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UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI SIENA

Dottorato di Ricerca in Medicina Molecolare XXII° CICLO

Coordinatore: Prof. Vincenzo Sorrentino

IDENTIFICAZIONE DI NUOVI GENI MUSCOLO-SPECIFICI: STUDIO DELL’ISOFORMA YIP1B

Relatore: Prof. Vincenzo Sorrentino Correlatore: Dott.ssa Virginia Barone

Dottoranda: Dott.ssa Elisa Mazzoli

Anno Accademico 2008-2009

I

Sommario

Riassunto 1

1 Introduzione 3

1.1 Il tessuto muscolare 3

1.2 Il muscolo scheletrico 4

1.3 Reticolo sarcoplasmatico, tubuli T e triade 8

1.4 Organizzazione del reticolo sarcoplasmatico durante lo sviluppo

12

1.5 Rapporti tra reticolo endoplasmatico e reticolo sarcoplasmatico

14

1.6 Localizzazione dell’apparato di Golgi nella fibra muscolare 18

1.7 Il traffico vescicolare nelle cellule mononucleate 20

1.8 Il traffico vescicolare nel muscolo scheletrico 28

1.9 La famiglia di proteine YIP in lievito 31

1.10 La famiglia di proteine YIP nei mammiferi 33

2 Scopo della tesi 37

3 Materiali e metodi 39

3.1 Colture cellulari 39

3.1.1 Miociti primari 39

3.2 Esperimenti di immunofluorescenza 41

3.2.1 Esperimenti di immunofluorescenza su cellule 41

3.2.2 Esperimenti di immunofluorescenza su sezioni di tessuto 42

II

3.2.3 Esperimenti di immunofluorescenza su diaframma 42

3.2.4 Microscopia confocale 43

3.3 Preparazione di lisati cellulari e di tessuto 43

3.3.1 Lisati cellulari 43

3.3.2 Lisati di tessuto 43

3.4 Preparazione di microsomi da cellule e da tessuto 44

3.5 Quantizzazione proteica con il metodo Bradford 44

3.6 Elettroforesi in gel di poliacrilammide (SDS-PAGE) 45

3.7 Western blot 46

3.8 Clonaggi 46

3.9 Trasfezioni 48

3.9.1 Trasfezione transiente in cellule 48

3.9.2 Trasfezione transiente in vivo 49

3.10 mRNA interference 49

3.11 Estrazione RNA totale 50

3.12 Preparazione del cDNA (RT-PCR) 51

3.13 Real-Time PCR 51

3.14 Produzione e purificazione di anticorpi policlonali 53

Trattamento degli animali 54

4 Risultati 55

4.1 Identificazione di nuovi geni espressi nel muscolo striato 55

4.2 Espressione dei membri della famiglia YIP1 in diversi tessuti 57

4.2.1 Espressione delle due isoforme di Yip1 in cellule C2C12 60

4.3 Validazione dell’anticorpo anti-Yip1B mediante Western blot 62

4.4 Analisi dell’espressione di Yip1B nei tessuti e in C2C12 63

4.5 Localizzazione sub-cellulare di Yip1B 64

4.5.1 Localizzazione di Yip1B in cellule C2C12 64

III

4.5.2 Localizzazione di Yip1B in miociti primari 67

4.5.3 Localizzazione di Yip1B in fibre muscolari adulte 69

4.6 Espressione di Yip1B durante il differenziamento cellulare delle C2C12

71

4.7 Espressione di Yip1B e Yip1A durante lo sviluppo muscolare embrionale

72

4.7.1 Analisi mediante Real-time PCR 72

4.7.2 Analisi mediante Western blot 75

4.7.3 Analisi mediante esperimenti di immunofluorescenza 75

4.8 Espressione di Yip1B in fibre rigeneranti 76

4.9 Effetto dell’overespressione di Yip1B e Yip1A in C2C12 indifferenziate

77

4.10 Knock-down di Yip1B 78

5 Discussione 84

6 Bibliografia 87

1

Riassunto

Il sistema di membrane interne delle fibre muscolari scheletriche, che

comprende il reticolo endo/sarcoplasmatico, i tubuli T e l’apparato di Golgi,

presenta una precisa organizzazione spaziale rispetto al sarcomero. Infatti nel

reticolo sarcoplasmatico si possono distinguere due regioni strutturalmente e

funzionalmente differenti: la porzione longitudinale, dove ci sono proteine

specializzate per la ricattura del calcio, e la porzione di reticolo giunzionale, in

corrispondenza dei tubuli T, dove sono presenti le proteine per il rilascio di calcio.

Anche l’apparato di Golgi ha una distribuzione particolare: esso appare costituito

da poche cisterne impilate l’una sull’altra disperse lungo la fibra e intorno ai

nuclei.

In questo contesto i meccanismi responsabili della localizzazione delle proteine

residenti nel reticolo sarcoplasmatico non sono ancora noti.

Allo scopo di studiare questi meccanismi, in laboratorio è stato isolato un

cDNA codificante una proteina chiamata Yip1B, omologa alla proteina Yip1p di

lievito. Diversi studi presenti in letteratura hanno mostrato che in lievito Yip1p è

una proteina importante per la biogenesi delle vescicole di trasporto rivestite da

COPII gemmanti dall’ER e per la loro competenza alla fusione con l’apparato di

Golgi.

Nei mammiferi l’omologo di Yip1p è presente come due isoforme: Yip1A e

Yip1B. Allo scopo di verificare e quantificare l’espressione di Yip1A e Yip1B nel

muscolo scheletrico sono stati effettuati esperimenti di Real-Time PCR su diversi

tessuti. Yip1A è espressa in modo ubiquitario, ad esclusione del muscolo

scheletrico adulto, mentre Yip1B è espressa esclusivamente nel muscolo striato.

E’ stata poi analizzata l’espressione di entrambe le isoforme di Yip1 durante lo

sviluppo embrionale e post-natale del muscolo. Dati di Real-Time PCR hanno

evidenziato una riduzione dell’espressione di Yip1A con il progredire dello

sviluppo e quindi del differenziamento muscolare, e un contemporaneo aumento

2

dei livelli d’espressione di Yip1B, la cui espressione proteica compare circa al 16°

giorno di vita embrionale.

Per studiare la localizzazione sub-cellulare e per meglio comprendere la

funzione di Yip1B sono stati prodotti anticorpi policlonali contro la porzione

idrofilica di Yip1B. Grazie ad esperimenti di Western blot, è stato visto che

l’antisiero prodotto é in grado di riconoscere la proteina endogena nel muscolo

striato, in cellule C2C12 differenziate, ma non in C2C12 non differenziate e in

altri tessuti, a conferma che si tratta di una proteina muscolo-specifica. Inoltre la

proteina è presente in maggiori quantità nella frazione microsomiale dei muscoli

scheletrici, a conferma della sua associazione con la membrana.

Esperimenti di immunofluorescenza nel muscolo scheletrico hanno rivelato

che la proteina Yip1B è localizzata ai poli del nucleo e in file di strutture

puntiformi lungo la fibra e co-localizza parzialmente con il marcatore del cis-

Golgi GM130.

Dati presenti in letteratura dimostrano che l’over-espressione dell’isoforma

Yip1A e soprattutto della sua porzione N-terminale, comporta la frammentazione

dell’apparato di Golgi. Per verificare se anche Yip1B possiede le stesse proprietà e

per indagare quale porzione possa essere responsabile di questo effetto, sono stati

trasfettati in cellule tre vettori d’espressione contenenti diverse porzioni del gene.

I risultati mostrano che l’over-espressione della forma intera e della porzione N-

terminale provocano la frammentazione dell’apparato di Golgi, fenomeno che

però non si verifica esprimendo la porzione di divergenza delle due isoforme

composta dai primi 80 amminoacidi.

Studi di knock-down sia in vitro che in vivo hanno infine dimostrato che il

silenziamento di Yip1B non altera la distribuzione del marcatore del cis-Golgi

GM130, indicando che la diminuzione della proteina ha un effetto diverso

rispetto alla sua over-espressione.

INTRODUZIONE

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3

1 Introduzione

1.1 Il tessuto muscolare

Nei Mammiferi sono presenti due tipi di tessuto muscolare: il tessuto

muscolare liscio e il tessuto muscolate striato.

Il tessuto muscolare liscio (fig. 1.1a) è costituito da unità

morfologicamente distinte, dette fibrocellule muscolari lisce presenti a livello

delle tonache muscolari degli organi cavi e dei vasi sanguigni, e poiché

innervato dal sistema nervoso vegetativo, la sua contrazione è al di fuori del

controllo volontario.

Il tessuto muscolare striato, così chiamato a causa della distribuzione delle

proteine contrattili che gli conferiscono un aspetto striato al microscopio

ottico, si divide in muscolo striato cardiaco e scheletrico.

Il tessuto muscolare cardiaco (fig. 1.1b) o miocardio è responsabile della

contrazione del cuore ed è formato da singoli elementi mononucleati uniti tra

loro da giunzioni di membrana. Il miocardio è in grado di generare

autonomamente lo stimolo alla contrazione grazie al nodo seno-atriale dal

quale si propagano gli impulsi elettrici che generano il battito cardiaco. Il

ritmo cardiaco è invece influenzato dall’attività del sistema nervoso autonomo

e da stimoli ormonali.

Il tessuto muscolare scheletrico (fig. 1.1c) costituisce la muscolatura

scheletrica di tutto l’organismo; essa è un sincizio formato dalla fusione,

durante lo sviluppo muscolare, di elementi mononucleati detti mioblasti che

fondendosi formano la fibra muscolare o miofibra. Il muscolo scheletrico è

un muscolo volontario in quanto riceve terminazioni nervose dal sistema

nervoso centrale.

INTRODUZIONE

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4

Fig 1.1 Tipologie di muscolo nei mammiferi (Adattata da http://www.colorado.edu/intphys/Class/IPHY3430-200/010muscles.htm)

1.2 Il muscolo scheletrico

Nel muscolo scheletrico le fibre muscolari sono disposte parallelamente e

circondate esternamente da una guaina connettivale detta epimisio. Da questa si

dipartono verso l’interno della struttura muscolare dei setti, che rappresentano

il perimisio, che vanno a circondare ciascun fascio di fibre. Dal perimisio si

dipartono dei setti più sottili che circondano ogni singola miofibra, formando

l’endomisio, che contiene capillari e assoni

(fig.1.2).

(a)

(c)

(b)

INTRODUZIONE

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5

Fig.1.2 Rappresentazione schematica della sezione longitudinale del

muscolo scheletrico

Sotto l’endomisio si trova il sarcolemma, ossia la membrana plasmatica, che

racchiude il citoplasma (sarcoplasma) della miofibra. Compresi tra il

sarcolemma e l’endomisio troviamo le cellule satelliti, mioblasti quiescenti in

grado di conferire al tessuto le capacità rigenerative.

E’ interessante notare che dal lato citoplasmatico del sarcolemma il

citoscheletro è molto sviluppato ed ha un ruolo fondamentale nel mantenerne

l’integrità della miofibra durante gli stress meccanici della contrazione. In

particolare è presente una proteina citoscheletrica, la distrofina che è il

componente principale di un complesso proteico multimerico chiamato

“dystrophin glicoprotein complex” (DGC); l’alterazione o l’assenza di

distrofina o di uno dei componenti del complesso DGC comporta

l’insorgenza di diverse forme di distrofia muscolare (Blake et al., 2002).

Immediatamente sotto la membrana plasmatica sono presenti numerosi

nuclei e all’interno del sarcoplasma troviamo gruppi di mitocondri, numerosi

INTRODUZIONE

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6

piccoli apparati di Golgi, gocce lipidiche e granuli di glicogeno per il

fabbisogno energetico della miofibra, e la mioglobina, che rappresenta

un’importante riserva d’ossigeno. E’ inoltre presente un esteso reticolo

endoplasmatico specializzato detto reticolo sarcoplasmatico, che sarà trattato in

dettaglio nel paragrafo successivo.

La maggior parte del citoplasma della miofibra è occupata dalle miofibrille,

lunghe strutture cilindriche con un diametro compreso tra 1 e 3 m, disposte

lungo l’asse maggiore della fibra, responsabili del fenomeno contrattile.

Ciascuna miofibrilla presenta ad un esame al microscopio a luce polarizzata

una striatura trasversale dovuta all’alternanza di bande chiare e scure. Le

bande scure sono birifrangenti o anisotrope, da qui il nome di bande A,

mentre le bande chiare che appaiono isotrope sono dette bande I. Ciascuna

banda I è divisa in due parti uguali da una linea più scura trasversale detta disco

Z. Al centro della banda A è presente una zona più chiara detta banda H

attraversata centralmente da una linea trasversale, la linea M. Il tratto

compreso tra due dischi Z prende il nome di sarcomero e rappresenta l’unità

strutturale e funzionale del tessuto muscolare scheletrico (fig. 1.3).

Le miofibrille sono costituite a loro volta da miofilamenti disposti

longitudinalmente e compenetranti tra loro: i miofilamenti spessi di miosina e i

miofilamenti sottili costituiti principalmente da actina.

I miofilamenti spessi occupano l’intera banda A e sono caratterizzati da

due fasci di molecole di miosina disposti in modo opposto e uniti al centro

del filamento; questa porzione in cui i filamenti hanno un diametro maggiore

costituisce la banda H. La miosina ha una struttura esamerica formata da 2

catene pesanti e da 2 coppie di catene leggere. Le catene pesanti si avvolgono

tra loro a formare la coda della molecola C-terminale mentre le porzioni N-

terminali si avvolgono separatamente e si associano con le catene leggere a

formare le teste della miosina, in cui si concentra l’attività ATPasica

responsabile della contrazione muscolare.

INTRODUZIONE

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Fig. 1.3 Rappresentazione schematica dell’organizzazione delle miofibrille in una fibra muscolare scheletrica (Adattata da http://faculty.etsu.edu/forsman/Hystologyofmuscleforweb.htm)

I miofilamenti sottili si dispongono in numero di 6 intorno a ciascun

filamento spesso e occupano l’intera banda I, parte della banda A, arrivando

fino ai limiti della banda H, e si ancorano a livello del disco Z. Sono formati

da monomeri di G-actina che polimerizza a formare una doppia elica di F-

actina, a sua volta circondata dalla doppia elica di tropomiosina, a cui sono

legate a intervalli regolari le 3 sub-unità della troponina.

Tropomiosina e troponina cooperano tra loro, in un meccanismo Ca2+

dipendente, per regolare l’associazione e lo scivolamento reciproco dei

filamenti spessi e sottili, che è alla base del meccanismo della contrazione

muscolare. Durante la contrazione, infatti, i filamenti sottili di actina scorrono

su quelli spessi di miosina con una conseguente riduzione della lunghezza

delle bande I e della banda H (Rosati et al., 2007).

INTRODUZIONE

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8

Esistono diversi tipi di fibre muscolari scheletriche che sono

principalmente distinte in base alle isoforme delle catene pesanti della

miosina: I, IIA, IIB, IIX. In linea più generale le fibre sono distinte in base

alla velocità di contrazione: si può affermare che le fibre a contrazione lenta

contengono miosina di tipo I, le fibre a contrazione veloce contengono

miosina di tipo IIB e IIX, le fibre intermedie contengono miosina di tipo IIA

(Schiaffino e Reggiani, 1996). E’ infine da tenere presente che fibre muscolari

con diversa velocità di contrazione, possiedono anche differenze nel tipo di

metabolismo, resistenza alla fatica ed altre proprietà.

1.3 Reticolo sarcoplasmatico, tubuli T e triade

Il reticolo sarcoplasmatico (RS) rappresenta una forma specializzata di

reticolo endoplasmatico e nella fibra muscolare occupa circa il 10% del

volume cellulare. La sua funzione principale è quella di regolare la

concentrazione del Ca2+ intracellulare durante la contrazione muscolare. Il

reticolo sarcoplasmatico è un complesso sistema di endomembrane che

circonda ciascuna miofibrilla e che instaura con le sue diverse zone dei precisi

rapporti spazio-funzionali. E’ costituito da 2 domini morfologicamente e

funzionalmente distinti: il reticolo sarcoplasmatico longitudinale, specializzato

nel recupero del calcio, e il reticolo sarcoplasmatico giunzionale, che ha la

funzione di rilascio del calcio (fig 1.4). Il RS longitudinale è formato da una

rete di tubuli disposti in modo longitudinale rispetto all’asse maggiore della

fibra localizzati, nei mammiferi, a livello della banda A e della parte centrale

della banda I. Questa porzione di reticolo è specializzata nel recupero di ioni

calcio dal sarcoplasma grazie alla presenza di proteine integrali di membrana

che fungono da pompe ioniche: le Ca2+ ATPasi SERCA. I tubuli del RS

longitudinale confluiscono in porzioni dilatate di reticolo, dette cisterne terminali

localizzate in corrispondenza della giunzione tra la banda A e la banda I, a

costituire il RS giunzionale (Franzini-Armstrong, 2004).

INTRODUZIONE

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Fig.1.4 Localizzazione del reticolo sarcoplasmatico in relazione alle diverse zone della miofibrilla (Adattata da http://faculty.etsu.edu/forsman/Hystologyofmuscleforweb.htm)

Nel lume del RS giunzionale è presente la calsequestrina, una proteina che

lega ioni calcio con elevata capacità ma con moderata affinità, che ha quindi la

funzione di aumentare la capacità d’immagazzinamento del calcio nel RS per

poi renderlo disponibile per la contrazione muscolare (Beard et al., 2004).

Tra due cisterne terminali adiacenti è presente un’invaginazione della

membrana plasmatica, denominata tubulo traverso o tubulo T, che porta alla

formazione di una struttura specializzata detta triade, costituita da due cisterne

terminali che fiancheggiano un tubulo T. Questa struttura rende possibile un

accoppiamento tra il segnale nervoso che arriva alla membrana plasmatica (e

quindi ai tubuli T) e il rilascio del calcio dal RS (ed in particolare dalle cisterne

terminali), fenomeno che è chiamato accoppiamento eccitazione-contrazione

(EC coupling). Nei tubuli T sono presenti infatti i recettori della diidropiridina

(DHPR), dei canali del calcio voltaggio-dipendenti che si trovano a diretto

contatto con i recettori della rianodina (RyR1 la principale isoforma presente

INTRODUZIONE

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nel muscolo scheletrico), un canale di rilascio del Ca2+ localizzato nelle

cisterne terminali del reticolo sarcoplasmatico. Queste due molecole formano

le unità di rilascio del calcio (fig. 1.5) e rappresentano i siti in cui avviene l’EC

coupling (Flucher and Franzini-Armstrong, 1996).

Fig.1.5 Struttura di un’unità di rilascio del calcio nelle fibre di muscolo scheletrico adulto (Adattata da Protasi F., 2002).

Durante l’EC coupling si ha la depolarizzazione della membrana

plasmatica dovuta all’impulso nervoso, che viene trasmessa fino ai tubuli T.

Qui le molecole di DHPR funzionano da sensori di voltaggio e stimolano in

modo calcio-indipendente l’apertura dei canali del calcio RyR1 permettendo la

fuoriuscita del calcio immagazzinato nel reticolo sarcoplasmatico. Il calcio

liberato è quindi in grado di legarsi alle proteine contrattili ed attivare la

INTRODUZIONE

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11

contrazione muscolare (Dulhunty, 2006). Dopo l’eccitazione, il rilassamento

del muscolo avviene grazie al trasporto ATP-dipendente del Ca2+ dal citosol

al lume del reticolo sarcoplasmatico, trasporto effettuato dalle Ca2+ ATPasi

SERCA presenti nel reticolo longitudinale (MacLennan, 1990).

Oltre a DHPRs e RYRs, altre proteine sono presenti a livello della triade e

partecipano al meccanismo dell’EC coupling. Tra queste troviamo la

calsequestrina, che, come detto in precedenza, è localizza a livello delle

cisterne terminali. La calsequestrina va incontro a modificazioni strutturali

dipendenti dalle variazioni della concentrazione di calcio. Un aumento della

concentrazione di calcio comporta infatti la sua polimerizzazione ed il suo

ancoraggio alla membrana del RS (fig. 1.6); inoltre cambia la sua

conformazione anche durante l’EC coupling, cambiamento che permette il

rilascio del calcio. L’ancoraggio alla membrana del RS avviene probabilmente

indirettamente, ossia mediante due altre proteine presenti a livello del reticolo

giunzionale: la triadina e la giuntina (fig. 1.6). Si tratta di due proteine

transmembrana contenenti siti di legame sia per la calsequestrina che per RyR

la cui funzione specifica non è stata ancora completamente chiarita (Beard et

al., 2004).

Un’altra proteina di ancoraggio presente a livello della triade è la

giuntofilina una proteina transmembrana fondamentale per la stabilizzazione

del complesso giunzionale che fa da ponte molecolare tra i tubuli T e il

reticolo sarcoplasmatico (Takeshima et al., 2000).

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Fig. 1.6 Modello dei cambiamenti strutturali che avvengono nella calsequestrina in funzione della concentrazione di calcio (da Beard N.A. et al., 2004)

1.4 Organizzazione del reticolo sarcoplasmatico durante lo

sviluppo

Il muscolo scheletrico origina dai somiti, delle masse di mesoderma

disposte ai lati della corda dorsale, costituiti da una parte miogenica posta

nella regione dorso-mediale del somite: il miotomo. Le cellule del miotomo si

differenziano in mioblasti che fondendosi e allungandosi formano i miotubi,

dei sincizi cellulari multinucleati dai quali si formeranno le fibre muscolari

adulte. Subito dopo la fusione dei mioblasti ha inizio la sintesi delle proteine

contrattili e il loro assemblaggio in miofibrille, che evolvono in un modello di

differenziamento a tre stadi: inizialmente si formano le “premiofibrille”

caratterizzate dalla presenza di Z-bodies, piccoli aggregati di alfa-actinina a cui

sono attaccati i filamenti di actina e di miosina, quest’ultima ancora di tipo

non muscolare; successivamente si formano le “miofibrille nascenti” nelle

INTRODUZIONE

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13

quali compaiono anche filamenti di miosina di tipo muscolare. Nell’ultimo

stadio di “miofibrilla matura” scompare la miosina non muscolare, gli Z-

bodies si fondono formando la linea Z e i filamenti di miosina muscolare si

dispongono a formare la banda A (Sanger et al., 2002). Durante la formazione

delle miofibrille avviene anche la maturazione del reticolo sarcoplamatico.

Il reticolo sarcoplasmatico subisce una serie di modificazioni graduali che

iniziano nella vita embrionale e continuano fino alle prime settimane di vita

post-natale. Nella vita embrionale le proteine tipiche del reticolo

sarcoplasmatico adulto sono distribuite in “clusters” posizionati in modo

casuale lungo la fibra in via di sviluppo. Ogni “cluster” è costituito da tutte le

componenti della triade, come RyR e triadina, e le proteine del tubulo T come

il DHPR, suggerendo quindi che i meccanismi responsabili della formazione e

del mantenimento di questa struttura sono presenti sin dai primi stadi dello

sviluppo (Takekura, 2001). E’ possibile quindi ipotizzare che tali meccanismi

includano eventi multipli quali l’instaurarsi di contatti diretti tra le proteine del

citoscheletro e della membrana plasmatica e la segregazione di diverse

proteine in domini distinti del RS (Rossi et al., 2008).

Il DHPR, ad esempio, al 14° e 15° giorno di vita embrionale (E14-E15)

nel ratto, si presenta sotto forma di piccoli “clusters” distribuiti all’interno

della fibra ma principalmente concentrati alla periferia della stessa; al giorno

E16 i “clusters” risultano longitudinalmente allineati e una frazione più

piccola comincia ad allinearsi anche in direzione trasversale. Al 17° giorno di

sviluppo embrionale cominciano a formare delle bande trasversali a livello

della giunzione tra la banda A ed I e dall’E18 queste doppie bande diventano

ben allineate, come nella fase adulta. Anche le pompe del calcio SERCA

fanno la loro comparsa allo stadio E14 sotto forma di “clusters” distribuiti in

modo casuale nell’intera fibra e a E16 cominciano ad allinearsi a livello del

disco Z. Questa distribuzione viene mantenuta fino allo stadio adulto ma

intorno al 5° giorno di vita postatale (D5) si aggiunge un bandeggio meno

marcato a livello della banda M (Giacomello e Sorrentino, 2009).

INTRODUZIONE

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I meccanismi coinvolti nell’organizzazione del reticolo sarcoplasmatico

rispetto alle diverse zone del sarcomero durante lo sviluppo non è però

ancora ben chiara. Ad esempio la comparsa delle prime strutture triadiche

avviene prima della comparsa e dell’allineamento delle miofibrille (Flucher et

al., 1994), ma per il mantenimento dei rapporti tra le diverse regioni del

reticolo sarcoplasmatico sembra invece sia molto importante l’associazione

con l’apparato miofibrillare. E’ stato infatti proposto il coinvolgimento di due

proteine, l’ankirina 1.5 e l’oscurina, nell’assemblaggio del RS intorno al

sarcomero. Essendo l’oscurina associata alle miofibrille ed in grado di

interagire con l’ankirina 1.5 localizzata nel reticolo sarcoplasmatico, è stato

ipotizzato un loro possibile ruolo nel mantenimento di connessioni stabili tra

il RS e le miofibrille (Bagnato et al., 2003). Inoltre l’ankirina 1.5 è una delle

prime proteine del RS a concentrarsi in particolari zone del reticolo poste

intorno alle miofibrille durante lo sviluppo e questo sembra suggerire un suo

ruolo nelle successive fasi dell’assemblaggio del reticolo sarcoplasmatico

(Giacomello and Sorrentino 2009).

1.5 Rapporti tra reticolo endoplasmatico e reticolo

sarcoplasmatico

Nelle cellule eucariotiche il reticolo endoplasmatico (ER) rappresenta un

sistema di membrane di forma tubulare e di cisterne appiattite suddiviso in

due sub-compartimenti: il reticolo endoplasmatico ruvido, così chiamato per la

presenza sulla sua membrana di numerosi ribosomi, dove avviene la sintesi

proteica, e il reticolo endoplasmatico liscio, privo di ribosomi, in cui

avvengono diversi processi metabolici come la sintesi di lipidi e che svolge la

funzione di deposito di calcio. Nel reticolo endoplasmatico liscio sono

presenti anche zone specializzate che costituiscono il reticolo endoplasmatico

di transizione, così chiamato in quanto contiene i “siti di uscita dall’ER” (ER

exit sites o ERES) da cui gemmano le vescicole di trasporto contenenti

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proteine e lipidi di nuova sintesi destinati all’apparato di Golgi (Alberts et al.,

2004).

Nel muscolo scheletrico la distribuzione di questi compartimenti del

reticolo endoplasmatico all’interno del reticolo sarcoplasmatico non è ancora

ben nota.

Alcuni lavori di Metsikkö e colleghi hanno cercato di chiarire la

distribuzione di marcatori tipici del reticolo endoplasmatico all’interno del RS

delle fibre muscolari scheletriche. Esperimenti di immunofluoerescenza con

l’uso di anticorpi diretti contro diverse proteine tipiche del reticolo

endoplasmatico ruvido hanno evidenziato una distribuzione perinucleare e un

evidente bandeggio. In particolare, due proteine luminali dell’ER, la disulfide

isomerasi (PDI) e BIP, che svolgono la funzione di chaperon molecolari, e la

riboforina II (RibII, una proteina di membrana associata al macchinario della

glicosilazione) mostrano una distribuzione perinucleare e un bandeggio che

occupa l’intera banda I e la giunzione di questa con la banda A (Rahkila et al.,

1997). La stessa distribuzione si riscontra anche per la proteina associata al

complesso del traslocone, la proteina di membrana TRAP. Comparando

questa distribuzione a quella della proteina SERCA residente all’interno del

reticolo sarcoplasmatico longitudinale e alla calsequestrina presente a livello

delle cisterne terminali, si nota una sovrapposizione dei differenti segnali che

non risulta però completa (fig. 1.7). Sembra quindi che la localizzazione delle

proteine dell’ER sia differente da quella delle proteine del RS, ma che tali

proteine risiedano comunque all’interno del sistema di membrane del reticolo

sarcoplasmatico (Kaisto and Metsikkö, 2003).

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Fig. 1.7 Distribuzione dei marcatori del reticolo endoplasmatico e del reticolo sarcoplasmatico di una fibra di ratto. (da Kaisto T. and Metsikkö K., 2003).

Nello stesso lavoro è stata individuata anche la posizione occupata dalle

vescicole di trasporto rivestite dal complesso molecolare COPII, mediante

l’uso di un anticorpo diretto contro la sub-unità Sec23. Tale marcatore si

localizza a livello della regione perinucleare, in strutture puntiformi lungo la

miofibra ma principalmente presenta un bandeggio a livello della linea Z;

inoltre, come emerge dalla doppia colorazione con anticorpi contro

calsequestrina, non mostra nessuna colocalizzazione con quest’ultima che

rappresenta un marcatore delle cisterne terminali (fig. 1.8).

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Fig 1.8 Distribuzione del marcatore degli ER exit sites (sec23) e delle cisterne terminali (CSQ) in una fibra di ratto. (da Kaisto T. and Metsikkö K., 2003).

Gli autori hanno quindi proposto un modello di localizzazione del reticolo

endoplasmatico ruvido all’interno del reticolo sarcoplasmatico: la porzione di

ER ruvido in cui avvengono i processi di traslocazione, glicosilazione e

folding sarebbe localizzato a livello delle cisterne terminali, mentre la

porzione di reticolo in cui si ha la formazione delle vescicole di trasporto e

quindi i siti di uscita dall’ER, il cosiddetto reticolo endoplasmatico di

transizione, si troverebbe a livello della linea Z (fig.1.9). In un lavoro più

recente dello stesso gruppo è stata inoltre proposta l’esistenza di microdomini

lipidici contenti proteine residenti nell’ER all’interno del reticolo

sarcoplasmatico, indicando che probabilmente si tratta di un sistema di

membrane continuo (Kaakinen et al., 2008).

Tuttavia l’organizzazione e i rapporti tra questi due compartimenti non

sono ancora chiari; in particolare non è noto come le proteine del RS una

volta prodotte nell’ER raggiungano la loro localizzazione definitiva nelle

regioni specializzate dell’SR, e più in generale come sia organizzato il

trasporto di membrana tra il reticolo endoplasmatico e l’apparato di Golgi

nelle fibre muscolari scheletriche. Questo argomento sarà ripreso in uno dei

paragrafi successivi.

Fig. 1.9 Rappresentazione schematica della distribuzione delle proteine tipiche del reticolo endoplasmatico all’interno del reticolo sarcoplasmatico. (adattata da Kaisto e Metsikkö, 2003).

1.6 Localizzazione dell’apparato di Golgi nella fibra muscolare

L’apparato di Golgi nelle cellule eucariotiche è composto da membrane

che formano una serie di cisterne appiattite impilate l’una sull’altra in una

struttura relativamente compatta che svolge un ruolo centrale nel traffico

cellulare. Il Golgi viene suddiviso in 3 regioni: il cis-Golgi più vicino al reticolo

endoplasmatico, il medial-Golgi centrale e il trans-Golgi posto dal lato della

membrana plasmatica. Nelle cellule muscolari indifferenziate, i mioblasti, il

Golgi presenta ancora questa forma compatta, ma con il procedere del

differenziamento, e quindi con la fusione dei diversi mioblasti, assume una

conformazione peculiare delle cellule muscolari. Infatti il Golgi da compatto

assume l’aspetto di una struttura frammentata che si dispone intorno al

Proteine tipiche del reticolo endoplasmatico ruvido Proteine tipiche del reticolo endoplasmatico

di transizione

INTRODUZIONE

___________________________

19

nucleo e che con il progredire del differenziamento comincia a disporsi anche

lungo i miotubi (Lu et al., 2001).

In una fibra muscolare adulta queste strutture frammentate si riducono di

dimensioni andando a costituire delle strutture puntiformi che si

distribuiscono in modo differente nella fibra di tipo veloce e in quella di tipo

lento. Nelle fibre a composizione lenta, come il soleo, l’apparato di Golgi si

dispone in strutture puntiformi lungo il perimetro dei nuclei e in file

distribuite lungo l’intera fibra; nelle fibre veloci occupa invece i poli del

nucleo e si distribuisce in modo più casuale lungo la fibra formando delle file

più corte contenenti da 1 a 3 strutture puntiformi (fig. 1.10); le fibre a

composizione intermedia mostrano una distribuzione del Golgi che presenta

entrambe le disposizioni (Ralston et al., 1999).

Fig 1.10 Apparato di Golgi in una fibra di tipo lento (riquadri a sinistra) e in una ti tipo veloce (riquadri a destra). I due riquadri superiori rappresentano la superficie della fibra. La scala colorata nei due riquadri inferiori indica i diversi piani a cui sono state acquisite le immagini: il rosso indica la superficie, il blu la sezione più interna della fibra. (da Ralston E. et al., 1999).

L’uso della microscopia elettronica ha evidenziato la presenza di piccoli

apparati del Golgi composti da tre o quattro cisterne impilate distribuiti lungo

l’intera fibra, corrispondenti alle strutture puntiformi osservate con

immunofluorescenza.

INTRODUZIONE

___________________________

20

La diversa distribuzione dell’apparato di Golgi nei diversi tipi di fibre

sembra dovuta alla diversa attività neurale imposta dal motoneurone. Le

proprietà delle fibre lente e veloci sono infatti in parte il risultato

dell’innervazione: l’innervazione di una fibra lenta con un impulso tipico di un

motoneurone veloce comporta la trasformazione della fibra da lenta a veloce

e viceversa (Pette, 2001). L’applicazione di uno stimolo opposto a quello

proprio della fibra comporta anche una riorganizzazione della distribuzione

del Golgi: ad esempio una fibra veloce denervata e stimolata con un impulso

lento assumerà una distribuzione del Golgi tipico di una fibra lenta (Ralston et

al., 2001).

1.7 Il traffico vescicolare nelle cellule mononucleate

I processi di secrezione e di endocitosi sono meccanismi complessi che

procedono attraverso diversi stadi quali la formazione di vescicole di

trasporto contenenti molecole cargo specifiche, il loro trasporto e la loro

fusione ad una membrana bersaglio specifica.

Il processo endocitotico permette l’ingresso di macromolecole dall’esterno

della cellula attraverso la membrana plasmatica mediante la formazione di

vescicole spesso rivestite di clatrina contenenti recettori specifici per le

macromolecole che devono essere inglobate nella cellula; in questo modo si

viene a creare un sistema molto selettivo di internalizzazione cellulare. Una

parte di queste macromolecole viene degradata nei lisosomi passando prima

per gli endosomi precoci e poi tardivi, due compartimenti di membrana che

fungono da sedi di smistamento. Negli endosomi precoci avviene anche il

riciclaggio dei recettori della membrana plasmatica mediante un trasporto

vescicolare.

Nella via biosintetica-secretoria le proteine sono smistate nella cellula e

secrete attraverso il passaggio dall’ER all’apparato di Golgi fino alla

membrana plasmatica mediante vescicole di trasporto che continuamente

INTRODUZIONE

___________________________

21

gemmano e si fondono con le diverse membrane interessate (fig. 1.11). Il

flusso di membrana tra i diversi compartimenti è costantemente bilanciato

con vie di recupero nella direzione opposta, portando membrane e proteine

specifiche al compartimento d’origine (Alberts et al., 2004).

Le proteine neo-sintetizzate, solubili e di membrana, entrano in questa via

passando dal reticolo endoplasmatico ruvido che rappresenta il primo

compartimento ad essere coinvolto nella via biosintetica-secretoria. Le

proteine destinate ad altre sedi della cellula passano poi nel reticolo

endoplasmatico liscio, così chiamato perché privo di ribosomi, dove avviene

l’esportazione verso l’apparato di Golgi. La fuoriuscita delle proteine avviene

in zone specializzate del reticolo liscio dette siti d’uscita dall’ER (ER Exit

Sites o ERES) o reticolo endoplasmatico di transizione. Qui le proteine

vengono selettivamente immagazzinate in vescicole di trasporto rivestite dal

complesso molecolare COPII in modo diretto (per quanto riguarda le

proteine di membrana) o indirettamente (come nel caso di proteine solubili)

mediante l’interazione con specifici recettori transmembrana come ad

esempio la proteina ERGIC53 (Derby and Gleeson, 2007).

Fig 1.11 Schematizzazione del pathway biosintetico-secretorio ed endocitotico che avviene tra il reticolo endoplasmatico e la membrana plasmatica. (da http:// 219.221.20061/ywwy/zbsw(E)/edetail7.htm)

INTRODUZIONE

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22

Questo rappresenta il modello classico di formazione e trasporto delle

vescicole secretorie. Inoltre è stato visto che le molecole di grandi dimensioni,

come ad esempio il procollagene, gemmano dall’ER mediante la formazione

di strutture tubulari e non di vescicole (Mironov et al., 2003), in modo

indipendente dal rivestimento COPII.

Il traffico vescicolare tra il reticolo endoplasmatico e l’apparato di Golgi

(early secretory pathway) ha inizio quindi con la formazione delle vescicole di

trasporto rivestite da COPII, complesso che oltre a selezionare le proteine

che devono essere trasportate fuori dall’ER, contribuisce alla deformazione

della membrana indispensabile per la formazione delle vescicole stesse.

COPII rappresenta un complesso molecolare costituito da 5 sub-unità

proteiche: Sar1, Sec23, Sec24, Sec13 e Sec31. L’assemblaggio di COPII ha

inizio quando Sec12, una proteina che svolge la funzione di fattore di scambio

del nucleotide guanilico (GEF), converte Sar1 (una proteina G facente parte

della famiglia delle proteine ARF) dalla forma legata a GDP a quella legata a

GTP; questa reazione permette il legame di Sar1-GTP alla membrana dell’ER

(Barlowe et al., 1994). A questo punto Sar1 permette il reclutamento di altre

due proteine del complesso: l’eterodimero Sec23/Sec24 portando alla

formazione del complesso di “pre-budding”. Tale complesso è già in grado di

reclutare le proteine cargo nella zona di formazione delle vescicole (Kuehn et

al., 1998). Successivamente si ha il reclutamento di un altro eterodimero

formato dalle proteine Sec13/Sec31 che comporta la polimerizzazione del

rivestimento e la deformazione della membrana (Matsuoka et al., 1998),

(fig.1.12).

Per quanto riguarda il reclutamento delle proteine cargo, sembra che tale

processo sia dovuto principalmente alla sub-unità Sec24. Questa sembra

essere presente come isoforme multiple (tre in lievito e quattro negli eucarioti

superiori) e questo probabilmente aumenta la varietà di cargo che possono

essere esportati dall’ER. Quello che si è visto è che Sec24 è in grado di

riconoscere domini di sequenza specifici presenti all’estremità C-terminale

delle proteine transmembrana che devono uscire dall’ER. Sono state

INTRODUZIONE

___________________________

23

identificate tre tipologie di domini: uno è il motivo di-acidico Asp-X-Glu,

l’altro è formato da due ingombranti residui idrofobici ed è per questo

identificato come motivo di-idrofobico (Barlowe, 2003). La terza classe invece

è rappresentata dai domini di-basici che sono localizzati in prossimità del

dominio transmembrana e che sembrano interagire direttamente con la sub-

unità Sar1 invece che con Sec24 (Giraudo and Maccioni, 2003).

Fig 1.12 Schematizzione della formazione delle vescicole rivestite dal complesso molecolare COPII a livello dei siti di uscita dall’ER. (da Mancias J.D. and Goldberg J., 2005)

Esistono anche numerose proteine solubili che sono efficientemente

esportate fuori dall’ER ma che non prendono contatto diretto con le proteine

di COPII. Sono stati elaborati due modelli, che non si escludono l’un l’altro,

per spiegare il reclutamento di tali proteine: uno di questi è il modello di

esportazione mediato da recettori in cui diverse proteine transmembrana,

presenti nella membrana della vescicola ricoperta da COPII in formazione,

riconoscono e quindi concentrano le proteine solubili a livello di questi siti di

esportazione. Tali proteine recettrici sono state identificate in ERGIC53, p24

o Erv29p in lievito (Tang et al., 2005). Il secondo modello, detto ”bulk flow”,

INTRODUZIONE

___________________________

24

rappresenta invece un processo passivo cioè un trasporto continuo in cui le

proteine non hanno bisogno di un segnale di riconoscimento per i recettori

per essere inglobate nella vescicola. Questo rappresenta un trasporto “per

default” e presuppone che la concentrazione di queste proteine sia simile tra i

siti di uscita dall’ER e il resto del lume endoplasmatico (Barlowe, 2003).

Una volta gemmate dall’ER, le vescicole di trasporto si fondono prima di

raggiungere l’apparato di Golgi formando delle strutture tubulari (“vesicular

tubular cluster” o VTC) che formano il compartimento intermedio (ERGIC),

posto tra gli ERES e il Golgi, che manca negli eucarioti inferiori come i lieviti

(fig. 1.13).

Fig. 1.13 Schematizzazione dell’early secretory pathway che avviene tra l’ER, l’ERGIC e l’apparato di Golgi. (da http://mcb.berkeley.edu/labs/schekman)

Il compartimento intermedio rappresenta una stazione di smistamento per

le proteine derivanti dall’ER che da qui o vengono trasportate al Golgi

mediante il traffico anterogrado, o vengono riportate indietro mediante il

traffico retrogrado (Appenzeller-Herzog and Hauri, 2006). Il traffico

retrogrado che avviene nell’ERGIC è mediato da vescicole di trasporto

rivestite dal complesso COPI. Tale complesso è formato da 7 sub-unità (α, β,

INTRODUZIONE

___________________________

25

γ, δ, β’, ε, ζ-COP) il cui assemblaggio è controllato da Arf1, una piccola

GTPasi della superfamiglia delle proteine Ras. Quando la sub-unità Sec7 del

fattore di scambio del nucleotide guanilico GBF1 catalizza lo scambio del

GDP con il GTP, Arf1-GTP subisce un cambiamento conformazionale che

lo lega in modo più saldo alla membrana e recluta le diverse sub-unità di

COPI. Arf1 legato al GDP si trova infatti già ancorato alla membrana

mediante il dimero p23/p24 e p24 svolge anche la funzione di aiutare la

polimerizzazione del rivestimento e la successiva deformazione della

membrana (fig 1.14).

Fig 1.14 Schematizzione della formazione delle vescicole rivestite dal complesso molecolare COPI nel traffico retrogrado (da Beck R. et al., 2009).

Per quanto riguarda il trasporto anterogrado, il ruolo di COPI non è stato

ancora completamente chiarito. COPI ha sicuramente un ruolo importante

nel traffico retrogrado sia dall’ERGIC e dal Golgi all’ER sia tra le diverse

cisterne del Golgi.

Il traffico retrogrado rappresenta una via di recupero per le proteine

residenti nell’ER, ma anche per tutte quelle proteine importanti per la

gemmazione delle vescicole che devono essere necessariamente restituite al

INTRODUZIONE

___________________________

26

reticolo endoplasmatico. Generalmente queste proteine contengono delle

sequenze di riconoscimento indispensabili per il loro impacchettamento nelle

vescicole COPI e quindi per il loro ritorno nell’ER. Per esempio, per quanto

riguarda le proteine solubili coinvolte nel folding o nell’assemblaggio proteico,

è stato visto che molte sono caratterizzate dalla presenza di una sequenza di

ritenzione all’estremità C-terminale, KDEL, responsabile del recupero delle

proteine che devono tornare all’ER. Grazie a questa sequenza le proteine si

legano a recettori specifici posti sia a livello dell’ERGIC che dell’apparato di

Golgi, che interagendo con COPI permettono la loro cattura e il loro ritorno

al reticolo endoplasmatico. Molte proteine di membrana residenti nell’ER

contengono invece la sequenza KKXX all’estremità C-terminale che le lega

direttamente al complesso COPI e vengono quindi prontamente

impacchettate all’interno delle vescicole (Beck et al., 2009).

Alcune proteine che sono prive di tali motivi (come la Shiga toxin)

vengono trasportate mediante il traffico retrogrado COPI-indipendente. Le

informazioni riguardo alla macchina molecolare che opera in questo traffico

sono molto poche, quello che è noto è che sembra essere coinvolta la Rab6

(White, 1999).

Oltre che una stazione di smistamento, il compartimento dell’ERGIC

sembra importante anche nel controllare la qualità delle proteine secretorie,

essendo caratterizzato dalla presenza di diverse proteine chaperon (Breuza et

al., 2004): quindi probabilmente le proteine con conformazione errata

potranno essere ri-inviate all’ER mediante il traffico retrogrado, per poi essere

degradate dal sistema di degradazione associato all’ER (Appenzeller-Herzog

and Hauri, 2006).

Il traffico vescicolare sia retrogrado che anterogrado tra il reticolo

endoplasmatico e l’apparato di Golgi avviene lungo i microtubuli del

citoscheletro e con un meccanismo dipendente dall’interazione tra due

proteine motrici: la dineina e la dinactina. La dineina lega i microtubuli,

mentre è stato visto che la dinactina è in grado di legarsi al rivestimento

INTRODUZIONE

___________________________

27

vescicolare COPII (Watson et al., 2005), COPI (Chen et al., 2005) e al

compartimento intermedio (Roghi and Allan, 1999).

Altro aspetto importante del traffico vescicolare è rappresentato

dall’abilità delle vescicole di trasporto di legarsi e poi fondersi con il

compartimento cellulare di destinazione. Il riconoscimento e quindi il legame

tra le diverse membrane interessate avviene grazie a tre classi proteiche: le

proteine di “tethering”, le proteine SNARE e le Rab GTPasi.

Le prime sono proteine che formano ponti tra una determinata vescicola e

la sua specifica membrana target prima della fusione, permettendo quindi il

riconoscimento. Sembra tuttavia che svolgano anche altre funzioni come

l’assemblaggio del complesso SNARE, la selezione del cargo, l’attacco al

citoscheletro e l’assemblaggio dei complessi di rivestimento vescicolare

(Lupashin and Sztul, 2005,) come per il fattore di tethering p115 che controlla

il traffico tra ER e Golgi a livello di diversi siti: durante la formazione delle

vescicole COPII, a livello dell’ERGIC e del Golgi (Appenzeller-Herzog and

Hauri, 2006).

Le proteine SNARE, oltre a fornire una specificità di legame, permettono

il contatto fisico tra le due membrane che devono fondersi. Queste proteine si

suddividono in v-SNARE poste sulla membrana della vescicola e in t-SNARE

presenti invece sulla membrana bersaglio. Il loro legame specifico porta alla

formazione di complessi stabili che bloccano insieme le due membrane e ne

permettono la successiva fusione (Hong, 2005), (fig. 1.15).

Le Rab GTPasi fanno parte della superfamiglia delle proteine RAS e

hanno la funzione di reclutare sulle membrane numerose proteine effettrici

coinvolte in diverse funzioni del traffico vescicolare come la gemmazione

delle vescicole, il loro trasporto, il riconoscimento e la fusione con le

membrane accettrici. Si tratta di proteine che nello stato legante il GDP sono

libere nel citosol e inattive grazie al legame con le proteine GDI (GDP-

dissociation inhibitor) che inibisce la dissociazione del GDP. La dissociazione

del GDI dalla proteina Rab è catalizzata dal GDI-displacement factor (GDF)

che permette il legame della Rab alla membrana.Una volta legata, la Rab passa

INTRODUZIONE

___________________________

28

nella sua forma attiva legante il GTP grazie ad un fattore di scambio del

nucleotide guanilico (GEF) ed è ora in grado di legare la specifica proteina

effettrice (fig. 1.15). La Rab torna nel suo stato inattivo legante il GDP grazie

all’azione di una proteina GAP che catalizza l’idrolisi del GTP (Grosshans et

al., 2006).

Fig. 1.15 Rappresentazione schematica del ciclo delle proteine SNARE e delle Rab GTPasi. (da Alberts B. et al., 2004).

1.8 Il traffico vescicolare nel muscolo scheletrico

Il differenziamento miogenico dei mioblasti in fibre muscolari adulte

comporta una massiccia riorganizzazione nella distribuzione degli organelli

cellulari e la comparsa di nuove strutture cellulari, come il reticolo

sarcoplasmatico. In questa profonda riorganizzazione anche il traffico

vescicolare subisce delle modificazioni nel muscolo, rispetto alle cellule

mononucleate. Ad oggi non è ancora completamente chiarito come le

proteine tipiche del reticolo sarcoplasmatico raggiungano la loro sede

INTRODUZIONE

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29

definitiva dopo esser state prodotte all’interno del reticolo endoplasmatico, e

come sia localizzato il reticolo endoplasmico “canonico” all’interno del RS.

Questo aspetto è stato in parte analizzato in un lavoro di Rahkila e colleghi

(1997) nel quale è stata studiata la localizzazione di diverse proteine coinvolte

nel traffico vescicolare tra ER e Golgi nelle fibre muscolari scheletriche di

ratto. Esperimenti di immunofluorescenza con anticorpi diretti contro la

proteina p58 (omologa alla proteina ERGIC53 umana), un marcatore del

compartimento intermedio, hanno evidenziato una distribuzione perinucleare,

un’evidente striatura longitudinale e un bandeggio trasversale che occupa

l’intera banda I. L’uso di anticorpi diretti contro la Rab1, coinvolta nel traffico

tra l’ER e l’apparato di Golgi, ha evidenziato una distribuzione simile a quella

di p58. In un lavoro precedente dello stesso gruppo è stato visto che anche β-

COP, una delle sub-unità di COPI, che è localizzata nell’apparato di Golgi e

che partecipa al traffico retrogrado tra quest’ultimo e l’ER, nel muscolo è

presente nella regione perinucleare, bandeggia a livello della banda I ed ha una

striatura longitudinale spesso caratterizzata da strutture puntiformi più intense

presumibilmente riconducibili ai gruppi di cisterne del Golgi. La distribuzione

dei diversi compartimenti coinvolti nel traffico vescicolare tra ER e Golgi è

stata verificata anche grazie all’analisi del traffico della proteina G, prodotta

dal virus della stomatite vescicolare (VSV), nella sua forma mutata

temperatura-sensibile tsO45, il cui traffico tra i vari compartmenti può essere

seguito modulando la temperatura. Alla temperatura di 39°C, che non

permette il folding della proteina G, questa si trova bloccata nell’ER ruvido a

livello della giunzione tra la banda A e la banda I; quando la temperatura

viene abbassata a 32°C, temperatura permissiva per il folding della proteina, e

la gemmazione delle vescicole bloccata con il dinitrofenolo, questa localizza

negli ER exit sites distribuendosi sia a livello della linea Z che nella regione

perinucleare. Se la temperatura viene portata a 20°C la proteina viene

trasportata all’apparato di Golgi andando a localizzarsi nella regione

perinucleare e in strutture puntiformi lungo la fibra (Rahkila et al., 1996). Con

esperimenti di doppia marcatura è emerso che le strutture longitudinali di p58

INTRODUZIONE

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30

e Rab1 seguono il corso dei microtubuli, così come anche il marcatore del cis-

Golgi GM130 evidenzia delle strutture puntiformi che colocalizzano con i

microtubuli longitudinali. Anche il traffico retrogrado sembra sia associato ai

microtubuli in quanto il trattamento con brefeldina A (che comporta la

ridistribuzione delle proteine del Golgi all’ER) delle fibre infettate con il VSV,

comporta il ritorno della proteina G dal Golgi all’ER, con una distribuzione

che segue quella dei microtubuli. Sembra quindi che il traffico vescicolare tra

ER/RS e l’apparato di Golgi avvenga nella fibra muscolare, come nelle cellule

mononucleate, lungo i microtubuli (Rahkila et al., 1997).

In un altro lavoro, effettuato su fibre di muscolo scheletrico e in cellule

mioblastiche, è stato visto che per un corretto targeting della calsequestrina

nelle cisterne terminali del RS c’è bisogno di un’attiva uscita dall’ER,

probabilmente mediata dalla gemmazione di vescicole rivestite di COPII:

sembra quindi ci sia bisogno di un trasporto mediato da vescicole per il

sorting della calsequestrina. Inoltre, poiché la distruzione del Golgi non

comporta un’alterazione della localizzazione di questa proteina nel RS, è stato

ipotizzato che molto probabilmente questo apparato non è coinvolto nel

targeting della calsequestrina (Nori et al, 2004).

Molte proteine sono mantenute all’interno del lume del reticolo

sarco/endoplasmatico mediante la sequenza KDEL, ma molte proteine del

RS, tra le quali la calsequestrina, non contengono questo segnale di ritenzione.

E’ stato ipotizzato che tale proteina sia mantenuta all’interno del reticolo

grazie alla sua capacità di polimerizzazione, che rappresenterebbe quindi un

meccanismo di ritenzione (Gatti et al., 2001; Houle et al., 2006).

Un’altra proteina residente nel reticolo sarcoplasmatico che non presenta

nessuna sequenza caratteristica di ritenzione è la pompa del calcio ATPasica

SERCA. In un lavoro di Newton e colleghi è stata dimostrata la presenza,

all’interno dell’isoforma SERCA1, di due motivi transmembrana (M1 e M2)

all’interno della regione N-terminale che svolgono il ruolo di segnali di

recupero. Infatti la ritenzione della proteina nel reticolo sarcoplasmatico non

è assoluta, in quanto è stato visto che una buona parte della proteina si ritrova

INTRODUZIONE

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31

anche nell’ERGIC, ma non prosegue il suo cammino lungo il pathway di

secrezione, ed infatti non raggiunge il trans-Golgi (Newton et al., 2003).

Sembra quindi che SERCA1 sia mantenuta nel RS tramite un processo di

recupero dall’ERGIC, come ipotizzato anche per altre due proteine di

membrana residenti nel reticolo sarcoplasmatico, il fosfolambano e la

sarcolipina. (Butler et al., 2007).

1.9 La famiglia di proteine Yip in lievito

La famiglia di proteine Yip rappresenta un insieme di piccole proteine di

membrana, capaci di interagire con le proteine Rab e con gli altri membri della

famiglia Yip stessa, che si sono conservate durante l’evoluzione; infatti le

ritroviamo in tutti gli organismi eucarioti, dai lieviti alle piante fino agli animali

più evoluti come i mammiferi. Il primo membro della famiglia ad essere stato

identificato è Yip1p di lievito quale interattore delle Rab GTPasi Ypt1p e

Ypt31p (Yang et al., 1998). Successivamente sono stati individuati altri

membri di questa famiglia: Yip2p o Yop1p (Calero et al., 2001), Yip3p (Calero

and Collins, 2002), Yip4p e Yip5p (Calero et al., 2002) e Yif1p che forma un

complesso con Yip1p (Matern et al., 2000) (fig. 1.16).

Fig. 1.16 Membri della famiglia di proteine YIP in lievito. (Adattata da Pfeffer e Aivazian, 2004).

INTRODUZIONE

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32

Si tratta di proteine caratterizzate da un’estremità N-terminale idrofilica,

probabilmente sufficiente per il legame con le Rab GTPasi, seguita da 4-5

regioni idrofobiche molto conservate, che rappresentano i domini

transmembrana (Shakoori et al., 2003).

Yip1p rappresenta il membro della famiglia fin’ora meglio studiato. Si

localizza a livello dell’apparato di Golgi, e poichè è in grado di legarsi alle Rab

GTPasi coinvolte nel traffico tra l’ER e l’apparato di Golgi, probabilmente è

richiesta per il trasporto vescicolare a livello dell’early secretory pathway.

Infatti in un lavoro di Barrowman e colleghi (2003), è stato visto che anticorpi

diretti contro Yip1p o Yif1p, che formano un complesso, bloccano il

trasporto vescicolare verso l’apparato di Golgi, ma questo effetto non si

presenta se gli anticorpi sono aggiunti dopo la formazione delle vescicole. Gli

autori di questo lavoro hanno quindi concluso che il complesso Yip1p-Yif1p

è richiesto per produrre vescicole secretorie competenti per la fusione con

l’apparato di Golgi. In un altro lavoro, è stato visto che anticorpi diretti

contro Yip1p non permettono la gemmazione dall’ER delle vescicole rivestite

da COPII, ma non ostacolano la fusione di queste con l’apparato di Golgi

(Heidtman et al., 2003). Tale risultato è in parte contrastante con quello del

lavoro precedente, ma può essere spiegato con l’ipotesi che altri membri della

famiglia possono svolgere la stessa funzione di Yip1p e Yif1p. Il complesso

Yip1p-Yif1p ha anche un terzo interattore: Yos1p, una proteina di membrana

che si localizza a livello del reticolo endoplasmatico, dell’apparato di Golgi e

delle vescicole di trasporto ricoperte da COPII, distribuzione che ha fatto

quindi ipotizzare un suo coinvolgimento nel traffico tra ER e apparato di

Golgi; questa ipotesi è sostenuta anche dal fatto che il silenziamento di Yos1p

comporta difetti nella secrezione caratteristici del blocco del trasporto tra

questi due compartimenti (Heidtman et al., 2005).

La capacità di Yip1p-Yif1p di interagire con due proteine Rab ha portato

ad ipotizzare un possibile ruolo di questo complesso come GDF (GDI

displacement factor), che permette la dissociazione del GDI dalla proteina

Rab e il legame della Rab alla membrana. Questa ipotesi è stata incoraggiata

INTRODUZIONE

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33

dalla scoperta che la proteina umana PRA1, omologa alla Yip3p di lievito, è in

grado di dissociare il complesso Rab9-GDI per il reclutamento della Rab9

sulla membrana degli endosomi (Sivars et al., 2003); Yip3p però agisce a livello

del trans-Golgi e ha una limitata omologia con la sequenza di Yip1p o Yip1f.

In un lavoro di Chen e colleghi è stato visto che una serie di proteine Rab che

agiscono a livello dell’apparato di Golgi, sono necessarie per lo svolgimento

delle funzioni di Yip1p e mutazioni di Yip1p diminuiscono la capacità di

interazione con le Rab. Gli autori hanno quindi ipotizzato un modello che

vede Yip1p agire in un pathway comune che coinvolge sia COPII che le Rab,

quest’ultime necessarie in una fase successiva alla gemmazione vescicolare,

(Chen et al., 2004). La Rab1 oltre ad avere un ruolo nella fusione delle

vescicole COPII con l’apparato di Golgi (Cao and Barlowe, 2000) sembra sia

coinvolta anche nella fusione delle vescicole COPI con il reticolo

endoplasmatico, e quindi nel traffico retrogrado tra l’apparato di Golgi e l’ER

(Kamena et al., 2008). Un ruolo simile del suo interattore Yip1p non è stato

però ancora dimostrato, ma evidenze del coinvolgimento del suo omologo di

mammifero, Yip1A, nel traffico retrogrado derivano da un lavoro recente di

Kano e colleghi, che verrà preso in esame nel paragrafo successivo.

Nonostante le numerose informazioni riguardanti la famiglia di proteine

Yip di lievito raccolte in questi ultimi anni, il loro ruolo nel trasporto

vescicolare non è ancora chiaro e ulteriori studi saranno necessari per

chiarirne la funzione.

1.10 La famiglia di proteine YIP nei mammiferi

La famiglia di proteine YIP nei mammiferi è composta da un numero

maggiore di proteine, 16 nell’uomo e 14 nel topo, e la maggior parte di esse ha

un’espressione ubiquitaria, ma la loro funzione è per lo più sconosciuta

(fig.1.17). Ad esse, nel lavoro di Shakoori e colleghi (2003), è stato attribuito

anche il nome di FinGERs, “Five-pass transmembrane proteins localizing in

INTRODUZIONE

___________________________

34

the Golgi apparatus and in the ER”, in quanto colocalizzano con il marcatore

del cis-Golgi GM130 e alcune mostrano una distribuzione cellulare simile a

quella dell’ER. In questo lavoro è stato osservato che l’over-espressione di tali

proteine comporta la disgregazione dell’apparato di Golgi, e questo può

avvenire o come diretta conseguenza dell’accumulo della proteina nell’ER,

che quindi comporterebbe un blocco del traffico anterogrado, o come effetto

sul mantenimento della struttura del Golgi dovuto all’alterazione del processo

di riconoscimento e/o fusione delle vescicole con l’apparato di Golgi.

Fig. 1.17 Membri della famiglia di proteine YIP nei mammiferi. (Adattata da Pfeffer S. and Aivazian D., 2004).

Il componente della famiglia Yip1A (FinGER5 o YIPF5. NCBI Ref Seq

NM_023311) rappresenta l’omologo di mammifero di Yip1p.

Yip1A condivide circa il 31% di omologia nucleotidica con Yip1p ed ha

un’espressione ubiquitaria. Yip1A possiede un’isoforma espressa solo nel

INTRODUZIONE

___________________________

35

muscolo striato, chiamata Yip1B (FinGER9 o YIPF7. NCBI Ref Seq

NM_023784), con la quale condivide circa il 61% di omologia; la regione di

divergenza risiede principalmente all’estremità N-terminale a livello dei primi

80 amminoacidi (fig. 1.18). Entrambe le isoforme sono caratterizzate, come

Yip1p di lievito, da una regione idrofilica all’N-terminale e da una regione C-

terminale idrofobica, contenete domini multipli potenzialmente in grado di

attraversare le membrane cellulari. E’ stato dimostrato che Yip1A si localizza

a livello dei siti di uscita dal reticolo endoplasmatico (ERES) ed è in grado di

legare Sec23 e Sec24, che rappresentano due delle sub-unità del complesso

molecolare COPII (Tang et al., 2001). Inoltre è stato riportato che l’over-

espressione del dominio idrofobico all’N-terminale di Yip1A comporta il

blocco del traffico tra l’ER e l’apparato di Golgi della proteina G del virus

della stomatite vescicolare (VSVG) e causa la frammentazione e la dispersione

dell’apparato di Golgi. Questi risultati fanno presuppore che Yip1A sia

coinvolta nella regolazione del traffico vescicolare tra ER e apparato di Golgi,

a livello degli ERES, come dimostrato per l’omologo di lievito Yip1p.

Fig. 1.18 Allineamento delle sequenze amminoacidiche di Yip1A e Yip1B di topo con Yip1p di lievito. (Adattata da Tang B.L. et al., 2001).

Tuttavia in un altro studio è stato riportato che il knockdown di Yip1A o

del suo interattore Yif1A non altera in alcun modo il traffico vescicolare

anterogrado tra ER e Golgi, ma provoca la frammentazione dell’apparato di

INTRODUZIONE

___________________________

36

Golgi in piccoli stacks circondati da numerose strutture vescicolari (Yoshida et

al., 2008). Gli autori hanno invece ipotizzato un ruolo nel traffico retrogrado

tra cis-Golgi ed ERGIC, e tra quest’ultimo e l’ER.

Questa ipotesi è in contrasto con i risultati ottenuti da Tang e colleghi

(2001), ed è in contrasto con quanto visto in lievito; tuttavia in un lavoro

molto recente tale ipotesi è stata riconsiderata, in quanto si è visto che il

silenziamento di Yip1A comporta il rallentamento del trasporto retrogrado

della tossina Shiga, dal Golgi all’ER, e contemporaneamente non altera il

trasporto anterogrado della VSVG. Inoltre la regione N-terminale di Yip1A

inibisce il trasporto retrogrado COPI-indipendente, ma non quello COPI-

dipendente o quello anterogrado (Kano et al., 2009).

2 Scopo della tesi

Il sistema di membrane interne delle cellule del muscolo scheletrico, che

comprende il reticolo endo/sarcoplasmatico, i tubuli T e l’apparato di Golgi,

presenta una precisa organizzazione spaziale rispetto al sarcomero. All’interno del

reticolo endo/sarcoplasmatico, il reticolo endoplasmatico “di transizione” è

localizzato a livello del disco Z, in strutture puntiformi lungo la fibra e nella

regione perinucleare, il reticolo endoplasmatico canonico è localizzato nell’intera

banda I e nella giunzione A-I (dove si trovano le triadi), mentre l’apparato di

Golgi si presenta distribuito in strutture puntiformi lungo la fibra e intorno ai

nuclei.

I meccanismi molecolari alla base dell’organizzazione spaziale e funzionale di

questo complesso sistema di membrane interne della fibra muscolare, non sono

ancora molto conosciuti.

Allo scopo di identificare nuovi geni coinvolti nello sviluppo e nel

mantenimento di quest’organizzazione di membrane nel muscolo striato, è stato

avviato uno studio, che si è servito di un approccio bioinformatico, per

l’identificazione di nuovi geni preferenzialmente espressi nel muscolo striato e

codificanti per proteine contenenti almeno un dominio idrofobico in grado di

ancorarle alle membrane interne.

L’attenzione è stata rivolta ad uno di questi geni identificati: Yip1B. Questo

gene codifica per una proteina omologa alla proteina Yip1p di lievito che sembra

coinvolta nel “early secretory pathway”. Nei mammiferi sono presenti due

isoforme, chiamate Yip1A e Yip1B, la cui localizzazione e funzione sono poco

note.

Lo scopo di questa tesi è stato quello di caratterizzare l’isoforma muscolo-

specifica Yip1B, attraverso lo studio della sua espressione e localizzazione in

cellule miogeniche e nel tessuto muscolare scheletrico, sia nella fase adulta che

durante lo sviluppo, grazie all’uso di un anticorpo policlonale specifico prodotto

in laboratorio, utilizzato in esperimenti di immunofluorescenza e in Western blot.

SCOPO DELLA TESI

___________________________

38

Questi esperimenti hanno mostrato che l’isoforma Yip1B è muscolo-specifica ed

è localizzata in parziale sovrapposizione al marcatore del cis-Golgi GM130.

Sono state inoltre effettuate delle Real-Time PCR per lo studio dell’espressione

in diversi tessuti e durante lo sviluppo muscolare di entrambe le isoforme di Yip1.

Questi esperimenti hanno mostrato che l’isoforma Yip1B inizia ad essere espressa

intorno al 16° giorno di vita embrionale del topo, ed aumenta la sua espressione

fino all’età adulta, mentre l’isoforma Yip1A ha un andamento opposto.

Allo scopo di comprendere il ruolo svolto dalla Yip1B nel tessuto muscolare

scheletrico sono stati infine effettuati esperimenti di tipo funzionale. In particolare

è stato indagato l’effetto dell’over-espressione di diverse porzioni della proteina

Yip1 e sono stati effettuati esperimenti di RNA-interference allo scopo di studiare

l’effetto del silenziamento dell’isoforma Yip1B.

3.Materiali e metodi

3.1 Colture cellulari

Le cellule sono state coltivate utilizzando materiali e soluzioni sterili e

lavorando sotto una cappa a flusso laminare. Le cellule sono state coltivate in

piastre petri di diverse dimensioni, in un incubatore alla temperatura di 37° C con

CO2 al 5%.

Le cellule sono state allargate staccandole dalla piastra utilizzando una

soluzione di Tripsina-EDTA (0.05% Tripsina, 0.53 mM EDTA, Invitrogen), e

mantenute in coltura in terreni di coltura diversi a seconda della linea cellulare

utilizzata.

La linea cellulare NIH-3T3 (fibroblasti di topo) è stata coltivata in DMEM

(Dulbecco’s modified Eagle’s medium) con aggiunta di glutammina 2 mM,

streptomicina 100μg/ml, penicillina 100U/ml, sodio-piruvato 1mM, 10% siero

fetale bovino (FBS). Le cellule sono state fatte crescere fino ad una confluenza di

circa l’80%, poi staccate con tripsina-EDTA con un trattamento a 37° C per circa

5 minuti, risospese in terreno completo, contate in camera di Burker e infine

piastrate. Per gli esperimenti d’immunofluorescenza le cellule sono state piastrate

direttamente su vetrini posizionati nella piastra di coltura.

La linea cellulare C2C12 (mioblasti di topo) è stata coltivata nello stesso

terreno di coltura utilizzato per la linea NIH-3T3 (DMEM completo con 10%

FBS). Per il differenziamento in miotubi, al DMEM è stato aggiunto 2% di siero

di cavallo. Per esperimenti d’immunofluorescenza, le cellule sono state piastrate su

vetrini ricoperti di gelatina animale al 2% disciolta in PBS 1x (Phosfate Buffer

Solution 10x: NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM, Na2HPO4/KH2PO4 10mM, pH 7.4).

3.1.1 Miociti primari

I miociti primari di ratto e di topo sono stati prelevati dagli arti posteriori di

animali sacrificati a tre giorni di vita poiché garantiscono una resa maggiore di

MATERIALI E METODI

___________________________

40

cellule satelliti. Gli arti posteriori sono stati privati della pelle e lavati in PBS. Il

tessuto è stato sminuzzato, trasferito in provette da 50 ml, lavato con PBS e

lasciato sedimentare a 37° C. Il sedimento è stato lavato con nuovo PBS, e

l’operazione ripetuta più volte finchè il tampone non è apparso limpido. Al fine di

isolare le singole cellule è stata effettuata un’incubazione a 37° C con tripsina allo

0,25% per 5 minuti. Il sovranatante ottenuto dalla prima tripsinizzazione è stato

scartato. Successivamente sono state effettuate tre incubazioni in tripsina di 15

minuti ciascuna durante le quali il campione è stato agitato mediante vortex ogni 3

minuti, per favorire la disgregazione meccanica del tessuto. I campioni sono stati

poi centrifugati per 10 minuti a 1000 g a temperatura ambiente. Il sovranatante è

stato trasferito in provette da 50 ml contenenti 5 ml di terreno DMEM completo

con 10% di FBS e poi filtrato attraverso due strati di garza sterile. La sospensione

cellulare è stata poi centrifugata per 10 minuti a 1000 g. I pellet cellulari sono stati

trasferiti in un’unica provetta utilizzando una pipetta pasteur di vetro e risospesi in

40 ml di terreno DMEM completo contenente 10% FBS.

La sospensione così ottenuta è costituita da cellule satelliti e da una frazione di

fibroblasti contaminanti. Per eliminare la frazione contaminante è stata effettuato

un pre-piastramento, ponendo la sospensione cellulare a 37° C per 50 minuti in

piastra Petri, per favorire l’adesione dei fibroblasti alla piastra. La frazione di

cellule rimasta in sospensione è stata raccolta in un’unica provetta e centrifugata

per 10 minuti a 1000 g. Il pellet ottenuto è stato risospeso in 20 ml di terreno

DMEM completo con 10% FBS, contato in camera di Burker e piastrato ad una

concentrazione di 80000 cellule per piastra da 35 mm, contenente vetrini ricoperti

di gelatina al 2%. Le cellule sono state fatte moltiplicare per due giorni e poi fatte

differenziare in terreno αMEM completo con aggiunta di dexametasone 0,1 μM,

idrocortisone 50 μM, 10% FBS e 5% HS.

MATERIALI E METODI

___________________________

41

3.2 Esperimenti di immunofluorescenza

Gli anticorpi primari utilizzati negli esperimenti di immunofluorescenza sono:

α-Yip1B prodotto nel presente lavoro (diluizione 1:1000); α-triadina ottenuto dalla

Prof.ssa Isabelle Marty (Grenoble, France) (diluizione 1:10000); α-myc (Clontech,

diluizione 1:500 per immunofluorescenza e 1:1000 per Western blot); α-GM130

(BD Biosciences, diluizione 1:200); α-actinina (Sigma, diluizione 1:2000); α-

actinina (Sigma, diluizione 1:3000) premarcata mediante il sistema Alexa Fluor

Monoclonal Antibody Labeling Kit (Invitrogen).

Gli anticorpi secondari marcati con Cy-2/Cy-3 sono della Jackson ImmunoR,

mentre quello marcato con Alexa Fluor647 è Invitrogen.

3.2.1 Esperimenti di immunofluorescenza su cellule

Le cellule cresciute sui vetrini sono state lavate due volte con PBS per togliere

il terreno di coltura. Le cellule sono state fissate con una soluzione di PBS

contenente il 3% di paraformaldeide e il 2% di saccarosio per 7 minuti. Poi sono

stati effettuati tre lavaggi veloci in PBS contenente BSA al 0.2% e

successivamente le cellule sono state permeabilizzate con Hepes-Triton buffer

(Hepes 20 mM pH 7.4, saccarosio 300 mM, NaCl 50 mM, MgCl2 3 mM, Triton-

X100 0.5%) per 3 minuti. Dopo tre lavaggi in PBS + 0.2% BSA, le cellule sono

state saturate con siero di capra (goat serum 5% in PBS + 0.2% BSA) per circa

un’ora a temperatura ambiente, per impedire legami aspecifici dell’anticorpo. Poi

sono state incubate con l’anticorpo primario diluito in PBS + 0.2% BSA per

qualche ora o per 16 ore, dipendentemente dall’anticorpo utilizzato, in camera

umida a 4°C. Sono stati quindi effettuati tre lavaggi da 10 minuti ciascuno in PBS

+ 0.2% BSA e poi aggiunto l’anticorpo secondario (coniugato con un

fluorocromo) per 1h a temperatura ambiente, al riparo dalla luce. Sono stati di

nuovo effettuati tre lavaggi da 10 minuti ciascuno prima di procedere al

montaggio dei vetrini, utilizzando il montante Mowiol (PBS pH 7.4, Mowiol 20%,

MATERIALI E METODI

___________________________

42

1.4-diazabiciclico-[2,2,2]-ottano DABCO come antifading agent). I vetrini sono stati

conservati al buio a 4° C

3.2.2 Esperimenti di immunofluorescenza su sezioni di tessuto

Il tessuto muscolare di interesse è stato prelevato e fissato su un supporto di

sughero in una goccia di OCT (Tissue Tek OCT) e allungato tramite spilli, poi

immerso in 2-metilbutano raffreddato in azoto liquido (-196° C) e conservato a -

80° C. Il campione è stato poi tagliato in sezioni sottili (circa 7-8 μm) tramite un

criostato (CM 1850, Leica) alla temperatura di circa -25° C. Le sezioni sono state

poste su vetrini (Superfrost) e conservate a -80° C. La qualità delle sezioni è stata

controllata tramite colorazione rapida con ematossilina di Herris (Sigma) al

microscopio ottico.

Il protocollo utilizzato per le reazioni di immunofluorescenza su sezioni è

uguale a quello utilizzato per le cellule, con l’unica differenza che lo step di

permeabilizzazione è stato omesso e l’incubazione con l’anticorpo primario è stata

effettuata per 16 ore.

3.2.3 Esperimenti di immunofluorescenza su diaframma

Il diaframma è stato prelevato e fissato in paraformaldeide al 3% e Triton

0.5% per un’ora a temperatura ambiente. Sono stati conservati in PBS 1X a +4°

C. Il protocollo utilizzato per le reazioni di immunofluorescenza sul diaframma è

uguale a quello utilizzato per le cellule, con l’unica differenza che lo step di

permeabilizzazione è stato effettuato contemporaneamente al fissaggio e

l’incubazione con l’anticorpo primario è stata effettuata per 16 ore.

MATERIALI E METODI

___________________________

43

3.2.4 Microscopia confocale

Per l’osservazione dei preparati ottenuti mediante reazioni di

immunofluorescenza e per l’acquisizione delle immagini è stato utilizzato il

microscopio confocale LSM 510 META (Zeiss) dotato di microscopio a

epifluorescenza invertito Axiovert 200 M, e di tre laser: argon (verde) 40mW con

un laser di eccitazione a 458, 488, 514 nm; HeNe (rosso) a 543 nm; HeNe (rosso

lontano, Cy5 etc.) a 633nm. Le immagini sono state acquisite con un obiettivo 40x

o 63.3x ad immersione, ad una risoluzione 1024x1024 pixels, con una profondità

di immagine di 8 bits, ed elaborate con software Zeiss LSM 510 Image Examiner

e Adobe Photoshop CS4.

3.3 Preparazione di lisati cellulari e di tessuto

3.3.1 Lisati cellulari

Le cellule in coltura sono state lavate due volte in PBS, staccate

meccanicamente (il tutto lavorando in ghiaccio), raccolte risospendendole in PBS

e centrifugate a 9300 g per 10 minuti. Il pellet è stato risospeso in tampone di lisi

RIPA (Tris HCl 50 mM, NaCl 150 mM, Sodio deoxicholato 1%, Triton-X100

1%, SDS 0.1%, NaN3 0.02%) a cui è stato aggiunto l’inibitore delle serin-proteasi

fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) alla concentrazione finale di 0,1 mM. Le cellule

sono state tenute in ghiaccio durante la lisi, per circa 1 ora, agitando di tanto in

tanto; sono state poi centrifugate a 4° C per togliere i detriti cellulari, e il

sovranatante è stato raccolto e conservato a -80° C.

3.3.2 Lisati di tessuto

I campioni di tessuto muscolare sono stati omogenati con l’omogenizzatore

ultraturax 10 secondi per tre volte in ghiaccio e poi risospesi in buffer di lisi

MATERIALI E METODI

___________________________

44

RIPA+PMSF (come per i lisati cellulari). Il campione è stato poi trasferito in tubo

o in Eppendorf e tenuto circa un’ora in ghiaccio agitando di volta in volta, per poi

essere centrifugato a 4° C per togliere i detriti cellulari. Il sovranatante è stato

raccolto e conservato a -80° C.

3.4 Preparazione di microsomi da cellule e da tessuto

I campioni cellulari sono stati raccolti come descritto per i lisati cellulari

mentre i campioni di tessuto muscolare sono stati tagliati in piccole porzioni

mediante bisturi (lavorando su una piastra petri posta in ghiaccio). A questo punto

sia le cellule che i tessuti sono stati trasferiti in dounce da 7 ml con pestello di tipo

tight contente il tampone di omogenizzazione (HEPES 5 mM pH 7.4, saccarosio

0.32 M e PMSF 0.1 mM) e omogenati con 40 colpi, in ghiaccio. L’omogenato è

stato trasferito in corex da 15 ml e centrifugato a 7000 g per 10 minuti a 4° C. Il

sovranatante è stato trasferito in provette da ultracentrifuga Nalgene e

centrifugato a 100000 g per un’ora a 4° C in ultracentrifuga (Beckam). Il pellet di

microsomi è stato risospeso in un piccolo volume di tampone di

omogenizzazione, aliquotato e conservato a -80° C.

3.5 Quantizzazione proteica con il metodo Bradford

La concentrazione proteica sia dei lisati che dei microsomi è stata valutata con

il metodo Bradford (1976), che consiste in un saggio colorimetrico basato sul

confronto della densità ottica del campione con quella di una quantità nota di una

proteina standard, nel nostro caso la BSA (albumina serica bovina). Sia quattro

concentrazioni scalari note (di solito 1, 3, 5, 9 μg) di proteina standard che un

volume preciso del campione, sono stati sciolti in acqua e reattivo di Bradford

(Coomassie G-250 blu, Biorad) mescolati in un rapporto di 4:1 Il reattivo di

Bradford si lega alle proteine in una forma anionica blu che assorbe a 595 nm. Le

MATERIALI E METODI

___________________________

45

quattro concentrazioni note di BSA sono state utilizzate per costruire una curva di

calibrazione, misurandone l’assorbanza a 595 nm, mediante uno spettrofotometro

(Ultrospec 2100 pro, UV/Visible Spectophotometer, Amersharm Pharmacia

Biotech), sulla quale si basa la quantizzazione della concentrazione proteica del

campione.

3.6 Elettroforesi in gel di poliacrilammide (SDS-PAGE)

Per permettere la separazione di proteine in base al peso molecolare è stata

utilizzata la tecnica SDS-PAGE (sodiumdodecylsulfate-polyacrylamid gel

electrophoresis). Il gel è formato da una parte superiore (stacking gel), che

compatta le proteine e gli pemette di raggiungere contemporaneamente la seconda

parte del gel (running gel) dove le proteine vengono separate, e la cui

concentrazione determina la dimensione dei pori e quindi la differente risoluzione

del gel stesso. I gels sono stati preparati utilizzando Acrilammide:Bis 37,5:1 al 4%

per lo stacking, e al 10 o 12,5% per il running in una soluzione di H2O, SDS 0,1%,

APS 0,1%,Temed 0,1% e Tris HCl 0,5 M, pH 6,8 per lo stacking gel o Tris HCl 1,5

M, pH 8,8 per il running gel.

I campioni sono stati preparati aggiungendo un’opportuna quantità di acqua e

di tampone Sample Buffer (0.065 M Tris HCl pH 6.8, SDS 2%, Glicerolo 10%, 2-

mercaptoetanolo 5%, Bromophenol-Blue 0.001%) e poi denaturati a 95° C per 2

minuti. Un pozzetto è caricato con un marker di peso noto (All Blue Precision

Plus Standards, Biorad). La corsa è stata eseguita in tampone di corsa TGS ( Tris

25 mM, Glicina 192 mM, SDS 0.1% pH 8.3) ad un amperaggio costante di 25

mA/gel.

MATERIALI E METODI

___________________________

46

3.7 Western Blot

Le proteine separate mediante elettroforesi sono state trasferite su una

membrana PVDF (Polyvinylidene Difluoride) utilizzando un apposito apparato di

trasferimento (Biorad) contenente il tampone di trasferimento (Tris 0.25%, glicina

1.92 M, SDS 0.01%, metanolo 10%). Il trasferimento è stato effettuato a 400 mA

per un’ora a 4° C oppure per 16 ore a 100 mA. Il gel è stato montato in un

“sandwich” all’interno della cella di trasferimento in cui sono stati posti in ordine:

due spugne, due fogli di carta 3 MM, il gel, la membrana PVDF, due fogli di carta

3 MM e due spugne.

Terminato il trasferimento, la membrana è stata saturata per un’ora in

agitazione a temperatura ambiente in TBS-T (Tris HCl 20 mM ph 7.4, NaCl 150

mM, Tween20 0.05%) con aggiunta di latte in polvere al 5%. E’ stato poi aggiunto

l’anticorpo primario per un’ora in agitazione a temperatura ambiente (se per 16

ore a 4° C). Gli anticorpi utilizzati sono: anti-Yip1B, prodotto nel presente lavoro,

anti-myc (Clontech) e anti PDI (Santa Cruz Biotechnology). Successivamente

sono stati effettuati 3 lavaggi da 10 minuti ciascuno in TBS-T ed è stato aggiunto

l’anticorpo secondario coniugato con la perossidasi di rafano (HRP) (Amersham

Pharmacia) per un’ora in agitazione a temperatura ambiente. Al termine

dell’incubazione sono stati effettuati altre tre lavaggi in TBS-T.

La rivelazione delle bande è stata ottenuta mediante ECL Western Blotting

Detection (Amersham Bioscience) ed esposizione su lastre fotografiche

HYPERFILMTM (Amersham Bioscience), sottoposte a sviluppo e fissaggio con

liquidi fotografici (KODAK) in camera oscura.

3.8 Clonaggi

I cloni utilizzati in questo studio sono riportati sinteticamente in tabella 3.2.

Per il clone Yip1B-Myc la sequenza completa del cDNA (Mus Musculus)

MATERIALI E METODI

___________________________

47

codificante la proteina Yip1B è stata inserita nel vettore di espressione

pcDNA.3.1/myc-His in frame con l’epitopo Myc.

La porzione N-terminale priva di domini transmembrana da base 1 a base 366

del cDNA (Mus Musculus) di Yip1B è stata clonata nel vettore d’espressione

pGEX4T-1 (Amersham Biosciences) per la produzione della proteina di fusione

Yip1B-GST.

I plasmidi ricombinanti Yip1B-N-ter, Yip1B-1-80, Yip1A intera, Yip1A N-ter,

Yip1A 1-80, sono stati creati per inserimento degli inserti corrispondenti nel

vettore pcDNA.3.1/myc-His(-)C con l’epitopo Myc non in frame con la proteina

e quindi non espresso. Gli inserti sono stati ottenuti per PCR, con primers

contenenti i siti di restrizione adatti, partendo dal cDNA (Mus Musculus) delle

proteine Yip1B e Yip1A. In tabella 3.1 è riportata la lunghezza degli inserti

clonati.

Tab. 3.1 Lunghezza degli inserti ottenuti per PCR

I plasmidi ricombinanti Yip1B-notag e Yip1B-GFP sono stati ottenuti per

digestione enzimatica XhoI/BamHI prelevando l’inserto dal clone Yip1B-Myc.

Per la costruzione del plasmide Yip1B-notag il vettore utilizzato è il

pcDNA.3.1/myc-His(-)C con l’epitopo Myc non in frame con la proteina e quindi

non espresso. Per la costruzione del plasmide Yip1B-GFP è stato utilizzato un

vettore di espressione eucariotica, pEGFP-N3 (Clontech) per l’espressione della

proteina Yip1B con GFP all’estremità C-terminale. Tutti i costrutti utilizzati sono

stati confermati per sequenza.

Plasmide cDNA Inserto

Yip1B-N-ter Yip1B ..da base 1 a 366

Yip1B-1-80 Yip1B ..da base 1 a 240

Yip1A intera Yip1A ..da base 1 a 774

Yip1A N-ter Yip1A ..da base 1 a 378

Yip1A 1-80 Yip1A ..da base 1 a 246

MATERIALI E METODI

___________________________

48

Plasmide Primers Seq. primers Sito di restrizione

Yip1B-GST 7a GST FW cgGGATCC atg tca aac cca gaa cag tat

BamHI /XhoI

7a GST REV ccgCTCGAG cgt ttc att cat gat gct gcc

Yip1B-MYC P7PFW ccgCTCGAGcg atg tca aac cca gaa cag tat

XhoI/BamHI

P7PR cgGGATCC ttc gaa aac ggt cag aag ggc

Yip1B-GFP Ottenuto per digestione XhoI/BamHI

Yip1B-notag Ottenuto per digestione XhoI/BamHI

Yip1B-N-ter

7a GST FW cgGGATCC atg tca aac cca gaa cag tat

BamHI/KpnI

mYip1b 366Rev-Kpn ggGGATCC cgt ttc att cat gat gct gcc

Yip1B-1-80 7a GST FW cgGGATCC atg tca aac cca gaa cag tat

BamHI/KpnI

mYip1b 240Rev-Kpn ggGGTACC aac tga ggg aga ctg tga gta

Yip1A intera

mYip1a 1FwBamHI cgGGATCC atg tca ggc ttt gat aac tta BamHI/KpnI

mYip1a 772Rev KpnI ggGGTACC gaa gac aga aat cag ggc aaa

Yip1A N-ter mYip1a 1FwBamHI cgGGATCC atg tca ggc ttt gat aac tta

BamHI/KpnI

mYip1a 378Rev KpnI ggGGTACC gtc cgt ctc att cat gat gct

Yip1A 1-80 mYip1a 1FwBamHI cgGGATCC atg tca ggc ttt gat aac tta

BamHI/KpnI

mYip1a 246Rev KpnI ggGGTACC ata gaa tgg ctg agg tgt tgt

Tab. 3.2 Elenco dei costrutti utilizzati

3.9 Trasfezioni

3.9.1 Trasfezione transiente in cellule

Le cellule sono trasfettate al raggiungimento di una confluenza di circa il 60 %,

usando il Lipofectamine Plus Reagent (Invitrogen), seguendo le istruzioni

riportate dalla ditta produttrice. Le cellule sono state incubate 3 ore a 37° C al 5%

CO2 in presenza dei reagenti di trasfezione e poi il terreno è stato sostituito con

DMEM completo con 10% FBS. Nel caso di C2C12 che devono essere

MATERIALI E METODI

___________________________

49

differenziate, il terreno di differenziamento è stato aggiunto il giorno successivo

alla trasfezione.

3.9.2 Trasfezione transiente in vivo

Le trasfezioni transienti in vivo sono state effettuate su muscolo tibiale di topo

adulto (CD1 di circa tre mesi). Gli animali prima trattati con anestetico Avertin

1,25% (Aldrich 24), sono stati trasfettati con i costrutti di interesse isolando il

tibiale e sottoponendolo ad elettroporazione con l’utilizzo dell’Electro Square

Porator ECM 830, BTX. Condizioni per l’elettroporazione: voltage 25 V, p.length

20 ms, impulse 5, interval 200 ms.

I DNA dei cloni usati per trasfettare sono stati preparati con Kit Nucleobond

Xtra Midi; Macherey-Nagel; e per ogni costrutto sono stati iniettati nel tessuto dai

15 ai 20 µg di DNA diluito in acqua in un volume massimo di 15 µl. I tessuti sono

stati prelevati dopo 15 giorni dalla trasfezione.

3.10 mRNA interference

Per inibire l’espressione genica della proteina di interesse è stato utilizzato il kit

BLOCK-iTTM Pol II miR RNAi Expression Vector (Invitrogen), che fa uso di

microRNA (miRNA), corte molecole di RNA della lunghezza di circa 22

nucleotidi. Il vettore di espressione contiene il promotore precoce del virus

umano citomegalovirus (CMV), che permette un’espressione elevata del miRNA.

Nel vettore è compresa la sequenza codificante per la proteina EmGFP (Emerald

Green Fluorescent Protein, proteina bioluminescente della medusa Aequorea

victoria), incorporata in modo che il sito di inserzione del pre-miRNA si trovi nella

regione al 3’ non tradotta (3’ UTR) dell’mRNA della EmGFP. L’espressione della

EmGFP permette di individuare le cellule esprimenti il miRNA ed è quindi

correlata al silenziamento del gene target.

MATERIALI E METODI

___________________________

50

Negli esperimenti di inibizione dell’espressione della proteina Yip1B sono stati

utilizzati tre miRNA, le cui sequenze sono state ottenute con il programma

BLOCK-iTTM RNAi Designer (Invitrogen), specifici per cDNA di topo (Mus

Musculus). I tre miRNA riconoscono tre sequenze a partire rispettivamente dal

nucleotide 93, 135, 553 (tab. 3.3). Il kit BLOCK-iTTM Pol II miR RNAi

comprende anche un controllo negativo costituito da un plasmide esprimente un

miRNA che non riconosce la sequenza di alcun gene conosciuto di vertebrato.

miRNA Sequenza riconosciuta

93 ATGACATGGGCTTCTACCAAT

135 AGGAGCCGAGTTGCAATGATT

553 TCACGCCTTACTGAACTTGAT

Tab. 3.3 Sequenze riconosciute dai tre miRNA utilizzati negli esperimenti di

RNA interference.

3.11 Estrazione RNA totale

Tutte le operazioni per l’estrazione dell’RNA sono effettuate in ghiaccio o a

4°C.

L’estrazione dell’RNA totale da tessuto di topo è effettuata tramite TRIzol

(Invitrogen) seguendo il protocollo standard indicato dalla casa produttrice.

Brevemente, 50-100 mg di tessuto sono stati omogenizzati in presenza di 1ml di

TRIzol. I campioni omogenizzati sono stati incubati per 5 minuti a temperatura

ambiente e successivamente sono stati aggiunti 0,2 ml di cloroformio per ml di

TRIzol usato. I campioni sono stati agitati e centrifugati a 12000 g per 15 minuti.

L’RNA rimasto nella fase acquosa è stato trasferito in un nuovo tubo e fatto

precipitare con l’aggiunta di isopropanolo, 0,5 ml per ml di TRIzol. Per

l’estrazione di RNA da cellule invece, è stato usato il Kit Nuclespin RNA II

(Macherey-Nagel). L’RNA dopo l’estrazione è stato risospeso in acqua RNAsi-

free e conservato a -80°C.

MATERIALI E METODI

___________________________

51

La misura della concentrazione dell’RNA è stata effettuata tramite lettura

spettrofotometrica (Ultrospec 2100 pro, UV/Visible Spectophotometer,

Amersharm Pharmacia Biotech), misurando l’assorbanza a 260 nm, dove 1 OD260

= [40 μg/ml]. L’integrità dell’RNA è stata determinata tramite corsa

elettroforetica su gel di agarosio all’1%.

3.12 Preparazione del cDNA (RT-PCR)

La sintesi di cDNA tramite RT-PCR è stata effettuata con reagenti Promega;

l’enzima usato è l’M-MLV RT (Moloney Murine Leukemia Virus reverse

transcriptase) in presenza di esanucleotidi random, secondo le istruzioni della casa

produttrice.

La qualità del cDNA ottenuto è stata saggiata tramite PCR utilizzando una

coppia di primers (di senso: 5’TGCGTGACATCAAAGAGAAG; antisenso: 5’

CGGATGTCAACGTCACACTT ) che amplificano per il gene ubiquitario della

β-actina.

Per la RT-PCR semi-quantitativa di Yip1B sono stati utilizzati i seguenti

primers: di senso 5’ AGAGATGTTCCTGCCATCAGA e antisenso 5’

AAAGGATGGGTCCTGTGAGAT

3.13 Real Time PCR

Per studiare l’espressione genica sono stati effettuati degli esperimenti di Real-

Time PCR, una tecnica di amplificazione del cDNA di tipo quantitativo, che

permette di seguire l’andamento dell’amplificazione in tempo reale grazie all'uso di

coloranti fluorescenti, come il SYBR Green, che s’intercalano con il DNA a

doppio filamento.

Per effettuare la Real-Time PCR è stata ustata la Real-Time Step One Plus

(Applied Biosystems). I reagenti impiegati per la mix di reazione sono tutti

MATERIALI E METODI

___________________________

52

contenuti nella Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) ad

esclusione, ovviamente, dei primers e del templato:

Volume (μl) Concentrazione finale

Power SYBR Green PCR Master Mix (2X) 10 1X

Primer Forward [1 μM] 1 50 nM

Primer Reverse [1 μM] 1 50 nM

Templato (1:5) 5 -

Acqua 3 -

Totale 20 -

Come gene housekeeping è stato scelto quello della β-actina. In tabella 3.4

sono elencate le coppie di primers utilizzate.

Primer Sequenza 5’→3’ Primer Sequenza 5’→3’

β-actina F

GATCTGGCACCACACCTTCT

Yip1B

F AGAGATGTTCCTGCCATCAGA

β-actina R

GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA

Yip1B

R AAAGGATGGGTCCTGTGAGAT

Yip1A F CTTAAACAGCGGTTTCTACCAGAC Yif1A

F TGCAATACAGCCATGATGTGCC

Yip1A R CTTGCTGTAGGGTCCTCCACT Yif1A

R CACCTCTGGGGAGAACCTTTG

Yif1B F ATGCACGCGACAGGTTTGGC

Yif1B R GGGCAGAACTCGTGTCATCAA

Tab. 3.4 Primers utilizzati per la RealTime-PCR.

I dati ottenuti sono stati elaborati mediante software Gene Expression Macro

(Bio-Rad), che per la quantizzazione relativa impiega la formula del ΔΔCt

MATERIALI E METODI

___________________________

53

modificata da Pfaffl (Pfaffl M.W., 2001), che tiene conto dell’efficienza di ciascuna

coppia di primers.

Per calcolare l’espressione di Yip1A e Yip1B all’interno dello stesso tessuto è

stata utilizzata la seguente formula: E-(ΔCt) che richiede un’efficienza dei primers

simile, come nel nostro caso, e che non tiene conto del gene housekeeping,

essendo la PCR di entrambi i geni effettuata sulla stessa preparazione di cDNA.

Per trasformare i valori ottenuti sottoforma di folds in valori percentuali, è

stata utilizzata la seguente formula: Yip1A(%)=100/1+X dove X rappresenta

l’espressione di Yip1B rispetto a Yip1A in fold (E-(ΔCt)). I valori ottenuti sono stati

messi su grafico mediante software Excel.

3.14 Produzione e purificazione di anticorpi policlonali

Per produrre la proteina ricombinante Yip1B-GST da utilizzare per

l’immunizzazione dei conigli, è stato utilizzato il plasmide Yip1B-GST, che

codifica per i primi 122 aminoacidi della Yip1B murina in frame con la

Glutatione-S-Transferasi (GST). La produzione e la purificazione della proteina

sono state effettuate secondo tecniche standard indicate dalla casa produttrice.

Gli anticorpi policlonali sono stati prodotti tramite immunizzazione di due

conigli (Oryctolagus cuniculus) New Zealand White, mantenuti secondo le condizioni

stabilite dai protocolli ministeriali. Ai conigli, dopo un periodo di adeguamento

alle condizioni di stabulazione locali, vengono prelevati alcuni ml di sangue per

ottenere il siero pre-immune, dopodichè sono immunizzati con iniezioni ripetute

contenenti 250 μg di proteina Yip1B-GST diluita in PBS al volume finale di 500

μl. Per la prima iniezione, 500 μl di soluzione proteica vengono addizionati a 500

μl di adiuvante di Freund completo (SIGMA), l’emulsione così ottenuta è iniettata

sottocute mediante iniezioni multiple. Per la seconda immunizzazione è stato

utilizzato l’adiuvante incompleto di Freund (SIGMA) e l’emulsione è iniettata a

livello sottoscapolare tramite iniezioni ripetute. Dopo la seconda immunizzazione,

è stato effettuato un prelievo di sangue dalla vena centrale dell’orecchio

MATERIALI E METODI

___________________________

54

dell’animale, sedato con Zoletil. Dopo le prime due immunizzazioni ed il primo

prelievo è stata effettuata un’iniezione endovena della soluzione proteica priva di

adiuvante nella vena periferica dell’orecchio del coniglio; in seguito il prelievo e

l’immunizzazione (tramite iniezione intramuscolare) sono stati effettuati a

settimane alterne.

I sieri sono stati preparati raccogliendo il sangue coagulato a 4° C over-night,

poi centrifugato a 1100 g a 4° C per 30 minuti. I campioni di siero sono stati

aliquotati e conservati alla temperatura di -20° C.

La purificazione dell’anticorpo policlonale è stata effettuata per affinità

utilizzando una colonna di proteina A come matrice. Tutti i passaggi della

purificazione sono stati fatti a 4°C o in ghiaccio per impedire la degradazione

dell’anticorpo. Le IgG totali sono state eluite dalla colonna con 100mM Glicina

(pH3). Le IgG sono state alla fine dializzate con Centricon Plus-20 (AMICON

Bioseparations) e la concentrazione di immunoglobuline è stata calcolata mediante

una lettura allo spettrofotometro misurando l’assorbanza a 280nm.

La qualità del purificato è stata infine verificata caricando circa 10 µg di IgG su

gel di acrilammide.

Trattamento degli animali

I campioni di tessuto utilizzati negli esperimenti sono stati prelevati dal

personale autorizzato dello stabulario del Polo Scientifico di San Miniato

dell’Università degli Studi di Siena, dove gli animali vengono trattati nel rispetto

delle normative vigenti riguardanti la protezione e l’utilizzo degli animali vertebrati

a fini sperimentali e scientifici: Decreto Legislativo del 27 gennaio 1992 n.116, la

decisione del Consiglio 1999/575/CE del 23 marzo 1998 e Decisione 2003/584/CE del

Consiglio del 22 luglio 2003.

4 Risultati 4.1 Identificazione di nuovi geni espressi nel muscolo striato

Negli anni passati nel nostro laboratorio la Dott.ssa Jelena Kunic ha avviato

uno studio mirato all’identificazione di nuovi geni preferenzialmente espressi nel

muscolo striato. Con l’uso di differenti database di espressione genica, come

SymAtlas, basati sui profili di espressione ottenuti mediante microarray, sono stati

identificati 235 geni di Mus Musculus caratterizzati da elevati livelli di espressione

nel muscolo striato rispetto agli altri tessuti (almeno 10 volte maggiori). Le

proteine codificate da questi 235 geni sono state sottoposte all’analisi mediante

software di predizione di domini transmembrana, come SOSUI, per selezionare i

geni codificanti per proteine contenenti almeno un dominio idrofobico,

potenzialmente in grado di ancorarle alle membrane interne del muscolo

scheletrico. Da questo screening sono state alla fine selezionate 4 proteine le cui

funzioni sono in parte o completamente sconosciute. I loro profili d’espressione

sono a questo punto studiati anche mediante esperimenti di RT-PCR allo scopo di

confermare la loro espressione preferenziale nel muscolo striato.

Gli studi successivi si sono concentrati su una di queste quattro proteine,

chiamata Yip1B (NCBI Ref Seq NM_023784). In figura 4.1 sono illustrati i livelli

d’espressione ottenuti mediante l’analisi dei microarray, dove si può osservare un

alto livello d’espressione nel muscolo cardiaco (barra in verde chiaro) e nel

muscolo scheletrico (barra in verde scuro). In figura 4.2 è rappresentata la

struttura secondaria, elaborata dal software di predizione dei domini

transmembrana SOSUI, di Yip1B: tale proteina sembra sia costituita da una

porzione citosolica all’N-terminale e da 4-5 domini idrofobici transmembrana

all’estremità C-terminale.

RISULTATI

___________________________

56

Fig. 4.1 Profili d’espressione di Yip1B in diversi tessuti. In verde chiaro espressione nel cuore, in verde scuro nel muscolo scheletrico. Da Gene Atlas

(http://symatlas.gnf.org/SymAtlas/).

Fig. 4.2 Rappresentazione schematica degli ipotetici domini transmembrana di Yip1B. Da SOSUI (www.sosui.proteome.bio.tuat.ac.jp).

Esperimenti di RT-PCR (fig. 4.3), hanno confermato l’espressione

esclusivamente muscolare della Yip1B che risulta espressa nel muscolo tibiale, nel

soleo, nel diaframma e nel cuore, ma non in tutti gli altri tessuti analizzati.

RISULTATI

___________________________

57

Fig. 4.3 RT-PCR di Yip1B. E’ stato utilizzato come normalizzatore il gene housekeeping β-actina.

4.2 Espressione dei membri della famiglia Yip1 in diversi

tessuti

Allo scopo di verificare e quantificare l’espressione di Yip1B e della sua

isoforma ubiquitaria Yip1A, sono stati effettuati esperimenti di Real-Time PCR su

diversi tessuti, compresi quattro tipi di tessuto muscolare scheletrico.

Come illustrato nel grafico derivante dall’analisi dell’espressione di Yip1A, tale

isoforma è espressa in tutti i tessuti analizzati anche se a livelli differenti, ma la sua

espressione è assente nei diversi tipi di muscolo scheletrico presi in esame, ossia il

muscolo tibiale, il soleo, l’EDL e il diaframma; è invece espressa nel muscolo

cardiaco (fig. 4.4).

RISULTATI

___________________________

58

Fig. 4.4 Espressione di Yip1A in diversi tessuti. L’espressione relativa è calcolata rispetto a quella del muscolo tibiale (*).

Al contrario, Yip1B è espressa nel muscolo striato, quindi scheletrico e

cardiaco, a conferma di quanto emerso negli esperimenti di RT-PCR (vedi fig.

4.3), mentre la sua espressione è assente in tutti gli altri tessuti analizzati (fig. 4.5).

Yip1B sembra quindi rappresentare l’isoforma muscolo-specifica.

Fig. 4.5 Espressione di Yip1B in diversi tessuti. L’espressione relativa è calcolata rispetto a quella della milza (*).

RISULTATI

___________________________

59

Poichè è noto che Yip1A e Yip1B formano complessi molecolari con altri

membri della stessa famiglia, ed in particolare con Yif1A e Yif1B, è stata

analizzata anche l’espressione di Yif1A e Yif1B. Entrambe le isoforme sono

risultate presenti, sebbene con diversi livelli d’espressione, in tutti i tessuti

analizzati, compresi i diversi tipi di muscolo (fig. 4.6 e 4.7). Non sembra quindi

emergere un’isoforma muscolo specifica tra questi due interattori.

Fig. 4.6 Espressione di Yif1A in diversi tessuti. L’espressione relativa è calcolata rispetto a quella della milza (*).

Fig. 4.7 Espressione di Yif1B in diversi tessuti. L’espressione relativa è calcolata rispetto a quella della milza (*).

RISULTATI

___________________________

60

4.2.1 Espressione delle due isoforme di Yip1 in cellule C2C12

Confermata l’espressione muscolo-specifica della Yip1B, sono stati effettuati

esperimenti di Real-Time PCR anche sulla linea cellulare miogenica C2C12, per

analizzare l’espressione delle due isoforme di Yip1 durante il differenziamento di

queste cellule. Dall’analisi dei dati ottenuti è emerso che l’espressione di Yip1B

nelle C2C12 differenziate aumenta di circa 1700 volte rispetto alle cellule non

differenziate, dove sembra essere assente (fig. 4.8).

Fig. 4.8 Espressione di Yip1B in C2C12 non differenziate e differenziate. L’espressione relativa è calcolata in base a quella delle C2C12 non differenziate (*).

La Yip1A è invece presente anche nelle C2C12 non differenziate (dato

rilevabile dal valore di ct, ma non dal grafico in fig. 4.9), ma la sua espressione

aumenta di sole 10 volte con il differenziamento. Questo dato sembra essere in

contrasto con quanto emerso nel grafico di fig. 4.4, poichè la Yip1A non è stata

riscontrata nel muscolo scheletrico. La presenza della Yip1A nella linea cellulare

C2C12 può essere spiegata dal fatto che solo circa il 40% delle cellule

differenziano in miotubi, mentre le restanti rimangono mononucleate e

continuano a proliferare, contribuendo probabilmente all’aumento d’espressione

di Yip1A rilevato in questi esperimenti. Inoltre, trattandosi di un sistema in vitro,

non si raggiunge un differenziamento completo paragonabile a quello delle fibre

muscolari adulte.

RISULTATI

___________________________

61

Fig. 4.9 Espressione di Yip1A in C2C12 non differenziate e differenziate. L’espressione relativa è calcolata rispetto a quella delle C2C12 non differenziate (*).

Analizzando i livelli d’espressione di un’isoforma rispetto all’altra, nelle cellule

non differenziate e differenziate, emerge che nelle prime si ha esclusivamente la

presenza dell’isoforma Yip1A, mentre con il differenziamento la sua espressione

diminuisce e comincia a comparire quella dell’isoforma muscolare Yip1B (fig.

4.10).

Fig. 4.10 Espressione di entrambe le isoforme Yip1 nelle C2C12 non differenziate e differenziate.

RISULTATI

___________________________

62

4.3 Validazione dell’anticorpo anti-Yip1B mediante Western

blot

Per studiare la localizzazione sub-cellulare e per meglio comprendere la

funzione di Yip1B è stato prodotto un anticorpo policlonale contro la porzione

idrofilica di Yip1B di topo. In particolare, il cDNA codificante per la porzione N-

terminale della proteina è stata clonata nel vettore pGEX-4T1. Tale costrutto è

stato poi utilizzato per la produzione della proteina ricombinante in frame con la

GST, necessaria per la produzione dell’anticorpo specifico in grado di riconoscere

la Yip1B.

Per saggiare la specificità dell’anticorpo ottenuto sono state inizialmente

trasfettate cellule NIH3T3 con il cDNA codificante la Yip1B in frame con

l’epitopo myc, e successivamente effettuati esperimenti di Western blot con

l’anticorpo prodotto e con l’anticorpo monoclonale α-myc di controllo. Parte

degli esperimenti di Western blot sono stati effetuati dalla Dott.ssa Antonietta

Corrado durante lo svolgimento della sua tesi di laurea.

E’ stato così verificato che l’anticorpo è in grado di riconoscere in modo

specifico la Yip1B ricombinante, caratterizzata da una banda di circa 37 KDa (fig.

4.11A); infatti la stessa banda è stata individuata anche dall’anticorpo α-myc

(fig.4.11B).

Fig. 4.11 Analisi della specificità dell’anticorpo mediante Western blot. In ogni

pozzetto sono stati caricati 60 g di proteine totali.

A B

RISULTATI

___________________________

63

4.4 Analisi dell’espressione di Yip1B nei tessuti e in C2C12

Una volta verificata la specificità dell’anticorpo prodotto, è stata verificata

anche la sua capacità di riconoscere la proteina endogena, e contemporaneamente

è stata analizzata, sempre mediante esperimenti di Western blot, la sua espressione

in diversi tessuti. L’antisiero prodotto é in grado di riconoscere la proteina

endogena in quanto si evidenzia una banda intorno ai 30 KDa, come atteso, ed

inoltre la banda specifica è presente nei muscoli striati e non in altri tessuti (fig.

4.12A), ad ulteriore conferma che si tratta di una proteina muscolo-specifica.

Inoltre è stato visto che la Yip1B è presente in tutte e tre le tipologie di muscolo

scheletrico: nel soleo, che è composto in prevalenza da fibre muscolari di tipo

lento; nell’EDL, che è un muscolo a composizione prevalentemente veloce, e nel

diaframma che è formato da fibre di entrambi i tipi ed è quindi considerato un

muscolo misto (fig. 4.12B). L’espressione di Yip1B è stata studiata anche nella

linea cellulare miogenica C2C12: la proteina è presente solo in cellule

differenziate, e quindi solo nei miotubi (fig. 4.12C), confermando i dati ottenuti

dagli esperimenti di Real-Time PCR.

Fig. 4.12 Analisi dell’espressione di Yip1B all’interno di diversi tessuti e in cellule

C2C12. In ogni pozzetto sono stati caricati 60 g di proteine totali.

A

B C

RISULTATI

___________________________

64

Poiché l’analisi informatica ha evidenziato che Yip1B presenta almeno quattro

domini di membrana, esperimenti di Western blot sono stati effettuati anche sulla

frazione microsomiale purificata da muscoli prelevati dagli arti inferiori di topo. I

risultati ottenuti mostrano che Yip1B è presente in maggiori quantità nella

frazione microsomiale dei muscoli scheletrici, confermando la sua associazione

alle membrane (fig. 4.13A).

Fig. 4.13 Analisi dell’espressione di Yip1B nella frazione microsomiale di muscolo scheletrico. La banda intorno ai 100 KDa (B) rappresenta la triadina utilizzata per verificare la qualità della preparazione microsomiale. In ogni pozzetto sono stati

caricati 60 g di proteine totali e 30 g della frazione microsomiale.

4.5 Localizzazione sub-cellulare di Yip1B

Allo scopo di studiare la localizzazione sub-cellulare di Yip1B nelle cellule

muscolari, sono stati effettuati esperimenti di immunofluorescenza su C2C12

differenziate, su miociti primari differenziati di ratto e su sezioni di muscolo

scheletrico tibiale di topo.

4.5.1 Localizzazione di Yip1B in cellule C2C12

Al fine di analizzare la localizzazione di Yip1B sono stati effettuati degli

esperimenti preliminari su cellule C2C12 trasfettate con diversi costrutti della

proteina in esame, prima di passare ad esaminare la distribuzione della proteina

A B

RISULTATI

___________________________

65

endogena. Dopo aver piastrato, trasfettato e differenziato per circa 7 giorni cellule

C2C12, sono stati condotti esperimenti di immunofluorescenza con l’utilizzo

dell’anticorpo appropriato e le cellule sono state analizzate al microscopio

confocale. Cellule trasfettate con la proteina di fusione Yip1B-myc e colorate con

l’anticorpo α-myc mostrano una distribuzione perinucleare e in strutture

puntiformi distribuite lungo il miotubo (fig. 4.14).

Fig. 4.14 Immunofluorescenza su cellule C2C12 trasfettate con Yip1B-myc e differenziate. Il segnale specifico è stato evidenziato con l’uso dell’anticorpo primario α-myc (1:500) e dell’anticorpo secondario rosso (barra: 5 μm).

Una distribuzione simile è stata evidenziata anche trasfettando la proteina in

frame con l’epitopo GFP.

Per escludere un’eventuale localizzazione errata dovuta alla presenza

dell’epitopo, le cellule sono state trasfettate con la Yip1B priva di tag e colorate

con l’anti-siero α-Yip1B. Come si osserva dalla figura 4.15 il segnale rimane

perinucleare e in strutture puntiformi, indicando che gli epitopi non sembrano

alterare la localizzazione della proteina ricombinante.

RISULTATI

___________________________

66

Fig. 4.15 Immunofluorescenza su cellule C2C12 trasfettate con Yip1B senza tag e differenziate. Il segnale specifico è stato evidenziato con l’uso dell’anticorpo α-Yip1B e dell’anticorpo secondario rosso (barra: 5 μm).

Una volta dimostrata la specificità dell’anticorpo prodotto, si è passati

all’esame della localizzazione della proteina endogena. Le cellule C2C12 sono state

piastrate, fatte differenziare per circa 8 giorni e poi colorate con l’uso

dell’anticorpo specifico. I risultati mostrano che la proteina endogena si

distribuisce in modo simile a quella ricombinante, localizzandosi nella regione

perinucleare e lungo i miotubi (fig. 4.16).

Fig. 4.16 Immunofluorescenza su cellule C2C12 differenziate. Il segnale specifico è stato evidenziato con l’uso dell’anticorpo α-Yip1B e dell’anticorpo secondario rosso (barra: 5 μm).

RISULTATI

___________________________

67

4.5.2 Localizzazione di Yip1B in miociti primari

Per verificare la localizzazione della proteina in cellule primarie, la stessa analisi

è stata effettuata su miociti primari di ratto. I miociti sono stati piastrati su vetrini

gelatinati, trasfettati con tre costrutti differenti, fatti differenziare per circa sei

giorni, colorati con l’anticorpo specifico e analizzati al microscopio confocale.

Anche nei miotubi derivati dai miociti primari, come nelle C2C12, il segnale

dato dalla Yip1B-myc e Yip1B-GFP (fig. 4.17) trasfettate è localizzato intorno al

nucleo e in strutture puntiformi distribuite lungo il miotubo.

Fig. 4.17 Immunofluorescenza su miociti primari di ratto trasfettati con Yip1B-myc (A) e Yip1B-GFP (B) e differenziati. Per i miociti trasfettati con Yip1B-myc il segnale specifico è stato evidenziato con l’uso dell’anticorpo primario α-myc (1:500) e dell’anticorpo secondario verde (barra: 5 μm).

A

B

Inoltre, come per le C2C12, i miociti sono stati trasfettati anche con la Yip1B

priva di epitopi per escludere una localizzazione errata delle proteine con i diversi

tag. Anche nei miociti la proteina priva di tag si dispone in modo simile a quella

ricombinante (fig. 4.18).

Fig. 4.18 Immunofluorescenza su miociti primari di ratto trasfettati. con Yip1B

senza tag e .differenziati. Il segnale specifico è stato evidenziato con l’uso dell’anticorpo α-Yip1B e dell’anticorpo secondario rosso (barra: 5 μm).

Per analizzare la distribuzione della proteina endogena nei miotubi derivanti da

miociti primari, è stata effettuata una doppia colorazione con l’antisiero α-Yip1B e

con l’anticorpo diretto contro l’ α-actinina, una proteina dell’apparato contrattile

che è localizzata in corrispondenza del disco Z del sarcomero solo nei miociti

differenziati. Come si può osservare dalla figura 4.19, la Yip1B si dispone intorno

ai nuclei e in strutture puntiformi lungo la fibra, come avviene per la proteina

ricombinante e come visto nella linea cellulare miogenica C2C12.

RISULTATI

___________________________

69

Fig. 4.19 Immunofluorescenza su miociti differenziati. Il segnale specifico è stato

evidenziato con l’uso dell’anticorpo α-Yip1B in rosso, e con l’anticorpo contro l’α-actinina in verde (barra: 5 μm).

4.5.3 Localizzazione di Yip1B in fibre muscolari adulte

Si è passati poi ad analizzare la localizzazione di Yip1B nei muscoli adulti. A

tale scopo sono stati prelevati muscoli tibiali di topo adulto, dai quali sono state

preparate delle sezioni, colorate poi con l’anti-siero α-Yip1B purificato. Come si

osserva dalla figura 4.20, la Yip1B si distribuisce in file di due o tre strutture

puntiformi lungo la fibra e ai poli del nucleo, evidenziato con l’uso del colorante

nucleare DAPI.

Yip1B

merge

α-actinina

RISULTATI

___________________________

70

Fig. 4.20 Immunofluorescenza su fibre di muscolo tibiale adulto. Il segnale specifico è stato evidenziato con l’uso dell’anticorpo α-Yip1B in rosso, i nuclei con il DAPI in blu (non in confocale), (barra: 5 μm).

Poiché tale localizzazione sembra essere molto simile a quella dell’apparato di

Golgi nelle fibre muscolari di tipo veloce, come appunto il muscolo tibiale, è stata

effettuata una doppia colorazione con l’anticorpo contro la Yip1B e con il

marcatore del cis-Golgi, il GM130.

Quello che si osserva è una co-localizzazione della Yip1B con il cis-Golgi, sia

in sezione longitudinale (fig. 4.21A) che in sezione trasversale (fig. 4.21B), anche

se ad un ingrandimento maggiore si può osservare che si tratta di una co-

localizzazione solo parziale con il cis-Golgi (fig. 4.21C).

RISULTATI

___________________________

71

Fig. 4.21 Immunofluorescenza su fibre di muscolo tibiale adulto. La sezione trasversale (A) e longitudinale (B) è stata colorata con l’anticorpo α-Yip1B in rosso e con il marcatore del cis-Golgi GM130 in verde. Il riquadro C indica l’ingrandimento della zona indicata dal riquadro in verde (barra: 5 μm).

4.6 Espressione di Yip1B durante il differenziamento

cellulare delle C2C12

Essendo la Yip1B espressa, come visto dai dati di Real-Time PCR e da

esperimenti di Western blot, nelle cellule C2C12 differenziate, ma non in quelle

mononucleate, l’espressione della proteina è stata analizzata durante il

differenziamento di questa linea cellulare. Cellule C2C12 sono state fatte

differenziare per un massimo di 10 giorni e raccolte anche a tempi intermedi, ossia

al terzo, quinto e settimo giorno. Le cellule sono state quindi lisate e caricate su

gel per poi effettuare un Western blot con l’anti-siero α-Yip1B.

A

B

Yip1B

Yip1B GM130

GM130

merge

merge

Yip1B GM130

merge

C

RISULTATI

___________________________

72

I risultati mostrano che l’espressione della proteina inizia intorno al 3° giorno

di differenziamento ed aumenta con il progredire del differenziamento dei

mioblasti in miotubi (fig.4.22).

Fig. 4.22 Analisi dell’espressione di Yip1B durante il differenziamento delle cellule C2C12. In ogni pozzetto sono stati caricati 60 μg di proteine totali, la normalizzazione della quantità di proteine caricate è stata effettuata con l’anticorpo α-PDI.

4.7 Espressione di Yip1B e Yip1A durante lo sviluppo

muscolare embrionale

Essendo Yip1B una proteina muscolo-specifica che mostra un aumento

d’espressione con il progredire del differenziamento delle C2C12, abbiamo

analizzato come varia la sua espressione durante lo sviluppo del muscolo

scheletrico adulto.

4.7.1 Analisi mediante Real-time PCR

L’aumento dell’espressione di Yip1B durante lo sviluppo è stato verificato con

esperimenti di PCR quantitativa, effettuata su un mix di tessuti muscolari

RISULTATI

___________________________

73

scheletrici prelevati dall’arto posteriore di topo a diversi stadi di sviluppo

embrionale, ossia al 14°, 16° e 18° giorno e al 1°, 5° e 15° giorno di vita post-

natale, oltre che allo stadio adulto. La sua comparsa si ha al 16° giorno di sviluppo

embrionale ed aumenta con l’avanzare dello sviluppo, raggiungendo livelli

massimi d’espressione nel muscolo adulto. Sono stati analizzati anche quattro tipi

di muscoli separatamente, a due differenti stadi: al 15° giorno di vita post-natale,

(fase in cui compaiono le caratteristiche tipiche che contraddistinguono le diverse

tipologie muscolari), e nello stadio adulto. Per ogni muscolo analizzato si ha

l’aumento d’espressione di Yip1B passando dal 15° giorno di vita post-natale alla

fase adulta (fig. 4.23).

Fig. 4.23 Espressione di Yip1B a differenti stadi di sviluppo embrionale e post-natale. L’espressione relativa è calcolata in base a quella del muscolo totale al 14° giorno di vita embrionale (SKM*).

E’ stata analizzata anche l’espressione dell’isoforma ubiquitaria Yip1A durante

le stesse fasi dello sviluppo, e quello che è emerso è un andamento

completamente opposto: il gene è espresso a livelli maggiori al 14° e 16° giorno di

sviluppo embrionale e la sua espressione diminuisce progressivamente con il

raggiungimento dell’età adulta. L’abbassamento d’espressione si verifica, come

atteso, anche nei quattro tessuti muscolari analizzati separatamente (fig. 4.24).

RISULTATI

___________________________

74

Fig. 4.24 Espressione di Yip1A a differenti stadi di sviluppo embrionale e post-natale. L’espressione relativa è calcolata in base a quella del muscolo totale adulto (SKMad*).

Comparando i livelli d’espressione delle due isoforme in ogni fase dello

sviluppo muscolare, si può vedere che con l’avanzare del differenziamento si ha la

diminuzione dell’espressione della Yip1A e un parallelo aumento dell’espressione

dell’isoforma muscolo-specifica Yip1B (fig.4.25).

Fig. 4.25. Espressione delle due isoforme in ogni stadio dello sviluppo muscolare.

RISULTATI

___________________________

75

4.7.2 Analisi mediante Western blot

La stessa indagine effettuata con la tecnica di Western blot su lisati proteici

derivanti da muscolo intero, prelevato al 14° e 18° giorno di sviluppo embrionale

e al 1°, 5° e 12° giorno di sviluppo post-natale, ha confermato la comparsa della

proteina Yip1B dopo il 14° giorno di vita embrionale ed un aumento

d’espressione nella fase post-natale (fig. 4.26). Non è stato possibile effettuare lo

stesso esperimento anche per Yip1A, poichè non abbiamo a disposizione un

anticorpo specifico per questa isoforma.

Fig. 4.26 Espressione di Yip1B a differenti stadi di sviluppo embrionale e post-

natale. In ogni pozzetto sono stati caricati 40 g di proteine totali. A destra è raffigurato il gel di acrilammide caricato come il precedente e colorato con Blue di Comassie per normalizzare la quantità di proteine caricate.

4.7.3 Analisi mediante esperimenti di immunofluorescenza

Esperimenti di immunofluorescenza sul diaframma prelevato al 14°, 16° e 18°

giorno di sviluppo embrionale e al 1° e 5° giorno di vita post-natale hanno

confermato la comparsa di Yip1B al 16° giorno di sviluppo embrionale, come già

emerso dallo studio dell’espressione del gene mediante esperimenti di PCR

quantitativa. Inoltre i risultati ottenuti evidenziano che la proteina, sin dal

momento della sua comparsa, mostra una parziale co-localizzazione con il

marcatore del cis-Golgi (GM130), (fig. 4.27).

RISULTATI

___________________________

76

Fig. 4.27 Immunofluorescenza sul diaframma di topo prelevato al 16° giorno di sviluppo embrionale. La sezione è stata colorata con l’anticorpo α-Yip1B in rosso, con il marcatore del cis-Golgi GM130 in verde. Le frecce indicano la co-localizzazione dei due segnali (barra: 5 μm).

4.8 Espressione di Yip1B in fibre rigeneranti

Effettuando esperimenti di trasfezione in vivo, poiché l’elettroporazione

comporta un danno notevole alle fibre, si è ottenuta la formazione di numerose

fibre rigeneranti. Dalla colorazione con l’anticorpo α-Yip1B di sezioni ottenute da

muscolo tibiale di topo prelevato dopo sette giorni dalla trasfezione, si è osservato

un notevole aumento dell’espressione della proteina nelle fibre rigeneranti rispetto

alle fibre non rigeneranti. In figura 4.28 si osserva infatti una fibra rigenerante al

cui interno la Yip1B (in rosso) è espressa ad alti livelli e si distribuisce in numerosi

aggregati di strutture puntiformi non ancora disposti in file ordinate, e in parte

localizzati in prossimità dei nuclei (non mostrati in questa immagine). Inoltre da

una doppia colorazione con l’anticorpo contro il GM130, si può osservare una

buona co-localizzazione con il cis-Golgi come osservato anche nelle fibre adulte e

in quelle in via di sviluppo.

Yip1B

GM130

merge

RISULTATI

___________________________

77

Fig. 4.28 Immunofluorescenza su muscolo tibiale di topo contenente fibre rigeneranti. La sezione è stata colorata con l’anticorpo α-Yip1B in rosso e con l’anticorpo α-GM130 in verde (barra: 5 μm).

4.9 Effetto dell’overespressione di Yip1B e Yip1A in C2C12

indifferenziate

Dati presenti in letteratura hanno mostrato che l’over-espressione

dell’isoforma Yip1A e soprattutto della sua porzione N-terminale in cellule

mononucleate comporta la frammentazione dell’apparato di Golgi, suggerendo

che questa proteina sia coinvolta nel mantenimento dell’apparato di Golgi stesso

(Tang et al., 2001). Per verificare se anche l’isoforma Yip1B è in grado di

provocare questo effetto sull’apparato di Golgi e quale porzione della proteina sia

eventualmente coinvolta in questo fenomeno, sono stati generati tre vettori

d’espressione codificanti per la proteina intera, per la porzione N-terminale

citosolica e per la porzione N-terminale citosolica costituita dai primi 80

amminoacidi, che rappresenta la porzione di divergenza tra le due isoforme

Yip1A e Yip1B. I costrutti così ottenti sono stati poi trasfettati in cellule C2C12.

Le cellule una volta trasfettate sono state colorate con l’anticorpo α-Yip1B e con

l’anticorpo α-GM130 per evidenziare l’apparato di Golgi. I risultati mostrano che:

trasfezioni transienti in cellule mononucleate della proteina intera e della porzione

RISULTATI

___________________________

78

N-terminale completa sembrano in grado di indurre la frammentazione e\o

dispersione dell’apparato di Golgi, come riportato in letteratura per l’isoforma

Yip1A. Tuttavia la porzione di divergenza rappresentata dai primi 80 aminoacidi

non sembra in grado di produrre lo stesso effetto (fig. 4.29).

Fig. 4.29 Immunofluorescenza su cellule C2C12 trasfettate con Yip1B intera (A), Yip1B N-terminale (B) e Yip1B N-terminale composta dai primi 80 aa (C). La Yip1B è stata evidenziata con l’uso dell’anticorpo α-Yip1B in rosso e l’apparato di Golgi

con l’anticorpo α-GM130 in verde. Nei riquadri centrali e in basso si possono osservare

cellule non trasfettate caratterizzate da un apparato di Golgi normale (barra: 5 μm).

4.10 Knock-down di Yip1B

Per comprendere la funzione di Yip1B nel muscolo scheletrico sono stati

effettuati esperimenti di RNA-interference, allo scopo di abbassare l’espressione

della proteina e di verificare un eventuale effetto sul muscolo scheletrico dovuto

alla mancanza di una quantità sufficiente di Yip1B.

Dopo aver disegnato due miRNA (con il programma BLOCK-iT RNAi

Designer) in grado di riconoscere due sequenze differenti dell’mRNA codificante

per la Yip1B, i vettori d’espressione codificanti per i due miRNA e per un miRNA

A B C

GM130

GM130

GM130

Yip1B Yip1B Yip1B

merge merge merge

RISULTATI

___________________________

79

di controllo non silenziante, sono stati trasfettati in cellule NIH3T3 mediante una

doppia trasfezione con il cDNA codificante per la Yip1B, allo scopo di testare in

vitro quale miRNA fosse in grado di silenziare la proteina bersaglio. Per ogni

miRNA sono state effettuate due trasfezioni variando il rapporto tra la quantità di

cDNA codificante per Yip1B e quella codificante per il miRNA. Nel rapporto 1:0

non è presente il miRNA e quindi il silenziamento dovrebbe essere nullo, ed è

stato quindi utilizzato come controllo negativo; nel rapporto 1:1 sono presenti le

stesse quantità dei due costrutti. La quantità di cDNA di Yip1B trasfettata è

uguale per ogni rapporto utilizzato e quindi la quantità di DNA totale trasfettato è

stata mantenuta costante aggiungendo il DNA del vettore vuoto. Le cellule

trasfettate sono state lisate 48 ore dopo la trasfezione e le proteine ottenute

caricate su gel su cui è stato effettuato un Wester blot con l’anticorpo contro la

Yip1B e con quello contro il PDI per normalizzare la quantità di proteine caricate

su gel (fig. 4.30).

Fig. 4.30 Analisi dell’espressione di Yip1B in cellule NIH3T3 co-trasfettate con il cDNA codificante Yip1B e tre miRNA differenti, nei rapporti 1:0, 1:1. In ogni pozzetto sono stati caricati 40 μg di lisato totale

Le bande ottenute dal blot, riguardanti l’espressione della Yip1B nelle diverse

combinazioni, sono state quantizzate e normalizzate rispetto al PDI mediante

densitometria effettuata con il software ImageJ. Dal grafico così ottenuto,

illustrato in figura 4.31, si osserva che entrambi i miRNA sono in grado di

silenziare la Yip1B, anche se in percentuali differenti. In particolare si può

RISULTATI

___________________________

80

osservare che il miRNA93 comporta un abbassamento dell’espressione della

Yip1B di circa il 33% rispetto al miRNA di controllo, mentre la diminuzione

dell’espressione della Yip1B sembra essere più consistente per il miRNA553 che

comporta un abbassamento dell’espressione della Yip1B di circa il 72%.

Fig. 4.31 Grafico derivante dall’analisi densitometrica effettuata sul Western blot di figura 4.30.

Per osservare l’effetto dei miRNA, cellule C2C12 sono state trasfettate con i

plasmidi codificanti il miRNA 93 e 553, e con il miRNA non silenziante come

controllo negativo. Una volta trasfettate e differenziate per circa 6 giorni, è stata

effettuata una colorazione con anticorpi contro Yip1B e contro il GM130, un

marcatore del cis-Golgi. Come si osserva dalla figura 4.32A, la fibra in verde che

esprime il miRNA di controllo presenta un evidente segnale di Yip1B (in rosso),

come atteso. Nella stessa figura, nel riquadro B e C, si osservano rispettivamente

una fibra trasfettata con il miRNA93 e una con il miRNA553, in cui notiamo un

notevole abbassamento dell’espressione di Yip1B, come riscontrato nel blot. Per

quanto riguarda il segnale dato dal GM130 (in viola), si può osservare che il

RISULTATI

___________________________

81

silenziamento di Yip1B, provocato da entrambi i miRNA, non produce nessun

evidente effetto sull’apparato di Golgi, il quale mantiene la stessa morfologia delle

fibre di controllo e non sembra essere frammentato, come invece osservato nel

lavoro di Yoshida e colleghi (2008).

Fig. 4.32 Immunofluorescenza su cellule C2C12 trasfettate con il miRNA di controllo (A), il miRNA93 (B) e il miRNA553(C). Le cellule trasfettate con il miRNA sono indicate in verde in quanto esprimono la GFP. Le cellule fatte differenziare per 6 giorni dopo la trasfezione, sono state colorate con l’anticorpo α-Yip1B in rosso e con il marcatore del cis-Golgi GM130 in viola (barra: 5 μm).

L’effetto del silenziamento è stato studiato anche nel muscolo scheletrico

adulto. Muscoli tibiali di topo sono stati trasfettati in vivo con il plasmide di

A C

GM130

GFP

Yip1B

merge

GM130

GFP

Yip1B

merge

GM130

GFP

Yip1B

merge

B

RISULTATI

___________________________

82

controllo e con entrambi i plasmidi contemporaneamente

(miRNA93+miRNA553), e prelevati dopo 6 e 15 giorni dalla trasfezione. Dopo 6

giorni non è stato rilevato alcun silenziamento della proteina; dopo 15 giorni

invece, come si può osservare in figura 4.34A, è ben visibile l’abbassamento

dell’espressione di Yip1B, che non si osserva invece trasfettando il plasmide di

controllo (fig.4.33A).

A B

Fig. 4.33 Immunofluorescenza su sezioni di muscolo tibiale di topo, trasfettato in vivo con il miRNA di controllo. Le fibre trasfettate con il miRNA sono indicate in verde in quanto esprimono la GFP. Le sezioni, prelevate 15 giorni dopo la trasfezione,

sono state colorate con l’anticorpo α-Yip1B in rosso (colonna A) e con l’anticorpo α-GM130 in rosso (colonna B), (barra: 5 μm).

merge merge

Yip1B

GFP GFP

GM130

RISULTATI

___________________________

83

Fig. 4.34 Immunofluorescenza su sezioni di muscolo tibiale di topo, trasfettato in vivo con il miRNA93+miRNA553. Le fibre trasfettate con il miRNA sono indicate in verde in quanto esprimono la GFP. Le sezioni, prelevate 15 giorni dopo la trasfezione,

sono state colorate con l’anticorpo α-Yip1B in rosso (colonna A) e con l’anticorpo α-GM130 in rosso (colonna B), (barra: 5 μm).

Come nelle C2C12, anche nel muscolo adulto non si evidenzia alcuna

alterazione dell’apparato di Golgi nelle fibre che esprimono i miRNA93 e 553 (fig

4.34B).

Yip1B

merge merge

GFP GFP

GM130

5 Discussione

Yip1B è una proteina omologa alla proteina Yip1p di lievito e fa parte della

numerosa famiglia di proteine YIP di mammifero che comprende anche un’altra

isoforma di Yip1, la Yip1A. Da dati presenti in letteratura è noto che la Yip1A

rappresenta l’isoforma ubiquitaria, mentre la Yip1B sembra essere l’isoforma

muscolo-specifica (Tang et al., 2001). Per verificare l’espressione di queste due

isoforme sono stati effettuati esperimenti di Real-Time PCR in diversi tessuti. E’

emerso che la Yip1A è espressa in molti dei tessuti analizzati anche se a livelli

differenti, compreso il cuore, ma la sua espressione è assente nei diversi tipi di

muscolo scheletrico adulto analizzati. Al contrario Yip1B è espressa

esclusivamente nei muscoli scheletrici e nel muscolo cardiaco: è stata quindi

confermata la sua natura di proteina muscolo-specifica. Poiché è noto che Yip1A

forma un complesso molecolare con il membro della stessa famiglia di proteine

Yif1A, è stata analizzata anche l’espressione della Yif1A e della sua omologa

Yif1B, per vedere se ci fosse un’isoforma muscolo-specifica. Entrambe sono

espresse, con diversi livelli d’espressione, in tutti i tessuti analizzati, quindi non

sembra evidenziarsi l’esistenza di una proteina Yif1 esclusivamente di tipo

muscolare.

Da esperimenti d’immunofluorescenza e analisi al microscopio confocale è

emerso che Yip1B si dispone in strutture puntiformi lungo il miotubo e nella

regione perinucleare, distribuzione osservata anche nelle fibre muscolari adulte.

Questa distribuzione della Yip1B è in gran parte sovrapponibile con la regione del

cis-Golgi. Tale localizzazione è quindi in accordo con una parte della letteratura

sull’isoforma omologa, Yip1A, che indica come questa isoforma sia localizzata

negli exit sites dell’ER, nell’ERGIC e nel cis-Golgi e cicli tra questi compartimenti,

mentre e’ in contrasto con il lavoro di Tang e colleghi (2001) che la localizza solo

nei siti di uscita del reticolo endoplasmatico.

DISCUSSIONE

___________________________

85

E’ stata poi analizzata l’espressione di entrambe le isoforme di Yip1 durante lo

sviluppo embrionale e post-natale del muscolo. Dati di Real-Time PCR hanno

evidenziato una riduzione dell’espressione di Yip1A con il progredire dello

sviluppo e quindi del differenziamento muscolare, e un contemporaneo aumento

dei livelli d’espressione di Yip1B, la cui espressione proteica compare dopo il 14°

giorno di vita embrionale. Questo indica che con il delinearsi delle caratteristiche

muscolari all’interno del tessuto, si ha la sostituzione di Yip1A con l’isoforma

muscolo-specifica Yip1B. Questo potrebbe significare che la funzione, ancora

poco chiara, di Yip1A nelle cellule non muscolari sia svolta da Yip1B nel muscolo

adulto, e che la sostituzione di un’isoforma con l’altra sia dovuta alle

caratteristiche specifiche dell’isoforma Yip1B, probabilmente legate ai

cambiamenti del sistema di membrane interne proprie delle cellule muscolari.

Con esperimenti di over-espressione è stata confermata la capacità di Yip1, e

della sua porzione N-terminale, di disgregare l’apparato di Golgi (Tang et al.,

2001), capacità che invece non ha la porzione di divergenza tra Yip1A e Yip1B

composta dai primi 80 amminoacidi. Sembra quindi che la sequenza proteica

responsabile di questo effetto risieda nella porzione N-terminale citosolica,

compresa tra gli amminoacidi 80 e 120, che rappresenta la regione solubile di

maggiore omologia tra le due isoforme.

Per comprendere la funzione di Yip1B è stato messo a punto un sistema di

mRNA-interference, con il quale si è ottenuto un notevole abbassamento

dell’espressione della proteina, sia in cellule C2C12 che in vivo in fibre muscolari

adulte. Dati presenti in letteratura hanno mostrato risultati contrastanti e

riguardanti soltanto l’isoforma ubiquitaria Yip1A: in un lavoro è emerso che il

silenziamento di Yip1A e del suo interattore Yif1A comporta la frammentazione

dell’apparato di Golgi (Yoshida et al., 2008). In un altro lavoro di Kano e colleghi

(2009), questo effetto non si verifica. Nei nostri risultati non abbiamo osservato

alcuna disgregazione dell’apparato di Golgi in accordo con il lavoro di Kano et al

(2009).

Il prossimo passo sarà quindi quello di indagare la funzione di Yip1B ed in

particolare di verificare se il silenziamento di Yip1B possa comportare una

DISCUSSIONE

___________________________

86

localizzazione errata delle diverse proteine residenti nel reticolo sarcoplasmatico.

Attualmente non si conoscono i meccanismi responsabili della localizzazione delle

proteine residenti nel reticolo sarcoplasmatico ed in particolare quali siano i

meccanismi di ritenzione nel reticolo e di targeting nelle diverse regioni

specializzate. Infatti la maggior parte delle proteine residenti nel reticolo

sarcoplasmatico è priva dei tipici segnali di ritenzione nell’ER.

A questo proposito è stato ipotizzato che alcune di esse si localizzano in modo

diverso da quello canonico, cioè che vengano trasportate fuori dal reticolo

attraverso il traffico vescicolare e che vengano poi riportate nel RS, ma il

meccanismo attraverso il quale ciò avviene è ancora sconosciuto.

A supporto di questa ipotesi sono presenti in letteratura alcuni dati riguardanti

alcune proteine del reticolo sarcoplasmatico. Per la calsequestrina sembra che la

corretta localizzazione nel RS sia dovuta ad un’attiva uscita dall’ER, tramite il

trasporto mediato da vescicole COPII (Nori et al, 2004), mentre per altre proteine

del reticolo sarcoplasmatico longitudinale, quali la SERCA1 (Newton et al., 2003).

ed il fosfolambano e la sarcolipina (Butler et al., 2007), e’ stato ipotizzato un

meccanismo di continuo recupero dall’ERGIC in quanto presenti anche a livello

del compartimento intermedio. Successivamente sarà quindi importante verificare

se Yip1B possa essere coinvolta nel “targeting” di queste o di altre proteine nelle

diverse regioni della fibra muscolare.

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UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI SIENA - unisi.it · Il tessuto muscolare striato, così chiamato a causa...

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