Strumenti e Tecniche Strumenti e Tecniche di studio di studio in patologia in patologia

Gli strumenti della patologia:

• Microscopia

• Biologia molecolare

• Indagini biochimiche

Microscopia Ottica Microscopia Ottica

�� citopatologiacitopatologia ed ed istopatologiaistopatologia

�� citochimica ed citochimica ed istochimicaistochimica

�� immunocitoimmunocito((istoisto)chimica )chimica

�� immunofluorescenzaimmunofluorescenza

Microscopia Microscopia Elettronica Elettronica

A trasmissione

A scansione

cytopath.co.uk

Campione citologico • Persa “la geografia spaziale”dell’organo / tessuto, i criteri diagnostici si basano quasi esclusivamente sulle caratteristiche delle cellule

– Caratteristiche morfologiche di nucleo e citoplasma • forma• colore• dimensione

– Pattern di aggregazione

Citologia esfoliativa

cellule esfoliate spontaneamente si ritrovano in: – Urine– Espettorato– Secrezioni– Versamenti – Liquor (liquido cerebrospinale)

Citologia per esfoliazione provocata

• Cellule attivamente asportate dalla superficie cutanea, di una mucosa o di una lesione

Citologia per aspirazione con ago sottile

http://www.vetmed.wsu.edu/resources/Techniques/images/fna_technique.jpg

Campione istologico

Mantenuti “siti, orientamento e rapporti” delle componenti tessutali prelevate

Anche nelle lesioni che si discostano molto dall’anatomia dell’organo da cui derivano, è mantenuta “la geografia spaziale” tra epitelio, stroma, vasi

Quantità di fissativo da utilizzare = rapporto 1:10rapporto 1:10

Fissazione del campione

…in caso di campioni di grandi dimensioni…

1

Lesioni piLesioni piùùrappresentativerappresentative

2

Consentire Consentire unun’’adeguata adeguata

fissazione fissazione ““a cuorea cuore””

Elevato n° di pezzi

++

Scarsa quantità di fissativo

Ridotta fissazioneRidotta fissazione

Attenzione!!!!!Attenzione!!!!!

Inadeguata fissazione….alterazione della morfologia cellulare…preparato istologico illeggibile!!!!

Buona fissazione Scarsa fissazione

Attenzione!!!!!Attenzione!!!!!

Tessuti ricchi di sangue (milza, lesioni emorragiche, ecc.) ���� necessaria la sostituzione periodica del fissativo

1) Incompleta fissazione

2) Formazione di pigmenti formalinici

Scopi:Scopi:

1)1) Immobilizzazione dei costituenti Immobilizzazione dei costituenti cellulari e cellulari e tissutalitissutali

2)2) InattivazioneInattivazione enzimi enzimi autolisantiautolisanti

3)3) InattivazioneInattivazione batteribatteri

4)4) Conferimento di stabilitConferimento di stabilitààstrutturale ai costituenti chimici strutturale ai costituenti chimici del protoplasmadel protoplasma

Fissazione completa dopo 24 oreFissazione completa dopo 24 ore

FissazioneFissazione

Requisiti dei fissativiRequisiti dei fissativi

• Elevato potere di penetrazione

• Fissazione uniforme

• NO coartazione tissutale

• Preparazione dei pezzi per l’inclusione in paraffina

• Compatibilità con numerose colorazioni istochimiche ed immunoistochimiche

FISSAZIONE MEDIANTE….

Agenti chimici Agenti fisici

-- composti organicicomposti organici

-- composti inorganicicomposti inorganici

-- congelamentocongelamento

-- calorecalore

Fissativi semplici

•• FormaldeideFormaldeide

- in commercio al 40% in soluzione acquosa (formalina)

- si usa al 10% (90 volumi di acqua, 10 volumi di formalina), neutra e tamponata

- assenza di neutralità: produzione di acido formico nella soluzione (riduzione dell’effetto di fissazione!!!)

Alto grado di penetrazione

No eccessivo indurimento dei tessuti

No dissoluzione dei lipidi

Immersione per lungo tempo

Formazione di legami a ponte tra residui di lisina

NO modificazione importante della struttura proteica

PericolositPericolositàà dei fissatividei fissativi

Formaldeide:Formaldeide:

- Tossica

- Infiammabile

- Irritante

1)1) FissazioneFissazione

2)2) DisidratazioneDisidratazione

3)3) ChiarificazioneChiarificazione

4)4) Inclusione in paraffinaInclusione in paraffina

5)5) Taglio delle sezioni Taglio delle sezioni

6)6) ColorazioneColorazione

50 %

etanolo70 %

etanolo

95 %

etanolo

100 %

etanolo

xylolo

Disidratazione

Disidratazione

paraffina

Tessuto fresco

Fissazione in formalina

Inclusione in paraffina Inclusione in paraffina

sezione

vetrino

Taglio Taglio

delle sezioni delle sezioni

ColorazioneColorazione

N° rif. IstologicoTessuto od organoSpecie animaleColorazione

IdentificazioneIdentificazione

Colorazioni cito-istochimiche- forniscono informazioni sul contenuto e sulla natura delle sostanze chimiche contenute nelle cellule (citochimica) o nei tessuti biologici (istochimica)

Alcian

- sfruttano la proprietà di alcuni reagenti di interagire con specifici composti chimici contenuti in cellule e tessuti formando dei prodotti “colorati”visibili al microscopi ottico

- utilizzabili anche per rilevare la presenza di alcuni tipi di agenti biologici all’interno dei tessuti (es. batteri, funghi, protozoi)

Ziehl-Neelsen

Grocott

Tecniche Tecniche immunologicheimmunologiche

Visualizzazione di una reazione antigeneVisualizzazione di una reazione antigene--anticorpo anticorpo mediante lmediante l’’utilizzo di marcatori utilizzo di marcatori

fluorocromifluorocromiComplesso enzima + Complesso enzima + substrato substrato cromogenocromogeno

IMMUNOFLUORESCENZAIMMUNOFLUORESCENZA IMMUNOISTOCHIMICAIMMUNOISTOCHIMICA

PRINCIPIO DI BASEPRINCIPIO DI BASE

ImmunoImmunofluorescenzafluorescenza

FluorocromiFluorocromi::fluoresceina, texasred, rodamina, ecc.

DIRETTA INDIRETTA

ImmunoImmunocitocitochimicachimica

DIRETTA INDIRETTA

EnzimaEnzima substratosubstrato

perossidasi 1) DAB (3,3-diaminobenzidina tetraidrocloruro)

2) AEC (3-amino-9-etilcarbazolo)

3) CN (4-cloro-1-naftol)

Fosfatasi alcalina

1) Fast red

2) Fast blue BB

Preparati citologici o sezioni istologiche sottoposte a reazioni

immunocito(isto)chimiche portano alla formazione di un prodotto “colorato”

che può essere analizzato al microscopio ottico

ImmunoImmunoistoistochimicachimica

Applicazioni dell’immunoistochimica:

• ricerca di base • diagnostica routinaria

Esempi in campo diagnostico:

- individuazione di antigeni di agenti patogeni nei tessuti

- discriminazione tra neoplasie di diversa istogenesi

- migliorare la caratterizzazione di neoplasie appartenenti ad uno stesso gruppo (es. linfomi)

- identificare l’origine di una metastasi di cui non si conosce il tumore primitivo (per es. marcatori tessuto specifici)

Valutazione di marker prognostici/predittivi nei tessuti neoplastici

Consente il reperimento di quantitàanche minime di materiale genetico (DNA) presente nei campioni inviati

l’amplificazione richiede la presenza di primers, ossia oligoncleotidi a singola filamento complementari alle

estremità della regione a sequenza nota

PCR - Polymerase Chain Reaction(Reazione a Catena della Polimerasi)

tecnica in vitro per l’amplificazione esponenziale di una sequenza di DNA disposta tra due regioni a sequenza nota

http://www.gene-quantification.de/block.html

RT (reverse transcription) – PCR: variante della tecnica PCR che consente di amplificare una molecola di DNA partendo da un insieme di RNA totali estratti da un tipo cellulare

ESEMPI DI APPLICAZIONI DELLA PCR

1. Identificazione di agenti patogeni in campioni biologici umani o animali, o negli alimenti (virus e batteri )

2. Identificazione di organismi geneticamente modificati(OGM)

3. Ricerca di farine di origine animale nei mangimi destinati all'alimentazione del bestiame

4. Analisi del DNA in medicina legale (es. test di paternità)

5. Diagnosi di malattie genetiche