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STRUTTURA E FUNZIONE DI BIOMOLECOLE

Predizione della Struttura Tridimensionale della proteina umana ETHE-1 con Homology Modeling

Sofia Cividini

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INTRODUZIONE

Lo scopo del presente lavoro è stato quello di riuscire a predire attraverso

Homology Modeling un modello tridimensionale della struttura della proteina

umana ETHE1 che è presente nella matrice mitocondriale e di cui si conosce

soltanto la sequenza primaria. Il gene che codifica per questa proteina, quando è

mutato, è responsabile di una grave e devastante malattia metabolica infantile

detta Encefalopatia Etilmalonica. Per poter attuare questo progetto è stato quindi

necessario ricercare degli omologhi di ETHE1 di cui era già stata risolta

empiricamente la struttura tridimensionale attraverso cristallografia a raggi-X o

NMR ed utilizzare poi il programma Swiss-PDBViewer per l’ Homology Modeling

come verrà descritto in seguito.

Homology Modeling

L’ Homology Modeling rappresenta uno dei migliori metodi attualmente utilizzati

per la predizione della struttura tridimensionale (3D) di quelle proteine di cui si

conosce solamente la sequenza primaria e deriva dalla teoria della selezione

naturale. Lo scopo dell’ Homology Modeling è quindi quello di costruire un

modello 3D per una determinata proteina di struttura sconosciuta (target

sequence) in base alla similarità di sequenza con proteine (template) le cui

strutture tridimensionali sono invece già state risolte per mezzo delle comuni

tecniche cristallografiche (cristallografia a raggi-X o NMR). Per potere costruire un

modello realistico occorre che vengano rispettate due condizioni:

1. La proteina target e la/le proteine stampo devono avere una percentuale di

similarità di sequenza primaria sufficientemente alta (25-30% o più); in

questo caso si è sicuri del fatto che le due o più proteine considerate siano

degli omologhi, cioè derivino da un progenitore ancestrale comune. Le

strutture 3D delle proteine appartenenti ad una certa famiglia sono più

conservate delle loro sequenze primarie per cui, se esiste una buona

percentuale di similarità di sequenza primaria, si può di solito assumere

che esista anche una buona similarità strutturale.

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2. E’ necessario che venga fatto un allineamento sufficientemente accurato tra

la sequenza target e le sequenze stampo considerate. L’ Homology Modeling

procede modellando il backbone della sequenza target in base a quello della

sequenza stampo, usando l’allineamento di sequenza per decidere dove

posizionare ciascun residuo. Perciò, la qualità dell’ allineamento di sequenza

è di cruciale importanza; benché esistano molti strumenti che permettono

di fare gli allineamenti in modo automatico, successivamente è sempre

necessario ricontrollare ed aggiustare manualmente l’allineamento stesso

per migliorarne ulteriormente la qualità (solitamente ci si basa sugli

allineamenti multipli forniti da ClustalW).

All’ inizio, la tecnica di routine dell’ Homology Modeling fa in modo che il

backbone della proteina target venga accomodato nella stessa maniera di quello

della proteina stampo. Questo significa che non solo le posizioni dei Cα, ma anche

gli angoli phi e psi e le strutture secondarie siano costruite in modo identico alla

proteina stampo. Successivamente, i packages di Homology Modeling più

sofisticati riescono ad aggiustare le posizioni delle catene laterali per ridurre al

minimo le collisioni e possono offrire inoltre strumenti di minimizzazione

dell’energia o di dinamica molecolare che rappresentano tutti dei tentativi di

miglioramento del modello. Anche se due proteine hanno un’ elevata identità di

sequenza ed una struttura secondaria e terziaria molto simile (folds identici), esse

non avranno comunque mai un backbone esattamente uguale, neanche in

condizioni comparabili. Per questo motivo, ci si deve aspettare che un modello

ricavato con Homology Modelling non sia proprio del tutto identico alla struttura

reale. Tutte le differenze nelle strutture del backbone proteico sono quantificate

attraverso un parametro detto rmsd, che sta per root mean square deviation e si

riferisce alle posizioni degli atomi di Cα. Un modello può essere considerato

“sufficientemente accurato” quando il suo rmsd si trova all’interno dell’ intervallo

di deviazioni osservate per le strutture sperimentali che mostrano un livello di

identità di sequenza simile al target ed alle sequenze stampo. Esempio: se noi

definiamo che un buon modello di predizione di struttura ha un valore di rmsd

<=2Å rispetto alla struttura empirica, allora la proteina stampo deve avere

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un’identità di sequenza >=60% con la proteina target affinché si abbia una

percentuale di successo maggiore del 70%.

Errori nei modelli costruiti con Homology Modeling

Quando la similarità tra la proteina-target e le proteine-stampo diminuisce, gli

errori nel modello aumentano. Vediamo quali sono i tipi di errori che si possono

principalmente verificare:

� Errori nell’impaccamento delle catene laterali → quando le sequenze

divergono, l’impaccamento delle catene laterali nel core proteico cambia.

Gli errori nelle catene laterali sono critici se si verificano in regioni che

sono coinvolte nella funzione della proteina (sito-attivo e siti di binding di

ligandi)

� Distorsioni e shifts nelle regioni correttamente allineate → Come

conseguenza della divergenza delle sequenze, la conformazione della

catena principale cambia anche se il fold rimane lo stesso.

� Errori nelle regioni senza uno stampo → i segmenti della sequenza

target che non hanno una regione equivalente nella struttura stampo (per

esempio: inserzioni o loops) rappresentano le regioni più difficili da

modellare.

� Errori dovuti ad un errato allineamento → Questi rappresentano il

grosso degli errori che vengono commessi nell’ Homology Modeling,

specialmente quando l’identità di sequenza tra target-stampo diminuisce al

di sotto del 30%. Comunque gli errori di allineamento possono essere

minimizzati in due modi:

1. di solito è possibile usare un gran numero di sequenze per costruire un

allineamento multiplo anche se la maggior parte di queste sequenze non

ha strutture 3D note; gli allineamenti multipli sono in genere più realistici

degli allineamenti a coppie.

2. si può migliorare l’allineamento modificando iterativamente quelle regioni

nell’allineamento stesso che corrispondono agli errori predetti nel modello.

� Stampi non corretti → questo diventa un potenziale problema quando le

proteine che sono usate come stampo sono solo lontanamente correlate al

target (identità di sequenza <25%).

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Valutazione dei modelli L’informazione che può essere ricavata da un modello di predizione di struttura

dipende dalla qualità del modello stesso. Diventa quindi essenziale stimare

l’accuratezza del modelli 3D ricavati con l’ Homology Modeling per poterli poi

correttamente interpretare. Il modello può essere valutato sia nella sua interezza

che a partire da singole regioni. Esistono molti programmi e server che

permettono di valutare un determinato modello (PROCHECK, ERRAT, BIOTECH,

AQUA, SQUID, ecc). Il primo passo nella valutazione di un modello è quello di

verificare che il modello abbia il corretto fold. Un modello avrà il fold corretto se:

� sarà stata scelta la giusta sequenza-stampo

� la sequenza-stampo sarà stata allineata approssimativamente in modo

corretto con la sequenza-target

Il fold di un modello può essere valutato in vari modi:

� attraverso un’alta similarità di sequenza con la proteina-stampo più vicina

� attraverso un’ energia basata sullo Z-score

� attraverso la conservazione nella sequenza target di residui chiave per la

funzione o la struttura della proteina stessa

Una volta che è stato accertato il fold del modello, una valutazione più dettagliata

della sua accuratezza può essere ottenuta in base alla similarità tra il target e le

sequenze-stampo. Un’ identità di sequenza superiore al 30% garantisce in linea

generale un modello di predizione relativamente buono per via delle ben note

relazioni tra similarità di struttura e di sequenza tra due proteine, della natura

geometrica del modeling che forza il modello ad essere quanto più vicino

possibile allo stampo e dell’ incapacità dell’attuale procedura di modeling di

recuperare un allineamento sbagliato.

ETHE-1

Le mutazioni che colpiscono il gene che codifica per la proteina ETHE1 sono

responsabili dell’ Encefalopatia Etilmalonica, che è una patologia metabolica

infantile estremamente grave che colpisce il cervello, il tratto gastro-intestinale ed

i vasi periferici. Nei pazienti affetti da questa sindrome si trovano alti livelli di

acido etilmalonico nei fluidi corporei e una grande diminuzione dell’ attività della

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citocromo-c ossidasi nel muscolo scheletrico; le severe conseguenze che derivano

dal mal funzionamento di questo enzima indicano quindi che ETHE1 gioca un

ruolo molto importante nel mantenimento dell’omeostasi mitocondriale e nel

metabolismo energetico. Il gene per ETHE1 è costituito da 7 esoni e si trova sul

cromosoma 19q13. La proteina ETHE1 contiene una sequenza di 24 amino acidi

in N-Te che mostra una grande similarità con i leader peptides delle proteine

destinate al mitocondrio. Infatti, è stato dimostrato che questa proteina viene

indirizzata verso questo organello dove rimane a livello della matrice in seguito al

taglio energia-dipendente del peptide segnale in N-terminale.

Swiss-PDBViewer

Swiss-PdbViewew è un programma liberamente disponibile che permette di

analizzare diverse proteine nello stesso tempo. Queste proteine possono essere

sovrapposte allo scopo di dedurre gli allineamenti strutturali e di comparare i loro

siti attivi o altre parti di rilievo. Inoltre, si possono facilmente ottenere mutazioni

negli amino acidi, legami-H, angoli e distanze tra gli angoli. La cosa di principale

rilievo è che Swiss-PdbViewer è collegato a Swiss-Model che è un server per

Homology Modeling automatico e che è stato sviluppato all’interno dello Swiss

Institute of Bioinformatics (SIB) in collaborazione con la GlaxoSmithKline ed lo

Structural Bioinformatics Group di Basilea. Il server per l’ Homology Modeling

SWISS-MODEL restituisce un file PDB pronto per DeepView, con il modello e

ciascun stampo in un differente layer. Inoltre, con DeepView possiamo vedere gli

allineamenti delle sequenze, aggiustare le posizioni dei gaps, vedere quali sono le

regioni dell’allineamento sfavorite energeticamente, trovare e fissare i clashes

delle catene laterali.

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RISULTATI

Attraverso il sito dell’ NCBI, è stata ricavata la sequenza primaria della proteina

ETHE1 umana che è stata quindi utilizzata per la ricerca degli omologhi di cui era

già nota la struttura 3D.

A questo scopo è stato usato BlastP con l’ opzione choose database pdb come si

può vedere nella figura 1. I risultati di BlastP mostrano che esiste un

allineamento significativo con l’enzima Gliossilasi 2 (GLO2) di Homo sapiens con

uno score di 70 ed un E-value pari a 3e-13; la percentuale dei residui identici è

del 27%. Questo enzima è costituita da 260 aa.

La Gliossilasi 2 appartiene alla superfamiglia delle metallo-β-Lattamasi ed è il

secondo dei due enzimi nel sistema delle gliossilasi; è un tiolestere che catalizza

l’idrolisi dell’ S-D-lactoilglutatione a dare glutatione ed acido D-lattico. Questo

enzima è costituito da due domini : il primo dominio si ripiega a formare una

struttura a sandwich costituita da 4 β-strands, simile a quella che è stata vista

nelle metallo-β-Lattamasi, mentre nel secondo dominio predominano le α-eliche.

>gi|14198377|gb|AAH08250.1| ETHE1 protein [Homo sapiens] MAEAVLRVARRQLSQRGGSGAPILLRQMFEPVSCTFTYLLGDRESREAVLIDPVLETAPRDAQLIKELGL RLLYAVNTHCHADHITGSGLLRSLLPGCQSVISRLSGAQADLHIEDGDSIRFGRFALETRASPGHTPGCV TFVLNDHSMAFTGDALLIRGCGRTDFQQGCAKTLYHSVHEKIFTLPGDCLIYPAHDYHGFTVSTVEEERT LNPRLTLSCEEFVKIMGNLNLPKPQQIDFAVPANMRCGVQTPTA

Figura 1

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Il sito attivo contiene un sito di binding per due atomi di Zn ed un sito di binding

per il substrato. Sono state risolte due strutture 3D per la Gliossilasi 2 umana:

1)1QH3 che contiene acetato e cacodilato nel sito attivo (risoluzione 1.9 Å)

2)1QH5 che contiene invece S-(N-hydroxy-N-bromophenylcarbamoyl)glutathione

(GBP) (risoluzione 1.45 Å).

1QH3 e 1QH5 rappresentano gli ID di PDB (Protein Data Bank) per queste

strutture e sono stati utilizzati per scaricare i corrispondenti file.pdb contenenti

tutte le coordinate strutturali necessarie per visualizzare la struttura 3D della

Gliossilasi 2 con il programma Swiss-PDBViewer.

ZN ZINC ION Zn 2+

GTT GLUTATHIONE C10 H18 N3 O6 S +

GBP S-(N-HYDROXY-N-

BROMOPHENYLCARBAMOYL)GLUTATHIONE C17 H23 N4 O8 Br S

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Length = 260 Score = 70.1 bits (170), Expect = 3e-13 Identities = 50/183 (27%), Positives = 88/183 (48%), Gaps = 12/183 (6%) Query: 36 FTYLLGDRESREAVLIDPVLETAPRDAQLIKELGLRLLYAVNTHCHADHITGSGLLRSLL 95 + YL+ D E++EA ++DPV DA ++ G++L + TH H DH G+ L L Sbjct: 13 YMYLVIDDETKEAAIVDPVQPQKVVDAA--RKHGVKLTTVLTTHHHWDHAGGNEKLVKLE 70 Query: 96 PGCQSVISRLSGAQADLHIEDGDSIRFGRFALETRASPGHTPGCVTFVL-----NDHSMA 150 G + I +++ G ++ A+P HT G + + + ++ Sbjct: 71 SGLKVYGGDDRIGALTHKITHLSTLQVGSLNVKCLATPCHTSGHICYFVSKPGGSEPPAV 130 Query: 151 FTGDALLIRGCGRTDFQQGCAKTLYHSVHEKIFTLPGDCLIYPAHDYHGFTVSTVEEERT 210 FTGD L + GCG+ F +G A + ++ E + LP D +Y H+Y T++ ++ R Sbjct: 131 FTGDTLFVAGCGK--FYEGTADEMCKALLEVLGRLPPDTRVYCGHEY---TINNLKFARH 185 Query: 211 LNP 213 + P Sbjct: 186 VEP 188

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Clickando sul quadratino S a fianco della Gliossilasi 2, Blast ci dice che ha

trovato 4 strutture correlate all’interno di questo gruppo di sequenze identiche. I

files scaricati dalla Protein Data Bank ( 1QH5.pdb o 1QH3.pdb ) contengono due

monomeri A e B. Vedi Figura 2.

________________________________________________________________________________

In questo lavoro è stata utilizzata la struttura tridimensionale corrispondente al

codice PDB 1QH5 e contenente due atomi di Zn ed il composto S-(N-hydroxy-N-

bromophenylcarbamoyl)glutathione, mentre per la costruzione del modello

predittivo della struttura 3D di ETHE1, è stato usato SwissModel di Swiss-

PDBViewer.

Analizziamo ora nel dettaglio i vari passaggi che sono stati fatti per arrivare al

modello 3D della nostra proteina target ETHE1:

� Come prima cosa siamo andati in Preferences ed abbiamo selezionato

l’opzione SwissModel; in questo modo ci è apparsa una finestra

(SwissModel Setting) attraverso la quale abbiamo potuto inserire il nostro

nome e l’indirizzo e-mail a cui far arrivare successivamente il modello

tridimensionale ottenuto da SwissModel.

� Dopo questo primo passaggio, per mezzo dell’opzione “Load Raw Sequence

to Model” presente nel menu-item di SwissModel, abbiamo caricato nel

workspace il file.txt con la sequenza amino acidica di ETHE1 in formato

FASTA. Il risultato che appare è una lunga e perfetta α-elica.

� Quindi, attraverso “Open PDB File” presente nel menu-item di File,

abbiamo caricato nel workspace anche il file 1qh5.pdb che contiene le

coordinate necessarie per la costruzione della struttura tridimensionale

della GLO2. Possiamo vedere che compaiono due monomeri A e B la cui

sequenza primaria è perfettamente identica (come abbiamo potuto

verificare dal Control Panel nel passaggio seguente).

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� A questo punto, attraverso il menu-item di Window, abbiamo visualizzato il

pannello di controllo (Control Panel) e la finestra degli allineamenti

(Alignment). Vedi Figura 3.

� Abbiamo poi selezionato ethe1 (questo può essere fatto sia a livello di

Alignment che di Control Panel) e tolto il segno di spunta presente nel

checkbox “Visible” posto in cima al pannello di controllo; in questo modo,

la lunga α-elica scompare. L’immagine è stata ricollocata al centro del

workspace per mezzo del bottone con le tre frecce rosse in alto a sinistra.

� Il successivo passaggio è stato quello di eliminare uno dei due monomeri.

Noi abbiamo scelto di usare il monomero A per cui abbiamo reso invisibile il

monomero B togliendo semplicemente i segni di spunta (sotto “show”)

corrispondenti ai suoi amino acidi ed agli altri componenti (Zn e GBP) e

lasciando spuntati solo quelli corrispondenti al monomero A. Nella Figura

4, il GBP è colorato in verde, mentre i due atomi di Zn sono colorati in

FIGURA 3

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azzurro. Per una visualizzazione migliore, abbiamo reso invisibili anche le

catene laterali del monomero A (togliendo i segni di spunta sotto “side”)

� Nella finestra Alignment, abbiamo evidenziato ethe1 per rendere attivo

questo layer, dopo di che abbiamo utilizzato l’opzione “Magic Fit” presente

nel menu-item di Fit. In questa maniera, si ottiene automaticamente un

primo allineamento tra la sequenza di ETHE1 e la sequenza di GLO2.

� Abbiamo poi messo il segno di spunta sul checkbox “visible” del Control

Panel per visualizzare la sequenza da modellare, dopo di che dal menu-item

di SwissModel abbiamo selezionato l’opzione “Update threading now” che

viene resa disponibile dopo aver tolto il segno di spunta dall’opzione di

default “Update Threading Display automatically”.

� Successivamente, abbiamo colorato in fucsia la sequenza di 1qh5 dove c’è

la sovrapposizione con ETHE1. Vedi Figura 5.

Figura 4

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� Il passaggio seguente è quello più importante e cioè abbiamo cercato di

migliorare manualmente l’allineamento delle due sequenze. A questo scopo,

abbiamo allineato con ClustalW la sequenza di ETHE1 e la sequenza di

GLO2 e siamo andati ad introdurre dei piccoli gaps nelle posizioni che

venivano mostrate nell’output di ClustalW sotto riportato. Abbiamo fatto

anche un allineamento multiplo con ClustalW utilizzando altre 8 sequenze

amino acidiche aventi un elevato grado di similarità con ETHE1, ma di fatto

veniva introdotto un enorme gap (24 posizioni) che rompeva la continuità

dell’allineamento tra ETHE1 e GLO2 nella zona antecedente l’estremità C-

Te (dati non mostrati). Quindi, non lo abbiamo considerato per correggere

l’allineamento delle nostre due sequenze. Siamo andati a confrontare il

valore dell’energia dell’allineamento fatto automaticamente con Magic Fit

rispetto al quello dell’allineamento fatto manualmente sulla base dei

risultati ottenuti con ClustalW e si è notato un buon miglioramento; si

passa da E=77,1 ad E=54,8 anche se i valori rimangono comunque in un

range positivo.

FIGURA 5

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CLUSTAL W (1.82) multiple sequence alignment gi|2494849|sp|Q16775|GLO2_HUMA -----------------------MKVEVLPALTDNYMYLVIDDETKEAAI 27 gi|14198377|gb|AAH08250.1| MAEAVLRVARRQLSQRGGSGAPILLRQMFEPVSCTFTYLLGDRESREAVL 50 : ::: .:: .: **: * *::**.: gi|2494849|sp|Q16775|GLO2_HUMA VDPVQP--QKVVDAARKHGVKLTTVLTTHHHWDHAGGNEKLVKLESGLKV 75 gi|14198377|gb|AAH08250.1| IDPVLETAPRDAQLIKELGLRLLYAVNTHCHADHITGSGLLRSLLPGCQS 100 :*** : .: :: *::* .:.** * ** *. * .* .* :

gi|2494849|sp|Q16775|GLO2_HUMA YGGDDRIGALTHKITHLSTLQVGSLNVKCLATPCHTSGHICYFVSKPGGS 125 gi|14198377|gb|AAH08250.1| VISRLSGAQADLHIEDGDSIRFGRFALETRASPGHTPGCVTFVLN----- 145 . . :* . .:::.* : :: *:* **.* : :.:.

gi|2494849|sp|Q16775|GLO2_HUMA EPPAVFTGDTLFVAGCG--KFYEGTADEMCKALLEVLGRLPPDTRVYCGH 173 gi|14198377|gb|AAH08250.1| DHSMAFTGDALLIRGCGRTDFQQGCAKTLYHSVHEKIFTLPGDCLIYPAH 195 : . .****:*:: *** .* :* *. : ::: * : ** * :* .* gi|2494849|sp|Q16775|GLO2_HUMA EYTINNLKFARHVEPGNAAIREKLAWAKEKYSIGEPTVPSTLAEEFTYNP 223 gi|14198377|gb|AAH08250.1| DYHG--FTVSTVEEERTLNPRLTLSCEEFVKIMGNLNLPKPQQIDFAVPA 243 :* :..: * . * .*: : :*: .:*.. :*: . gi|2494849|sp|Q16775|GLO2_HUMA FMRVREKTVQQHAGETDPVTTMRAVRREKDQFKMPRD 260 gi|14198377|gb|AAH08250.1| NMRCGVQTPTA-------------------------- 254 ** :*

16 � Abbiamo provato anche ad adoperare l’opzione “smooth” settando il fattore di

smoothing dal valore di default 2 al valore 1 consigliato nel tutorial. Quando

un amino acido si trova in condizioni ottimali, la sua energia è intorno allo

zero, viceversa più l’energia sale e meno quel residuo si trova in condizioni

ideali. Il grafico rappresentante l’andamento dell’energia dei singoli amino

acidi indicava la presenza di tre residui (Gly69, Leu94 e Leu95) con un’energia

di molto superiore allo zero al posto dei due (Ser93 e Pro96) che si ottenevano

in precedenza. Quindi, per la costruzione del modello abbiamo lasciato il

valore di default per lo smoothing factor. Vedi Figure 6 e 7.

Figura 6. Nella finestra Alignment, il grafico ci mostra l’andamento dell’energia dell’allineamento a livello di ciascun residuo amino acidico. Se il residuo è ok, la sua energia è intorno allo zero, mentre se il residuo non è ok, la sua energia sale oltre lo zero. Nel nostro allineamento, utilizzando uno smooth=2, abbiamo solo due residui molto sofferenti e cioè S93 e P96 (in rosso) che sono circondati da amino acidi che hanno un’energia inferiore anche se non ottimale (in arancione e giallo) come si può notare sopra. Gli amino acidi presenti nel resto della sequenza, anche quella non mostrata, hanno invece un’ energia più o meno intorno o sotto il valore zero.

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� Siamo anche andati a controllare gli amino acidi che davano clashes

attraverso l’opzione “aa making clashes” presente nel menu-item Select. Dopo

di che abbiamo tentato di eliminare i clashes attraverso l’opzione “Fix Selected

Sidechains” presente nel menu-item Tools, ma questa operazione era troppo

gravosa in termini di tempo, per poter essere fatta su ciascuno dei suddetti

amino acidi. Per questo motivo purtroppo non si è potuto rifinire il modello più

di tanto.

� A questo punto, abbiamo utilizzato l’opzione “Submit modelling request”

presente nel menu-item di SwissModel ed abbiamo inviato il nostro progetto al

Figura 7. L’andamento dell’energia, ottenuto utilizzando uno smooth factor=1, mostra che ci sono tre residui molto sofferenti e cioè G69, L94 e L95 (in rosso) a loro volta circondati da amino acidi che hanno un’energia inferiore ma non ottimale (in arancione e giallo) come si può notare sopra. Gli amino acidi presenti nel resto della sequenza, anche in questo caso, hanno invece un’ energia più o meno intorno o sotto il valore zero.

18 server SwissModel. Successivamente, il progetto analizzato ci è stato inviato

attraverso e-mail.

� Nella Figura 8, possiamo vedere l’ipotetica struttura tridimensionale di ETHE1

predetta attraverso il nostro modello. Nel file in Power Point “ FOTO: ETHE 1”

(allegato in visione) riportiamo la stessa struttura 3D vista da diverse

angolazioni.

Nel modello tridimensionale che abbiamo ottenuto, possiamo notare la presenza del

dominio costituito da β-strand, nonché la presenza del dominio costituito da α-eliche

come avevamo già riscontrato esistere nella struttura 3D della Gliossilasi 2 risolta

sperimentalmente attraverso cristallografia a raggi-X. Questo ci dà un’indicazione

che il nostro modello sia abbastanza corretto, anche se non eccessivamente rifinito,

poiché sussiste una buona sovrapposizione tra la struttura predetta e quella reale,

tenendo anche conto che la similarità a livello della sequenza primaria tra le due

proteine non è eccessivamente alta (27%).

Figura 8 STRUTTURA 3D DI ETHE1 PREDETTA ATTRAVERSO HOMOLOGY MODELING