Thesis Presentation: Influenza del paradigma Fear Conditioning sull’espressione dei fattori di...

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“Influenza del paradigma Fear Conditioning sull’espressione dei fattori di trascrizione Specific AT-rich DNA-binding Protein (SATB) 1 and 2 nell’amigdala di topo.” Tesi di Laurea in Medicina Facoltà di Medicina e Psicologia – Università di Roma “La Sapienza” Angelo D’Ambrosio

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  • DAmbrosio, A. Influenza del paradigma Fear Conditioning sullespressione dei fattori di trascrizione Specific AT-rich DNA-Binding Protein (SATB) 1 and 2 nellamigdala di topo. Tesi di Laurea in Medicina, 2011-2012*

    Un terzo della popolazione europea riporter una patologia psichiatrica nel corso della vita. (Alonso J, Angermeyer MC, Bernert S, et al., 2004)Prevalenza maggiori disturbi psichiatrici:Disturbi dansia: 10.6%Disturbi dellumore: 6.8%Schizofrenia: 0.4%Disturbi della personalit: 13.4%

    La Patologia Psichiatria Molto Diffusa

    Le patologie psichiatriche sono estremamente comuni andando a colpire un terzo della popolazione europea (Wittchen HU, Jacobi F., 2005)Uno studio europeo ha riportato una prevalenza di disturbi d'ansia dell'11% in europa*

    DAmbrosio, A. Influenza del paradigma Fear Conditioning sullespressione dei fattori di trascrizione Specific AT-rich DNA-Binding Protein (SATB) 1 and 2 nellamigdala di topo. Tesi di Laurea in Medicina, 2011-2012*

    VIENE TRATTATO IL SINTOMONON LA CAUSALa Patologia Psichiatria Molto DiffusaLa maggior parte dei farmaci a nostra disposizione agisce sulle sinapsi e in partcolare sul sistema delle monoammine (serotina, noradrenalina, GABA)

    L'approccio farmacologico fin'ora utilizzato, basato sulla regolazione delle monoammine e dei loro recettori ha avuto successi limitati.Si cura il sintomo ma non la causa*

    DAmbrosio, A. Influenza del paradigma Fear Conditioning sullespressione dei fattori di trascrizione Specific AT-rich DNA-Binding Protein (SATB) 1 and 2 nellamigdala di topo. Tesi di Laurea in Medicina, 2011-2012*

    Epigenetica

    Una nuova serie di studi si sta concentrando sull'epigenetica, come meccanismo di regolazione dell'espressione generalizzata del DNA e quindi del fenotipo neuronaleI paradigmi pi noti dell'epigenetica sono la metilazione del DNA e la modifica del grado di compattazione attraverso il controllo del livello di acetilazione degli istoni da parte dei fattori nucleari HDAC e HATStudi sugli inibitori degli HDAC hanno avuto effetti positivi nei distubi dell'umore.Ma questi fattori hanno un effetto generalizzato sulla trascrizione genica.Abbiamo quindi di capire meglio come funziona il fenomeno della regolazione epigenetica per trovare target farmacologici pi specifici.*

    DAmbrosio, A. Influenza del paradigma Fear Conditioning sullespressione dei fattori di trascrizione Specific AT-rich DNA-Binding Protein (SATB) 1 and 2 nellamigdala di topo. Tesi di Laurea in Medicina, 2011-2012*

    Epigenetica

    Una nuova serie di studi si sta concentrando sull'epigenetica, come meccanismo di regolazione dell'espressione generalizzata del DNA e quindi del fenotipo neuronaleI paradigmi pi noti dell'epigenetica sono la metilazione del DNA e la modifica del grado di compattazione attraverso il controllo del livello di acetilazione degli istoni da parte dei fattori nucleari HDAC e HATStudi sugli inibitori degli HDAC hanno avuto effetti positivi nei distubi dell'umore.Ma questi fattori hanno un effetto generalizzato sulla trascrizione genica.Abbiamo quindi di capire meglio come funziona il fenomeno della regolazione epigenetica per trovare target farmacologici pi specifici.*

    DAmbrosio, A. Influenza del paradigma Fear Conditioning sullespressione dei fattori di trascrizione Specific AT-rich DNA-Binding Protein (SATB) 1 and 2 nellamigdala di topo. Tesi di Laurea in Medicina, 2011-2012*

    SATB1 e SATB2 e le MARLa cromatina organizzata in anse.

    Il nostro studio si concentrato su una famiglia di fattori di regolazione della trascrizione di recente scoperta. SATB1 e SATB2La cromatina nel nucleo in interfase organizzata in anse che regolano l'accessibilit di tali regioni ai macchinari nucleare.Alla formazione di queste anse contribuiscono le MAR (matrix attachment regions), necessare sia alla architettura stabile delle anse, che alla loro modifica influenzando la trascrizione genica.SATB1 e due agiscono legandosi a queste anse fungendo da punto d'attracco per una serie di influenzatori pi o meno indiretti della trascriozione come le HDACH.*

    DAmbrosio, A. Influenza del paradigma Fear Conditioning sullespressione dei fattori di trascrizione Specific AT-rich DNA-Binding Protein (SATB) 1 and 2 nellamigdala di topo. Tesi di Laurea in Medicina, 2011-2012*

    SATB1 e SATB2 e le MARLe Matrix Attachment Regions (MARs) sono dei domini che permettono lattracco del DNA alla matrice nucleare e la formazione e la regolazione delle anse della cromatina.

    Il nostro studio si concentrato su una famiglia di fattori di regolazione della trascrizione di recente scoperta. SATB1 e SATB2La cromatina nel nucleo in interfase organizzata in anse che regolano l'accessibilit di tali regioni ai macchinari nucleare.Alla formazione di queste anse contribuiscono le MAR (matrix attachment regions), necessare sia alla architettura stabile delle anse, che alla loro modifica influenzando la trascrizione genica.SATB1 e due agiscono legandosi a queste anse fungendo da punto d'attracco per una serie di influenzatori pi o meno indiretti della trascriozione come le HDACH.*

    DAmbrosio, A. Influenza del paradigma Fear Conditioning sullespressione dei fattori di trascrizione Specific AT-rich DNA-Binding Protein (SATB) 1 and 2 nellamigdala di topo. Tesi di Laurea in Medicina, 2011-2012*

    SATB1 e SATB2 e le MARI fattori SATB si legano alla base delle anse e fungono da landing point per una molteplicit di effettori, fra i quali anche HDAC e HAT.

    Il nostro studio si concentrato su una famiglia di fattori di regolazione della trascrizione di recente scoperta. SATB1 e SATB2La cromatina nel nucleo in interfase organizzata in anse che regolano l'accessibilit di tali regioni ai macchinari nucleare.Alla formazione di queste anse contribuiscono le MAR (matrix attachment regions), necessare sia alla architettura stabile delle anse, che alla loro modifica influenzando la trascrizione genica.SATB1 e due agiscono legandosi a queste anse fungendo da punto d'attracco per una serie di influenzatori pi o meno indiretti della trascriozione come le HDACH.*

    DAmbrosio, A. Influenza del paradigma Fear Conditioning sullespressione dei fattori di trascrizione Specific AT-rich DNA-Binding Protein (SATB) 1 and 2 nellamigdala di topo. Tesi di Laurea in Medicina, 2011-2012*

    SATB1 e SATB2I fattori SATB sono necessari per lo sviluppo di molte linee cellulari e sono coinvolti in alcune patologie.SATB1Switch da emoglobina fetale ad adultaDifferenziazione CD4+CD8+PatologiaDeficit causa ritardo mentaleFenotipo metastatico K mammellaNel Sistema NervosoSviluppo IEGCorretta formazione precoce delle spine dendriticheSATB2Necessario lyonizzazione chromosoma XSviluppo osseoAttivazione IgM in cellule BPatologiaDeformazioni crani-facciali, palato schisi, ritardo mentale,Screening K Colon RettoNel Sistema NervosoFenotipo cortico-corticale neuroni cortecciaSwtich colinergico delle fibre sudoromotorie del simpatico

    Sono stati studiati i ruoli di SATB soprattutto nello sviluppoSATB1 faSATB2 faEntrabi agiscono nel sistema Nervoso. SATB1 regola la sequenza dell'espressione di geni necessari per la plasticit sinaptica e la densita di sinapsi. SATB2 necessario per la differenziazione dei neuroni corticali da cortico-spinali a cortico-corticali.*

    DAmbrosio, A. Influenza del paradigma Fear Conditioning sullespressione dei fattori di trascrizione Specific AT-rich DNA-Binding Protein (SATB) 1 and 2 nellamigdala di topo. Tesi di Laurea in Medicina, 2011-2012*

    SATB1 e SATB2,RiassumendoI fattori SATB regolano lespressione di molti geni permettendo la modifica della cromatina. Fungono quindi da interruttori generali del fenotipo cellulare.Le informazioni sulla loro funzione fa intuire un possibile ruolo nelle funzioni cognitive superiori e quindi anche nella loro patologia.Il nostro studio un primo approccio alla definizione di SATB2 nei processi di apprendimento e affettivi.A tal fine abbiamo indagato leffetto del modello del Fear Conditioning sullespressione nellamigdala di topo.

    Regolatori globali dell'espressione genica e quindi probabilmente coinvolti nelle funzioni cognitive superiori e nelle loro alterazioni patologiche*

    DAmbrosio, A. Influenza del paradigma Fear Conditioning sullespressione dei fattori di trascrizione Specific AT-rich DNA-Binding Protein (SATB) 1 and 2 nellamigdala di topo. Tesi di Laurea in Medicina, 2011-2012*

    Fear ConditioningE un paradigma di memoria associativa.Presentando pi volte uno stimolo emotivamente neutro, come un suono, con uno rilevante, come il dolore causato da una scossa elettrica, alla fine lo stimolo neutro sar in grado autonomamente di provare risposte associate a quello rilevante.La risposta che noi andiamo a misurare il freezing.

    Noi abbiamo indagato come SATB vengano inluenzati nel topo dal FC, un paradigma di memoria associativa.il paradigma dice che associando pi volte un stimolo neutro (un suono, o il contesto stesso) con uno emozionalmente rilevante, lo stimolo neutro sar in grado di provocare le risposte associate allo stimolo avversivoPer valutare la creazione delle memorie associative registriamo il freezing, ovvero il tempo di assenza di qualunque movimento nel topo a parte il respiro.*

    DAmbrosio, A. Influenza del paradigma Fear Conditioning sullespressione dei fattori di trascrizione Specific AT-rich DNA-Binding Protein (SATB) 1 and 2 nellamigdala di topo. Tesi di Laurea in Medicina, 2011-2012*

    Amigdala

    Noi abbiamo indagato l'influenza che questi due fattori possono avere nell'amigdala.L'amigdala il centro nevralgico di analisi e memorizzazione della paura e dell'ansia.Nuclei e connessioni*

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    Protocolli Di Fear Conditioning

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    Protocollo Di Fear Conditioning

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    MetodiTopi C57/Bl6n.Perfusione tramite infusione transcardica di acido picrico e paraformaldeide.Immunostaining con immuno perossidasi e immuno fluorescenza.Anticorpi utilizzati per le proteine SAT:Rabbit policlonale anti-SATB1 (rRbSATB1) [1:1000] da Abcam (ab49061)Mouse monoclonale anti-SATB2 (mMsSATB2) [1:1500] da Abcam (ab51502)Rabbit monoclonale anti-SATB12 (mRbSATB2) [1:500] da Abcam (ab92446)

    DAmbrosio, A. Influenza del paradigma Fear Conditioning sullespressione dei fattori di trascrizione Specific AT-rich DNA-Binding Protein (SATB) 1 and 2 nellamigdala di topo. Tesi di Laurea in Medicina, 2011-2012*

    Immunoreativit

    I 3 anticorpi mostrano un segnale differente in amigdala. dal confronto con la letteratura possiamo dire che pRB e mRB sono specifici. Quindi mMs specifico per entrambi.Noi questo lo abbiamo scoperto dopo e abbiamo eseguito i nostri esperimentiMa il fatto che il segnale di SATB2 in amigdala trascurabile rispetto a SATB1, possiamo attribuire i risultati a SATB1*

    DAmbrosio, A. Influenza del paradigma Fear Conditioning sullespressione dei fattori di trascrizione Specific AT-rich DNA-Binding Protein (SATB) 1 and 2 nellamigdala di topo. Tesi di Laurea in Medicina, 2011-2012*

    ImmunoreativitAnti-FOXP2 = rosso mMs-SATB2 = verde

    Mancanza di co-localizzazione tra FOXP2 e SATB21/ nel complesso basolaterale dellamigdala

    DAmbrosio, A. Influenza del paradigma Fear Conditioning sullespressione dei fattori di trascrizione Specific AT-rich DNA-Binding Protein (SATB) 1 and 2 nellamigdala di topo. Tesi di Laurea in Medicina, 2011-2012*

    ImmunoreativitAnti-GAD = rosso mMs-SATB2 = verdeAssenza di espressione del SATB-1/2 nei neuroni GABAergici inibitori nellamigdala

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    Training di Fear ConditioningI dati mostrano lefficacia del modello, con un aumento significativo del freezingFA: fear acquisition

    FC: fear conditioning

    S/L: Short/Long

    Proponiamo per brevit i dati di un solo esperimento, ma esperimenti simili da noi fatti danno risultati simili.Analizzando i dati del comportamento possiamo vedere come il FC sia un paradigma efficacia nella creazione di ansia e paura associativa sia per gli stimoli sensoriali, che per il contesto.*

    DAmbrosio, A. Influenza del paradigma Fear Conditioning sullespressione dei fattori di trascrizione Specific AT-rich DNA-Binding Protein (SATB) 1 and 2 nellamigdala di topo. Tesi di Laurea in Medicina, 2011-2012*

    Quantificazione segnale

    Costante diminuzione a 24h e a 72h del segnale di SATB1 nellamigdala basolaterale.

    Mostriamo quindi i risultati sulla quantificazione cellulare di SATB1, fatta tramite l'anticorpo doppiamente specifico su citato.possiamo vedere sia dalle immagini che dal grafico come il segnale di SATB1 cali in BLA passando dai controlli, ai topi sacrificatii 24h dopo training a quelli sacrificati 72hquesto cambiamento e il trend decrescente sono statisticamente significativi*

    DAmbrosio, A. Influenza del paradigma Fear Conditioning sullespressione dei fattori di trascrizione Specific AT-rich DNA-Binding Protein (SATB) 1 and 2 nellamigdala di topo. Tesi di Laurea in Medicina, 2011-2012*

    Quantificazione segnale

    Il segnale di SATB2 in amigdala basolaterale difficilmente apprezzabile e mostra una variazione a campana, sebbene non significativa.

    SATB2 mostra invece risultati pi dubbi.abbiamo un comportamento a campana invertita, che indica una prima sotto regolazione di SATB2 che tende a regredire a livelli normali.Sfortunatamente non significativi*

    DAmbrosio, A. Influenza del paradigma Fear Conditioning sullespressione dei fattori di trascrizione Specific AT-rich DNA-Binding Protein (SATB) 1 and 2 nellamigdala di topo. Tesi di Laurea in Medicina, 2011-2012*

    InterpretazioniDiminuzione di SATB1 nei topi trattatiDiminuzione di SATB1 potrebbe impedire complessamento HDAC con cromatina, favorendo la trascrizione genica necessaria per plasticit sinapticaSATB1 e SATB2 potrebbero interagire positivamente o negativamente.Impossibile valutare effetti di modifiche post-trascrizionali su SATB1 e SATB2.In futuro sar necessario sviluppare dei knock-out condizionali per valutare gli effetti del deficit dei fattori SATB sullapprendimento di ansia e paura nel Fear Conditioning.

    Questi risultati, soprattutto per satb1 possono essere interpretati con il ruolo che questo ha sul compattamento della cromatina tramite HDAC.Infatti SATB1 funge da punto di attracco per questo fattore permettendogli di deacitilare gli istoni, aumentando cos il compattamento della cromatina e quindi diminuendo la trascrizione genica.di converso una diminuizione di SATB1 potrebbe accompagnarsi ad una regolazione positiva di certi geni, necessaria per la plasticit sinaptica.*

    DAmbrosio, A. Influenza del paradigma Fear Conditioning sullespressione dei fattori di trascrizione Specific AT-rich DNA-Binding Protein (SATB) 1 and 2 nellamigdala di topo. Tesi di Laurea in Medicina, 2011-2012*

    Epigenetica?Un meccanismo complesso per un sistema complesso

    Vediamo quindi come l'epigenetica aggiunge ennesimi livelli di complessit al vecchio paradigma un gene una proteina. Complessit che si manifesta chiaramente nella complessit del nostro sistema nervoso, nella fisiologia e nella patologia.Comprendere tali sistemi ci permetter di affinare ancora ulteriormente le nostre armi terapeutiche per riportare nei ranghi quegli interruttori fenotipici andati fuori asse.*

  • GRAZIE!

    Le patologie psichiatriche sono estremamente comuni andando a colpire un terzo della popolazione europea (Wittchen HU, Jacobi F., 2005)Uno studio europeo ha riportato una prevalenza di disturbi d'ansia dell'11% in europa*L'approccio farmacologico fin'ora utilizzato, basato sulla regolazione delle monoammine e dei loro recettori ha avuto successi limitati.Si cura il sintomo ma non la causa*Una nuova serie di studi si sta concentrando sull'epigenetica, come meccanismo di regolazione dell'espressione generalizzata del DNA e quindi del fenotipo neuronaleI paradigmi pi noti dell'epigenetica sono la metilazione del DNA e la modifica del grado di compattazione attraverso il controllo del livello di acetilazione degli istoni da parte dei fattori nucleari HDAC e HATStudi sugli inibitori degli HDAC hanno avuto effetti positivi nei distubi dell'umore.Ma questi fattori hanno un effetto generalizzato sulla trascrizione genica.Abbiamo quindi di capire meglio come funziona il fenomeno della regolazione epigenetica per trovare target farmacologici pi specifici.*Una nuova serie di studi si sta concentrando sull'epigenetica, come meccanismo di regolazione dell'espressione generalizzata del DNA e quindi del fenotipo neuronaleI paradigmi pi noti dell'epigenetica sono la metilazione del DNA e la modifica del grado di compattazione attraverso il controllo del livello di acetilazione degli istoni da parte dei fattori nucleari HDAC e HATStudi sugli inibitori degli HDAC hanno avuto effetti positivi nei distubi dell'umore.Ma questi fattori hanno un effetto generalizzato sulla trascrizione genica.Abbiamo quindi di capire meglio come funziona il fenomeno della regolazione epigenetica per trovare target farmacologici pi specifici.*Il nostro studio si concentrato su una famiglia di fattori di regolazione della trascrizione di recente scoperta. SATB1 e SATB2La cromatina nel nucleo in interfase organizzata in anse che regolano l'accessibilit di tali regioni ai macchinari nucleare.Alla formazione di queste anse contribuiscono le MAR (matrix attachment regions), necessare sia alla architettura stabile delle anse, che alla loro modifica influenzando la trascrizione genica.SATB1 e due agiscono legandosi a queste anse fungendo da punto d'attracco per una serie di influenzatori pi o meno indiretti della trascriozione come le HDACH.*Il nostro studio si concentrato su una famiglia di fattori di regolazione della trascrizione di recente scoperta. SATB1 e SATB2La cromatina nel nucleo in interfase organizzata in anse che regolano l'accessibilit di tali regioni ai macchinari nucleare.Alla formazione di queste anse contribuiscono le MAR (matrix attachment regions), necessare sia alla architettura stabile delle anse, che alla loro modifica influenzando la trascrizione genica.SATB1 e due agiscono legandosi a queste anse fungendo da punto d'attracco per una serie di influenzatori pi o meno indiretti della trascriozione come le HDACH.*Il nostro studio si concentrato su una famiglia di fattori di regolazione della trascrizione di recente scoperta. SATB1 e SATB2La cromatina nel nucleo in interfase organizzata in anse che regolano l'accessibilit di tali regioni ai macchinari nucleare.Alla formazione di queste anse contribuiscono le MAR (matrix attachment regions), necessare sia alla architettura stabile delle anse, che alla loro modifica influenzando la trascrizione genica.SATB1 e due agiscono legandosi a queste anse fungendo da punto d'attracco per una serie di influenzatori pi o meno indiretti della trascriozione come le HDACH.*Sono stati studiati i ruoli di SATB soprattutto nello sviluppoSATB1 faSATB2 faEntrabi agiscono nel sistema Nervoso. SATB1 regola la sequenza dell'espressione di geni necessari per la plasticit sinaptica e la densita di sinapsi. SATB2 necessario per la differenziazione dei neuroni corticali da cortico-spinali a cortico-corticali.*Regolatori globali dell'espressione genica e quindi probabilmente coinvolti nelle funzioni cognitive superiori e nelle loro alterazioni patologiche*Noi abbiamo indagato come SATB vengano inluenzati nel topo dal FC, un paradigma di memoria associativa.il paradigma dice che associando pi volte un stimolo neutro (un suono, o il contesto stesso) con uno emozionalmente rilevante, lo stimolo neutro sar in grado di provocare le risposte associate allo stimolo avversivoPer valutare la creazione delle memorie associative registriamo il freezing, ovvero il tempo di assenza di qualunque movimento nel topo a parte il respiro.*Noi abbiamo indagato l'influenza che questi due fattori possono avere nell'amigdala.L'amigdala il centro nevralgico di analisi e memorizzazione della paura e dell'ansia.Nuclei e connessioni*I 3 anticorpi mostrano un segnale differente in amigdala. dal confronto con la letteratura possiamo dire che pRB e mRB sono specifici. Quindi mMs specifico per entrambi.Noi questo lo abbiamo scoperto dopo e abbiamo eseguito i nostri esperimentiMa il fatto che il segnale di SATB2 in amigdala trascurabile rispetto a SATB1, possiamo attribuire i risultati a SATB1*Proponiamo per brevit i dati di un solo esperimento, ma esperimenti simili da noi fatti danno risultati simili.Analizzando i dati del comportamento possiamo vedere come il FC sia un paradigma efficacia nella creazione di ansia e paura associativa sia per gli stimoli sensoriali, che per il contesto.*Mostriamo quindi i risultati sulla quantificazione cellulare di SATB1, fatta tramite l'anticorpo doppiamente specifico su citato.possiamo vedere sia dalle immagini che dal grafico come il segnale di SATB1 cali in BLA passando dai controlli, ai topi sacrificatii 24h dopo training a quelli sacrificati 72hquesto cambiamento e il trend decrescente sono statisticamente significativi*SATB2 mostra invece risultati pi dubbi.abbiamo un comportamento a campana invertita, che indica una prima sotto regolazione di SATB2 che tende a regredire a livelli normali.Sfortunatamente non significativi*Questi risultati, soprattutto per satb1 possono essere interpretati con il ruolo che questo ha sul compattamento della cromatina tramite HDAC.Infatti SATB1 funge da punto di attracco per questo fattore permettendogli di deacitilare gli istoni, aumentando cos il compattamento della cromatina e quindi diminuendo la trascrizione genica.di converso una diminuizione di SATB1 potrebbe accompagnarsi ad una regolazione positiva di certi geni, necessaria per la plasticit sinaptica.*Vediamo quindi come l'epigenetica aggiunge ennesimi livelli di complessit al vecchio paradigma un gene una proteina. Complessit che si manifesta chiaramente nella complessit del nostro sistema nervoso, nella fisiologia e nella patologia.Comprendere tali sistemi ci permetter di affinare ancora ulteriormente le nostre armi terapeutiche per riportare nei ranghi quegli interruttori fenotipici andati fuori asse.*