA and Lung Cancer:MicroRNA and Lung Cancer:
ConclusioniConclusioni
• MicroRNA hanno ruolo fondamentale nella regolazione della MicroRNA hanno ruolo fondamentale nella regolazione della espressione proteicaespressione proteica
• let-7 è in grado di inibire la trascrizione di RASlet-7 è in grado di inibire la trascrizione di RAS
• Nel tumore polmonare è presente una ridotta espressione di Nel tumore polmonare è presente una ridotta espressione di let-7let-7
• L’assenza di let-7 si associa ad una iperespressione di RAS e L’assenza di let-7 si associa ad una iperespressione di RAS e ad un peggioramento della prognosi nel tumore polmonaread un peggioramento della prognosi nel tumore polmonare
• Possibilità di terapia genica in futuro?Possibilità di terapia genica in futuro?
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MicroRNA and Lung CancerMicroRNA and Lung Cancer
• RAS e tumore polmonareRAS e tumore polmonare
• microRNA: definizione e funzionemicroRNA: definizione e funzione
• Ruolo dei microRNA nel tumore polmonareRuolo dei microRNA nel tumore polmonare
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MicroRNA and Lung CancerMicroRNA and Lung Cancer
CLINICA DI MALATTIE DELL’APPARATO CLINICA DI MALATTIE DELL’APPARATO RESPIRATORIORESPIRATORIO
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Journal ClubJournal Club
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RUOLO DELLA FARNESILTRANSFERASI NELLA RUOLO DELLA FARNESILTRANSFERASI NELLA ATTIVAZIONE DI RASATTIVAZIONE DI RAS
CANCER RESEARCH 63, 5656-5668, september 15; 2003CANCER RESEARCH 63, 5656-5668, september 15; 2003
Cell Cell MembraneMembrane
RAS CAAX RAS CAAX
RAScc
AAX
COCHCOCH33COCHCOCH33COCHCOCH33Lys lysLys lys
K RAS
N RAS
H RAS
PTIPTICompetitive inhibitor of Competitive inhibitor of
prenyltransferaseprenyltransferaseP-P Prenyltransferase + P-P Prenyltransferase + isoprenyl-pyrophosphateisoprenyl-pyrophosphate
Isoprenyl groupIsoprenyl group
Proteolysis Proteolysis (Rce-1)(Rce-1)