UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI PAVIA

FACOLTA’ DI SCIENZE MM. FF. NN. FARMACIA E MEDICINA

DIPARTIMENTO DI FISICA NUCLEARE E TEORICA DIPARTIMENTO DI BIOLOGIA ANIMALE

CORSO DI LAUREA INTERFACOLTA' IN BIOTECNOLOGIE INDUSTRIALI

STUDI PRELIMINARI PER L’APPLICAZIONE DELLA BORON NEUTRON CAPTURE THERAPY (BNCT) ALLE

METASTASI DIFFUSE NEL POLMONE DI RATTO Relatore: Chiar.mo Prof. Saverio Altieri Correlatori: Chiar.ma Prof.ssa Rosanna Nano

Dott. James G. Bakeine

Tesi di Laurea Magistrale di

Marta Di Salvo

Anno Accademico 2007-2008

1

INDICE Introduzione 3 Capitolo 1 7 La terapia per cattura neutronica sul boro (BNCT) 7 1.1 Le basi della BNCT 7 1.2 La BNCT delle metastasi epatiche diffuse 12 1.2.1 Risultati clinici della BNCT su tumore metastatico epatico 15 1.2.2 Il follow up post operatorio 17 1.2.3 Discussione e conclusioni 19 Capitolo 2 21 La BNCT nel trattamento dei tumori polmonari diffusi 21 2.1 Cancro polmonare: stato attuale della ricerca 21 2.2 Limiti e vantaggi della radioterapia convenzionale 25 2.3 La BNCT nei tumori diffusi del polmone 27 2.4 Il modello animale 29 2.5 Misura della concentrazione di 10B nel polmone di ratto 31 2.6 Risultati degli studi della farmacocinetica del PBA nel modello .. 35 Capitolo 3 37 Test di efficacia della BNCT nelle metastasi polmonari di ratto 37 3.1 Trattamento BNCT in vitro 38 3.1.1 Efficienza di piastramento 39 3.1.2 Sopravvivenza delle cellule post-irraggiate 41 3.3 Studio in vivo 41 3.4 Caratterizzazione istologica della malattia polmonare metastatica 45 Capitolo 4 49 Conclusioni e sviluppi futuri 49 Bibliografia 52

2

3

Introduzione

Una terapia ideale per il trattamento dei tumori diffusi deve distruggere

selettivamente tutte le cellule tumorali senza creare danni al tessuto

normale; la terapia per cattura neutronica sul boro (BNCT) è un trattamento

bimodale che presenta caratteristiche che si avvicinano a questo ideale; essa

è basata sull'effetto biologico indotto nei tessuti dalla reazione nucleare

10B(n,α)7Li e la sua selettività dipende non solo dal campo neutronico con

cui si irraggia il tumore ma anche e soprattutto dalla diversa bio-

distribuzione dell'elemento 10B nelle cellule tumorali rispetto a quelle sane.

Sfruttando il differente metabolismo tra cellule tumorali e sane, l'accumulo

del boro produce una distinzione significativa tra le unità tissutali e dunque,

in seguito all'irraggiamento, un trattamento differenziato dei tessuti malati

rispetto a quelli normali [1,2]. Questa proprietà intrinseca del trattamento

acquista un particolare valore nei quadri clinici dei tumori multifocali

distribuiti sull'intero volume dell'organo e che, quindi, non sono trattabili

con le consuete tecniche radioterapiche.

La presente tesi si inserisce nello studio condotto (presso l'Università di

Pavia con finanziamenti MIUR e INFN) sulla fattibilità della BNCT dei

tumori diffusi, in particolare quelli polmonari; il carcinoma polmonare,

infatti, tra tutte le patologie oncologiche, presenta l'incidenza più alta a

4

livello mondiale e ha, d'altro canto, la peggior prognosi. Inoltre, le metastasi

che interessano il polmone sono quasi sempre letali perchè sono in forma

diffusa e chirurgicamente non operabili. La BNCT mostra una serie di

caratteristiche intrinseche che la rendono una terapia potenzialmente

radicale per questo tipo di patologie.

La ricerca condotta a Pavia in ambito BNCT ha riguardato il trattamento dei

tumori diffusi inoperabili; in passato il gruppo si è dedcato al trattamento

delle metastasi epatiche diffuse e più recentemente è passato studiare la

possibilità di estendere l’applicabilità della BNCT ai tumori polmonari

diffusi. Come primo step in quest’ultimo campo è stata affrontata la verifica

dell’assorbimento selettivo del boro nel tumore e la possibilità di creare un

campo di neutroni termici uniforme nel volume polmonare da irraggiare. Da

un lato è stato messo a punto un modello di ratto con metastasi polmonari da

adenocarcinoma del colon ed è stato studiato l’assorbimento del boro in

funzione del tempo, sia nei tessuti tumorali sia nel polmone sano; dall’altro

è stata studiata con metodi di Monte Carlo la distribuzione della dose di

radiazione nel torace di un modello antropomorfo. Nel lavoro

sull’assorbimento del boro e sulla sua biodistribuzione nel ratto con

metastasi polmonari, è stato dimostrato che si produce una concentrazione

di boro 4-5 volte più alta nel tumore rispetto al parenchima polmonare sano

dopo 4 ore dall’iniezione intraperitoneale di Borophenilalanina (BPA) [3,4].

5

Con calcoli Molte Carlo si è visto che irraggiando un modello di torace

umano con due fasci collimati e contrapposti (antero-posteriore e postero-

anteriore) di neutroni epitermici [5,6] si ottiene in tutto il polmone una

distribuzione uniforme di neutroni termici; questo garantisce la possibilità di

colpire il tumore con la stessa efficacia indipendentemente dalla sua

posizione nell’organo. Questi risultati positivi ci hanno spinti a proseguire

nella ricerca, che è stata indirizzata allo studio dell’efficacia del trattamento

delle metastasi nell’animale per mezzo della linea cellulare DHD/K12/TRb

di adenocarcinoma del ratto. Si sta studiando la sopravvivenza di queste

cellule trattate con Borophenilalanina (BPA) e irraggiate con neutroni; lo

studio viene condotto sia in vitro sia nell’ animale. La tappa finale di questa

ricerca prevede l’irraggiamento nella colonna termica del reattore TRIGA

Mark II dell’Università di Pavia, di un certo numero di ratti con tumore e

trattati con BPA. Da questo punto di vista l’esperimento rappresenta la

prosecuzione degli studi condotti al MIT (Massachussets Institute of

Technology) di Boston dedicati allo studio degli effetti della BNCT nel

polmone sano di ratto.

Il lavoro descritto in questa tesi riguarda lo studio dell’efficacia della BNCT

nel tumore metastatico polmonare; sono stati condotti esperimenti sia in

vitro che in vivo-vitro. Cellule di adenocarcinoma del colon

DHD/K12/TRb, in grado di produrre metastasi polmonari nel ratto, sono

6

state trattate con BNCT ed inoculate in ratti singenici BD-IX; è stata quindi

studiata l’efficacia del trattamento BNCT valutando la sopravvivenza dei

ratti e analizzando nell’animale la capacità proliferativa delle cellule trattate.

7

CAPITOLO 1

La terapia per cattura neutronica sul Boro

(BNCT)

1.1 Le basi della BNCT

La BNCT (Boron Neutron Capture Therapy) è una terapia oncologica basata

sull'irraggiamento con neutroni di bassa energia di un volume tumorale

dopo la somministrazione di un drogante borato in grado di accumularsi

selettivamente nelle cellule malate. L'isotopo 10 del boro non è radioattivo e

presenta una sezione d'urto estremamente elevata (3837 barn) per la cattura

di neutroni termici mediante la reazione 10B(n,α)7Li (fig.1).

Fig. 1 Rappresentazione schematica della reazione di cattura neutronica sul 10B. In seguito a questa reazione nucleare vengono emesse particelle α e ioni Li

ad alto Trasferimento Lineare di Energia (LET) e con range in tessuto di 7 e

8

4 µm, rispettivamente, confrontabili con le dimensioni lineari delle cellule;

queste particelle trasportano un’energia complessiva di 2.79 MeV che viene

rilasciata entro pochi µm dal punto di produzione.

Il razionale alla base della BNCT come terapia medica sta dunque nella

possibilità di depositare, mediante la radiazione prodotta dall'irraggiamento

del 10B, una dose sufficientemente alta da indurre delle lesioni letali, quali

danni irreversibili al DNA e apoptosi, nella cellula tumorale che ha

accumulato il drogante.

Le particelle pesanti sono più efficaci delle radiazioni γ o degli elettroni nel

produrre danni biologici. Infatti gli effetti dell’irraggiamento di un tumore

sono legati non solo alla dose assorbita, che esprime a livello macroscopico

l’energia assorbita per unità di massa, ma anche ad almeno altri 2 parametri:

1) il modo di trasferire energia dalla radiazione al tessuto, espresso dal

LET, che rappresenta la densità lineare di energia ceduta lungo il

percorso della particella (si misura in KeV/ μm);

2) il contenuto di ossigeno nei tessuti irradiati; gli effetti biologici

solitamente diminuiscono quando si riduce il contenuto di ossigeno

nei tessuti e di questo bisogna tener conto quando si irraggiano

tessuti tumorali, nei quali il tenore di ossigeno è generalmente basso,

poiché sono scarsamente vascolarizzati.

9

Sperimentalmente si è osservato che le radiazioni ad alto LET come

particelle α e ioni pesanti, nel danneggiare le cellule, sono più efficaci delle

radiazioni a basso LET (elettroni, X , γ) e il loro effetto non risente della

scarsa ossigenazione. Questo fatto si può spiegare perché nel caso di

radiazioni ad alto LET gli effetti di danno sono legati alle elevate cessioni

locali di energia, che comportano più frequenti rotture del DNA delle cellule

colpite. E’ ovvio che la BNCT, in cui entrano in gioco particelle α e 7Li sia

più efficace delle terapie con elettroni o raggi γ.

I danni biologici, essendo legati alla dose, dipendono dal numero di reazioni

10B (n,α) 7Li che avvengono nella cellula e quindi dalla concentrazione di

10B e dall’intensità del fascio di neutroni termici. Poiché si vuole dare una

dose letale di radiazione solo alle cellule tumorali, risparmiando quelle sane,

è necessario che la concentrazione di 10B nei tessuti tumorali sia maggiore

che nei sani. A tale scopo è importante la ricerca di composti veicolanti il

Boro, che entrino in modo preferenziale nelle cellule tumorali, permettendo

di raggiungere un rapporto tra la concentrazione di 10B in tessuti tumorali e

sani significativi per la terapia.

Se il veicolante del 10B fosse assorbito esclusivamente dalle cellule tumorali

si disporrebbe di una terapia totalmente selettiva, in grado cioè di

danneggiare solo il tessuto malato risparmiando completamente il

10

circostante sano (purchè una raggiunta una concentrazione minima di

soglia). Nella pratica questo purtroppo non avviene ed è dunque importante

raggiungere nei tessuti delle condizioni di deposito differenziale, che

ovviamente privilegino la componente istologica tumorale. Si osservi inoltre

che, data l'anatomia di un tumore, l'irraggiamento neutronico non potrà mai

interessare esclusivamente i volumi tumorali ma inevitabilmente interesserà

anche regioni istologicamente sane. Nella pratica medica della BNCT si

raggiunge quindi la selettività richiesta somministrando al tumore una dose

letale mantenendo la dose ai tessuti sani al di sotto di un valore di tolleranza

tipico di ogni tessuto.

L’indiscusso vantaggio della BNCT è la selettività che non trova

significativi rivali nelle altre tecniche radioterapiche, comprese quelle

all’avanguardia come l’adroterapia. Nella BNCT la selettività non dipende

dal campo di irraggiamento ma a dalla biodistribuzione del 10B, che, come è

stato dimostrato, può essere accumulato preferenziale nelle cellule tumorali

quando veicolato da appositi farmaci. Ancora, visto che l'accumulo di 10B

interessa indipendentemente ogni singola cellula, con la BNCT si possono

trattare anche foci tumorali così piccoli da risultare invisibili alle normali

indagini diagnostiche, fornendo così anche ai pazienti in stadi estremamente

avanzati e con metastatizzazione capillare diffusa una speranza di cura e

sopravvivenza.

11

L'impiego della BNCT alla gamma più vasta possibile di patologie

neoplastiche dipende criticamente dai progressi riportati nei vari campi di

ricerca coinvolti, quali la fisica biomedica, la chirurgia e la radioterapia. A

monte è comunque imprescindibile la sintesi di nuovi droganti, in grado di

assicurare rapporti di concentrazione tumore/sano per il 10B anche più

elevati di quelli attualmente ottenibili. I droganti attualmente impiegati per

la BNCT clinica sono il BSH (Sodium Dodecaborane (Na2B12H11SH) e il

BPA (BoroPhenylAlanine, C9H1210BNO4). Il primo risulta particolarmente

adatto al trattamento dei tumori cerebrali. Infatti, la cinetica di accumulo

della molecola prevede l'attraversamento della barriera emato-encefalica

solo nelle zone in cui la struttura è danneggiata dal tumore. Il meccanismo è

passivo e perciò non garantisce dei rapporti di concentrazione tra il tumore e

il sangue superiori a 2; inoltre il boro si va a depositare nello spazio

intracellulare, rimanendo relativamente lontano dal nucleo più

radiosensibile. Al contrario, la BPA entra nelle cellule mediante un

meccanismo attivo e si distribuisce nel nucleo cellulare e nel citoplasma in

modo uniforme. Il meccanismo attivo assicura un considerevole

interessamento del sangue, che comunque presenta valori di concentrazione

tra la metà e un quarto di quella caratteristica del tumore, garantendo così

una buona selettività.

12

Gli studi attualmente in corso hanno come principio cardine lo sviluppo di

molecole in grado di rispondere specificatamente ad agenti espressi dalle

cellule tumorali, così da disporre di droganti dedicati alle singole linee

cellulari. La più interessante eccezione a questo approccio è rappresentata

dalla molecola GB-10 che esplica la sua selettività non tanto nel deposito

cellulare quanto in uno specifico effetto a carico dei vasi sanguigni propri

della massa tumorale [7].

Le altre possibili frontiere della ricerca in campo chimico sono le

nanotecnologie e l'impiego dei liposomi. Con le prime si tenta di costruire

una nanostruttura cava all'interno della quale depositare il boro. La

selettività potrebbe essere assicurata mediante l'impianto sulla superficie

della nanoparticella di recettori specifici per il tumore di volta in volta

trattato [8] . Un meccanismo analogo impiegherebbe i liposomi, che hanno

dimostrato capacità di trasporto del boro sia in esperimenti in vitro che in

vivo [9].

1.2 La BNCT delle metastasi epatiche diffuse

In questo paragrafo viene illustrata l’applicazione della BNCT al

trattamento delle metastasi diffuse e multifocali insediate in organi che

possono essere sottoposti alla procedura di autotrapianto; il protocollo

13

originale messo a punto a Pavia è noto con l'acronimo TAOrMINA

(Trattamento Avanzato di Organi Mediante Irraggiamento Neutronico ed

Autotrapianto) ed è stato applicato per la prima volta al mondo su due

pazienti terminali [10,11].

Nel 1984 presso l’Università di Pavia fu avviato un grande programma

multidisciplinare di ricerca con l’obbiettivo di applicare la BNCT al

trattamento delle metastasi epatiche diffuse e non operabili chirurgicamente.

Le fasi principali del trattamento prevedono la perfusione del fegato con

BPA, l’espianto dell’orgnao, l’irraggiamento all’interno di una postazione

del reattore nucleare e il successivo reimpianto nel paziente. Il programma è

stato sviluppato da una collaborazione fra la sezione pavese dell’Istituto

Nazionale di Fisica Nucleare (INFN), il Dipartimento di Fisica Nucleare e

Teorica e i Dipartimenti di Chirurgia e di Biologia Animale. L’applicazione

sui pazienti è stata preceduta da una lunga fase di studio in vitro ed in vivo

su un modello animale messo a punto dalla collaborazione.

Cellule neoplastiche della livnea DHD/K12/TRb da adenocarcinoma sono

state iniettate per via intrasplenica in ratti BD-IX inducendo così lo sviluppo

di metastasi epatiche. Con questo modello animale è stata dapprina

dimostrato l’assorbimento selettivo del boro nelle metastasi epatiche; come

carrier del boro è stata usata la 10BPA, una sostanza che penetra nelle cellule

14

cancerogene con un meccanismo di trasporto attivo, cosicchè la

concentrazione di 10B nelle cellule può essere più alta di quella presente nel

fluido interstiziale e nel mezzo di coltura [12-13]. Gli effetti della BNCT

sono stati studiati in vitro sulla suddetta linea cellulare. Dopo la crescita in

terreno di cultura contenente BPA le cellule sono state sottoposte ad

irraggiamento neutronico. Gli effetti in vitro sono stati studiati sulle cellule

seguendo la loro capacità proliferativa con il test dell’efficienza di

piastramento, una delle più comuni procedure per valutare la sopravvivenza

delle cellule dopo l’irraggiamento. La valutazione della sopravvivenza

dipende dalla dimostrazione che le cellule mantengono la capacità

proliferativa per formare colonie contenenti più di 50 cellule [14]. Gli

esperimenti sono stati fatti su cellule mantenute per 18 ore in un medium

contenente 10BPA in quantità tali da produrre una concentrazione di 20 ppm

di 10B. Dopo l’irraggiamento neutronico (ad una fluenza di neutroni termici

di 7x1012 cm-2) le cellule sono state seminate in varie flasks di coltura e su

piastre Petri per l’osservazione a diversi intervalli di tempo: 1, 2, 5, 7, 9, 12,

15 e 21 giorni e per effettuare il conteggio delle cellule e l’analisi del DNA;

naturalmente nello studio sono stati osservati campioni di controllo (varie

combinazioni fra esposizione al boro e all’irraggiamento neutronico). Il test

dell’efficienza di piastramento è stato fatto seminando cellule in 5 piastre

Petri replicate per ciascuna concentrazione selezionata con un range che va

da 50 a 250 cellule per i campioni di controllo e da 1x105 a 5x105 per la

15

cellule trattate. Le cellule sopravvissute dopo il trattamento sono

visibilmente allungate, fenomeno dovuto a una mancata divisione cellulare e

quindi ad un aumento del contenuto di DNA. L’efficienza di piastramento

conferma gli effetti del trattamento ma evidenzia anche la presenza di una

subpopolazione di cellule resistenti pari a circa lo 0.05% delle cellule

trattate.

Il test di validazione preclinico in vivo è consistito nello svolgimento

dell’intera procedura della BNCT nel ratto con metastasi epatiche di colon

carcinoma. Risultati ottenuti [15-16] hanno dimostrato:

1) che il tessuto epatico sano non è stato danneggiato dal trattamento

BNCT;

2) la presenza di cellule fagocitarie di Kupffer;

3) la presenza di leucociti coinvolti nel processo di rimozione dei debris

cellulari.

1.2.1 Risultati clinici della BNCT su tumore metastatico epatico

Nel 2001, avendo ottenuto l’approvazione del Comtato Etico del Policlinico

S. Matteo e del Ministero della Salute, è stato dato l’avvio al programma

dell’applicazione clinica della BNCT su un fegato isolato[17]. La procedura,

applicata su 2 pazienti, comprendeva sostanzialmente tre fasi: la prima fase

16

chirurgica includeva la perfusione del fegato con una soluzione di 10BPA;

nella fase radioterapeutica il fegato isolato veniva lavato e raffreddato,

trasferito nella colonna termica del reattore nucleare Triga Mark II e

irraggiato con una fluenza neutronica di 4x1012 cm-2 corrispondente ad un

tempo di irraggiamento di circa 10 minuti; in seguito, nella seconda fase

chirurgica, il fegato veniva reimpiantato nel paziente.

Ai controlli successivi all'operazione, il fegato del primo paziente mostrava

chiari segni di necrosi nelle zone che in diagnosi erano state classificate

come sedi metastatiche, anche laddove le metastasi erano state rilevate solo

con un’ecografia intra-operatoria (alcune metastasi erano troppo piccole per

essere individuate con le attuali tecniche di imaging dall’esterno del corpo).

Questo primo paziente è sopravvissuto per 4 anni senza mostrare segni di

recidive che sono poi purtroppo sopraggiunte sia in sede epatica che

extraepatica, portandolo alla morte un anno dopo la loro individuazione.

Il secondo caso, trattato nel 2003, ha presentato un decorso peggiore in

quanto il paziente è deceduto dopo un mese in seguito ad una trombosi

dell'arteria epatica. In questo caso le condizioni iniziali del paziente erano

davvero pesantemente debilitate ed era nota una cardiomiopatia che poteva

gravemente influenzare l'esito del trattamento. L'analisi postmortem del

fegato ha comunque confermato il potenziale curativo della tecnica

17

TAOrMINA, mostrando zone necrotiche in corrispondenza di tutte le

metastasi: sia quelle accertate dall’esterno che quelle accertate nell’esame

intraoperatorio. Considerando la concentrazione di 10B nel tumore e nel

tessuto normale e quindi le dosi delle radiazioni assorbite, i quadri di questo

paziente sono buoni come lo sono stati per il primo; la durata della

procedura si è rilevata più breve nonostante le difficoltà insorte dalla

correzione chirurgica della suddetta anomalia vascolare.

1.2.2 Il follow up post operatorio

All’inizio il periodo post operatorio (cioè le prime tre settimane dopo la

BNCT) è stato molto simile in entrambi i pazienti che hanno mostrato

sintomi di insufficienza renale ed epatica e una precoce rabdomiolisi con

profonda astenia, inibizione dei tessuti maggiori e segni di indebolimento

celebrale. Queste manifestazioni cliniche sono apparse secondo una

sequenza definita e hanno mostrato una evoluzione simile, apparentemente

riconducibile a una sindrome. Possiamo attribuire ciò ad un grande aumento

dei mediatori tumorali, probabilmente citochine, prodotte come

conseguenza di una grande quantità di lisi cellulare. Dopo la BNCT in

questi noduli neoplastici si è osservata la presenza di aree necrotiche di

tessuto. Delle piccole aree di danno necrotico sono apparse nel fegato anche

18

quando nel periodo pre-operativo non erano state trovate metastasi. Questo

lascia supporre che sono state trattate anche neoplasie “nascoste” diffuse.

Il secondo paziente una volta operato ha mostrato delle complicazioni

Fig 2.: Aspetto macroscopico del fegato all’autopsia del secondo paziente 33 giorni dopo il trattamento. A sinistra, vista esterna della convessità e, a destra, sezione coronarica lungo il lobo destro. Aree necrotiche biancastre multiple sono diffuse sulla superficie parenchimale e all’interno dell’organo.

vascolari che consistevano in una trombosi dell’arteria epatica,

un’insufficienza cardiaca con uno squilibrio liquido ed edema polmonare.

Mascroscopicamente sulla superficie del fegato sono state trovate masse

biancastre di varie forme e dimensioni. (Figg 2) La corrispondente

microscopia ha evidenziato masse necrotiche di tipo coagulativo con

scomparsa dell’originale struttura istologica (Fig 3). Nella cicatrice

diaframmatica aderente al fegato sono state trovate infiltrazioni focali di

cellule di carcinoma del colon. Il normale tessuto epatico è stato sottoposto

a biopsia e non è stata trovata alcuna metastasi intraepatica.

19

Fig 3.: Sezioni istologiche colorate con ematossilina ed eosina osservate in campioni ottenuti dal secondo paziente. .

1.2.3 Discussione e conclusioni

Le considerazioni finali sono basate sui risultati ottenuti con le applicazioni

di una procedura interamente nuova con solo due pazienti..Si sono trovati

degli aspetti molto positivi in termini di efficienza oncologica. Altri aspetti

si sono rilevati meno favorevoli, discutibili e che richiedono miglioramenti.

Iniziando dagli aspetti positivi l’esperienza clinica conferma l’efficacia

della BNCT nel distruggere le popolazioni di cellule tumorali e l’alta

selettività di questo annientamento. Nessun altro tipo di terapia

antineoplastica può essere equiparabile. Questa dichiarazione è basata sui

risultati dell’indagine macroscopica e sulla valutazione microscopica del

20

fegato nel secondo paziente. La presenza delle cellule neoplastiche

multifocali nei noduli irraggiati testimonia un processo che permette la

graduale eliminazione delle popolazioni cellulari, in cui è rallentata la

capacità proliferativa dovuta al danno di radiazioni. La locazione di queste

cellule alla periferia delle masse necrotiche neoplastiche può essere

facilmente espiantata. L’attivo ruolo dei fagociti in seguito all’irraggiamento

con BNCT aumentano e si osservano numerose cellule di Kupffer nell’atto

di fagocitare detriti cellulari. Anche in termini di tempo di sopravvivenza si

sono riscontrati dati eccezionali poichè si sono ottenuti 44 mesi di buona

qualità di vita nel primo paziente, se messo a confronto con il tempo medio

di sopravvivenza di 4-10 mesi previsti dalla letteratura medica [18,19].

Un’altra affermazione che si è riscontrata è la prova del basso impatto della

radiazione neutronica sul tessuto normale epatico. Nonostante le diffuse

fibrosi epatiche che si sono riscontrate in entrambi i pazienti, la funzione

epatica, come valutato dal GEC, è migliorata nel primo paziente dopo la

BNCT (73% vs 63% pre-operazione). I disordini clinici e biochimici

osservati durante le tre settimane del periodo pre-operativo sono

un’espressione di una “sindrome post-irraggiamento”, che può essere

mediata dal rilascio di una grande quantità di citochine.

21

CAPITOLO 2

La BNCT e il trattamento dei tumori polmonari diffusi

I risultati positivi ottenuti nel trattamento mediante BNCT delle metastasi

epatiche diffuse ci hanno spinti a studiare la possibilità di estendere questa

tecnica al trattamento dei tumori diffusi del polmone. In questo caso

abbiamo esplorato anche la possibilità di effettuare il trattamento

irraggiando il torace con fasci esterni di neutroni, ossia senza fare ricorse

all’espianto degli organi.

2.1 Cancro polmonare: stato attuale della ricerca

Ogni anno, in tutto il mondo, il cancro viene diagnosticato a circa 10.9

milioni di persone e, nello stesso lasso di tempo, si stimano 6.7 milioni di

decessi per cause oncologiche. Ciò significa che circa il 12% dei decessi di

qualsiasi natura ha come causa una forma di cancro. Questa frazione varia

tra le diverse regioni del globo: si ha un minimo del 4% in Africa ed un

massimo del 23% nel Nord America, mentre l'Europa si caratterizza con un

19% di frequenza.

22

A livello mondiale e prescindendo dalla distinzione tra i sessi, gli studi

epidemiologici attuali danno come carcinoma maligno più comune quello

polmonare, con circa 1.4 milioni di nuovi pazienti ogni anno, equivalenti al

12.8% di tutti i nuovi casi diagnosticati (Fig. 4). Il 58%dei casi di questo

tumore compete ai paesi economicamente più sviluppati [20]. Statistiche

molto recenti, risalenti al 2006 e riferite alla sola area europea, danno invece

come più frequente il carcinoma alla mammella (13.5% di tutti i casi

diagnosticati), seguito da quello al colon retto (12.9%) e, infine, da quello

polmonare (12.1%) [21].

Fig. 4: tumori più comunemente diagnosticati escluso il NMSC1, stime mondiali nel 2002 1 NMSC = Non Melanoma Skin Cancer

23

Nel 2002, l'incidenza del carcinoma polmonare tra la popolazione maschile

italiana è risultata la più alta tra quelle di tutti i più comuni tumori, mentre

tra le donne è stata solo quarta, preceduta dal carcinoma mammario, del

colon retto e dell'utero [22] (Fig. 5). Queste incidenze sono in accordo con

l'aspetto noto e globale che il carcinoma polmonare predilige i pazienti

maschi, anche se nei Paesi occidentali da alcuni anni si sta assistendo ad un

lento ma costante aumento della vulnerabilità femminile.

Fig. 5: frequenza e mortalità dei tumori più comuni nella popolazione italiana al 2002

Per quel che riguarda la correlazione cancro-età, l’intervallo di tempo

statisticamente più

24

fragile risulta essere quello tra 55 e 65-70 anni che, vista l'aspettativa di vita

media nei Paesi sviluppati di 75.8 anni, fa del cancro al polmone una

malattia a considerevole impatto sociale ed economico. Di nuovo e sempre

per i Paesi tecnologicamente trainanti, da qualche anno si sta osservando un

aumento del numero di pazienti afferenti alle fasce più giovani.

Nonostante le numerose innovazioni sia sul piano diagnostico che su quello

terapeutico che hanno portato ad un incremento della sopravvivenza e della

qualità di vita dei pazienti, quello polmonare rimane il carcinoma con

peggior prognosi su scala globale, in grado di rendere conto del 18% di tutti

i decessi imputati al cancro (Fig. 6). In questo senso non c'è disaccordo con

le ultime statistiche europee che imputano al tumore polmonare il 19.7% dei

morti per cancro. Per l'esito tipicamente infausto della malattia è certamente

determinante il fatto che molti carcinomi polmonari vengono diagnosticati

in uno stadio già avanzato. Inoltre, molti pazienti sono fumatori abituali e

perciò presentano ulteriori danni cardiaci e polmonari che pregiudicano

l’impiego delle più efficaci e adottate opzioni terapeutiche, quali la

resezione chirurgica e le terapie multimodali. La più alta percentuale di

sopravvivenza a 5 anni dalla diagnosi si riscontra tra i pazienti statunitensi

(14%), mentre in Europa il valore è più basso (8%) ma comunque in

accordo con la media caratteristica dei Paesi tecnologicamente sviluppati.

25

Fig.6 : mortalità dei più comuni tumori, stime mondiali al 2002

2.2 Limiti e vantaggi della radioterapia convenzionale

La radioterapia è la tecnica più usata nei casi di carcinoma polmonare non

resecabile chirurgicamente, grazie alla sua capacità di eradicare grosse e

localizzate masse tumorali dalla regione toracica. Sebbene i primi impieghi

nella pratica medica siano stati molto stimolanti, ben presto sono emersi i

limiti di questa tecnica: una inaccettabile fallibilità a livello sistemico (stadi

avanzati metastatizzati) e un povero controllo locale, di norma positivo solo

nel 20-40% dei casi. Di fatto tutte le ricadute successive a cicli di

radioterapia possono essere ricondotte o ad una non perfetta circoscrizione

della sede del tumore primario o alla deposizione nella stessa di una dose

26

inadeguata, o a tutte e due le cause. D'altro canto, non si deve pensare che

per migliorare il controllo locale si possa semplicemente aumentare la dose

impartita al tumore; infatti questa via è fortemente limitata dai gravi effetti

collaterali sui tessuti sani, come polmoniti ed esofagiti, la cui incidenza,

come quella del controllo del tumore, aumenta proporzionalmente con

l'aumento della dose totale assorbita. I futuri sviluppo nel campo della

radioterapia devono quindi concentrarsi su due aspetti fondamentali: il

deposito della dose più alta e geometricamente accurata possibile nella sede

tumorale e la salvaguardia dei tessuti sani, in altre parole, la

massimizzazione del rapporto di dosi tra regioni istologicamente normali e

quelle interessate dalla malattia.

Nella pratica, la radioterapia può venire somministrata mediante fasci di

radiazioni di diversa natura: fotoni (tipicamente nella regione X) che

rappresentano la pratica radiogena più tradizionale, particelle cariche

leggere (elettroni) oppure pesanti (protoni o ioni di masse superiori, ad

esempio ioni carbonio o ferro), come ancora particelle neutre (neutroni).

Due aspetti sono di fondamentale importanza per capire i differenti benefici

e/o svantaggi

delle tecniche che impiegano le diverse radiazioni: la distribuzione di dose

nei tessuti in funzione dello spessore attraversato e l'efficacia biologica,

quantificata attraverso il parametro di Efficacia Biologica Relativa (RBE).

27

2.3 La BNCT nei tumori diffusi del polmone

La selettività della BNCT, come già detto in precedenza, è determinata dalla

microdistribuzione del 10B, piuttosto che dalla conformazione del campo

neutronico impiegato per il trattamento. Questo conferisce alla terapia una

spiccata indipendenza dall’anatomia del tumore e libera i terapisti dalla

necessità di conoscere in dettaglio la conformazione della massa da trattare

per progettare il più sicuro piano di irraggiamento. Questa proprietà della

BNCT è ancora più rilevante quando si ha a che fare con una forma

tumorale diffusa, il cui caso più eclatante è certamente quello della

metastatizzazione secondaria.

Il progetto WIDEST, finanziatio dall’INFN e attivato presso l'Università di

Pavia, si inserisce in questo contesto ed ha come obiettivo lo studio della

fattibilità della BNCT per il più largo spettro possibile di tumori maligni

diffusi. Incoraggiati dagli esiti positivi dei trattamenti condotti sulle

metastasi epatiche, nel 2005 è stato avviato un progetto di ricerca sui tumori

diffusi del polmone. A livello mondiale il carcinoma al polmone è la più

comune causa di morte di uomini e donne e il 14% del tasso di

sopravvivenza a 5 anni è rimane immutato da anni. Per questa ragione è

essenziale una nuova proposta e la validazione di una nuova terapia e nel

2005 è stato avviato il progetto WIDEST per iniziare uno studio sulla

28

fattibilità di una terapia mediante BNCT utilizzando l’esperienza e le

conoscenze dei gruppi che avevano già lavorato sulla ricerca del fegato. La

filosofia alla base del trattamento del polmone è identica a quella adottata

per il fegato, ma la realizzazione pratica richiede un cambiamento completo

di prospettiva. Se nel fegato si poteva evitare completamente l'irraggiamento

indesiderato di organi adiacenti facendo ricorso all'espianto, nel caso del

polmone si preferisce non percorrere questa strada in quanto l'asportazione

dell'organo implicherebbe dei pericoli maggiori per il paziente,

principalmente legati al collasso che l'organo subirebbe immediatamente

dopo l'estrazione dalla sede toracica. Per questo si preferisce effettuare

l'irraggiamento dall'esterno dell'intera regione toracica. E’ possibile

irraggiare il polmone con dei fasci di neutroni epitermici, che

nell'attraversare i primi strati dei tessuti biologici subiscono la

termalizzazione necessaria ad innescare le reazioni di cattura nella sede

tumorale, oltre a garantire un deposito di dose decisamente più blando dei

tessuti superficiali. Inoltre, la struttura spugnosa dell'organo e la bassa

densità (tre volte inferiore a quella del fegato), implicano una minima

attenuazione del campo neutronico, garantendo così degli ottimi livelli di

omogeneità delle grandezze di campo. In verità, per via del diametro medio

di un polmone umano, l’optimum di omogeneità viene raggiunto

prevedendo l'irraggiamento con due fasci contrapposti antero-posteriore e

postero-anteriore.

29

L'attività del gruppo di ricerca di Pavia, dopo aver studiato con simulazioni

Monte Carlo la distribuzione della dose in fantocci antropomorfi, ha

concentrato i suoi sforzi nell'elaborazione di un modello animale con cui

poter testare in vivo sia l'accumulo del drogante borato che l'irraggiamento

neutronico.

2.4 Il modello animale

Per ottenere campioni polmonari metastatici e tessuto polmonare normale

abbiamo utilizzato ratti BDIX con metastasi polmonari indotte da cellule di

colon adenocarcinoma [23]. Per indurre le metastasi negli animali è stata

usata la linea cellulare DHD/K12/TRb di colon carcinoma. La linea

cellulare è stata ottenuta da un colon adenocarcinoma indotto da 1,2

dimetilidrazina in ratti singenici BDIX, selezionata e clonata per la sua

capacità di indurre tumori progressivi e metastatici nell’ospite [24].

Le cellule possono essere mantenute a confluenza per molto tempo senza

apparenti cambiamenti nella biologia cellulare, compresa la tumorigenicità.

La linea cellulare cresce a confluenza cellule poligonali monostratificate in

fiaschette per tessuto di coltura in Ham's F10 medium con aggiunta di 10%

siero fetale di vitello. In una prima fase le metastasi erano indotte in ratti

30

BDIX (maschi, peso 250 g) con iniezione intrasplenica di 1.5 x 105 cellule

di colon-carcinoma in anestesia generale. Dopo l’iniezione veniva effettuata

la splenoctomia. In questo modo l’intervallo di tempo tra l’iniezione

cellulare e la comparsa delle metastasi tumorali del polmone era troppo

lunga: 20-27 giorni. Inoltre in alcuni animali le metastasi intaccavano solo il

fegato mentre i polmoni rimanevano sani.

Fig.7.: Immagine del torace di un ratto 10 giorni dopo l’iniezione di cellule D/K12/Trb .Lo spread metastatico è visibile su tutta la superficie polmonare e in entrambi i polmoni. Per ottenere un modello più efficiente è stata utilizzata una tecnica

chirurgica per indurre il tumore. Le cellule tumorali sono state iniettate via

vena cava inferiore, con la stessa dose di 1.5 x 105 cellule. Tutti i ratti

31

sottoposti a questo trattamento hanno dato risultati positivi: 10-12 giorni

dopo i polmoni presentavano delle visibili metastasi macroscopiche (Fig.7).

2.5 Misura della concentrazione di 10B nel polmone di ratto

Per la misura della concentrazione del boro è stato utilizzato il modello

animale descritto nel paragrafo precedente. La metodologia di induzione

delle metastasi polmonari ci ha permesso di somministrare il BPA dopo10

giorni dall’iniezione di cellule tumorali. La soluzione di BPA 0.14 M è stata

preparata combinando BPA (10B enriched, L-isomer) con un eccesso di

fruttosio 10% molare in acqua. Il pH è stato portato a 9.5-10 con NaOH, e

dopo pochi minuti il pH è stato riportato a7.4 con HCl [25]. Sono stati

studiati due metodi di infusione: intra-venosa e intra-peritoneale. Alcuni

ratti sono stati usati per testare l’efficacia di amministratione del metodo, ed

è stata scelta la via intra-peritoneale perché era più facile da realizzare e con

buoni risultati riguardanti i valori della concentrazione di boro.

Sono stati trattati circa 50 ratti i cui risultati sono stati utilizzati per

costruire la curva della farmacocinetica del BPA e per studiare la

distribuzione spaziale del boro nel tessuto polmonare. I ratti sono stati

sacrificati a intervalli regolari dopo l’infusione della BPA; dopo il sacrificio

32

dei ratti gli organi sono stati congelati in azoto liquido e poi tagliati con un

criostato Leyca allo spessore di 10 μm e colorati con ematossilina ed eosina.

Le fettine di tessuto sono state organizzate in coppia o in triplette a seconda

del tipo di analisi. Le fettina sono state tagliate e messe in coppia per

l’imaging del boro, e ciascuna di queste consisteva in un primo campione

spesso 60 μm direttamente depositato su una pellicola sensibile per la

autoradiografia neutronica, e un secondo spesso 10 μm depositato su un

vetro per l’analisi morfologica utilizzando il metodo do colorazione

standard di ematossilina-eosina. Per l’analisi quantitativa una fettina spessa

60 μm è stata depositata su un dischetto di mylar per essere irraggiato nella

Colonna Termica del reattore, una seconda fettina è stata preparata per

l’analisi morfologica, e una terza fettina di nuovo spessa 60 μm è stata

depositata su una pellicola per la neutronigrafia.

Le tecniche perfezionate dal gruppo di Pavia riguardano l'imaging della

distribuzione del 10B (autoradiografia neutronica) e la sua quantificazione

nei campioni di tessuto prelevati dal ratto (spettrometria α). La

neutronigrafia consente di ottenere immagini della biodistribuzione di 10B in

scala di grigi. L'immagine risulta dallo sviluppo in soluzione di NaOH di

una pellicola di nitrato di cellulosa (CN85, LR115) o di policarbonato

(CR39) che ha la proprietà di essere sensibile alle particelle ad alto LET ma

trasparente alla luce e ai raggi γ. Lo sviluppo mette in evidenza le tracce

33

lasciate dalle particelle α prodotte nella reazione di cattura sul 10B. Infatti,

per ottenere una neutronigrafia è necessario irraggiare con neutroni un

campione di tessuto previamente depositato sulla pellicola. La valenza della

neutronigrafia per la quantificazione delle concentrazioni di 10B nei tessuti è

doppia. Innanzitutto la radiografia mette in evidenza per semplice confronto

l'accumulo selettivo del boro da parte del tessuto tumorale. Come detto,

l'immagine radiografica si presenta come una scala di grigi, in cui le zone

più scure derivano da un flusso elevato della radiazione ad alto LET e sono

quindi in corrispondenza di regioni tissutali in cui l’accumulo del 10B è stato

considerevole. Confrontando la radiografia con il relativo esame istologico è

evidente la corrispondenza tra le zone scure della prima e quelle

riconosciute come cancerose della seconda.(Fig.8)

Fig 8: confronto tra l’esame istologico (sinistra) e l’autoradiografia neutronica (destra) di due sezioni successive di tessuto polmonare (40 μm tra le due)

34

In secondo luogo, la neutronigrafia può essere impiegata per stimare

quantitativamente le concentrazioni di drogante riscontrate nei campioni. In

tal caso, i tempi di irraggiamento e sviluppo devono essere stabiliti in

funzione della qualità delle tracce indotte dalle particelle, che devono essere

ben separate per consentirne il conteggio. A questo punto, si stima la

concentrazione di boro acquisendo in modo digitale le immagini e

analizzandole con un opportuno software. Un ulteriore impiego della

neutronigrafia è quello di strumento ausiliario alle tecniche analitiche

propriamente quantitative, volte anche loro alla determinazione delle

concentrazioni di 10B. Tutte queste tecniche soffrono del problema del

campione misto, ossia del fatto che un campione di tessuto malato non

presenta mai una composizione omogenea, ma necessariamente alterna

regioni di parenchima sano ad altre occupate dalle metastatasi. Inoltre, entro

la medesima regione tumorale l'istologia e la relativa funzionalità cambiano

profondamente, passando, ad esempio, da cellule proliferanti a nuclei di

necrosi. In questi casi, la concentrazione di 10B risultante dalle analisi è da

intendersi come un valore medio. Questa stima è spesso molto lontana dal

valore vero relativo tanto al parenchima sano quanto al tumore. Pertanto, per

separare i contributi dei due tipi tissutali si deve conoscere la frazione di

volume totale occupata dal tumore e dal tessuto sano. Per ottenere questi

pesi si analizza in modo digitale l'immagine istologica, aiutandosi con la

35

corrispondente neutronigrafia per meglio selezionare le aree interessate dal

tumore.

L'altra tecnica impiegata a Pavia per misurare i livelli di boro nei tessuti dei

campioni polmonari è la spettrometria α. In questo caso, si determinano le

concentrazioni a partire dallo spettro energetico delle particelle cariche

emesse nella reazione di cattura (n,α) sul 10B. Si deve dunque irraggiare

una fettina di tessuto polmonare all'interno della colonna termica e

raccogliere le particelle cariche grazie ad un opportuno rivelatore posto di

fronte al campione (rivelatore a Si). La descrizione di questa tecnica non è

oggetto di questa tesi.

2.6 Risultati degli studi della farmacocinetica del PBA nel modello animale

Lo studio di farmacocinetica, condotto a Pavia ha coinvolto ad oggi una

popolazione complessiva di 50 ratti, senza tener conto del gruppo di

controllo che non è stato sottoposto ad alcun tipo di trattamento e da cui si è

potuto studiare il background naturale di 10B dei tessuti. Da questi controlli

si è ottenuta una concentrazione di fondo inferiore a 0.5 ppm, compatibile

con l'analogo risultato ottenuto nella ricerca sul fegato. Questo primo studio

sul modello animale ha chiarito l'andamento temporale dei tassi di 10B nei

tessuti sano e tumorale, oltre al rapporto relativo tra i due che rappresenta la

36

discriminante per la fattibilità della BNCT per il polmone. In particolare, le

misure di concentrazione sono state effettuate sacrificando gli animali dopo

1, 2, 4, 6 e 8 ore dall'infusione del BPA.(Fig.9)

Fig 9: concentrazioni di 10B nelle metastasi e nel tessuto polmonare sano e relativo rapporto in funzione del tempo trascorso dalla somministrazione del BPA.

Dal secondo grafico riportato in figura 9, si può osservare come il rapporto

R(t) = CT(t) / CH(t) sia massimo e pari circa a 4.5 dopo 4 ore dall'infusione

del drogante (CT(t): concentrazione di 10B nel tumore all'istante t, CH(t):

concentrazione di 10B nel parenchima sano all'istante t). Osserviamo in

conclusione che è in corso un ampliamento della statistica relativa a questi

valori, mediante il trattamento di altri ratti.

37

CAPITOLO 3

Test di efficacia della BNCT nelle metastasi polmonari di

ratto

In questo capitolo viene descritta la parte sperimentale della tesi. Il lavoro è

consistito nella realizzazione di un test in vivo-vitro di efficacia del

trattamento BNCT del tumore metastatico polmonare usando cellule

DHD/K12/TRb trattate con BNCT e inoculate in ratti BDIX. I risultati di

questo lavoro saranno utili in seguito per testare meglio l’efficacia della

BNCT in questo tipo di trattamento costruendo una curva di sopravvivenza

di ratti BDIX; dopo l’ induzione delle metastasi polmonari i ratti sarebbero

sottoposti al trattamento BNCT completo (infusione di una soluzione di

BPA e irraggiamento presso il reattore Triga Mark II in modo da esporre la

zona toracica ad un flusso neutronico adeguato) e poi sarebbe costruita la

curva di sopravvivenza.

Cellule DHD/K12/TRb sono state incubate in medium contenente BPA e in

seguito irraggiate in vitro ad una prestabilita dose neutronica. Dopo

l’irraggiamento le cellule sono state inoculate in ratti BDIX per valutare la

loro capacità di indurre metastasi polmonari. Sono stati studiati tre gruppi di

38

ratti: un gruppo A a cui sono state inoculate cellule preventivamente

sottoposte a trattamento BNCT in vitro (irraggiamento neutronico di cellule

contenenti boro), un gruppo B in cui sono state inoculate cellule sottoposte

ad irraggiamento neutronico in vitro in assenza di boro; e un gruppo di

controllo C in cui sono state inoculate cellule non sottoposte ad alcun

trattamento. Dopo ogni irraggiamento una quota delle cellule è stata

utilizzata per valutarne la sopravvivenza attraverso il test di piastramento.

3.1 Trattamento BNCT in vitro

La linea cellulare utilizzata, come già specificato, è la DHD/K12/TRb

selezionata e clonata per la sua capacità di indurre tumori progressivi e

metastatici in animali singenici [26]. Le cellule sono state fatte crescere in

mezzo di coltura HAM F10 (50:50 v/v) arricchito con il 10% di siero fetale

di vitello (FBS), una piccola quantità di glucosio DMEM e l’1% di

gentamicina come protezione batterica. Per sottooporre le cellule a

trtattamento BNCT queste sono state incubate per 4 ore in un mezzo di

coltura con aggiunta di BPA (10B al 95%) ad una concentrazione di

80μg/ml; prima dell’irraggiamento neutronico sono state sciacquate in PBS

per rimuovere ogni traccia di BPA non assorbito. La solubilizzazione della

BPA avviene in fruttosio 6M (2ml); il pH viene portato al valore di 7.5

aggiungendo NaOH ed eventualmente HCL. Le cellule vengono poi

sottoposte ad irraggiamento con neutroni termici nel reattore TRIGA Mark

39

II dell’Università di Pavia alla potenza di 250 KW per 10 minuti. Il flusso

neutronico termico nella posizione di irraggiamento era di 1 . 1010 cm-2 s-1.

Le cellule irradiate senza arricchimento di Boro sono state prese come

controllo.

3.1.1 Efficienza di piastramento

Una cellula che sopravvive ad un trattamento con radiazione è quella che

mantiene una capacità proliferativa illimitata, mentre quella che fallisce i

propri tentativi di proliferazione è ritenuta annientata, nonostante essa possa

dividersi o possa rimanere intatta nella popolazione cellulare. Il bilancio

della sopravvivenza delle cellule dopo l’irraggiamento viene fatto

verificando la loro capacità di produrre un largo numero di progenie, cioè di

produrre una colonia. Una delle più comuni procedure per testare la

sopravvivenza cellulare è il saggio di piastramento in vitro.

Le cellule vengono incubate in un medium appropriato a 37°C.

L’attaccamento delle cellule sulla superficie delle piastre tessutali e quelle

che mantengono la capacità proliferativa crescono formando discrete

colonie di cellule. Dopo un certo numero di giorni di incubazione, che

dipendono dal tasso di crescita della cellula, i piatti sono prelevati

dall’incubatore e le colonie sono fissate e colorate in modo da essere

facilmente contate. (fig. 10).

40

Fig.10. Test di efficienza di piastramento. Capsule Petri seminate con 100 cellule della linea di colon carcinoma DHD/K12/TRb, fissate e colorate con blu di Toluidina dopo 8 giorni di coltura. Esempi di cellule di controllo (n=68, A) e di cellule trattate con boro e irraggiate con neutroni, le quali hanno ricevuto una dose di 0.5 Gy (n=30, B) e che hanno quindi una sopravvivenza di 30/68 = 44%.

Le cellule che non mantengono la capacità proliferativa in seguito

all’irradiazione possono ancora dividersi poche volte, ma formano solo delle

minuscole colonie “abortive”. Se una colonia contiene più di 50 cellule

(cioè deriva da una singola cellula da almeno sei cicli di divisione) è di

solito in grado di avere una crescita continua e si può ritenere che derivi da

una cellula sopravvissuta. L’efficienza di piastramento (PE) di una

popolazione cellulare è calcolata dividendo il numero delle colonie formate

per il numero delle cellule piastrate. Con questa tecnica può essere costruita

una curva della sopravvivenza cellulare in funzione della dose assorbita in

41

seguito agli irraggiamenti; si può così studiare l’efficacia della BNCT su

questo tipo di cellule [27].

3.1.2 Sopravvivenza delle cellule post irraggiate

Le cellule dopo essere state incubate per 4 ore in terreno di coltura arricchito

con 80 ppm di 10B sono state irraggiate in un campo di neutroni termici per

10 minuti a 250 kW; la dose di radiazioni assorbita dalle cellule è di 34Gy.

Le cellule irraggiate e quelle non irraggiate, utilizzate come controllo, con e

senza arricchimento di Boro, sono state piastrate in 5 Petri ripetute per

ciascuna concentrazione selezionata con vaschette con un range che va da 1

x 106 a 5 x 106 cellule irraggiate con l’arricchimento di Boro e da 50 a 250

in tutte le altre rimanenti condizioni studiate. Abbiamo ottenuto un PE di

0.05± 0.01% (SD) di cellule arricchite con boro e irraggiate, contro il PE di

94.4 ± 1% di cellule arricchite con il boro e non irraggiate, e un PE di 3 ±

0,5% per cellule irraggiate ma senza boro.

3.3 Studi in vivo

Una parte delle cellule irraggiate come descritto nel paragrafo precedente è

stata usata per verificare la loro capacità di proliferazione una volta

42

inoculate nel ratto attraverso la vena cava inferiore. Una popolazione di 30

ratti è stata suddivisa in 3 gruppi da 10; al primo gruppo (A) sono state

inoculate 1.5 milioni di cellule DHD/K12/TRb dopo essere state trattate in

terreno di coltura con BPA ed esposte ai neutroni come detto sopra; al

secondo gruppo (B) e' stato inoculato lo stesso numero di cellule sottoposto

allo stesso irraggiamento delle precedenti ma senza esposizione al 10B; al

terzo gruppo (C) e' stato inoculato lo stesso numero di cellule che però non

avevano subito alcun trattamento (controllo). Ad intervalli di 1 mese

dall'inoculo delle cellule, un animale per ogni gruppo veniva sacrificato; gli

animali che morivano prima della data prefissata venivano sottoposti ad

autopsia e il polmone era analizzato come negli altri casi.

Una volta sacrificato l’animale, il polmone veniva prelevato e conservato in

formalina al 10%. Dopo fissazione in paraffina dai campioni di polmone

venivano ricavate fettine di tessuto depositate su vetrino, trattate con eosina-

ematossilina e analizzate al microscopio ottico. La metodica di colorazione

“ematossilina-eosina” prevedeva:

1) 15 minuti in Ematossilina

2) 20 minuti in acqua di fonte corrente

3) passaggio in acqua distillata

4) 40 secondi in Eosina

43

5) Successiva scala alcolica per 2-3 minuti in ogni alcool a partire da

alcool 70°, alcool 80° alcool 95°, assoluto, assoluto/xilolo ed infine

xilolo.

Per l’osservazione al microscopio ottico i preparati venivano montati con

“Entellan”.

Un’ altra popolazione di 30 ratti suddivisa con le stesse modalità di prima in

tre gruppi A, B e C (10 animali in ogni gruppo) è stata sottoposta a follow

up per determinare la loro sopravvivenza. Tutte le procedure chirurgiche

sono state portate a termine in anestesia generale in condizioni asettiche

secondo il Commettee Sperimentale ed Etico degli Animali dell’Università

di Pavia.

I dati di sopravvivenza dei 3 gruppi sono stati riportati nel grafico di

Kaplan-Meier (Fig.11).

44

Fig.11. Il grafico di Kaplan-Meier rappresenta la sopravvivenza dei ratti nei tre gruppi analizzati. Al 4 mese di follow up la sopravvivenza del gruppo A (n=10) era del 90%, paragonata allo 0% del gruppo C ( n=10) (p<0.001).

Dal grafico si osserva che tutti gli animali in gruppo C sono morti entro un

mese; mentre oltre il’90% dei ratti in gruppo A, ossia quelli inoculati con

cellule trattate con BNCT, a di 4 mesi erano ancora vivi. L’efficacia del

trattamento BNCT risulta evidente anche quando si confronta la percentuale

di sopravvivenza di questo gruppo con quella del gruppo B dei ratti

irraggiati con neutroni ma in assenza di B.

45

3.4 Caratterizzazione istologica della malattia polmonare metastatica in

funzione del tempo

Per valutare la presenza del tumore metastatico e la sua evoluzione a livello

tessutale il polmone è stato espiantato e sottoposto ad esame istologico. I

polmoni dei ratti del gruppo A (inoculati con cellule sottoposte a trattamento

BNCT) sacrificati dopo un mese dal trattamento. A livello macroscopico

(fig.12a) si osservano polmoni integri di colore rosa come da tessuto sano; il

polmone presenta una struttura anatomica di dimensioni normali e ben

identificabile. Si nota, dall’istologia, un ispessimento del parenchima dato

anche dall’invasione di cellule infiammatorie, risultato che indica una forte

reazione immunitaria, con parecchie aree di enfisema e atelettasia. Inoltre, è

stata constatata l’assenza del tumore (fig. 12b).

46

Fig 12 (a.b) immagini rappresentative dopo un mese dal trattamento di ratti che erano satati inoculati con cellule trattate in vitro con la BNCT(gruppo A), le quali mostrano l’assenza di metastasi e la corrispondente istologia mostra cambiamenti nel tessuto quali atelettasia ed enfisema. Fig 1 (c,d) immagini rappresentative dopo un mese dal trattamento di ratti (Gruppo C) che erano satati inoculati con cellule non trattate, la cui istologia mostra la presenza di palle metastatiche. (istologia mag. x10)

Tutti i campioni osservati non presentano cellule neoplastiche organizzate

sotto forma di ammassi rotondeggianti. Si osservano invece nella maggior

parte dei camiponi ampie aree di tessuto enfisematoso dovuto alla

dilatazione degli alveoli polmonari con atrofia e scomparsa dei setti

alveolari. Rispetto al tessuto polmonare normale si osservano grossi spazi

otticamente vuoti delimitati da setti alveolari marcatamente distesi. Si

47

osservano inoltre ampie aree di tessuto ispessito con infiltrato di cellule del

sistema infiammatorio. Tale osservazione è da considerarsi un quadro tipico

di atelettasia, che consiste in diminuzione del contenuto aereo del polmone

con collasso degli alveoli. Le pareti degli alveoli si avvicinano l’una all’altra

così da dare l’impressione che il tessuto polmonare sia più ricco di cellule

del solito. I capillari sono in genere dilatati.

Le fig.12c) e (d) si riferiscono a ratti inoculati con cellule non sottoposte a

trattamento BNCT (gruppo C). Tutti questi ratti sono morti entro un mese.

Come si vede nella fig.12c), a livello polmonare, si osservano

macroscopicamente numerose aree di colore biancastro e di piccole

dimensioni ampiamente diffuse su tutto il parenchima polmonare. Tali

polmoni presentano un aumento di volume e un colore rossastro che indica

iperemia. All’esame istologico (fig. 12d) si osservano due ampie aree

neoplastiche di forma rotondeggiante localizzate nel parenchima polmonare.

Tutti gli animali che avevano avuto questo trattamento presentavano

all’esame istologico lo stesso quadro: presenza di numerose cellule

neoplastiche infiltranti il parenchima polmonare, per lo più ammassate sotto

forma di aree rotondeggianti capsulate. Il restante parenchima polmonare

presentava quadri di enfisema o aree con alveoli normali.

48

Sono stati inoltre analizzati e presi in esame i polmoni degli animali del

gruppo B; in questo caso le cellule erano state semplicemente irraggiate con

neutroni senza aver subito l’esposizione alla BPA; in pratica queste cellule

non erano state trattate con BNCT. Sono stati analizzati ratti sacrificati a 1 e

a 4 mesi dall’inoculo delle cellule. L’istologia dei ratti del gruppo B

sacrificati dopo 1 mese presenta aree più o meno compromesse da

ispessimenti a livello alveolare e da atelettasia, ma non sono state

identificate cellule tumorali che si organizzino sotto forma di aree

rotondeggianti. Nei ratti dello stesso gruppo B, sacrificati dopo 4 mesi

dall’inoculo, all’esame istologico si notava una sostituzione totale del

parenchima polmonare con cellule neoplastiche invadenti gli alveoli; si

osserva la presenza di tessuto collagene avvolgente le aree neolplastiche di

forma rotondeggiante che si formano in diversi punti del parenchima; le

strutture di aree neoplastiche in alcuni punti sono ben localizzate sotto

forma di noduli sferiformi. E’ stato dedotto che in questo gruppo di ratti lo

attecchmentoi neoplastico avviene dopo almeno 2 mesi dall’inoculo; ossia il

semplice irraggiamento neutronico delle cellule in assenza di boro ha

l’effetto di ritardare l’attecchimento del tumore.

49

CAPITOLO 4

Conclusioni e sviluppi futuri

In questa tesi sono stati riportati i risultati di esperimenti che preludono ad

un test di efficacia della BNCT in vivo in un modello animale di metastasi

polmonari, come esempio di tumore polmonare diffuso.

Gli studi in vitro hanno messo chiaramente in evidenza come la BNCT porti

ad una inibizione significativa della sopravvivenza delle cellule tumorali

della linea DHD/K12/TRb del carcinoma del colon nell’animale.

Le cellule tumorali trattate in vitro con la BNCT vedono significativamente

ridotta la capacità di indurre metastasi nel modello animale di ratto.

Nel caso delle cellule irraggiate solo con i neutroni e in assenza di boro

supponiamo che il danno prodotto a livello di DNA risulti parziale e quindi

suscettibile di riparazione da parte di alcune cellule. Il numero ridotto di

cellule sopravvissute produce una tardiva comparsa delle metastasi; perciò

50

l’irraggiamento con soli neutroni da un punto di vista terapeutico non

presenta un reale vantaggio

Nonostante i risultati presentati siano preliminari, possono essere fatte due

osservazioni in questa fase iniziale dello studio:

a) un numero insignificante ma non trascurabile di cellule tumorali

sono resistenti alla BNCT sotto ideali condizioni di irraggiamento ad

una dose neutronica predefinita di rilevanza clinica; queste cellule

sono in grado di mantenere la loro capacità di indurre una patologia

metastatica al polmone in un modello animale, come è evidente in

un animale del gruppo A che ha sviluppato metastasi;

b) è stata osservata una struttura polmonare caratterizzata da atelettasia

ed enfisema in animali inoculati con cellule irraggiate, anche in

assenza di esposizione da radiazione diretta dell’animale; questo

suggerisce che i debris cellulari e quindi i prodotti dell’apoptosi

associata introducono nell’interstzio vascolare polmonare una

risposta infiammatoria e dei processi di guarigione con il risultato

finale di un danno strutturale al tessuto polmonare normale,

indipendente dall’irraggiamento. Questo scenario clinico può essere

riprodotto in pazienti sottopposti alla terapia con BNCT dove la

morte di cellule tumorali all’interno delle metastasi polmonari

diffuse, in mancanza di una pulizia del tessuto devitalizzato, può

51

provocare simili reazioni infiammatorie acute aggravando perciò una

già anticipata polmonite.

In un prossimo futuro si spera di ottenere informazioni più complete

attraverso un test in vivo nello stesso modello animale usato in questo

lavoro di tesi. Dopo aver indotto le metastasi polmonari in un gruppo di

ratti, si pensa di sottoporre questi ratti ad irraggiamento neutronico dopo la

perfusione di BPA-Fruttosio E’ già stato realizzato un sistema che

permetterà di irraggiare i ratti nella colonna termica del reattore in modo da

esporre al flusso neutronico solo la zona toracica e proteggendo il resto del

corpo dell’animale. Si spera di ottenere utili informazioni sulla possibilità di

applicare la BNCT al trattamento dei tumori polmonari diffusi attraverso lo

studio della sopravvivenza della popolazione di ratti trattati e attraverso

l’analisi degli effetti indotti nell’animale dal trattamento.

52

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