Teratoma del testicolo di un topo adulto appartenente al ceppo 129.Si possono osservare molti tipi di tessuti (si veda anche il disegno nel-

la pagina a fronte) ben differenziati, ma disorganizzati, i quali deri-vano tutti dalla differenziazione delle cellule di carcinoma embrionale.

Teratoma spontaneo che si è sviluppato all'interno di un tubulo semini-fero di un testicolo in un feto di topo di 16 giorni. Si può osservare unteratoma a uno stadio precoce (struttura ovale), composto da cellule dicarcinoma embrionale, in mezzo alle altre cellule germinali normali.

Un teratoma sperimentale (struttura ovale) può essere facilmente in-dotto trapiantando le creste genitali (i precursori embrionali dellegonadi, che contengono le cellule germinali) di un feto di topo maschiodi 12 giorni sul testicolo di un topo adulto dello stesso ceppo genetico.

TESSUTONERVOSO

TESSUTOADIPOSO

Questa ricostruzione schematica della micrototografia in alto nella pagina a fronte mostra lavarietà di tessuti presenti in un teratoma del testicolo. Il tumore contiene tessuti che normal-mente derivano da tutti e tre i foglietti embrionali: cartilagine, osso, tessuto adiposo e fibre mu-scolari dal mesoderma; tessuto nervoso dall'ectoderma ed epitelio ghiandolare dall'endoderma.

u

n teratorna è un tumore formatonon solo da cellule neoplastiche(come altri tumori) ma anche

da molti tipi di cellule differenziate e datessuti a vari livelli di maturazione. Unteratoma tipico può includere, per esem-pio, cellule nervose, muscolari, sangui-gne, epiteliali, ghiandolari ecc. Le cellulepossono essere aggregate a formare verefibre muscolari, tessuti ghiandolari o ner-vosi, cartilagini od ossa; immersi nellamassa possono trovarsi anche peli, capellio denti. Il termine teratoma deriva da unaparola greca che significa mostruosità;tuttavia le medesime proprietà che fannosembrare mostruosi i teratomi li rendonointeressanti dal punto di vista biologico ela possibilità di disporre di teratomi indot-ti sperimentalmente nel topo ha fornitoun valido strumento di indagine in pato-logia, immunologia, genetica e biologiadello sviluppo.

Le cellule da cui traggono origine i tera-tomi assomigliano a cellule embrionaliindifferenziate riguardo alla struttura,alla biochimica e alle proteine antigeni-che presenti sulla loro superficie. Tuttaviale cellule da cui derivano i teratomi sonopotenzialmente maligne e sono chiamatecellule di carcinoma embrionale; essesono responsabili della crescita incontrol-lata di questi tumori. Quando una celluladi carcinoma embrionale si divide puòdare origine a due nuove cellule embrio-nali, a una cellula embrionale e a unacellula differenziata normale o a due cel-lule differenziate del tipo più vario. Fin-ché i tumori contengono cellule di carci-noma embrionale continuano a crescere:tali tumori sono maligni e sono indicaticome teratocarcinomi. Quando tutte lecellule embrionali si sono differenziate invari tipi di tessuti normali, i tumori noncrescono più: essi sono benigni e sonoindicati semplicemente come teratomi.

Furono riscontrati teratomi nelle ovaiee nei testicoli di esseri umani già nel XIXsecolo, ma fino a poco tempo fa la loroorigine rimaneva un mistero; la loro com-posizione eterogenea fece erroneamenteritenere che essi derivassero in qualchemodo dall'inclusione in un feto di porzio-ni di un altro feto abortito. Le nostre ri-

cerche hanno stabilito che i teratomi sioriginano da cellule germinali: dalle cellu-le uovo nella femmina e dai precursoridegli spermazotoi nel maschio. Per cosìdire, un teratoma può servire come mo-dello di un embrione di mammifero. Nellenostre ricerche sfruttiamo questa somi-glianza per studiare un problema centraledello sviluppo: in che modo una singolacellula, l'uovo fecondato, si differenzia eforma i diversi tipi cellulari e i tessuti del-l'organismo?

Dato che le cellule di carcinoma em-brionale sono maligne e ciononostantedanno origine a tessuti normali, i teratomici hanno anche insegnato qualcosa sullanatura della trasformazione neoplastica.Abbiamo ottenuto alcune delle informa-zioni più interessanti da esperimenti in cuiabbiamo prodotto chimere di topi (mo-saici genetici) alcuni tessuti delle qualiderivavano da una cellula di carcinomaembrionale. Con ciò abbiamo dimostratoche queste cellule tumorali maligne pos-

sono perdere le loro proprietà neoplasti-che in condizioni ambientali appropriate.

T 'induzione di teratomi in ratti e pulciniera stata descritta già dal 1907 dal

patologo Max Askanazy dell'Universitàdi Ginevra, ma la manipolazione speri-mentale di teratomi risale solo al 1953,quando uno di noi (Stevens) notò perprimo un teratoma del testicolo in un topodel ceppo 129, una delle molte linee pureche venivano allevate nel Jackson Labo-ratory a Bar Harbor, nel Maine. L'esamedi un grande numero di topi maschi dellostesso ceppo rivelò che circa 1'1 per centodi essi sviluppava teratomi spontanei. Itumori erano riconoscibili una settimanadopo la nascita, in uno stadio caratteristi-co per la presenza di cellule differenziatetipiche di un teratoma maturo. Chiara-mente i topi del ceppo 129 erano in qual-che modo predisposti alla formazione diteratomi. Attraverso un programma diselezione fu possibile generare un sotto-

Teratomi e chimereI teratomi sono tumori composti da un ammasso di cellule differenziatee tessuti. Le cellule maligne da cui essi originano possono svilupparsinormalmente nell'embrione dando origine a chimere o mosaici genetici

di Karl Illmensee e Leroy C. Stevens

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66 67

ceppo in cui circa il 30 per cento dei ma-schi sviluppava teratomi. Questo resepossibile cercare la risposta a domandecome : quando appaiono inizialmente iteratomi e da che tipo di cellule si origina-no? Quali fattori genetici e ambientali in-fluenzano la loro formazione?

I teratomi potevano essere identificatinei feti del nostro sottoceppo dal 15°giorno di gestazione. I tumori erano com-posti da gruppi di cellule non differenzia-te simili a quelle di un normale feto di 5giorni. Tutti i teratomi dei feti di 15 giornisi trovavano tra le cellule germinali pri-mordiali nei tubuli seminiferi del testico-lo. Questi tubuli sono formati da celluledel Sertoli e contengono solo cellule ger-minali primordiali. Dato che i tumori era-no situati entro i tubuli e dato che le lorocellule avevano la struttura e persino l'ul-trastruttura delle cellule germinali, cisembrò molto probabile che la cellula diorigine di un teratoma fosse una cellulagerminale primordiale.

La somiglianza con un giovane em-brione persisteva per un certo periododurante lo sviluppo del teratoma. Nei topineonati i teratomi contenevano celluledifferenziate che corrispondevano ai 3foglietti embrionali dello sviluppo norma-le: ectoderma, endoderma e mesoderma.Erano presenti due tipi di epitelio: unosomigliava all'ectoderma di un giovaneembrione e si sviluppava poi, negli stadipiù avanzati, in tessuti epiteliali o nervosi;l'altro era simile alla faringe embrionale esi sviluppava in tessuti respiratori o delsistema digerente. Tra i tessuti epiteliaric'erano cellule del mesoderma che for-mavano poi cartilagini, muscoli od ossa.

Le dimensioni relative dei teratomi neitopi neonati e nei vari stadi di sviluppoembrionale a partire dal 15° giorno face-vano pensare che i tumori si originasseroal 12° giorno. Il passo successivo nel ten-tativo di comprendere l'insorgenza deiteratomi consistette quindi nell'asporta-zione delle creste genitali (le strutturefetali da cui si sviluppano i testicoli o gliovari) da feti del ceppo 129 e di parecchiealtre linee pure al 12° giorno di sviluppo enel loro trapianto su reni, fegati e testicolidi adulti. L'obiettivo era di scoprire se lecreste genitali, che contengono i precur-sori delle cellule germinali, avrebberoformato testicoli con teratomi e se la loca-lizzazione specifica del trapianto potesseinfluenzare la differenziazione dei tessutiall'interno di tali teratomi.

Quando le creste genitali maschili fu-rono trapiantate sul rene o sul fegato die-dero origine a testicoli in cui l'incidenza diteratomi era quella usuale per il ceppo129. Quando le creste genitali furono tra-piantate sui testicoli, d'altra parte, circa il70 per cento di esse formarono teratomi.Quando furono trapiantate creste genitalidi feti al 13° giorno o successivi, si notòche l'incidenza dei teratomi indotti spe-rimentalmente diminuiva drasticamentecon l'aumento dell'età del feto. In altreparole, dopo il 13° giorno di gestazione lecellule attraversano uno stadio di matura-zione che impedisce la formazione deiteratomi.

Teratoma dell'ov ano originato per partenogenesi in un topo femminadel ceppo LT. Benché non sia stato fecondato, un uovo si è divisospontaneamente nell'ovario (in alto a sinistra) e procede nello sviluppo

fino allo stadio di morula (in alto a destra) e di blastocisti (al centro, asinistra). Poi esso si disorganizza (al centro, a destra) e successivamentesi trasforma in un teratoma (in basso) contenente tessuti ben differenziati.

La varietà di tessuti presente in un teratoma dell'ovario è dimostrata in questo disegno schematicodella microfotografia in basso nella pagina a fronte. Il tumore contiene un dente, dell'osso, tessutoconnettivo ed epitelio ghiandolare, tutti derivanti dalle cellule maligne di carcinoma embrionale.

La possibilità di indurre sperimental-mente teratomi con una frequenza moltosuperiore a quella spontanea aprì la stra-da a numerose ricerche su questi tumori ein modo particolare rese possibile unnuovo metodo d'indagine per individuarela cellula di origine. I topi omozigoti peruna mutazione chiamata Steel (cioè topiin cui due cromosomi omologhi portanoentrambi il gene mutato) mancano di cel-lule germinali e sono sterili. Introducem-mo la mutazione nel sottoceppo con altaincidenza di teratomi del ceppo 129 e tra-piantammo le creste genitali di feti al 12°giorno sui testicoli di topi adulti. Alcunidei feti erano omozigoti per Steel e alcuniportavano un solo gene Steel. (I topi orno-

zigoti per Steel hanno il mantello biancomentre i loro fratelli non omozigoti hannoil mantello nero. In questo modo poteva-mo identificare i feti omozigoti trapian-tando sui testicoli anche un po' di tessutocutaneo e andando a vedere più tardi ilcolore che esso assumeva.)

Le creste genitali dei topi non omozigo-ti si svilupparono per il 75 per cento intesticoli con teratomi, più o meno l'inci-denza normale dei teratomi sperimentali.In marcato contrasto con ciò, tutte le cre-ste genitali dei loro fratelli omozigoti perSteel si svilupparono in testicoli senza te-ratomi. Le creste genitali normali conte-nevano cellule germinali primordiali;quelle dei topi omozigoti no. L'esperi-

I corpi embrioidi si originano da cellule di carcinoma embrionale iniettate nel peritoneo (cavitàaddominale) di topi adulti. Questi corpi sono composti di un gruppo di cellule di carcinomaembrionale circondate da endoderma primitivo e assomigliano in certa misura a giovani embrioni.

TESSUTO CONNETTIVO

EPITELIO

DENTE

1 teratomi sperimentali vengono indotti trapiantando un giovane embrio-ne (a sinistra) o la cresta genitale (in colore) di un feto (a destra) in un sito

extrauterino di un topo adulto. Un embrione di 6 giorni o una cresta di11-13 giorni hanno la massima probabilità di produrre un teratoma.

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mento perciò dimostrò ciò che le osserva-zioni precedenti avevano suggerito: i te -ratomi del testicolo si originano da cellulegerminali primordiali che, per qualcheragione ancora sconosciuta, si trasforma-no in cellule neoplastiche.

I ad somiglianza tra i teratomi e i giovani embrioni suggerì un altro esperimen-to, in cui trapiantammo giovani embrionisui testicoli o sui reni di ospiti adulti.Quando un embrione al 6° giorno di ge-stazione viene trapiantato in una di que-ste localizzazioni extrauterine, continua asvilupparsi, ma in maniera disorganizza-ta: le cellule embrionali proliferano e sidifferenziano in quasi tutti i tipi di tessutimaturi. Dopo un mese, circa metà deitrapianti riusciti assomigliano a teratomicomposti di vari tessuti adulti ben diffe-renziati. L'altra metà forma tipici terato-carcinomi che non contengono solo cellu-le differenziate, ma anche cellule embrio-nali non differenziate simili alle celluleche danno origine ai teratocarcinomispontanei.

I teratomi derivati da embrioni sonosimili a quelli dell'ovario e del testicoloper ogni loro caratteristica osservabile,sebbene siano originati non dalle cellulegerminali ma dalle cellule dell'ectodermadegli embrioni. (Quando si trapiantanocellule embrionali non ectodermiche,queste non formano teratomi.) Eviden-temente le cellule ectodermiche embrio-nali fino al 6° giorno di gestazione sono ingrado di dare origine a molti tipi di cellulee tessuti, inclusi quelli che derivano nor-malmente dall'endoderma e dal meso-derma oltre che dall'ectoderma, e forse

(benché non sia provato) anche ai precur-sori delle cellule germinali.

La fonte principale del materiale biolo-gico per gli studi sui teratomi è costituitadal teratocarcinoma trapiantabile. Si tra-pianta un teratoma sotto la pelle di unaltro topo istocompatibile con l'ospiteoriginario. Se il teratoma è maligno, cre-sce; dopo tre settimane si trapianta partedel materiale tumorale su un altro topoistocompatibile. (Se il tumore non venissetrapiantato, continuerebbe a crescere ealla fine ucciderebbe il proprio ospite.) Ilprocedimento va ripetuto ogni tre setti-mane. Alcuni teratocarcinomi trapianta-bili sono stati mantenuti in coltura in que-sto modo per molti anni. Le cellule capo-stipite maligne di alcuni di essi rimangonopluripotenti (capaci di differenziarsi inun'ampia varietà di tessuti diversi); in al-tri casi il potenziale di sviluppo delle cellu-le capostipite diventa limitato dopo alcu-ne generazioni di trapianti, così che lecellule si differenziano in un numero ri-stretto di tessuti o persino in uno solo diessi, per esempio tessuto nervoso, o mu-scolo scheletrico, o endoderma.

Quando le cellule di alcuni tumori tra-piantabili vengono iniettate nella cavitàperitoneale di un topo, stimolano le cellu-le che tappezzano il peritoneo a produrreun accumulo di liquido, o ascite. Le cellu-le tumorali sospese nel liquido continua-no a proliferare come teratocarcinomiascitici, che tendono a formare piccolestrutture molto simili a embrioni di toponormali di 4 o 5 giorni: un gruppo dicellule simili all'ectoderma primitivo cir-condate da un singolo strato di celluleanaloghe all'endoderma primario di un

giovane embrione. Tali strutture venneroosservate la prima volta nel 1940 dal pa-tologo francese Alfred Peyron in un tera-torna del testicolo di un uomo. Egli lechiamò «corpi embrioidi» e fu così colpitodalla loro somiglianza con embrioni nor-mali che affermò di aver scoperto unacollezione di giovani embrioni umani(malgrado la loro strana localizzazione).

Nel fluido intraperitoneale i corpi em-brioidi di topo crescono e poi si dividono aformare due nuovi corpi i quali possonoessere ritrapiantati e coltivati in questomodo per molti anni. Se un corpo em-briode viene trapiantato in una dellenumerose possibili localizzazioni nel cor-po di un topo adulto, cresce e forma untumore solido formato da molti tipi ditessuti differenziati e da cellule non diffe-renziate di carcinoma embrionale. Que-sto significa che le cellule capostipite deicorpi embrioidi sono capaci di conservarela loro pluripotenza per molti anni sebbe-ne non la esprimano. Dato che possonoessere facilmente identificati e manipola-ti, i corpi embrioidi sono diventati unostrumento di primaria importanza nellostudio del differenziamento.

Nel 1964 Lewis J. Kleinsmith e G. Bar-ry Pierce dell'Università del Michi-

gan dimostrarono che anche una cellula diteratocarcinoma isolata può rimanerepluripotente. Essi posero una cellula iso-lata di carcinoma embrionale in un sottilecapillare di vetro e innestarono il capillaresotto la pelle di un topo adulto. Lì la cellu-la si divise e il clone di cellule figlie proli-ferò e si differenziò in vari tipi cellulari,originando alla fine un tumore multidiffe-

renziato. Tuttavia molte osservazioni re-sero impossibile concludere in base a que-sto tipo di esperimento che le cellule dicarcinoma embrionale sono effettiva-mente totipotenti, cioè realmente equiva-lenti alle normali cellule embrionali quan-to a capacità di sviluppo. Per prima cosa,alcune cellule figlie rimasero maligne,suggerendo l'ipotesi che la loro trasfor-mazione neoplastica fosse geneticamentedeterminata. Inoltre, alcuni tessuti diffe-renziati rimasero anormali e immaturi.L'assenza di determinati tessuti, compre-so il rene, il timo, il polmone e il fegato, datutti i numerosi tumori solidi osservatisuggerì che le cellule capostipite potesse-ro essere comparabili alle cellule di unembrione maturo le cui capacità di svi-luppo sono diventate limitate.

Malgrado le molte somiglianze morfo-logiche, biochimiche e immunologiche trale cellule di teratocarcinoma e le normalicellule embrionali, una grossa differenzaera innegabile: le cellule di teratocarci-noma erano maligne, e alcune delle cellu-le loro discendenti sembravano mantene-re il carattere di malignità attraverso mol-te generazioni. Per dimostrare chiara-mente la totipotenza delle cellule di tera-tocarcinoma si sarebbe dovuto dimostra-re che le loro proprietà maligne non ne-cessariamente persistono ma sono rever-sibili in condizioni ambientali opportune.Tali condizioni potrebbero essere ottenu-te ponendo le cellule capostipiti malignedi teratoma in stretta associazione con lecellule normali di un giovane embrione.

Nel 1974 Ralph L. Brinster della Uni-versity of Pennsylvania School of Veteri-nary Medicine eseguì appunto un tale tipodi esperimenti. Egli iniettò cellule di tera-tocarcinoma in alcune blastocisti, chesono embrioni molto giovani (quattrogiorni e mezzo), avendo cura di porre lecellule iniettate presso la massa di celluleinterne della blastocisti, alcune delle qualidanno poi origine all'embrione maturo.Successivamente egli trasferì le blastocistinell'utero di «madri adottive» (femmineche erano state rese «pseudogravide »accoppiandole a maschi vasectomizzati equindi sterili) in modo che gli embrioniestranei si potessero impiantare e svilup-pare. Uno dei topi che nacquero avevachiazze marroncine sul mantello bianco.Il mantello bianco derivava dal ceppo cheaveva fornito la blastocisti e quindi granparte del materiale embrionale; le chiazzemarroncine erano il colore «agouti» (pelo

Una cellula di teratocarcinoma viene iniettatain una blastocisti di topo, che è un embrione di4 giorni e mezzo. La blastocisti, di circa 0,075millimetri di diametro, viene fissata all'estre-mità di una pipetta con la punta arrotondata;all'interno della pipetta per l'iniezione si puòvedere una singola cellula tumorale (1). Lacellula viene iniettata e si attacca alla massa dicellule interne, le quali daranno origine al-l'embrione (2). La blastocisti collassa a causadella manipolazione (3), ma si riespande dopoalcune ore in coltura (4); la cellula tumoralerimane attaccata alla massa di cellule interne,con cui si integrerà durante il loro sviluppo.

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CELLULE DISSOCIATE

IN COLTURA PER 24 ORE

DUE CELLULE FIGLIE

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IMPIANTODELLA BLASTOCISTI

• NELL'UTERO

UNA CELLULAVIENE INIETTATANELLA BLASTOCISTI

IMPIANTODELLA BLASTOCISTINELL'UTERO

SITO DI IMPIANTO

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IL SITO DI IMPIANTOVIENE INIETTATOSOTTO LA CUTE

UNA CELLULA VIENEPOSTA IN UNCAPILLARE DI VETRO

AUTOPSIADOPO UNASETTIMANA

\i/ IMPIANTO SOTTOCUTANEODEL CAPILLARE

INTRODUZIONE DELLE CELLULENELLA VESCICOLA VUOTA

RIMOZIONEDELLA MASSACELLULAREINTERNA

BLASTOCISTIRICOSTITUITA

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BLASTOCISTI PRIVADI ZONA PELLUCIDACELLULE DI

TERATOCARCINOMA

con bande nere e gialle) degli animali dacui era derivata la cellula di teratocarci-noma. Il topo era evidentemente unachimera (dal nome dell'animale dellamitologia greca che aveva la testa di unleone, il corpo di una capra e la coda di unserpente).

T 'osservazione da parte di R. L. Brin-I ster del mantello chimerico costituivaun'importante indicazione del fatto che lecellule di carcinoma embrionale potesse-ro perdere la loro malignità e differen-ziarsi normalmente. Sfortunatamente leblastocisti che egli aveva utilizzato deri-vavano da un ceppo di topi albini di com-posizione genetica non determinata, ilche rendeva impossibile identificare lapartecipazione di cellule tumorali ad altritessuti. Nel 1974, insieme ad Alice Mintzdell'Institute for Cancer Research di Fi-ladelfia, iniettammo cellule di carcinomaembrionale provenienti da un teratocar-cinoma ascitico del ceppo 129 in blastoci-sti di altre linee pure portatrici di numero-si marcatori genetici, in modo di poterdistinguere in seguito le cellule derivatedalla blastocisti da quelle derivate daltumore.

I corpi embrioidi da cui erano state pre-levate le cellule di carcinoma embrionaleavevano una lunga storia. Nel 1967, nelJackson Laboratory, un embrione di seigiorni del ceppo 129 era stato trapiantatosul testicolo di un ospite adulto, inducen-dovi la formazione di un teratocarcinomasperimentale che era stato coltivato peralcune generazioni come un tumore tra-piantabile e poi convertito in un terato-carcinoma ascitico. Quest'ultimo era sta-to mantenuto per otto anni nel fluido pe-ritoneale di generazioni successive di topied era servito per ottenere i corpi em-brioidi da cui avevamo preso le cellule dicarcinoma embrionale che ci erano servi-te per gli esperimenti d'innesto.

Una serie di esperimenti produsse circa40 topi chimerici sani, alcuni dei qualiraggiunsero l'età di quasi un anno (circametà della durata di vita normale di untopo) prima di venire sacrificati per leanalisi successive. In queste chimere nonc'era traccia di teratomi. (Di tanto in tan-to si sviluppavano teratomi in topi nonchimerici, cioè in topi che non conteneva-no nei loro tessuti cellule di teratocarci-noma.) Nelle chimere sane fummo in gra-do di identificare, oltre alle chiazze colo-rate sul mantello, un grande numero di

prodotti genici specifici del ceppo 129(cioè delle cellule di carcinoma embriona-le) e non del ceppo della blastocisti. Que-sti prodotti genici includevano l'emoglo-bina dei globuli rossi, le immunolglobuli-ne delle plasmacellule, le proteine delfegato, la melanina nera in certe celluleepidermiche, la melanina gialla nelle cel-lule dei follicoli piliferi e una varianteelettroforetica dell'enzima glucosio fosfa-to isomerasi in quasi tutti gli organi. Talimarcatori erano rintracciabili in tessutiderivanti da tutti e tre i foglietti embriona-li - ectoderma, endoderma e mesoderma -così come in tessuti che normalmente nonsi ritrovano nei teratocarcinomi, il fegato,il rene e il polmone. In due casi le cellulederivate dal carcinoma embrionale diede-ro origine persino a spermatozoi che fu-rono in grado di fecondare regolarmentedelle uova e generare piccoli sani, i qualicontenevano in ogni loro tessuto i marca-tori del ceppo 129 (o della cellula di car-cinoma embrionale).

I ' passo successivo fu quello di iniettarenelle blastocisti alcune cellule singole,

in modo di poterne dimostrare la diffe-renziazione normale. I risultati furonosignificativi: la discendenza (clone) dellacellula tumorale isolata entrava a far par-te di tutti i tessuti principali di un topochimerico, il quale poteva svilupparsinormalmente fino allo stato adulto. Inquesto modo si stabilì inequivocabilmen-te che le cellule di carcinoma embrionalepossiedono la stessa totipotenza delle cel-lule di un giovane embrione. Dopo averfatto parte di un tumore altamente mali-gno per quasi otto anni - circa 200 gene-razioni di trapianti - queste cellule capo-stipite di teratoma erano in grado diesprimere il loro patrimonio geneticocompleto in una sequenza ordinata di dif-ferenziazioni in tessuti somatici e germi-nali. La perdita della malignità era chia-ramente un processo irreversibile, datoche i tessuti del mosaico derivati dallacellula tumorale non davano mai origine atumori quando venivano trapiantati sottola pelle di un topo istocompatibile. Alcontrario se si impiantavano in posizionesottocutanea le cellule di carcinoma em-brionale originali, si formavano sempregrossi teratocarcinomi.

Si potrebbe obiettare che la popolazio-ne di cellule di carcinoma embrionale eraeterogenea per quanto riguarda le pro-prietà maligne, così che alcune cellule

potrebbero essere in grado di differen-ziarsi normalmente e altre, diverse dalleprime, sarebbero destinate a formaretumori. La spiegazione alternativa deirisultati sperimentali è che la stessa cellu-la di carcinoma embrionale può o diffe-renziarsi normalmente o dare origine a untumore; la scelta sarebbe determinata daltipo di ambiente in cui la cellula vieneiniettata. Per potere distinguere tra que-ste due possibilità variammo l'esperimen-to ancora una volta. Mantenemmo in unmezzo di coltura adeguato alcune celluledi carcinoma embrionale isolate, finché sidivisero e formarono due cellule figlie.Una di queste fu iniettata in una blastoci-sti e fatta sviluppare in una madre adotti-va; l'altra fu impiantata sotto la pelle di untopo adulto. In alcuni casi la cellula iniet-tata nella blastocisti prese parte alla nor-male differenziazione dei tessuti, mentrela cellula sorella diede origine a un terato-carcinoma. Evidentemente ciò che pro-vocava la differenza era l'ambiente em-brionale.

Un'altra prova a favore di questa con-clusione fu ottenuta iniettando le celluledi carcinoma embrionale in blastocisti,privandole però dell'influenza ambienta-le esercitata dalle normali cellule embrio-nali. Fu asportata tutta la massa di celluleinterne della blastocisti (che dà origineall'embrione maturo), e al suo posto fu-rono iniettate nel trofoblasto vuoto circa20 cellule di carcinoma embrionale.Quando veniva trasferita nell'utero diuna madre adottiva, la blastocisti ricosti-tuita era in grado di impiantarsi ma non disvilupparsi in un embrione maturo.Quando il sito di impianto (la parete del-l'utero e la blastocisti ) veniva asportato eposto sotto la pelle di un ospite istocom-patibile, dava origine a un teratocarcino-ma. L'analisi enzimatica del tumore stabi-lì che esso derivava unicamente dalle cel-lule di carcinoma embrionale, non dal tro-foblasto o dal tessuto uterino. É chiaroquindi che, quando sono lasciate a se stes-se, le cellule capostipite maligne manten-gono le loro proprietà neoplastiche; ridi-ventano normali solo quando sono stret-tamente associate a cellule embrionali.

T n una linea pura di topi chiamati LT1- circa metà delle femmine sviluppavateratomi dell'ovario. Questi bizzarri tu-mori derivano da uova che per qualcheragione sconosciuta vengono attivate par-tenogeneticamente nell'ovario e, senzaessere state fecondate, si dividono e sisviluppano in giovani embrioni, che poi sidisorganizzano e formano teratomi inve-ce che feti normali. A volte un tumoredell'ovario può essere trasformato in unteratocarcinoma trapiantabile iniettando-lo sotto la cute di un topo adulto dellastessa linea pura: i tumori così ottenutisono adatti all'analisi sperimentale. Lacrescita neoplastica dei tumori dell'ovarioè dovuta a qualche cambiamento stabiledi tipo genetico o anche queste cellulemaligne sono capaci, come quelle dei te-ratocarcinomi derivati dagli embrioni, didifferenziarsi normalmente?

Iniettammo cellule isolate di teratocar-

Gli esperimenti di iniezione entro una blastocisti hanno dimostrato che una cellula singola diteratocarcinoma è in grado di differenziarsi normalmente. Le cellule di teratocarcinoma vengonodissociate con un enzima proteolitico e messe in coltura separatamente. Alcune cellule tumorali sidividono e formano due cellule figlie, una delle quali v iene iniettata dentro una blastocisti di undiverso ceppo di topi. La blastocisti viene trasferita dentro l'utero di una «madre adottiva),pseudogravida, dove dà origine a un topo chimerico sano (a sinistra) che ha tessuti derivati dallacellula tumorale nel mantello (in colore) e in organi interni. L'altra cellula figlia, in un capillare divetro, viene impiantata sotto la pelle di un topo adulto e diventa un teratocarcinoma (al centro),dimostrando che una singola cellula tumorale può, a seconda dell'ambiente, o differenziarsinormalmente o rimanere maligna. La presenza di cellule embrionali è necessaria per la perditadella malignità, come è dimostrato dal seguente esperimento. Si iniettano delle cellule di terato-carcinoma dentro una blastocisti da cui è stata rimossa la massa centrale di cellule (a destra); lablastocisti ricostituita viene posta nell'utero di una madre adottiva, dove si impianta. Il sito diimpianto viene rimosso e trapiantato sotto la pelle di un topo dove forma un teratocarcinoma.

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TERATOCARCINOMADELL'OVARIO

TAGLIATOIN PICCOLI PEZZI

FEMMINA LT

I PEZZETTI VENGONOINIETTATI SOTTO LA CUTE

DI UN TOPO LT

I PEZZETTIVENGONO DISSOCIATIIN CELLULE SINGOLE

TUMORE

BLASTOCISTI

CELLULE DI TERATOCARCINOMAE BLASTOCISTI

FEMMINA CBA-T6/T6

UNA CELLULA SINGOLAVIENE INIETTATANELLA BLASTOCISTI

LE BLASTOCISTI SONOIMPIANTATE NELL'UTERO

o\

CHIMERE NORMALI

BLASTOCISTI

FIBROSARCOMA UMANOO EPATOMA DI RATTO CARENTI

DELL'ENZIMA HPRT

CELLULE DI TERATOCARCINOMADI TOPO CARENTIDELL'ENZIMA TK

777FUSIONE CELLULARE PROVOCATADAL VIRUS SENDAI

LE CELLULE IBRIDE VENGONOINIETTATE SOTTO LA CUTE

DI UN TOPO

CELLULE IBRIDEE BLASTOCISTI

BLASTOCISTI

BLASTOCISTI

FEMMINA C57BL/6

UNA SINGOLACELLULA IBRIDAVIENE INIETTATAIN UNA BLASTOCISTI

LA BLASTOCISTI VIENEIMPIANTATA NELL'UTERO

SELEZIONE DELLE CELLULEIBRIDE SU TERRENO HAT

cinoma dell'ovario in blastocisti geneti-camente marcate di un diverso ceppo ditopi, che ponemmo nell'utero di madriadottive. I trapianti diedero origine a pa-recchi topi chimerici normali con contri-buti derivanti dalla cellula tumorale nelmantello e in tutti gli organi principali.Una femmina risultò avere nelle ovaiealcune uova funzionanti che avevano avu-to origine dalle cellule di teratocarcinomache erano state iniettate. Una volta fe-

condate, tali uova diedero origine a prolesana: topi normali la cui «madre geneti-ca» era un tumore. Questi risultati dimo-strano che le cellule di teratocarcinomafemminili, come le corrispondenti ma-schili. in un ambiente embrionale perdo-no le loro proprietà maligne e si differen-ziano normalmente in tessuti adulti e che,in rari casi, i geni delle cellule tumoralipossono persino venire trasmessi allegenerazioni successive. E quindi impro-

babile che la trasformazione neoplasticache produce un teratocarcinoma dell'ova-rio sia il risultato di una deficienza o diuna alterazione della composizione gene-tica dell'uovo.

A conferma di questa idea trovammoche le uova del ceppo pigmentato LT cheavevano cominciato a dividersi parteno-geneticamente e avevano raggiunto lostadio di otto cellule potevano essererimosse dall'ovidotto e fuse con embrioni

normali allo stadio di otto cellule di unalinea pura di topi albini. Quando il risulta-to di tale fusione veniva posto in una ma-dre adottiva, si sviluppavano topi chime-rici (albini e pigmentati) normali. Quan-do una chimera femmina fu incrociata conun maschio albino, diede alla luce sia to-pini albini che pigmentati. La progeniepigmentata poteva avere avuto originesolo da uova che discendevano dall'em-brione partenogenetico. La nostra con-

elusione è che le aberrazioni dello svilup-po che producono sia i teratocarcinomidell'ovario che quelli del testicolo sonocorrelate causalmente a cambiamenti nelfunzionamento dei geni piuttosto che nel-la loro struttura.

Dobbiamo menzionare alcune proveottenute da un tipo di esperimento un po'differente che tendono a contraddire inostri risultati di reversione completa. Lelinee cellulari di teratocarcinoma sono

state mantenute anche come colture dilaboratorio oltre che in animali vivi e si èdimostrato che anche così sono capaci didifferenziarsi in molti tipi di tessuti. Nellaboratorio di Richard L. Gardner all'U-niversità di Oxford, Virginia E. Pa-paioannou e i suoi colleghi hanno inietta-to da 20 a 40 cellule di teratocarcinomacoltivate in vitro in alcune blastocisti,hanno impiantato le blastocisti in madriadottive e hanno ottenuto molti topi chi-

Un teratocarcinoma dell'ovario viene rimosso da una femmina del sotto la pelle di un altro topo LT, dove formano un tumore maligno.ceppo LT e tagliato in piccoli pezzi. Alcuni di questi vengono impiantati Altri vengono dissociati in cellule singole, che vengono iniettate dentro

blastocisti prese da femmine di un ceppo differente; le blastocisti ven-gono impiantate nell'utero di una madre pseudogravida. La sua proge-

nie include topi chimerici normali in cui le cellule tumorali hannocontribuito a parte del mantello, a organi interni e a cellule germinali.

È stato possibile sviluppare un sistema d'indagine biologica combinandole tecniche di ibridazione cellulare con la procedura di iniezione di celluledentro le blastocisti. Le cellule di un teratocarcinoma di topo carenti di

un enzima (TK) vengono coltivate insieme a cellule umane o a celluletumorali di ratto carenti di un enzima differente (HPRT) in presenza divirus Sendai inattivato. Alcune di queste cellule si fondono e formano

cellule ibride che sono coltivate in un terreno particolare (HAT) dovesolo esse possono sopravvivere. Iniettate in topi «nudi» privi di difeseimmunitarie, queste cellule formano tumori maligni. Se invece vengono

iniettate nelle blastocisti prese da un ceppo di topi neri e successivamen-te impiantate in una madre adottiva, le cellule si differenziano nor-malmente e contribuiscono a formare parte della progenie chimerica.

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BLASTOCISTI 41110114.1

CELLULA da>IBRIDA

Questa chimera derivata da un ibrido cellulare hall mantello nero (come il ceppo della blastocisti)con chiazze bianche derivate dalla cellula ibrida uomo-topo che era stata iniettata. La variantedell'enzima glucosio fosfato isomerasi caratteristica del ceppo della blastocisti e quella caratteristi-ca della cellula ibrida sono entrambe presenti nella chimera e possono essere distinte medianteelettroforesi. Le due varianti migrano diversamente in un campo elettrico, come è dimostrato dallebande di controllo (a sinistra). La variante più lenta caratteristica della cellula ibrida (bande in-feriori) è presente in 7 tessuti. Nel muscolo scheletrico le due varianti formano una molecola en-zimatica ibrida la cui presenza attesta il funzionamento dell'enzima della cellula ibrida nella chimera.

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5.- Q ( (' O

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merici. La maggior parte di questi topichimerici sviluppava tumori pochi mesidopo la nascita. Riteniamo che i tumoripossono essere il risultato del fatto che ilgrande numero di cellule iniettate non si èpotuto integrare normalmente durantel'inizio dello sviluppo. Inoltre, nel corsodella coltivazione in vitro le cellule tumo-rali possono avere accumulato anomaliecromosoniche e di altro tipo che non ne-cessariamente facevano parte della strut-tura genetica e della potenzialità di svi-luppo delle cellule di carcinoma embrio-nale originarie.

La schiacciante maggioranza delle pro-ve ottenute dalla ricerca sul cancro in tuttiquesti anni sembrava giustificare l'assun-to che la trasformazione maligna è uncambiamento irreversibile. Ricerche re-centi eseguite sia su piante che su animalisuggeriscono che questo dogma non siasempre applicabile, almeno per certitumori. B concepibile che la trasforma-zione allo stato maligno non risulti sem-pre da mutazioni stabili nella struttura deigeni, ma a volte da cambiamenti reversi-bili, non-mutazionali dell'espressionegenica, che provocano anormalità nelcorso della differenziazione e quindi lacrescita neoplastica.

Speriamo di potere utilizzare il sistemacostituito dalle cellule di teratocarcinomaper rintracciare le origini e le cause dellatrasformazione maligna e per svelare i

meccanismi di interazione fra cellule chea volte conducono a una reversione dellostato maligno. I teratomi potrebbero nonessere unici per quando riguarda la lorocapacità di tornare alla normalità. La no-stra tecnica di introdurre una cellula diteratocarcinoma in un embrione di topo esaggiarne le potenzialità di sviluppo nel-l'animale vivo può essere applicabile adaltre cellule neoplastiche. In questo casopotremmo essere in grado di determinarese cellule tumorali più specializzate han-no subito cambiamenti genetici stabili osono ancora flessibili per quanto riguardail loro potenziale di sviluppo e quindi pos-sono, almeno in certa misura, venire inte-grate in tessuti normali.

T a combinazione del nostro metodo diinnesto di blastocisti con la tecnica di

ibridazione cellulare ha di recente apertouna nuova linea di ricerca sulla differen-ziazione. La tecnica di ibridazione è utileper identificare particolari enzimi e altriprodotti genici e correlarli a geni su cro-mosomi particolari; l'iniezione di celluletumorali in blastocisti rende possibile l'in-troduzione delle cellule ibride in animalivivi e quindi costituisce un saggio biologi-co dell'attività di tali geni. Abbiamo in-trapreso tali esperimenti combinati in col-laborazione con Carlo M. Croce del Wi-star Institute of Anatomy and Biology diFiladelfia. Nel suo laboratorio abbiamo

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LATTATO DEIDROGENASI GLICEROLFOSFATO DEIDROGENASI

EPATOMA DI RATTO

TERATOMA DI TOPO

CELLULA IBRIDA

FEGATO DI TOPO

FEGATO DI RATTO

FEGATO C

FEGATO B

FEGATO A

INTESTINO A

RENE A

È possibile identificare enzimi di ratto in estratti da organi di tre topichimerici (A, B, C) derivati da blastocisti in cui erano state iniettatecellule ibride topo-ratto. Le prime 5 bande elettroforetiche a partiredall'alto mostrano la migrazione di due enzimi, lattato deidrogenasi(LDH) e gliceroffosfato deidrogenasi (GPD), in cellule di epatoma diratto, in cellule di teratocarcinoma di topo, in ibridi delle prime due e infegato normale di topo e di ratto. Le successive 5 bande documentano

la presenza di varianti dell'enzima di ratto nel fegato di tutte e tre lechimere e nell'intestino e nei reni della chimera A. Il funzionamento deigeni di ratto durante lo sviluppo del topo è dimostrato dal fatto chenelle chimere esiste un'attività GPD inesistente nel teratoma di topo onelle cellule ibride; ci sono eteropolimeri topo-ratto (GPD nel fegato diA eB e nell'intestino diA ); c'è una forma di LDH tipica del ratto adultonon riscontrabile nelle cellule ibride (fegato di A, B eC e rene di A).

adattato le tecniche per coltivare in vitrolinee cellulari ricavate da teratocarcinomidi topo in modo da ottenere cellule diteratocarcinoma carenti di un particolareenzima, la timidina chinasi (TK). Questecellule sono state fuse con cellule umane odi tumori di topo carenti di un diversoenzima, l'ipoxantina fosforibosiltransfe-rasi (HPRT). Solo le cellule ibride inter-specifiche sono capaci di crescere in unterreno particolare in cui entrambi i tipi dicellule parentali muoiono (si veda l'arti-colo La genetica del cancro di Carlo M.Croce e Hilary Koprowski, in «Le Scien-ze», n. 116, aprile 1978).

Nel terreno selettivo le cellule ibrideperdono gran parte dei loro cromosoniumani o di ratto, ma mantengono il cro-mosoma estraneo che contiene il locusgenetico per TK, il quale è necessario perla sopravvivenza. Nell'uomo, nel ratto enel topo i geni per TK e per l'enzimagalattochinasi sono associati (cioè sonoentrambi sullo stesso cromosoma). Legalattochinasi tipiche dell'uomo e del rat-to possono essere facilmente distinte daquella tipica del topo per mezzo dell'elet-troforesi. e questo fornisce un comodomarcatore biochimico per identificare lapresenza del prodotto genico estraneo edimostrare così l'espressione normale deigeni estranei nelle cellule ibride. La per-manenza di parecchi cromosomi di rattonelle cellule ibride topo-ratto ci ha per-messo di ricercare un certo numero diforme enzimatiche specifiche del ratto,rendendo possibile una più estesa analisi

dell'espressione genica. Entrambi i tipi dicellule interspecifiche conservano le loroproprietà maligne e formano grossi tumo-ri quando vengono impiantate sotto lapelle di topi «nudi» (che hanno danni alsistema immunitario e quindi accettano iltrapianto di tessuto estraneo).

Abbiamo deciso di studiare la potenzia-lità di queste cellule tumorali ibride in unambiente che promuove la differenzia-zione normale. Insieme a Peter C. Hoppedel Jackson Laboratory e ai nostri colle-ghi dell'Università di Ginevra abbiamotrapiantato cellule ibride singole in bla-stocisti geneticamente marcate, abbiamofatto sviluppare le blastocisti in madriadottive e abbiamo ottenuto parecchi topichimerici sani in cui era possibile dimo-strare che le cellule tumorali ibride ave-vano contribuito al mantello e a vari or-gani interni. Tranne un tumore del fegatonessuno dei tessuti derivati dalle celluletumorali mostrava alcuna anormalitàstrutturale. Evidentemente le celluleibride maligne si erano differenziatenormalmente e si erano integrate nellanuova generazione durante lo sviluppo.

Nei topi chimerici erano riscontrabilianche prodotti genici estranei. Abbiamotrovato la forma umana della galattochi-nasi nel cuore di una chimera e nel rene diun'altra. Abbiamo riscontrato le formetipiche del ratto di nove enzimi differentiin parecchi organi di tre chimere adulte. Ilfatto che alcuni prodotti genici di rattoscoperti negli animali non erano riscon-trabili nelle cellule ibride nel terreno di

coltura e che le chimere producevanoanche eteropolimeri (molecole ibridecomposte da tutt'e due le forme di ratto edi topo di certi enzimi) dimostra che i geniestranei vengono espressi funzionalmentenell'animale adulto. La sintesi di variantienzimatiche che si trovano solo negli adul-ti indica inoltre che l'espressione dei genidi ratto continua a essere regolata durantelo sviluppo del topo. Stiamo ora estenden-do l'analisi ad altri geni nel tentativo discoprire a quale stadio di sviluppo vengo-no espressi e in che modo essi influenzanola differenziazione e la malattia.

-I-25 anni di ricerca sui teratomi di topoindotti sperimentalmente hanno chia-

rito molti punti dell'origine, della geneti-ca e delle proprietà di differenziazione diquesti strani tumori. L'importante osser-vazione che le cellule capostipite malignedei teratocarcinomi contribuiscono alladifferenziazione di tessuti normali neitopi chimerici ha richiamato l'attenzionesul fatto che la condizione neoplasticapuò a volte tornare alla normalità. Orache siamo in grado di ottenere ibridi dicellule di carcinoma embrionale e di ren-derle quindi portatrici di materiale gene-tico estraneo per l'integrazione in un ec-cellente sistema di saggio biologico - itessuti di un animale in via di sviluppo - lastrada dovrebbe essere aperta non soloper nuovi progressi nello studio della dif-ferenziazione dei mammiferi, ma anchedel processo di trasformazione neoplasti-ca e della sua reversione.

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