STIMA DELL’INCERTEZZA DI MISURA DA STUDI DI VALIDAZIONE CONDOTTI IN LABORATORIO.

STIMA DELL’INCERTEZZA DI MISURA DA STUDI DI VALIDAZIONE CONDOTTI

IN LABORATORIO.DETERMINAZIONE DI AFLATOSSINA M1 NEL LATTE CON METODICA HPLC

DOPO PURIFICAZIONE CON COLONNE DI IMMUNOAFFINITA’

MONTEGROTTO TERME 1-2 DICEMBRE 2005

6° MEETING DEI RESPONSABILI E TECNICI DI LABORATORIO

DEL SETTORE LATTIERO-CASEARIO

A.Caria, M.Cabiddu, I.Ibba, C.Cicalò

OBIETTIVO DEL METODO

Determinare la quantità di aflatossina M1 nel latte

impiegando un procedimento di estrazione con colonna di

immunoaffinità e misurazione con HPLC con rivelatore a fluorescenza


UNI CEI ENV 13005:2000§ 3.4 CONSIDERAZIONI PRATICHE

3.4.8”……l’incertezza non può sostituirsi al pensiero critico, all’onestà intellettuale ed alla capacità professionale. La valutazione dell’incertezza non è né un compito di routine né un esercizio puramente matematico, ma dipende dalla conoscenza approfondita della natura del misurando e della misurazione. La qualità e l’utilità dell’incertezza attribuita al risultato di una misurazione dipendono pertanto, in definitiva dall’approfondimento, dall’analisi critica e dall’integrità morale di chi contribuisce ad assegnare il valore “.


IL PROCEDIMENTO PER LA STIMA DELL’INCERTEZZA

INIZIO 1. SPECIFICARE IL MISURANDO

FINE

2. IDENTIFICARE LE FONTI DINCERTEZZA

3. SEMPLIFICARE RAGGRUPPANDO LE FONTI PER LE QUALI VI SONO DATI ESISTENTI

4. QUANTIFICARE LE COMPONENTIRAGGRUPPATE

5. QUANTIFICARE LE COMPONENTIRESIDUE

6. CONVERTIRE LE COMPONENTI IN SCARTI TIPO

7. CALCOLARE L’ INCERTEZZA TIPO COMPOSTA E L’INCERTEZZA ESTESA


SGRASSATURA

ESTRAZIONE E PURIFICAZIONE

ELUIZIONE

CONCENTR.ESTRATTO E DILUIZ.A VOLUME

MISURAZIONE CON HPLC

PREPARAZIONE DEL MATERIALE

PER LA TARATURA

TARATURA HPLC

RISULTATO

FASE 1. SPECIFICARE IL MISURANDO


IL DIAGRAMMA CAUSA EFFETTO

• Il diagramma causa-effetto è un modo utile per elencare le fonti di incertezza.

• Mostra le loro reciproche relazioni e indica l’influenza del risultato

• Serve a evitare di contare alcune fonti più di una volta

FASE 2- IDENTIFICARE LE FONTI DI INCERTEZZA


FASE 2- IDENTIFICARE LE FONTI DI INCERTEZZA

IL DIAGRAMMA CAUSA EFFETTOCOME SI COSTRUISCE

1. SCRIVERE L’EQUAZIONE COMPLETA PER IL RISULTATO. I PARAMETRI DELL’EQUAZIONE COSTITUISCONO I RAMI PRINCIPALI DEL DIAGRAMMA. SE APPROPRIATO AGGIUNGERE RAMI CHE RAPPRESENTANO LO SCOSTAMENTO GLOBALE( AD ES. RECUPERO )

2. CONSIDERARE OGNI FASE DEL METODO E AGGIUNGERE I RELATIVI FATTORI AL DIAGRAMMA A PARTIRE DAGLI EFFETTI PRINCIPALI

3. PER OGNI RAMO AGGIUNGERE I FATTORI CHE CONTRIBUISCONO FINCHE’ GLI EFFETTI DIVENTANO TRASCURABILI

4. RIDISEGNARE IL DIAGRAMMA RISOLVENDO LE DUPLICAZIONI, RENDENDO ESPLICITI I CONTRIBUTI E ACCORPANDO LE CAUSE COLLEGATE. METTERE I TERMINI RELATIVI ALLA PRECISIONE IN UN RAMO SEPARATO


EQUAZIONE DI BASE UTILIZZATA PER IL CALCOLO DEL MISURANDO

• Tutti i parametri dell’equazione possono avere un’incertezza associata con il loro valore e quindi sono potenziali fonti di incertezza.

• Ci possono essere anche altri parametri che pur non comparendo nell’equazione influenzano i risultati ( es tempo di estrazione e temperatura ) e quindi sono fonti potenziali di incertezza.

• La nostra equazione è:

Wm = [mA ( Vf / Vi ) . 1/V]

dove

Wm = misurandomA= quantità di aflatossina M1 in ng corrispondente all’area del

picco di aflatossina M1 del campione Vi = volume di campione iniettato in µlVf= volume di ripresa del campione in µlV = quantità del campione iniziale in ml

FASE 2- IDENTIFICARE LE SORGENTI DI INCERTEZZA


FASE 2. IDENTIFICARE LE SORGENTI DI INCERTEZZADIAGRAMMA CAUSA EFFETTO

AREA PICCO CAMPIONE

VOLUME INIEZIONE

VOLUMEFINALE

RISULTATO

RECUPEROVOLUME INIZIALE

CAMPIONEMATERIALE

RIFERIMENTO


FASE 2-IDENTIFICARE LE SORGENTI DI INCERTEZZA DIAGRAMMA CAUSA-EFFETTO

AREA DEL PICCO CAMPIONE mA

Taratura vetr. Taratura

Temperatura

QUANTITÀ DI AFLATOSSIN

A NEL CAMPIONE

Inc. mr

RECUPERO R

AREA PICCO MR

VOLUME INIZ CAMP V

Temperatura

Tarat vetreria

Ripetibilità

Diluizione

Tar.vetr Op.

Ripetib.

Precisione

Precisione

Taratura HPLC Operatore

Operatore

Operatore

MAT.RIFER.

VOLUME FINALE Vf

Precisione

VOL.INIEZ.

Tar.vetr Op.

Ripetib.Tar.vetr Op

.

Ripetib.

Diluizione

Tar.vetr Op.

Ripetib.


SGRASSATURA

ELUIZIONE CON

ACETONITRILE

CONC.ESTRATTO E DILUIZ.A VOL.

MISURAZIONE CON HPLC

ESTRAZIONE E PURIFICAZIONE

FASE 2. IDENTIFICARE LE SORGENTI DI INCERTEZZA

-CAPACITÀ OPERATORE- QUALITA’ DELLA COLONNINA

-QUALITA’ VETRERIA -CAPACITÀ OPERATORE-QUALITA’ REAGENTE

-CAPACITA’ OPERATORE - QUALITA’ DELLA VETRERIA

-CAPACITÀ OPERATORE-INTEGRAZIONE-VOLUME INIEZIONE-CALCOLO RISULTATO-TARATURA-QUALITA’ DEI REAGENTI

-CAPACITÀ OPERATORE

PROCESSO ANALITICO

PREPARAZIONE DEL MATERIALE

PER LA TARATURA

TARATURA HPLC

- MATER.RIFERIM- CAPACITA’ OPERAT.- TARATURA PIPETTE- QUALITA’ VETR.- TEMPERATURA

CAPACITA’ OPERAT.

FONTI DI INCERTEZZA

FONTI DI INCERTEZZA

RISULTATO


FASE 3 : SEMPLIFICARE RAGGRUPPANDO LE FONTI PER LE QUALI VI SONO DATI ESISTENTI

RIPETIBILITA’ AREA PICCO CAMP mA MAT.RIF. VOLUME FINALE


A NEL CAMPIONE

RECUPERO R AREA PICCO MR

VOLUME INIZ CAMP

Temper.

Tarat vetreria

Taratura HPLC

Taratura

HPLC

Area picco mr

Vol fin estratto

Vol iniz camp

Volume e dil mr

Area picco campione

diluizione mr

Taratura

Inc. mr

Temper Temper

Tarat vetreria

DIAGRAMMA CAUSA-EFFETTO

VOL. INIEZ

Vol iniezione


RIPETIBILITA’ (1) AREA PICCO CAMP mA (1) MAT.RIF.(3) VOLUME FINALE (1)


A NEL CAMPIONE

RECUPERO R (2)

AREA PICCO MR (1)

VOLUME INIZ CAMP

(1)

Temper.

Tarat vetreria

(2)

Taratura HPLC (3)

Taratura

HPLC (3)

Area picco mr

Vol fin estratto

Vol iniz camp

Volume e dil mr

Area picco campione

diluizione mr (1)

Taratura (2)

Inc. mr (3)

Temper Temper

Tarat vetreria (2)

DIAGRAMMA CAUSA-EFFETTO

VOL. INIEZ

Vol iniezione

FASE 4-5. QUANTIFICARE LE COMPONENTI RAGGRUPPATE

(1) Ripetibilità considerata durante lo studio di variabilità del procedimento analitico

(2) Considerata durante lo studio dello scostamento sistematico

(3) Da considerare durante la valutazione delle altre fonti di incertezza


Fasi 4 E 5 QUANTIFICAZIONE DELLE COMPONENTI DELL’INCERTEZZA

1. La miglior stima disponibile della variazione globale tra le diverse esecuzioni del processo analitico ( ripetibilità )

2. La miglior stima disponibile dello scostamento sistematico globale (recupero ) e della sua incertezza

3. La quantificazione di qualsiasi incertezza associata con effetti di cui non si sia tenuto conto in modo completo negli studi delle prestazioni globali


FASE 6-CONVERTIRE LE COMPONENTI IN SCARTI TIPO

STUDIO DI VARIABILITÀ DEL PROCEDIMENTO ANALITICO RIPETIBILITA’

D1 D2 MEDIA DIFFERENZA DIFFERENZA/MEDIA1 53,72 53,69 53,71 0,03 0,00062 36,19 38,9 37,55 -2,71 -0,07223 46,51 45,83 46,17 0,68 0,01474 24,25 26,36 25,31 -2,11 -0,08345 23,7 19,77 21,74 3,93 0,18086 45,49 44,96 45,23 0,53 0,01177 62,77 65,35 64,06 -2,58 -0,04038 34,57 27,45 31,01 7,12 0,22969 13,8 11,8 12,80 2,00 0,156310 44,3 47,6 45,95 -3,30 -0,071811 22,7 20,4 21,55 2,30 0,106712 22,6 19,6 21,10 3,00 0,142213 20,6 20,6 20,60 0,00 0,000014 24,43 22,9 23,67 1,53 0,064715 26,01 21,36 23,69 4,65 0,196316 49,27 41,65 45,46 7,62 0,167617 47,04 48,22 47,63 -1,18 -0,024818 22,3 20,34 21,32 1,96 0,091919 29,7 27,44 28,57 2,26 0,079120 32,3 29,71 31,005 2,59 0,083521 24,11 25,08 24,595 -0,97 -0,039422 61,99 58,68 60,335 3,31 0,0549

u (x) rip 0,0945


STUDIO DELLO SCOSTAMENTO SISTEMATICO

E’ stato eseguito durante la validazione del metodo mediante prove di recupero ( campioni omogeneizzati divisi in due aliquote, una delle quali addizionata con aflatossina M1 )

L’incertezza tipo è stata calcolata come scarto tipo della media

u (REC)= SCARTO TIPO % DEL RECUPERO

√NUMERO ESPERIMENTI CONDOTTI

Valutazione del recupero: verificare se è significativamente uguale a 1 ( 100% ) ; usando un test di significatività( t-test ) t= 1-REC /u (REC)



FASE 6-CONVERTIRE LE COMPONENTI IN SCARTI TIPOSTUDIO DELLO SCOSTAMENTO SISTEMATICO

VALORE STAND VAL CAMP RAPPORTO RECUPERO%

1 50 48,07 1,0 96,1

2 48,49 40,09 0,8 82,7

3 50 47,47 0,9 94,9

4 100 82,99 0,8 83,0

5 50,1 40,75 0,8 81,3

6 50 41 0,8 82,0

7 48,56 39,37 0,8 81,1

8 34,43 27,4 0,8 79,6

9 68,74 66,86 1,0 97,3

10 56,7 46,4 0,8 81,8

11 100 81,8 0,8 81,8

12 100 85,2 0,9 85,2

13 100 91,89 0,9 91,9

14 54,9 46,6 0,8 84,9

86,0

14 3,7 6,2

Inc. tipo 0,01657

t= (1-0,86)/ 0,01657 8,235294118

>del t tabulato per 10 gl=2,23 e del t a 15 gl =2,13


ALTRE FONTI DI INCERTEZZA

Incertezza del materiale di riferimento fornita dal produttore

u = 0.0068



già trasformata in distribuzione rettangolare dividendo per √3

FASE 7. CALCOLARE L’ INCERTEZZA TIPO COMPOSTA

uc ( Wm )/ Wm =√ somma delle incertezze tipo relative

uc (Wm) = √ (0.0945)2+ (0.01657)2+ (0,0068)2

Wm

uc (Wm ) = Wm √ (0.0945)2+ (0.01657)2+(0.0068)2

Wm = 34.60 uc =3,33

INCERTEZZA TIPO RELATIVA DEL CAMPIONE =radice della somma delle incertezze di ripetibilità, del recupero e

del materiale di riferimento


ESPRESSIONE DEL RISULTATOCALCOLARE L’ INCERTEZZA TIPO ESTESA

= 13

Il numero dei gradi di libertà effettivi risulta maggiore di 10 pertanto il fattore di copertura può essere assunto uguale a 2 (v. SINAL DT 0002 ).

Calcolo dei gradi di libertà effettivi:

Formula di Welch Satterthwaite

INCERTEZZA ESTESA U (Wm)

U (Wm) = [uc (Wm ) ] . 2


FINE ESPRESSIONE DEL RISULTATO

CALCOLARE L’ INCERTEZZA TIPO ESTESA

U (Wm) = [ uc (Wm ) ] . 2

Wm = 34.60 ng/l ± 6,66

k =2 e t = 95%


Stima dell’incertezza in base ai dati di precedenti studi collaborativi per lo sviluppo e la validazione del metodo

Lo scarto tipo di riproducibilità ottenuto in uno studio collaborativo

può essere assunto come l’incertezza del metodo da riportare nel rapporto

di prova

La riproducibilità del metodo è il parametro completo nella valutazione della precisione; tiene conto di tutte le possibili

variabilità all’interno e all’esterno dei laboratori


Stima dell’incertezza in base ai dati di precedenti studi collaborativi per lo sviluppo e la validazione del metodo

SI ATTRIBUISCE ALLA RIPRODUCIBILITA’ IL VALORE DELL’INCERTEZZA COMPOSTA E SUCCESSIVAMENTE, TRAMITE

OPPORTUNO FATTORE DI COPERTURA, SI OTTIENE L’INCERTEZZA ESTESA.

Wm ± k . SR


RIFERIMENTI

• UNI EN ISO/IEC 17025:1999 Requisiti generali per la competenza dei laboratori di prova e taratura

• Istituto Superiore di Sanità- Quantificazione dell’incertezza nelle misure analitiche.Seconda Edizione (2000) della Guida EURACHEM/CITAC CG 4-Rapporti ISTISAN 03/30

• SINAL DT-0002 Guida per la dichiarazione dell'incertezza di misura rev 1• UNI CEI ENV 13005 – Luglio 2000- Guida all’espressione dell’incertezza di

misura• De Martin – ARPA-FVG-RGQ Pordenone: Workshop “ Validazione dei metodi

e incertezza di misura nei laboratori di prova: le linee guida delle Agenzie Ambientali-Ottobre 2003”

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