Sterolii

in plante si drojdii

Localizare

Membrana eucariote / stabilitate

Rar procariote

Colesterolul

Molecular Biology of the Cell, 4th Edition

La mamifere ateroscleroza

Forme Liber 30-40% membrane, rigid sau lipoproteine

Esterificat – in citoplasma celulelor / lipoproteine

diabetul zaharat nefrozehipotiroidism

Lipidele şi ateroscleoroza

Reducerea lumenului vascular

depuneri de lipide pe pereţii vaselor

plăcile de aterom

http://www.gridgit.com/

Lipidele şi ateroscleoroza

https://2015091.weebly.com/

Liproteine (LDL, HDL)

Bittencourt, J. A., The Power of Carbohydrates, Proteins, and Lipids (e-book), CreateSpace, 2013

LDLColesterol

HDLproteine:lipide

http://mesacharter.blogspot.com/2015/

Derivatii sterolilor

Glicozidelesterolilor

plante

alge

Acizi biliari

componenta bilei

conjugati

Acid taurocolic – absorbtie eficienta

Pavlovic,N..at al., (2018) Front. Pharmacol. 9:1283.

Derivatii sterolilor - glucocorticoizi

Natural Sintetic

Pflug, NC. El al., Environ. Sci.: Water Res. Technol., 2017,3, 450-461

https://www.ausmed.com.au/

Dexametazona

Reacții alergice

Artrita

Psoriasis

Boli respiratorii

afecteaza dezvoltarea si functiile sexuale

-estradiol - hormon s. feminin

Testosteronul - hormon s. masculin

Celulele Leydig

ovare

Hormonii

Lipida amfifila

Grupe nepolare(hidrofobe)

Grupe polare(hidrofile)

Strat bilipidic

Faza nepolara (resturi de acizi grasi, colesterol)

Faza polara(apoasa)

Membrana bifosfolipidica

Formarea straturilor bilipidice

Difuzia lipidelor

Difuzie transversala

Difuzie laterala

Functiile membranelor

“Granita” pentru celula

Structuri dinamice

2 tipuri: interna, externa

Temperatura de tranzitie

Structura ordonata, bine impachetata

Structura mai putin ordonata, lanturi hidrocarbonate labile

Transformarea bacteriilorCelule competentewww.edvotek.com

Inserarea ADN-ului

E.coli Mitocondria

Peroxizomi

Numarul de membrane

Distrubutia lipidelor in plasma membranara

Flexibilitatea lanturilor in aciziigrasi saturati/nesaturati

Deficienta lipidelor

• Grasimile trebuie sa constituie 3% din total caloriilor–prevenirea deficientelor

• Sindroamele datorate deficientei acizilor grasi

Uscarea pielii, dermatite (deficienta in ac. linoleic)

Tremuratul mainilor (deficienta a prostaglandinelor)

Inabilitatea de a controla presiunea sângelui

Rolul acizilor grași omega 3 în suprimareaCatabolismului proteinelor musculare

Malta, F.A.P.S. et al. (2019), Journal of Functional Food, 54,1-12

Cantitate ridicata de lipide

Cancer

Boli de inima

Diabet

Obezitate

Presiune mare a sangelui

Concentratie mare

a colesterolului în sange http://antararx.com/images/pi12.jpg

ADNul si ARNul- purtatori ai informatiei

Structurile ac. nucleici - criterii

- informatia geneticăforma stabilă

- informatia geneticădecodată

- informatia accesibila proteinelor acizilor nucleici

- copiere fidelatransferul informației

Clancy, S. & Brown, W. (2008) Translation: DNA to mRNA to Protein. Nature Education 1(1):101

Compusul izolat

- nucleina (contine P)

- acid nucleic

- acid deoxiribonucleic (ADN)

F. Meischer a izolat ADN-ulin 1869 din leucocite

Izolarea ADN-ului

http://www.dnaftb.org/15/bio.html

www.catawiki.de

http://www.dnaftb.org/12/bio.html

Teoria evolutiei speciilor

Localizarea ADNul

1914 R. Feulgen - fucsina (colorant) leaga ADNul

Localizarea acestuia

http://www.gettyimages.com/

www.slideshare.net

Robert Feulgen

Localizarea ADN-ul

Fibroblastele din soareceActina, FITC Tubulina, Cy5 Nucleu (ADN), DAPI

http://www.leica-microsystems.com/science-lab/fluorescent-dyes/

SYBR Green I

www.company7.com

Purinele

Pirimidinele

Bazele purinice și pirimidinice

ARN

Componența acizilor nucleici

1920 P.A. LeveneADN 4 baze purinice/pirimidinice deoxiriboza si o grupare fosfat

Ipoteza gresita – Cuarteți de deoxitetranucleotide care se repetă5’-GATCGATCGATC-….-GATC-3’

http://www.dnaftb.org/15/bio-2.html

Diferența între nucleozide și nucleotide

Bază + riboză

https://www.zigya.com

Bază + riboză + fosfat

Legarea nucleotidelorLegături fosfodiesterice

http://www.uic.edu/classes/bios/bios100/

Erwin Chargaff

Componența acizilor nucleici

Nicole Kresge et al.J. Biol. Chem. 2005;280:e21

2 descoperiri importante

(i) ponderile egale A şi T (G şi C)

(ii) compoziția ADN-ului variazade la o specie la alta

a infirmat teoria lui Levene

www.bio.miami.edu/dana/

https://moodle.clsd.k12.pa.us

Perechile de baze

Perechi de baze Hoogsteen

Perechi de baze Watson-Crick

Diplococcus pneumoniae Bacterie care cauzeaza pneumonia

Factorul de transformare

www.sciencemag.orgStreptococcus pneumoniae

www.visionlearning.com

F. Griffith

1920 F. Griffith – factorul de transformare

ADN-ul este materialul ereditar - M. DelBruck şi S. Luria. Aceştia au analizat bacteriofagele (inveliş proteic + ADN) care atacă bacteriile E.Coli

http://www.dnaftb.org/17/animation.html

http://www.ck12.org/biology/

1944, O. Avery, C. MacLeod si M. McCarty

Factorul de transformare

ADNul– factorul de transformare

A. Hershey, M. Chase - genetica bacteriofagelor

Reconfirmarea: ADN-ul este purtatorul informatiei genetice

Structura ADNului

Structura ADNului

Polimer - 2 lanţuri de deoxinucleotide

B-ADN-ului - trăsăturile structurale:

lanţuri antiparalele

rotite spre dreapta

D = 20 Å

bazele nucleotidice– leg. de H (interior)

legacy.hopkinsville.kctcs.edu

10 bp / rotaţie completă

pasul de 34 Å

Watson şi Crick structura B ADN-lui

dublu helix

vs Paulingstructura B ADN-lui

tripluhelix

bert1293.glogster.com

blo

g.w

orld

agro

forestry.o

rg

Tipuri de ADN - difractograme

A-ADN

B-ADN

Z-ADN

Arnott, TRENDS in Biochemical Sciences, 3(6), 349-354, 2006

Tipuri de ADN

12 bp / rotaţie

pasul 44 Å

orientare spre stânga

11,6 bp / rotaţie

pasul 34 Å

orientare spre dreapta

10 bp / rotaţie

pasul 34 Å

orientare spre dreapta

ARNul

http://biology.stackexchange.com11 bp / rotaţie

pasul de 30,9 Å

Sinteza lantului polipeptidic

1. Activarea (esterificarea) - citoplasma

2. Initierea ARNm + AAactivat + 30Sribozom

complex

+ 50Sribozom

3 proteinesi GTP

4. Terminarea - oprirea sintezei proteinei

3. Elongarea - adaugarea a noi aminoacizi

- nou aminoacil-ARNt + ARNm

- formarea legaturii peptidice

5. Prelucrarea postranslationala

Reactia de activare

fiecare molecula ARNt

un aminoacid

Aminoacil-adenilat (anhidrida mixta)

Aminoacil-ARNt

Elemente structurale ale ARNt-ului

Anticodon(triplet)

3ACCACGCUUAA

GACACCU

GC

*G U G U

CUGAG

GU

A

AA G

UC

AGACC

C G A GA G G

G

GACUCAU

UUAGGCG5

Capat la care se afla o grupareaminoacil

Legaturi dehidrogen

Anticodon

*

*

**

*

**

*

***

ARNt-ul

Molecula ARNt contine:

- base normale A, U, G si C

- derivati metilati ai A, U, G si C

Bazele ARNt-ului:

Impiedica formarea legaturilor

intramoleculare

Nu permit formarea legaturilor

intermoleculare (ARNt-ARNt)

Reduc actiunea nucleazelor

asupra ARNt

Reactia de initiere

formil-metionil-ARNt

Metionil-ARNt

(AUG codon)

Compozitia si masa ribozomilor

70S Mr 2.7 x 106

50S 30S

Mr 1.8 x 106

5S ARNr23S ARNr36 proteine

Mr 0.9 x 106

16S ARNr21 proteine

S - unitati Svedberg

30S, 50S si 70S - vsed la ultracentrifugare

vsed = f (forma, masa)

Densitatea si coeficientii de sedimentare ai componentelor celulareL.K. Kleinsmith & V.M. Kish, Principles of Cell

and Molecular Biology, ed. 2 (H. Collins, 1995)

30S P A

Etapele initierii

FI3 FI1

ARNm A U G5‘ 3‘

A U G - codon de initiere

FI2

U A C

GTP

U A C - anticodon

A - catalitic site pentru formarea noului aminoacil-ARNt

P - catalitic site pentru formarea legaturii peptidiceE - catalitic site unde ARNtasele parasesc ribozomul

50S

E

Ciclul elongatiei1) Legarea noului aminoacil-ARNt

ARNm A U G 5‘ 3‘

U A C

P30S

50S

A

T-GTP

T - factor de elongatieT-GTP-(AA2-ARNt) - complex ternar

tetraciclina

blocheaza centrul activ A

inhiba sinteza peptidei

Situsul E

H

C O

NH

C

C

O

R1

O

H

ARNtMET

Situsul P

NH2

C

C

O

R2

O

H

ARNtAA2

..

Situsul A

ARNm

A U G5‘ 3‘

50S

30S

Atacul nucleofil

Legaturapeptidica

Pep.transf.

Pep. transf. 23S ARNr

Ciclul elongatiei2) Formarea legaturii peptidice

ARNm

A U G codon AA2

5‘ 3‘

Situs E Situs A

3‘ARNm

A U G codon AA2 codon AA3

5‘

Translocaza(FE-G / GTP)

NH2

C

O

R3 H

ARNtAA3

CO

Situs P

OH

ARNtMET

Situs A

NH-CHO

C

C

R1

O

H

NH

C

O

R2 H

ARNtAA2

CO

Situs E

OH

ARNtMET

Situs P

NH-CHO

C

C

R1

O

H

NH

C

O

R2 H

ARNtAA2

CO

Ciclul elongatiei3) Translocatia

Incheierea sintezei

Este semnalata de presenta codonilor terminali(UAA, UAG, UGA)

30S P AARNm | | | | |UGA| 5‘ 3‘

50S

E | |

FD - factori de desprindere

FD

Peptidil transferaseFD1, FD2

Disocierea complexuluiFD3

Inhibitori ai sintezei proteice

Interactiile cloramfenicolului cu nucleotide din cavitatea peptidil transferazei

(D. radiodurans)

G 2484

U 2485

C 2431

A 2430

U 2479

U 2483

G 2044Mg2+

Mg2+2.451

Å

Cloramfenicol

Blocheaza transferul dePeptidil-ARNt

D. Radioduransbacteria gram-positiva

http://www.esrf.eu/

Tirozinil-ARNt-ul

Puromicina se leaga de situsul A al ribozomului

Peptidil-puromicina blocheaza prematur sinteza peptidica

Puromicina

Inhibitori ai sintezei proteice

Streptomicina

• Se leaga de subunitatea 30S

• Produce citirea gresita a Informatiei genetice

• Inhiba la concentratii mariprocesul de initiere

Proteine toxice

Toxina (difteria) inactiveaza factorul 2 al elongatiei

Ricina depurineaza o adenozina a 23S ARNr

Inhibitori ai sintezei proteice

Flexibilitate conformationala a ADN-ului este limitataConformeri ai adenozinei

majoritatea acizilor nucleici – conformatie anti

Z-ADN–conformatie anti/sin

Cromozomii

virusuri

bacterii

molecule circulare (plasmide)

ADNul viral

ADN - eucariote sau procariote - dimensiuni mari

mase medii

modele de studiu

https://ib.bioninja.com.au/

Proprietăţile ADN-ului în soluţie

Proprietaţile acido-bazice (pKa, cationi, amine)

Vâscozitatea - gradul de denaturare al ADNului- gradul de împachetare al duplexului

Coeficientul de sedimentaremasa molecularăa tipurilor de ADN

gradient de zaharoza sau CsCl

Denaturarea si renaturareaMijlocul intervalului de temperatură de topire, Tm (m = eng. melting-topire).

Renaturarea1960, J. Marmur temperatura T < Tm + 25 grade https://uoqasim.edu.iq/e_Learning/

Denaturarea acizilor nucleici

Duplex-helix ADNul si ARNul pot fi denaturate

Stabilitatea ADN - factori

natura solventului

tăria ionică

conţinutul de perechi G-C

pH

Idili A, Vallée-Bélisle A, Ricci F, JACS, 2014, 136 (16), 5836–5839

Reactia PCR (The polymerase chain reaction)

Amestec de componente:

enzima ADN polimeraza

deoxinucleotide

PCR Thermocycler

primeri

solutie tampon

Mg2+

Etapele PCR

1. Denaturarea ADN-ului (95C) – separarea lanturilor

2. Alinierea primerilor (40C- 65C) la ADN-ul monocatenar

3. Reactia de polimerizare a ADN-ului (polimeraza, 72C) extinderea lanturilor de ADN nou la capatul primerilor.

• La baza tehnicii PCR schimbarile de temperatura

modificari ale ADN-ului

• PCR – 20-40 cicli de temperatura

• 20 cicli de temperatura 2 h

amplificarea fragmentului ADN

1.048.576 copii

Kary Mullis (1983)

Regiunea de interes5’

3’ 5’

3’

1) Denaturarea95 ºC

5’ 3’

3’ 5’

2) Alinierea55 ºC5’ 3’

3’ 5’

5’3’

3’5’Primer 2

Primer 1

3) Extinderea72 ºC

5’

3’ 5’

3’

5’

3’ 5’

3’

Repetarea pasilor 1-3

Numar mare de copii ale fragmentului ADN

Doua fragmente

de ADN identice

Reacția PCR (The polymerase chain reaction)

Surse de ADNMcCance,S.R & Leberg,P.L.,

Conservation geneticsIn wildlife management

Construirea primerilor criterii

• continut de baze in jur de 50% GC

• lungimea 15-30 pb

• cei doi primeri trebuie sa nu formeza duplexuri

• sa nu conțină bucle

• capatul 3’ trebuie complementaritate perfectă cu ADNul țintă

• temperatura de aliniere a primerilor 50-64 ºC

Tm (ADN) =2 x (numar de baze A/T) + 4x (numar de baze C/G)

• temperatura de aliniere < 5 ºC față de Tm (ADN)

ADN polimeraze stabile la temperaturi ridicate

PCR implica temperaturi ridicate

ADN polimeraze stabile

Taq ADN polimeraza

Thermus aquaticus

(izvoare termale)

1976

Activitatea maxima75 - 80 0C

Fidelitate scăzută (1 / 9000 pb)

Acuratețea polimerazelor

Pyrococcus furiosus

Pfu polimeraza

Controlul reacției PCR

Shen, C.H,. Amplification of Nucleic Acids,in Diagnostic Molecular Biology, 2019

Electroforeza ADN-ului

Tehnica de separare a acizilor nucleici prin electroforeza orizontala (de tip submarin)

Aplicații ale reacției PCR

• manipularea genetica

• in criminalistica

• detectia HIV ADNul - celulele rosii primeri corespunzatori secventelor HIV

• diagnosticare prenatala a bolilor genetice

• aneuploidiilor fetale

• detectia alterarilor genetice din plasma

http://www.nature.com/nm/journal/v18/n7/images/nm.2829-F2.jpg

“Balizele”moleculare

1996Tyagi si Kramer

Proba etichetata cu 2 molecule1 fluorofor + 1 stingator

Balizele moleculare

Oligonucleotide cu structura unui ac

25-40 pb

15-30 pb complementare cu secventa

tija 5-10 pb

In absenta secventei complementare – fluorescenta este stinsa

Legarea la secventa complementare – disocierea tijei

Crește distanța F-Q

Crește fluorescenței

Factori care afectează tehnica – T, pH, secventa buclei sau tijei

Aplicații - detectia agentilor patogeni sau determinarea genotipului

“Balizele”moleculare