UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI MILANO Facoltà di Medicina e Chirurgia

Scuola di Specializzazione in Biochimica Clinica

Gagliardi Barbara

TOLLERANZA IMMUNOLOGICA NELLA PRATICA CLINICA DEI

TRAPIANTI DI ORGANO

LE BARRIERE DEL TRAPIANTO

Trapianto clinico

Organo trapiantatoEsempi di malattia

Rene

Cuore

Polmone

Fegato

Cornea

Pancreas o isole

Midollo osseo

Intestino tenue

Cute

Insufficienza renale terminale

Insufficienza cardiaca terminale

Ipertensione polmonare/Fibrosi cistica

Cirrosi, cancro

Distrofia, cheratiti

Diabete

Immunodeficienze, leucemie

Cancro

Ustioni

AUTOTRAPIANTO

XENOTRAPIANTOALLOTRAPIANTO

ISOTRAPIANTO

UN PO’ DI STORIA…• Nel 1943 Medawar e Gibson scoprirono che il rigetto tissutale è mediato dalle cellule del sistema immune • Nel 1953 Billingham, Brent e Medawar dimostrarono sperimentalmente che la compresenza di cellule- leucociti di donatore e ricevente determinava l’assenza di rigetto verso i tessuti del ceppo del ricevente ma non verso i tessuti di altri ceppi “sistema HLA”• Nel 1959, Murray effettua il primo trapianto di rene nell’uomo, donato da un fratello (gemello), dopo una Total Body Irradiation (TBI)• Nel corso del 1960 si aggiunsero i primi interventi di fegato (Starzl 1967), cuore (Barnard 1968), midollo osseo (1968) e l’utilizzo di Azatioprina e steroidi • Negli anni ‘70 si arriva alla scoperta ed uso della Ciclosporina A

Permettere la TOLLERANZA SPECIFICA di un organo da parte di

un sistema immune diverso

LE LEGGI DEL TRAPIANTO

MHCa

MHCa

MHCa

MHCa

MHCbMHCb

0

50

0

100

10 200

50

0

100

10 200

50

0

100

10 20

Trapianto di cute in un ricevente SINGENICO

Trapianto di cute in un ricevente ALLOGENICO

Secondo trapianto di cute dallo STESSO

DONATORE

Percentuale di sopravvivenza dei trapianti

MHCa

MHCb non immunizzato

0

50

0

100

10 20

MHCb sensibilizzato contro MHCa

Il trasferimento di cellule T accelera il rigetto da un donatore sensibilizzato a un

ricevente non immunizzato

Giorni dopo il trapianto

Trapianto di cute in un ricevente

SINGENICO

Trapianto di cute in un ricevente ALLOGENICO

Trapianto di cute in un ricevente

INCOMPATIBILE per un antigene MINORE

Giorni dopo il trapianto

MHCa

MHCa

MHCa

MHCa

MHCaMHCb

0

50

0

100

60 1200

50

0

100

60 1200

50

0

100

60 120

Percentuale di sopravvivenza dei trapianti

10

PRESENTAZIONE DEGLI ALLOANTIGENI DEL TRAPIANTO AI LINFOCITI T DEL RICEVENTE

Le APC del ricevente processano proteine e presentano peptidi derivati

dal trapianto

Le APC del donatore migrano verso il linfonodo e stimolano le cellule T

alloreattive del ricevente

ALLORICONOSCIMENTO DIRETTO ALLORICONOSCIMENTO INDIRETTO

I LINFOCITI T E I SUOI COLLABORATORI

EFFETTI SUL TRAPIANTO

Complemento

APC

Th

CD4

CD8

IL-2

INF-γ

IL-2IL-4IL-5

linfotossinaINF-γ

anticorpi

attivazione

citotossicità cellulo-mediata

citotossicità cellulare anticorpo-dipendente

danno litico occlusione vascolare

mediatori dell’infiammazione

cellule trapiantate

I MECCANISMI DELLA TOLLERANZA PERIFERICA

• ANERGIA CLONALE il riconoscimento da parte di linfociti attivati dall’antigene allogenico presentato da APC in assenza di segnale costimolatorio renderà i linfociti incapaci di rispondere a quell’antigene

• ACTIVATION-INDUCED CELL DEATH (AICD) viene iniziato dall’IL2 e richiede l’espressione del recettore Fas-ligand sulle cellule T attivate che successivamente vengono indotte all’apoptosi

• SVILUPPO DI LINFOCITI T, PROGENITORI MIELOIDI O CELLULE DERIVATE DALLO STROMA CON FUNZIONE DI REGOLATORI O SOPPRESSORI i linfociti T regolatori sono capaci di inibizione allo-specifica grazie al rilascio di citochine (TGF-β o IL-10); i progenitori mieloidi CD34 a seconda che esprimano il CD86, funzionano come potenti APC, in gardo di polarizzare i linfociti T e B verso un pattern più o meno immunogenico di risposta verso alloantigeni; cellule derivate dallo stroma del midollo osseo (cheratinociti e cellule endoteliali), mancando di attivitò costimolatoria, potrebbero avere un ruolo indiretto nell’indurre tolleranza nelle cellule T

I TEMPI DEL RIGETTO

TIPO DI RIGETTO TEMPO NECESSARIO CAUSA

Iperacuto minuti-ore anticorpi anti-donatore preformati e complemento

Accellerato giorni riattivazione di linfociti T sensibilizzati

Acuto giorni-settimane attivazione primaria dei linfociti T

Cronico mesi-anni cause poco chiare: anticorpi,

immunocomplessi, reazioni cellulari lente, ricaduta della malattia

LE ALLOREAZIONI NEL RIGETTO DEI TRAPIANTI

midollo osseo

Nel TRAPIANTO di RENE le cellule T del RICEVENTE attaccano l’ORGANO

TRAPIANTATO

RIGETTO DEL TRAPIANTO

Nel TRAPIANTO di MIDOLLO OSSEO le cellule T del TESSUTO TRAPIANTATO attaccano i tessuti del RICEVENTE

MALATTIA DA REAZIONE DEL TRAPIANTO CONTRO

L’OSPITE (GVHD)

PREVENZIONE DEL RIGETTO

TIPIZZAZIONE TISSUTALE

METODO SIEROLOGICO (2-3h)

complemento

HLA-B8

anti HLA-B8

tripan blue

La morte delle cellule conferma che queste

esprimono l’antigene in questione.

REAZIONE LINFOCITARIA MISTA (4-5gg)

3 7

T

4 7

T

b4 4

B

cellula test DR4,7cellula test DR3,7

cellula tipizzante DR4,4

nessun riconoscimento

riconoscimento

Trasformazione e proliferazione

Nessuna reazione

Le cellule DR3,7 riconoscono le cellule tipizzanti come estranee e ciò viene rivelato dalle celle test in fase di trasformazione e proliferazione; al contrario le cellule DR4,7, che presentano la

specificità delle cellule tipizzanti, non riconoscono queste ultime e quindi non reagiscono ad esse.

PREVENZIONE DEL RIGETTO

IMMUNOSOPPRESSIONE CON FARMACI

FARMACI IN GRADO DI INATTIVARE SOLO QUEI CLONI LINFOCITARI CHE SONO SPECIFICI PER GLI ANTIGENI DEL

DONATORE, LASCIANDO INALTERATI GLI ALTRI CLONI

AZATIOPRINA

ASPECIFICA

Diminuisce o abolisce l’attività del sistema immunitario indipendentemente dall’antigene

rendendo il ricevente estremamente vulnerabile alle infezioni.

STEROIDI

CICLOSPORINASopprimono i

macrofagi attivati, diminuiscono la

funzione delle APC e riducono

l’espressione delle molecole MHC

Sopprime la produzione di linfochine da

parte dei linfociti Th

Incorporandosi nel DNA delle

cellule in via di divisione, ne impedisce l’ulteriore

proliferazione

SPECIFICA

TOTAL LYMPHOID IRRADIATION (TLI)I linfociti maturi sono

drasticamente eliminati tramite irradiazione,

mentre il midollo osseo viene protetto e rimane

intatto; questa metodica , seguita da

un’esposizione all’antigene, induce una tolleranza completa ma

risulta pericolosa se utilizzata

abitudinariamente a scopi clinici

DONOR SPECIFIC TRANSFUSION

(DST)Una trasfusione di sangue del donatore somministrata per

via endovenosa nel ricevente, una settimana

prima del trapianto, determina un attecchimento a lungo termine dell’organo (nel 80% dei casi il successo del trapianto è del 95-100%). In alternativa, anticorpi anti-donatore , somministrati al ricevente al momento del

trapianto possono causare un potenziamento passivo della sopravvivenza del trapianto.

UN OSSERVAZIONE SPERIMENTALE…

Razionale: studiare la capacità delle cellule T di indurre tolleranza per sviluppare approcci di possibile applicazione clinica

Il trasferimento di alloantigeni da parte di cellule T può essere usato per indurre tolleranza nei confronti di un trapianto allogenico effettuato in riceventi sottoposti a regimi di condizionamento mieloablativi e non?

•Sopravvivenza di cellule T che esprimono alloantigeni in topi sottoposti a irradiazione

•Sopravvivenza di cellule T che esprimono alloantigeni in topi sottoposti a condizionamento non-mieloablativo

• La tolleranza indotta attraverso il trasferimento di cellule T mature ha evitato il rigetto cronico del trapianto di cuore

• Topi sottoposti a trapianto di cuore che non hanno ricevuto cellule T hanno rigettato il trapianto (infiltrato di cellule T CD3+ e cellule B B220+)

• Il trapianto di cuore in topi riceventi che sono stati sottoposti a trasferimento di cellule T dopo condizionamento mieloablativo non presenta segni di infiltrati cellulari

• Il trapianto di cuore è stato ben accettato anche in topi riceventi sottoposti a trasferimento di cellule T dopo condizionamento non-mieloablativo

• La tolleranza indotta mediante il trasferimento di cellule T mature determina una diminuzione nel siero dei livelli di citochine pro-infiammatorie

La concentrazione di IFN-γ, IL-15, IL-9, IL-1α e IL-1β è significativamente più bassa nel siero di topi che hanno ricevuto cellule T (istogramma bianco) rispetto a quelle delle stesse citochine misurate nel siero di topi che non hanno ricevuto cellule T (istogramma nero)

• Il trasferimento di cellule T mature ha causato la delezione centrale delle cellule T alloreattive

La frequenza di cellule CD4+ e CD8+ esprimenti Vβ3 era significativamente ridotta in topi riceventi cellule T (istogramma bianco) rispetto a topi controllo non riceventi cellule T (istogramma nero).

• Il trasferimento di cellule T mature aumenta la frequenza di cellule T con funzioni regolatorie

Scarsa presenza di infiltrati cellulari nel trapianto di topi sottoposti a condizionamento mieloablativo e scarsa presenza di cellule positive per FoxP3 rispetto ad un abbondante presenza delle stesse cellule osservata nel trapianto di topi sottoposti a condizionamento non-mieloablativo

CONCLUSIONI• Il trasferimento di cellule T mature in topi sottoposti a regimi di condizionamento non-mieloablativi determina uno stato di tolleranza a lungo termine.

• Il trapianto di un organo solido in topi riceventi è stato tollerato indefinitamente.

• L’istologia dell’organo trapiantato non ha mostrato i segni caratteristici del rigetto cronico. • Non sono state osservati aumenti nei livelli sistemici di citochine proinfiammatorie associate allo sviluppo del rigetto cronico come IFN-γ, IL-1α e IL-1β.

IL TRASFERIMENTO DI CELLULE T MATURE INDUCE TOLLERANZA NEI CONFRONTI DI ALLOANTIGENI MHC DI CLASSE I E DI CLASSE II

• Sia gli antigeni di superficie che quelli intracellulari trasportati nel timo dalle cellule T mature sono coinvolti nei fenomeni di selezione negativa, ma solo parzialmente.

• Cellule del donatore Foxp3+ sono più abbondanti rispetto a cellule naive nel sangue periferico dei riceventi.

• Cellule esprimenti Foxp3 si osservano nell’organo trapiantato di topi riceventi il trasferimento di cellule T mature.

NELL’INDUZIONE DELLA TOLLERANZA OLTRE ALLA DELEZIONE CENTRALE GIOCANO UN RUOLO IMPORTANTE ANCHE LA REGOLAZIONE IN PERIFERIA DELLE RISPOSTE MEDIATE DALLE CELLULE T

LE CELLULE T ALLOGENICHE MATURE SONO CAPACI DI INDURRE E MANTENERE LA TOLLERANZA NEI CONFRONTI DEL CUORE TRAPIANTATO

CONCLUSIONI

• Il traguardo della tolleranza immunologica può essere raggiunto non solo tramite farmaci immunosoppressori con lo scopo di ridurre o abolire il rigetto ma soprattutto tramite la manipolazione biologica di cellule e/o molecole capaci di indurre selettivamente uno stato di non responsività antigene specifica.

• Nel trapianto di organi l’obbiettivo da raggiungere deve essere l’attecchimento dell’organo in uno stato di “donor-specific T cell unresponsiveness” mediante la produzione di un microchimerismo donatore-ricevente.

• Nonostante i regimi di pretrattamento, la comparsa del rigetto acuto è un evento clinico quasi ineludibile; tuttavia quasi sempre è dominabile con in normali mezzi terapeutici, permettendo in ogni caso il ritorno ad una situazione di “minimizzazione dell’immunosoppressione” che non interferisce con il raggiungimento e mantenimento di un alto grado di “donor-specific nonreactivity”

• Molte esperienze cliniche hanno confermato, se non la possibilità di lasciare completamente senza immunosoppressione il ricevente, di indurre uno stato di quasi tolleranza con la quale diminuire il pericolo, nel lungo periodo, di effetti tossici.