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STRUTTURA E FUNZIONE DI BIOMOLECOLE

Predizione della Struttura Tridimensionale della proteina umana ETHE-1 con Homology Modeling

Sofia Cividini

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INTRODUZIONE

Lo scopo del presente lavoro è stato quello di riuscire a predire attraverso

Homology Modeling un modello tridimensionale della struttura della proteina

umana ETHE1 che è presente nella matrice mitocondriale e di cui si conosce

soltanto la sequenza primaria. Il gene che codifica per questa proteina, quando è

mutato, è responsabile di una grave e devastante malattia metabolica infantile

detta Encefalopatia Etilmalonica. Per poter attuare questo progetto è stato quindi

necessario ricercare degli omologhi di ETHE1 di cui era già stata risolta

empiricamente la struttura tridimensionale attraverso cristallografia a raggi-X o

NMR ed utilizzare poi il programma Swiss-PDBViewer per l’ Homology Modeling

come verrà descritto in seguito.

Homology Modeling

L’ Homology Modeling rappresenta uno dei migliori metodi attualmente utilizzati

per la predizione della struttura tridimensionale (3D) di quelle proteine di cui si

conosce solamente la sequenza primaria e deriva dalla teoria della selezione

naturale. Lo scopo dell’ Homology Modeling è quindi quello di costruire un

modello 3D per una determinata proteina di struttura sconosciuta (target

sequence) in base alla similarità di sequenza con proteine (template) le cui

strutture tridimensionali sono invece già state risolte per mezzo delle comuni

tecniche cristallografiche (cristallografia a raggi-X o NMR). Per potere costruire un

modello realistico occorre che vengano rispettate due condizioni:

1. La proteina target e la/le proteine stampo devono avere una percentuale di

similarità di sequenza primaria sufficientemente alta (25-30% o più); in

questo caso si è sicuri del fatto che le due o più proteine considerate siano

degli omologhi, cioè derivino da un progenitore ancestrale comune. Le

strutture 3D delle proteine appartenenti ad una certa famiglia sono più

conservate delle loro sequenze primarie per cui, se esiste una buona

percentuale di similarità di sequenza primaria, si può di solito assumere

che esista anche una buona similarità strutturale.

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2. E’ necessario che venga fatto un allineamento sufficientemente accurato tra

la sequenza target e le sequenze stampo considerate. L’ Homology Modeling

procede modellando il backbone della sequenza target in base a quello della

sequenza stampo, usando l’allineamento di sequenza per decidere dove

posizionare ciascun residuo. Perciò, la qualità dell’ allineamento di sequenza

è di cruciale importanza; benché esistano molti strumenti che permettono

di fare gli allineamenti in modo automatico, successivamente è sempre

necessario ricontrollare ed aggiustare manualmente l’allineamento stesso

per migliorarne ulteriormente la qualità (solitamente ci si basa sugli

allineamenti multipli forniti da ClustalW).

All’ inizio, la tecnica di routine dell’ Homology Modeling fa in modo che il

backbone della proteina target venga accomodato nella stessa maniera di quello

della proteina stampo. Questo significa che non solo le posizioni dei Cα, ma anche

gli angoli phi e psi e le strutture secondarie siano costruite in modo identico alla

proteina stampo. Successivamente, i packages di Homology Modeling più

sofisticati riescono ad aggiustare le posizioni delle catene laterali per ridurre al

minimo le collisioni e possono offrire inoltre strumenti di minimizzazione

dell’energia o di dinamica molecolare che rappresentano tutti dei tentativi di

miglioramento del modello. Anche se due proteine hanno un’ elevata identità di

sequenza ed una struttura secondaria e terziaria molto simile (folds identici), esse

non avranno comunque mai un backbone esattamente uguale, neanche in

condizioni comparabili. Per questo motivo, ci si deve aspettare che un modello

ricavato con Homology Modelling non sia proprio del tutto identico alla struttura

reale. Tutte le differenze nelle strutture del backbone proteico sono quantificate

attraverso un parametro detto rmsd, che sta per root mean square deviation e si

riferisce alle posizioni degli atomi di Cα. Un modello può essere considerato

“sufficientemente accurato” quando il suo rmsd si trova all’interno dell’ intervallo

di deviazioni osservate per le strutture sperimentali che mostrano un livello di

identità di sequenza simile al target ed alle sequenze stampo. Esempio: se noi

definiamo che un buon modello di predizione di struttura ha un valore di rmsd

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un’identità di sequenza >=60% con la proteina target affinché si abbia una

percentuale di successo maggiore del 70%.

Errori nei modelli costruiti con Homology Modeling

Quando la similarità tra la proteina-target e le proteine-stampo diminuisce, gli

errori nel modello aumentano. Vediamo quali sono i tipi di errori che si possono

principalmente verificare:

� Errori nell’impaccamento delle catene laterali → quando le sequenze

divergono, l’impaccamento delle catene laterali nel core proteico cambia.

Gli errori nelle catene laterali sono critici se si verificano in regioni che

sono coinvolte nella funzione della proteina (sito-attivo e siti di binding di

ligandi)

� Distorsioni e shifts nelle regioni correttamente allineate → Come

conseguenza della divergenza delle sequenze, la conformazione della

catena principale cambia anche se il fold rimane lo stesso.

� Errori nelle regioni senza uno stampo → i segmenti della sequenza

target che non hanno una regione equivalente nella struttura stampo (per

esempio: inserzioni o loops) rappresentano le regioni più difficili da

modellare.

� Errori dovuti ad un errato allineamento → Questi rappresentano il

grosso degli errori che vengono commessi nell’ Homology Modeling,

specialmente quando l’identità di sequenza tra target-stampo diminuisce al

di sotto del 30%. Comunque gli errori di allineamento possono essere

minimizzati in due modi:

1. di solito è possibile usare un gran numero di sequenze per costruire un

allineamento multiplo anche se la maggior parte di queste sequenze non

ha strutture 3D note; gli allineamenti multipli sono in genere più realistici

degli allineamenti a coppie.

2. si può migliorare l’allineamento modificando iterativamente quelle regioni

nell’allineamento stesso che corrispondono agli errori predetti nel modello.

� Stampi non corretti → questo diventa un potenziale problema quando le

proteine che sono usate come stampo sono solo lontanamente correlate al

target (identità di sequenza

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Valutazione dei modelli L’informazione che può essere ricavata da un modello di predizione di struttura

dipende dalla qualità del modello stesso. Diventa quindi essenziale stimare

l’accuratezza del modelli 3D ricavati con l’ Homology Modeling per poterli poi

correttamente interpretare. Il modello può essere valutato sia nella sua interezza

che a partire da singole regioni. Esistono molti programmi e server che

permettono di valutare un determinato modello (PROCHECK, ERRAT, BIOTECH,

AQUA, SQUID, ecc). Il primo passo nella valutazione di un modello è quello di

verificare che il modello abbia il corretto fold. Un modello avrà il fold corretto se:

� sarà stata scelta la giusta sequenza-stampo

� la sequenza-stampo sarà stata allineata approssimativamente in modo

corretto con la sequenza-target

Il fold di un modello può essere valutato in vari modi:

� attraverso un’alta similarità di sequenza con la proteina-stampo più vicina

� attraverso un’ energia basata sullo Z-score

� attraverso la conservazione nella sequenza target di residui chiave per la

funzione o la struttura della proteina stessa

Una volta che è stato accertato il fold del modello, una valutazione più dettagliata

della sua accuratezza può essere ottenuta in base alla similarità tra il target e le

sequenze-stampo. Un’ identità di sequenza superiore al 30% garantisce in linea

generale un modello di predizione relativamente buono per via delle ben note

relazioni tra similarità di struttura e di sequenza tra due proteine, della natura

geometrica del modeling che forza il modello ad essere quanto più vicino

possibile allo stampo e dell’ incapacità dell’attuale procedura di modeling di

recuperare un allineamento sbagliato.

ETHE-1

Le mutazioni che colpiscono il gene che codifica per la proteina ETHE1 sono

responsabili dell’ Encefalopatia Etilmalonica, che è una patologia metabolica

infantile estremamente grave che colpisce il cervello, il tratto gastro-intestinale ed

i vasi periferici. Nei pazienti affetti da questa sindrome si trovano alti livelli di

acido etilmalonico nei fluidi corporei e una grande diminuzione dell’ attività della