SSMT 2004/2005 Lavoro di Diploma - Sbt · 2011. 4. 1. · SSMT 2004/2005 Lavoro di Diploma...

SSMT 2004/2005

Lavoro di Diploma

Valentina Galiani, 3LM Ospedale Civico Lugano

Responsabile, Dr. Roberto della Bruna

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INDICE Riassunto…………………………………………………………………………………. 2

1. Introduzione……………………………………………………………………………. 3-7 1.1. Alcuni cenni storici sulla creatina e sulla creatinina…………………………… 3 1.2. La creatinina……………………………………………………………………….. 4 1.3. La clearance della creatinina………………………………………………….. 4-6 1.4. Interpretazione clinica…………………………………………………………….. 6 1.5. I metodi di determinazione……………………………………………………….. 7

2. Obbiettivi del lavoro e strategia di realizzazione………………………………….. 8 2.1. Strategia di realizzazione………………………………………………………… 8

3. Materiali e metodi……………………………………………………………………. 9-14

3.1. I campioni………………………………………………………………………….. 9 3.1.1. La raccolta delle urine……………………………………………………….. 10

3.2. I controlli di qualità e la calibrazione…………………………………………… 11 3.3. Gli apparecchi………………………………………………………………... 11-12 3.4. Analisi statistica………………………………………………………………….. 12 3.5. Crea Plus…………………………………………………………………………. 13 3.6. Crea……………………………………………………………………………….. 14

4. Risultati………………………………………………………………………………. 15-23

4.1. Tabella delle misurazioni……………………………………………………. 15-16 4.2. Precisione dei metodi…………………………………………………………… 17 4.3. Confronto dei metodi………………………………………………………… 17-23

4.3.1. Confronto della creatinina sierica………………………………………. 18-19 4.3.2. Confronto della creatinina urinaria……………………………………... 20-21 4.3.3. Confronto della clearance………………………………………………. 22-23

5. Discussione…………………………………………………………………………. 24-25

6. Costi……………………………………………………………………………………… 25

7. Conclusioni.…………………………………………………………………………….. 26

8. Bibliografia.……………………………………………………………………………... 27

9. Ringraziamenti………………………………………………………………………….. 28

Allegati Allegato 1; “L’HPLC”………………………………………………………………….. 29-30 Allegato 2; “ROCHE/HITACHI 912”……………………………………………………... 31 Allegato 3; “Crea Plus”………………………………………………………………… 32-35 Allegato 4; “Crea”……………………………………………………………………… 36-39 Allegato 5; “Grafici”…………………………………………………………………… 40-54

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RIASSUNTO Scopo del lavoro di diploma è stato il confronto tra la determinazione della creatinina secondo il metodo enzimatico e la determinazione secondo Jaffé, in vista di un possibile cambio metodo per allinearsi agli standard internazionali. Le misure di creatinina e della sua clearance sono state eseguite su campioni di plasma/siero e urina ottenuti dal laboratorio dell’Ospedale Civico di Lugano. Le misurazioni sono avvenute entro sette giorni dal prelievo. Il confronto tra i metodi ha permesso di stabilire che il metodo enzimatico è preciso, affidabile e sostanzialmente sovrapponibile al metodo in uso. Una leggera sottostima della creatinina nel plasma/siero per valori bassi (< 100µmol /l) è probabilmente da attribuire all’insensibilità del nuovo metodo alle pseudocreatinine. Il nuovo metodo permette inoltre di fornire risultati allineati agli standard internazionali. L’introduzione del nuovo metodo comporterebbe annualmente spese supplementari di circa 14000,00 CHF.

The aim of the diploma work was to compare the determination of creatinine according to the enzymatic method and that of Jaffé, in view of a possible change of method in order to align with international standards. Measurement of creatinine and its clearance was performed on samples of serum/plasma and urine samples from the laboratory of the Civic Hospital in Lugano. Measurement was done seven days from collection. By comparison between the methods it was possible to establish that the enzymatic method is precise, reliable and substantially a replacement for the method in current use. A slight undervaluation of the creatinine in the serum/plasma for low values (< 100µmol /ls) was probably due to the insensitivity of the new method to the pseudocreatinines. In addition, the new method allows the supply of results which are in line with international standards. The introduction of the new method would involve additional annual expenses of around 14000,00 CHFs.

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1. INTRODUZIONE

1.1 Alcuni cenni storici sulla creatina e sulla creatinina

1832 La creatina viene scoperta per la prima volta, nelle carni rosse, dallo scienziato francese Chevreul. 1847 Lieberg confermò che la creatina era un normale costituente della carne e osservò che la carne di volpi selvatiche conteneva una quantità di creatina dieci volte superiore alla concentrazione presente in quella delle volpi tenute in cattività. Ipotizzò così, che l’attività motoria comportasse un incremento della concentrazione muscolare di creatina. Circa nello stesso periodo, i ricercatori Heintz e Pettenkofer, evidenziarono nelle urine una sostanza, che Lieberg confermò essere la creatinina. Sulla base dell’osservazione che l’escrezione urinaria di creatinina era correlata alla massa muscolare, si pensò che essa fosse un prodotto metabolico della creatina dei muscoli. 1886 Jaffè descrive il metodo per determinare la creatinina. 1900 Nei primi anni del XX° secolo, estraendo la creatina dalla carne e dalle urine, si notò che non tutta la sostanza somministrata all’animale o all’uomo veniva poi recuperata nelle urine sottoforma di creatinina. Si arrivò a pensare che parte della creatina potesse essere trattenuta nell’organismo per scopi plastici o energetici. 1912-1914 Studi condotti dai ricercatori Folin e Denis, dimostrarono che il suo contenuto muscolare poteva essere incrementato con assunzioni supplementari nella dieta di creatina. Infatti nei gatti vennero riscontrati aumenti di tessuto muscolare fino al 70%. 1923 Hahn e Meyer stimarono che per un uomo di 70 Kg, il contenuto totale di creatina era di circa 140 g (2 g/Kg). 1927 I ricercatori Fiske e Subbarow scoprirono l’esistenza della fosfocreatina (o creatinfosfato), molecole di creatina e fosfato unite in un legame chimico e immagazzinate nei tessuti muscolari. Si scoprì che questa sostanza aveva un ruolo nella contrazione muscolare. (1) Oggi la creatina è uno degli integratori alimentari più utilizzati da tutti gli atleti.

Figura 1, Michel Chevreul 1786-1889

Figura 2, molecola di creatina

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1.2. La creatinina

La parola crea deriva dal greco kreas e significa carne. (1) Creatinina o 2-imino-1-metil-imidazolidin-4-one, ha struttura chimica C4H7N3O e massa molecolare di 113,12 g/mol. Contenuta essenzialmente nei muscoli e deriva dalla creatina e dal creatinfosfato. La creatina viene prodotta e liberata in circolo dal fegato, dal pancreas e dai reni, per poi essere assorbita dal tessuto muscolare. Nei muscoli la fosforilazione con la creatinchinasi trasforma la creatina in creatinfosfato, che funge da riserva energetica da trasferirsi sull’ADP. Dalla degradazione della creatina e del creatinfosfato si forma la creatinina, la quale va in seguito a distribuirsi nei vari liquidi corporei. La quantità di creatinina nel nostro organismo dipende dalla massa muscolare, infatti tra i due c’è una stretta correlazione. Nelle persone con funzione renale normale quasi tutta la creatinina formata viene eliminata mediante filtrazione glomerulare, ma non riassorbita. Solo piccole quantità vengono escrete tubularmente, metabolizzate o liberate nell’intestino. (2) Queste proprietà, unite alla facilità e all’economicità del dosaggio, rendono la creatinina particolarmente adatta a stimare il tasso di filtrazione glomerulare. Valori normali: Donna: 44 – 80 µmol/l

Uomo: 62 – 106 µmol/l (3)

1.3. La clearance della creatinina La clearance della creatinina permette di stimare in modo abbastanza preciso il volume di liquidi filtrato dal rene nell’unità di tempo (1 minuto). Negli anni sono state sviluppate diverse formule matematiche più o meno precise per calcolare la filtrazione glomerulare partendo dalla creatinina plasmatica e urinaria: alcune di queste si accontentano solo della concentrazione plasmatica. Alcune formule prevedono una correzione che tenga conto della superficie corporea e quindi, indirettamente, della massa muscolare del paziente. Altre formule sono state inoltre sviluppate per valutare la filtrazione glomerulare in pazienti pediatrici, e cioè con massa muscolare molto ridotta. La formula attualmente usata nei laboratori dell’Ente Ospedaliero Cantonale, in ml/min, è la seguente: (5)

creatinina urinaria in µmol/l ∗ volume urinario 1.73 creatinina sierica in µmol/l ∗ tempo di raccolta ∗ superficie corporea

oppure

creatina urinaria in µmol/l ∗ volume urinario ∗ 1.73

creatinina sierica in µmol/l ∗ tempo di raccolta ∗ superficie corporea in m2

5

Altre formule usate per il calcolo della clearance: Formula di Cockroft-Gault, in ml/min: (4) Femmine Maschi

[(140-età) ∗ peso in Kg ∗ 0.85]

0.81 ∗ creatinina sierica in µmol/l

(140-età) ∗ peso in Kg

0.81 ∗ creatinina sierica in µmol/l

[(140-età) ∗ peso in Kg ∗ 0.85

72 ∗ creatinina sierica in mg/dl]

[(140-età) ∗ peso in Kg

72 ∗ creatinina sierica in mg/dl]

Nei reparti di pediatria, per bambini di pochi anni, si usa sovente la formula: (10)

Bisogna sapere però, che disponendo solamente della creatinina sierica, la stima della clearance è approssimativa. Per quanto riguarda invece la superficie corporea, essa viene determinata in funzione del peso e dell’altezza del paziente con appositi nomogrammi.

Altrimenti per chi volesse, esistono anche formule matematiche. Formula secondo DuBois e DuBois: (2)

= peso0.425 ∗ altezza0.725 ∗ 71.84 Formula secondo Mosteller, in m2: (2)

peso in Kg ∗ altezza in cm

3600

C (ml/min./1.73 m2) = 48.7 ∗ lunghezza corporea in cm Creatinina sierica in µmol/l

=

Creatinine Clearance Predictor Con il peso e gli anni del paziente, la scheda riporta quale dovrebbe essere la concentrazione di creatinina e come dovrebbe essere la clearance.

Body Surface Area Con l’altezza e il peso del paziente, la scheda riporta il valore della superficie corporea.

Figura 3, indicatore della Abbott Diagnostics, OCL.

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La clearance può essere usata come parametro per valutare:

- un’eventuale riduzione della filtrazione glomerulare; - per il controllo del decorso in caso di medicazione, - per stimare la necessità di dializzare un paziente.

Valori normali: 17-151 ml/min (3)

1.4. Interpretazione clinica Ipercreatininemia → Ridotta filtrazione glomerulare: insufficienza renale acuta; insufficienza renale cronica; stadi avanzati del diabete mellito. → Liberazione di creatinina dai muscoli: traumi; ustioni; processi degenerativi (distrofia muscolare acuta). → Medicamenti: sali di litio, di mercurio e di tallio; analgesici/antiflogistici; antibiotici; diuretici; citostatici. → Altre malattie: leucemie acute; morbo di Cushing; miotonia atropica; artrite reumatoide; lupus eritematoso sistemico (LES). Diminuzioni della creatinina → Non è di rilevanza clinica. → Si riscontra in gravidanza, durante il primo e secondo trimestre. (2)

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1.5. I metodi di determinazione

Il metodo di riferimento per la misura della creatinina è l’HPLC1(High Performance Liquid Chromatography). Questo metodo è una forma versatile di cromatografia usata con una grande varietà di fasi stazionarie e mobili per separare singoli composti in base alle dimensioni, alla polarità, alla solubilità, alla carica, alle caratteristiche di assorbimento, ecc… (6) L’HPLC è un metodo poco usato nei laboratori in quanto richiede una tecnologia relativamente complessa, lenta e costosa. Generalmente la determinazione della creatinina in siero/plasma e urina avviene secondo il metodo di Jaffé e altre varianti con picrato o il metodo enzimatico colorimetrico L’analisi viene effettuata su apparecchi automatici. Il metodo secondo Jaffé: Prevede che la creatinina in soluzione alcalina reagisca con picrato dando una colorazione giallo-arancio la cui intensità è proporzionale alla concentrazione di creatinina. La lettura avviene fotometricamente. Il metodo enzimatico colorimetrico: Questo metodo fa capo all’idrolisi della creatinina e ad altri processi enzimatici, portando anch’essa alla formazione di un colorante la cui intensità è proporzionale alla concentrazione di creatinina. Anche in questo caso la misurazione avviene fotometricamente. Da fine 2003, le norme internazionali IVD2 prevedono che questi due metodi siano standardizzati ai valori ottenuti con il metodo di riferimento. 1 HPLC: cromatografia in fase liquida ad alta prestazione. 2 IVD: in vitro diagnostica.

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2. OBIETTIVI DEL LAVORO E STRATEGIA DI REALIZZAZIONE

I laboratori dell’Ente Ospedaliero Cantonale determinano attualmente la creatinina secondo il metodo di Jaffé descritto nel 1886. Il metodo è probabilmente il più antico tra quelli ancora in uso nelle determinazioni chimico-cliniche, e permette misure abbastanza precise a costi molto bassi. Questo metodo è però soggetto ad alcune interferenze che influiscono positivamente sulla determinazione. Le sostanze in questione vengono definite “cromogene” o “pseudo creatinine” e ne fanno parte: • l’acetone; • il piruvato; • il glucosio; • il fruttosio; • l’acido urico • l’acido ascorbico; • le cefalosporine; • alcune proteine; • l’acido acetacetico. Per soddisfare le nuove norme internazionali, le ditte produttrici di reagenti propongono di usare il metodo di Jaffè compensato, in modo da eliminare l’influenza delle “pseudo-creatinine”. Questa compensazione è comunque approssimativa, in quanto ogni campione contiene una quantità variabile di sostanze cromogene. Per questo motivo i laboratori dell’ente ospedaliero (EOLAB), intendono valutare la possibile introduzione della determinazione della creatinina secondo il metodo enzimatico. Il metodo è insensibile alle “pseudo creatinine” ed inoltre, è più opportuno per i campioni pediatrici ed oncologici. L’introduzione del metodo di analisi enzimatico uniformerebbe inoltre i risultati dei laboratori principali con i risultati già ora prodotti dalla Clinica di riabilitazione di Novaggio e dagli Ospedali di zona di Acquarossa e Faido. In questi laboratori la determinazione della creatinina viene effettuata con l’apparecchio Reflotron (chimica secca), già standardizzato sulla creatinina enzimatica. Prima di introdurre il nuovo metodo nei laboratori è comunque necessaria una sua valutazione, in quanto sulla misura della creatinina e soprattutto della clearance della creatinina sono basati i dosaggi di molti medicamenti. L’obbiettivo principale è valutare la precisione e l’attendibilità del nuovo metodo, nonchè l’impatto economico.

2.1. Strategia di realizzazione Il confronto dei metodi, verrà eseguito su una sessantina di campioni di: • siero/plasma; • e urina. Verranno determinate la creatinina sierica e la creatinina urinaria con entrambi i metodi, utilizzando un analizzatore automatico Roche/Hitachi 912, presso il laboratorio dell’Ospedale Civico di Lugano. In seguito, con i dati del paziente, verrà calcolata la superficie corporea e la clearance. I risultati delle misurazioni di creatinina plasmatica, urinaria e della clearance della creatinina verranno analizzati statisticamente secondo i metodi di: • Passing-Bablock; • Deming; • ed Altman e Bland. Completerà il lavoro una stima dei costi del nuovo metodo.

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3. MATERIALI E METODI

3.1. I campioni

Nel capitolo 1.3. vengono elencati i fattori che possono servire per determinare la clearance, di seguito verrà descritta la fonte dell’informazione o il modo di raccolta. L’altezza e il peso: • Il medico, l’assistente o l’infermiere/a indicano sulla richiesta d’analisi l’altezza e il peso del paziente, così che in laboratorio si può calcolare la superficie corporea. L’età: • La data di nascita è riportata automaticamente sull’etichetta del paziente che viene attaccata alla richiesta e memorizzata nel programma LAB4003 del computer. I campioni di siero/plasma: • Non ci sono stati criteri di scelta particolari per la raccolta, la maggior parte dei campioni aveva concentrazioni inferiori o superiori ai valori normali. I pazienti erano per lo più adulti e anziani. L’urina: • L’urina è quella delle ventiquattro ore. I criteri di scelta sono gli stessi per i campioni di siero/plasma. Per la conservazione e la preparazione del materiale, ho cercato di seguire le indicazioni riportate nelle metodiche originali “Crea Plus” e Crea”.

3 LAB400: programma informatico in uso nei laboratori dell’ente ospedaliero per la registrazione delle analisi.

Siero Plasma Urina

Provetta/prelievo

Provetta con il tappo giallo/marrone.

Provetta anticoagulata con litio eparina o sodio EDTA.

Provetta grande, vuota per l’urina, senza

conservanti.

Conservazione

2-8°C (per la conservazione a

lungo termine congelare).

2-8°C (per la conservazione a

lungo termine congelare).

2-8°C (per la conservazione a lungo termine congelare).

Stabilità 7 giorni. 7 giorni. 4 giorni.

Scelta dei campioni

24 femmine e 30 maschi;



Altro

La maggioranza dei campioni ha concentrazione

patologica, alta.

La maggioranza dei campioni ha concentrazione

patologica, alta.

Le misurazioni dell’urina venivano effettuate una volta a settimana, perciò poteva capitare che

l’urina rimanesse uno, massimo due giorni in più in frigorifero.

L’urina rimasta qualche giorno ferma, forma un deposito sul fondo della provetta, per questo

motivo prima dell’esecuzione del test miscelare bene.

Tabella 1, indicazioni principali dei campioni, della loro raccolta e della loro

10

3.1.1. La raccolta delle urine Quando si parla di urine delle ventiquattro ore, si tratta di una raccolta urinaria che dura ventiquattro ore. Solitamente la raccolta inizia la mattina. Per questo esame bisogna seguire una semplice procedura standard:

1. Identificare l’apposito contenitore per la raccolta con nome, cognome e data di nascita;

2. In questo caso gettare la prima urina del mattino nel gabinetto; 3. Durante il resto della giornata e la notte, urinare invece nel contenitore; 4. Infine il mattino seguente, circa ventiquattro ore dopo la prima minzione, urinare per

l’ultima volta nel contenitore. Durante la raccolta si possono effettuare degli errori:

- svuotamento incompleto della vescica; - perdita di urine durante il processo (es: urinare nel gabinetto) o defecamento; - comprendere la prima urina del mattino.

Ricordarsi di chiudere bene il contenitore di raccolta e di mantenerlo in posizione verticale, onde evitare di perdere altro materiale e di compromettere il risultato, che diventerebbe poco affidabile. Una volta arrivato in laboratorio, il contenitore urinario verrà preso in consegna dalla laboratorista o dal laboratorista, che prenderà nota della quantità di urina erogata e proseguirà con la determinazione della creatinina. Valori normali: Donna: 7000 – 14000 µmol/24h Uomo: 9000 – 21000 µmol/24h (3)

Figura 4, provetta per siero/plasma, OCL.

Figura 4 Provetta per urina, OCL.

Figura 5, rack con alcune provette raccolte durante la settimana, OCL.

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3.2. I controlli di qualità e la calibrazione Nel laboratorio dell’Ospedale Civico di Lugano, i controlli di qualità interni per la creatinina nel siero e nel plasma, sono eseguiti con:

- Multiqual 1 della Biorad (Francia); - Multiqual 3 sempre della Biorad (Francia).

Invece nel Laboratorio dell’Ospedale San Giovanni con:

- Precinorm U della Roche Diagnostics GmbH (Germania, Mannheim) Visto che i controlli possono essere differenti da laboratorio a laboratorio, ogni settimana, eseguivo entrambi, sia Multiqual che Precinorm. Per l’urina invece, il controllo di qualità usato è:

- Liquicheck 1, urine chemistry control della Biorad (Francia); - Liquicheck 2, urine chemistry control della Biorad (Francia).

La calibrazione del metodo è stata eseguita utilizzando:

- C.f.a.s.4; - Soluzione fisiologica (NaCl allo 0.9%) pronta all’uso.

3.3. Apparecchi Hitachi 912 L’Ospedale Civico di Lugano, mi ha lasciato disporre di un analizzatore automatico Roche-Hitachi 912 per effettuare tutte le misurazioni. Principio di misurazione: • Fotometrico. Campioni utilizzati: • Siero; • plasma; • urina. Una breve descrizione dell’apparecchio la si può trovare negli allegati. Prima di procedere con le misurazioni, è stato necessario programmare l’analisi del nuovo metodo, in quanto sull’analizzatore era disponibile solo la determinazione secondo Jaffè.

4 C.f.a.s.: Calibrator for automated system.

Figura 6, analizzatore automatico Hitachi 912, OCL.

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Centrifuga Eppendorf 5804 R Per la determinazione della creatinina nel siero e nel plasma, il campione deve essere prima centrifugato. Programmazione della centrifuga: (5)

- 3500 giri/minuto; - 10 minuti.

Anche l’urina deve essere centrifugata prima della misurazione: (5)

- 2000 giri/minuto; - 10 minuti.

Dopo che l’urina è stata centrifugata, decantare il sovranatante in un’altra provetta.

3.4. Analisi statistica Il confronto tra i due metodi d’analisi è stato esaminato secondo un metodo parametrico (regressione di Deming), un metodo non parametrico (regressione di Passing-Bablock) e secondo il metodo di Altman e Bland, utilizzando il programma Analyse-it + Clinical Laboratory 1.65, in uso presso EOLAB all’OSG (Ospedale San Giovanni) di Bellinzona. Alcuni dettagli sui metodi d’analisi utilizzati.

Figura 7, mezzo informatico per la programmazione delle analisi, OCL.

Figura 8, piatto1: campioni, CQ; piatto2: cuvette; piatto 3 e 4: reattivi, OCL.

Figura 9, Centrifuge 5804R, Eppendorf, OCL:

1

2 3

4

1

2 3

4

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3.5. Crea Plus (7) Crea Plus (Creatinina Plus) della Roche è il metodo enzimatico scelto da EOLAB da introdurre nella routine a scapito del metodo di Jaffè. Finalità d’uso Test enzimatico in vitro per la determinazione quantitativa diretta della creatinina nel

siero, nel plasma e nell’urina umani, impiegando analizzatori di chimica clinica.

Sommario Il metodo enzimatico è basato sulla determinazione generalmente riconosciuta della sarcosina dopo conversione della creatinina per mezzo della creatininasi e della sarcosinossidasi. La perossidasi di idrogeno rilasciata viene misurata tramite una

reazione Trinder modificata. L’ottimizzazione del sistema tampone e dell’indicatore colorimetrico permette une quantificazione sia precisa che specifica della

concentrazione di creatinina. I risultati di tale metodo sono ben correlati con quelli ottenuti con l’HPLC.

Principio del test Test enzimatico colorimetrico: 1. Al campione viene aggiunto il reattivo 1 (R1), cosicché la creatina endogena

viene decomposta ed i sieri lipemici vengono chiarificati. 2. Aggiunta del reattivo 2 (R2) ed inizio della reazione. 3. La creatinina viene idrolizzata mediante l’azione della creatininasi,

diventando creatina. 4. La creatina viene idrolizzata mediante l’azione della creatinasi in sarcosina

ed urea. 5. La sarcosina, in presenza di ossigeno, viene convertita dalla

sarcosinossidasi in glicina, formaldeide e perossido di idrogeno. 6. Il perossido d’idrogeno rilasciato, produce con 4-aminofenazone e HTIB

(grazie all’effetto catalitico della perossidasi), un colorante chinoneiminico, la cui intensità di colore è direttamente proporzionale alla concentrazione di creatinina presente e viene misurata fotometricamente.

Reattivi Soluzioni pronte all’uso: R1: tampone, creatinasi, sarcosinossidasi, ascorbato-ossidasi, detergenti,conservante.R2: tampone, creatininasi, perossidasi, 4-aminofenazone, esacianoferrato di potassio, detergente, conservante.

Conservazione: - componenti delle confezioni integri a 2-8°C fino alla data di scadenza; - aperti e refrigerati sullo strumento 28 giorni.

Campioni Siero, plasma e urina: I campioni di urina vengono diluiti 1:11 (1+10) con acqua distillata o deionizzata o con NaCl (0.9%). Per le altre indicazioni vedere capitolo 3.1. “Materiali usati”.

Calibrazione Lineare a due punti con C.f.a.s. Da eseguire ogni 28 giorni, a cambio del lotto o se richiesta dal procedimento del CQ.

Questo test è stato calibrato contro l’HPLC.

Controlli di qualità (CQ) Siero/plasma: Precinorm U, Precinorm U plus, Precipath U, Precipath U plus, Multiqual 1 e 3.

Urina: Liquicheck 1 e 2, Precinorm Albumin, Precipath Albumin.

Calcolo e fattori di conversione I fattori di conversione sono: - mg/dl ∗ 88.4 = µmol/l;

- µmol/l ∗ 0.0113 = mg/dl. Gli strumenti Roche/Hitachi effettuano il calcolo automatico della concentrazione

di creatinina di ciascun campione.

Interferenze Siero/plasma: - L’ittero, l’emolisi, la lipemia e l’acido ascorbico non danno interferenze

significative; - La dobutamina può provocare risultati falsamente bassi; - Campioni emolizzati di neonati, di bambini o di adulti (HbF) o raramente

gammopatie monoclonali possono interferire con il test; - Una stima della velocità di filtrazione glomerulare in base alla formula di

Schwartz può dare valori troppo alti. Urina:

- L’ittero, l’emolisi, l’acido ascorbico, il glucosio e l’urobilinogeno non danno interferenze significative;

Sensibilità analitica Limite di sensibilità inferiore - Siero: 0.03 mg/dl (2.7 µmol/l) - Urina: 0.3 mg/dl (27 µmol/l)

Tabella 2, descrizione del metodo Crea Plus (metodo enzimatico).

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3.6. Crea (8) Crea, anch’essa della Roche, è il metodo attualmente in uso presso tutti i laboratori dell’ente ospedaliero. Finalità d’uso Test cinetico in vitro con rate-blanking e compensazione, per la determinazione

quantitativa della creatinina nel siero, nel plasma e nell’urina umani, impiegando analizzatori automatici di chimica clinica.

Sommario Il presente metodo è basato sulla reazione di Jaffè descritta da Popper et al. nonché da Seelig e Wüst, e modificata da Bartels. Rispetto al metodo originario, questa

versione presenta una maggiore sensibilità e una migliore precisione.

Principio del test Test colorimetrico cinetico: 1. Al campione viene aggiunto il reattivo 1 (R1). 2. Aggiunta del reattivo 2 (R2) ed inizio della reazione. 3. In soluzione alcalina, la creatinina, con il picrato, forma un complesso di

colore giallo-arancine la cui intensità di colore è direttamente proporzionale alla concentrazione di creatinina.

Reattivi Soluzioni pronte all’uso: - R1: idrossido di sodio.

- R2: acido picrico. Conservazione:

- componenti della confezione integri a 15-25°C fino alla data di scadenza. - Aperti e refrigerati sullo strumento 56 giorni.

Campioni Siero, plasma e urina: Per le indicazioni vedere capitolo 3.1. “Materiali usati”.

Calibrazione A due punti con C.f.a.s. Da eseguire a cambio del lotto del reattivo e se richiesto dai procedimenti del CQ.

Questo metodo è stato standardizzato contro ID-MS4.

Controlli di qualità (CQ) Siero/plasma: Precinorm U, Precinorm U plus, Precipath U, Precipath U plus, Multiqual 1 e 3.

Urina: Precinorm Albumin, Precipath Albumin, Liquicheck 1 e 2.

Calcolo e fattori di conversione I fattori di conversione: - mg/dl ∗ 88.4 = µmol/l;

Introdurre il valore di correzione per la reazione proteica non specifica: - per mg/dl → y = ax + b (a = 1.0, b = -0.3); - per µmol/ → y = ax + b (a = 1.0, b = -26).

L’analizzatore effettua il calcolo automatico della concentrazione dell’analita.

Interferenze Siero/plasma: - Ittero, emolisi, lipemia, acetone, acetoacetato e β-idrossibutirrato non danno

interferenze significative; - Antibiotici contenenti cefalosporina provocano risultati falsamene positivi; - In rari casi i bambini di età inferiore ai tre anni e anziani riportano valori

inferiori a 0.2 mg/dl; - Non utilizzare campioni emolizzati di neonati, bambini o adulti con HbF >5%.- Una stima della velocità di filtrazione glomerulare in base alla formula di

Schwartz può dare valori troppo alti. Urina:

- Ittero, emolisi, glucosio e urobilinogeno non danno interferenze significative;- Diversi farmaci di frequente impiego, non provocano interferenze.

Sensibilità analitica Limite di sensibilità inferiore: - 0.2 mg/dl (18 µmol/l).

Per informazioni più dettagliate a riguardo dei due metodi, fare riferimento alla metodica originale negli allegati. 4 ID-MS: spettrometria di massa a diluizione isotopica.

Tabella 3, descrizione del metodo Crea (metodo di Jaffè).

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4. RISULTATI

4.1. Tabella delle misurazioni

Uomini: CREA SIERICA CREA URINARIA CLEARANCE I° Determinazione

PZ. Vol. urine Sup. corporea Jaffé Plus Jaffé Plus Jaffé Plus crea siero crea urina clearance

050318-065 1300 1.85 314 331 3004 3232 8 8 301 3064 9

050211-067 3500 2.00 129 144 2236 2563 36 37 141 * *

050328-086 2300 1.74 272 283 3773 3943 22 22 274 3802 22

050213-065 800 1.61 72 71 2879 3361 24 28 76 3183 25

050213-053 785 2.28 170 202 3470 3997 8 8 179 3930 9

050211-116 850 1.53 183 220 2903 3246 11 10 195 2955 10

050325-069 1100 1.83 347 372 5829 5942 12 12 356 5830 12

050329-139 2980 1.92 77 64 5307 5283 129 154 75 5483 136

050329-213 1580 1.61 282 296 2126 2096 9 8 293 2060 8

050414-123 3300 1.63 120 110 2893 2838 59 63 119 2803 50

050415-055 1800 2.02 247 251 4477 4620 19 20 244 4537 20

050311-114 2900 1.94 304 349 3766 4222 22 22 309 * *

050307-224 2520 2.33 109 119 4114 4579 49 50 121 4258 46

050415-105 700 1.71 434 475 7644 7774 9 8 452 7640 8

050415-084 920 2.58 93 82 20296 21503 93 112 92 20424 95

050414-171 2250 2.00 76 62 6424 6431 114 140 72 6270 118

050314-057 1200 1.86 133 125 5003 5290 29 33 136 5381 31

050316-154 1800 1.93 235 236 2475 2465 12 12 245 2562 12

050315-236 1485 1.88 102 89 4906 5054 46 54 96 4886 48

050316-162 2100 2.09 186 197 6586 6902 43 42 200 6807 41

050316-165 1400 2.18 74 65 10363 10273 108 122 72 10228 110

050316-160 2200 2.07 150 150 5579 5799 47 49 159 5763 46

050318-044 3195 1.98 51 39 2407 2341 91 116 48 2307 93

050320-083 600 1.59 102 89 4998 5328 22 27 100 5228 24

050321-145 1900 1.75 140 136 4396 4603 41 44 140 4338 41

050321-176 2100 2.03 218 233 4468 4800 25 26 226 4740 26

050323-187 2100 2.37 149 153 3065 3066 22 21 153 2987 21

050323-074 980 1.92 147 154 6677 6974 28 28 156 6676 26

050323-176b 2900 1.98 153 158 5057 5063 58 56 154 4857 55 050324-166 1880 2.07 216 221 4686 4674 24 23 217 4365 22

* Mancano i dati. I dati nella tabella 4a, si riferiscono alle misurazioni per il confronto dei due metodi, invece i dati riportati nella tabella 4b, fanno riferimento alle misurazioni effettuate dal laboratorio all’arrivo del campione.

Tabella 4a, misurazioni di 30 pazienti maschi. Tabella 4b

16

Donne: CREA SIERICA CREA URINARIA CLEARANCE I° Determinazione

PZ. Vol. urine Sup. corporea Jaffé Plus Jaffé Plus Jaffé Plus crea siero crea urina clearance

050217-133 1820 1.50 71 68 3629 4125 75 88 69 3753 78

050217-073 4700 1.72 297 336 1508 1746 17 17 301 1655 18

050311-054 2800 1.94 163 178 1338 1444 14 14 168 1278 13

050309-055 1400 1.94 153 165 1301 1392 7 7 155 1322 7

050310-038 1900 1.94 171 187 1045 1164 7 7 164 1040 7

050315-137 2350 1.76 66 63 3894 4030 95 103 69 3998 93

050315-058 2000 1.9 210 204 2443 2559 15 16 215 2504 15

050316-132 2660 1.75 134 137 4265 4466 58 60 142 4595 59

050318-055 1200 1.63 74 66 7257 7577 87 102 72 7045 87

050318-127 3000 1.67 202 166 2255 2068 24 27 210 2246 23

050321-127 1200 1.62 102 106 4064 4185 35 35 112 4098 33

050322-106 1400 1.57 75 61 5358 5552 77 98 78 5329 73

050322-128 1800 1.51 76 74 4027 4194 76 81 79 4126 75

050324-135 1800 1.33 107 99 1871 1874 28 31 103 1851 29

050324-083 600 1.52 260 266 5637 5641 10 10 274 5549 10

050324-142 1150 1.67 76 66 8354 8473 91 106 77 8192 88

050324-030 515 1.73 122 120 10034 10391 29 31 12h 123 9834 29

050324-123 2200 1.81 115 113 3891 4062 49 52 116 3861 49

050329-108 400 1.52 257 257 8907 9535 11 12 256 9374 12

050414-148 1050 1.63 77 62 4418 4548 44 57 78 4324 43

050415-095 400 1.87 146 140 13911 14184 24 26 12h 143 14020 25

050411-046 1510 1.76 89 84 2265 2136 26 26 90 2194 25

050413-094 2000 1.62 98 90 3661 3582 55 59 108 3512 48

050413-091 1700 1.93 66 57 4965 4705 80 87 79 4910 66

Anche per i pazienti donne, il confronto è stato eseguito con i dati della tabella 5a. nella tabella 5b, sono stati riportati i dati della prima determinazione del laboratorio.

Tabella 5a, misurazioni di 24 pazienti donna. Tabella 5b

17

4.2. Precisione dei metodi

L’imprecisione delle analisi è stata calcolata dal coefficiente di variazione (Deviazione standard x 100/ media dei risultati) ottenuto sui controlli di qualità forniti dalla ditta. I controlli sono stati effettuati in giorni successivi. È stato quindi determinato il coefficiente di variazione interassay. Metodo enzimatico:

Materiale Controllo di qualità N Media CV%5

Multiqual 1 7 59 2.11


Siero/plasma

Precinorm U 7 91 2.93

Liquicheck 1 7 7294 4.4 Urina

Liquicheck 2 7 13569 4.59

Metodo di Jaffé:

Materiale Controllo di qualità N Media CV%



Siero/plasma

Precinorm U 7 101 1.32

Liquicheck 1 7 8162 2.32 Urina

Liquicheck 2 7 17828 2.86

Tutti i coefficienti di variazione sono inferiori al 5%, entrambi i metodi sono quindi da considerare precisi.

4.3. Confronto dei metodi Di seguito verranno mostrati i risultati statistici ottenuti, con un piccolo commento di spiegazione. 5 CV%: Coefficiente di Variazione, espresso in percentuale.

18

4.3.1. Confronto della creatinina sierica Test Bias plots CREA SIERICA: Jaffé v Plus Performed by LABDER Date 2 maggio 2005

n 54

Bias 2.759

95% CI -1.577to 7.095

95% limits of agreement 95% CI

Lower -28.377 -35.619to -21.136

Upper 33.896 26.655to 41.137

Identity line A=B

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

0 100 200 300 400 500

CREA SIERICA - Jaffé

CR

EA S

IER

ICA

- Pl

us

Zero bias

-30-25-20-15-10-505

101520

0 200 400

Mean of CREA SIERICA

Diff

eren

ce b

etw

een

met

hods

(%

)

Figura 10 Figura 11

Zero bias

-40

-30

-20

-10

0

10

20

30

40

50

0 200 400


Diff

eren

ce b

etw

een

met

hods

0 10 20 30

Figura 12 Figura 13 Le figure mostrano il confronto tra le due determinazioni secondo il metodo di Altman-Bland. Dalle figure si nota come il metodo enzimatico (Plus) tenda a sottostimare leggermente la misura per i valori di creatinina inferiori a 100µmol/L, mentre la sovrastima leggermente per i valori superiori.

19

Test Passing & Bablock method conversion CREA SIERICA: Jaffé v Plus Performed by LABDER Date 2 maggio 2005

n 54 Coefficient 95% CI

Intercept -18.808 -23.500to -14.470 Slope 1.133 1.099to 1.176

Cusum test for linearity - p > 0.1

y = 1.1329x - 18.808

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

50 150 250 350 450


CR

EA S

IER

ICA

- Pl

us

Test Deming regression CREA SIERICA: Jaffé v Plus Performed by LABDER Date 2 maggio 2005

n 54 Imprecision SD 1.0000 1.0000

Variance ratio 1.0000 Coefficient SE 95% CI

Intercept -18.5889 3.4218 -25.4552to -11.7225 Slope 1.1358 0.0192 1.0973to 1.1742

y = 1.1358x - 18.589

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

50 150 250 350 450


CR

EA S

IER

ICA

- Pl

us

La figura mostra il confronto tra le due determinazioni secondo il metodo non parametrico di Passing-Bablock. La regressione tra il metodo di Jaffé (x) e il metodo enzimatico (y) è riprodotta nell’equazione y= 1.13x – 18.8.

La figura mostra il confronto tra le due determinazioni secondo il metodo parametrico di Deming. La regressione tra il metodo di Jaffé (x) e il metodo enzimatico (y) è riprodotta nell’equazione y= 1.13x -18.6.

Figura 14

Figura 15

20

4.3.2. Confronto della creatinina urinaria Test Bias plots CREA URINARIA: Jaffé v Plus Performed by LABDER Date 2 maggio 2005

n 54

Bias 181.29695% CI 116.736to 245.856

95% limits of agreement 95% CI Lower -282.293 -390.109to -174.477 Upper 644.885 537.070to 752.701

Identity line

A=B

0

5000

10000

15000

20000

25000

0 5000 10000 15000 20000 25000

CREA URINARIA - Jaffé

CR

EA U

RIN

AR

IA -

Plus

Zero bias

-10

-5

0

5

10

15

20

0 10000 20000

Mean of CREA URINARIA

Diff

eren

ce b

etw

een

met

hods

(%)

Figura 16 Figura 17

Zero bias

-400

-200

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

0 10000 20000


Diff

eren

ce b

etw

een

met

hods

0 10 20 30 40

Figura 18 Figura 19 I le figure mostrano il confronto tra le due determinazioni secondo il metodo di Altman-Bland. Dalle figure si nota come il metodo enzimatico tenda a sovrastimare leggermente la misura (bias di 181 µmol/L).

21

Test Passing & Bablock method conversion CREA URINARIA: Jaffé v Plus Performed by LABDER Date 2 maggio 2005


Intercept 57.970 -52.793to 141.378 Slope 1.025 1.001to 1.049


y = 1.0254x + 57.97

0

5000

10000

15000

20000

25000

0 5000 10000 15000 20000


CR

EA U

RIN

AR

IA -

Plus

Test Deming regression CREA URINARIA: Jaffé v Plus Performed by LABDER Date 2 maggio 2005



Intercept -7.2837 50.4538 -108.5266to 93.9592 Slope 1.0389 0.0086 1.0215to 1.0562

y = 1.0389x - 7.2837

0

5000

10000

15000

20000

25000

0 5000 10000 15000 20000


CR

EA U

RIN

AR

IA -

Plus

La figura mostra il confronto tra le due determinazioni secondo il metodo non parametrico di Passing-Bablock. La regressione tra il metodo di Jaffé (x) e il metodo enzimatico (y) è riprodotta nell’equazione y= 1.025x + 57.9.

Figura 20

La figura mostra il confronto tra le due determinazioni secondo il metodo parametrico di Deming. La regressione tra il metodo di Jaffé (x) e il metodo enzimatico (y) è riprodotta nell’equazione y= 1.04x – 7.28.

Figura 21

22

4.3.3. Confronto della clearance Test Bias plots CLEARANCE: Jaffé v Plus Performed by LABDER Date 2 maggio 2005

n 54 Bias 4.7

95% CI 2.6to 6.7 95% limits of agreement 95% CI

Lower -9.9 -13.3to -6.5 Upper 19.2 15.8to 22.6

Identity line

A=B

0

20

40

60

80

100

120

140

160

0 50 100 150

CLEARANCE - Jaffé

CLE

AR

AN

CE

- Plu

s

Zero bias

-10

-5

0

5

10

15

20

25

0 50 100 150

Mean of CLEARANCE

Diff

eren

ce b

etw

een

met

hods

(%)

Figura 22 Figura 23

Zero bias

-10

-5

0

5

10

15

20

25

30

0 50 100 150

Mean of CLEARANCE

Diff

eren

ce b

etw

een

met

hods

0 10 20 30 40

Figura 24 Figura 25 Le figure mostrano il confronto tra le due determinazioni secondo il metodo di Altman-Bland. Dalle figure si nota come il metodo enzimatico tenda a sovrastimare leggermente la misura per valori di clearance superiori a 50 ml/min.

23

Test Passing & Bablock method conversion CLEARANCE: Jaffé v Plus Performed by LABDER Date 2 maggio 2005



Cusum test for linearity - p 0.01 > p < 0.05 (non-linear relationship between X and Y detected)

y = 1.1303x - 1.7619

0

20

40

60

80

100

120

140

160

0 50 100

CLEARANCE - Jaffé

CLE

AR

AN

CE

- Plu

s

Test Deming regression CLEARANCE: Jaffé v Plus Performed by LABDER Date 2 maggio 2005




y = 1.205x - 3.9106

0

20

40

60

80

100

120

140

160

0 50 100

CLEARANCE - Jaffé

CLE

AR

AN

CE

- Plu

s

La figura mostra il confronto tra le due determinazione secondo il metodo di Passing-Bablock. La leggere sovrastima descritta in precedenza è confermata da questo grafico. La regressione tra i due metodi è riprodotta nell’equazione y= 1.13x – 1.76.

Figura 26

La figura mostra il confronto tra le due determinazioni secondo il metodo parametrico di Deming. La regressione tra il metodo di Jaffé (x) e il metodo enzimatico (y) è riprodotta nell’equazione y= 1.20x – 3.91.

Figura 27

24

5. DISCUSSIONE La creatinina e rispettivamente la sua clearance sono tra le analisi maggiormente richieste in ambito ospedaliero. Oltre al monitoraggio della funzione renale, molti medicamenti vengono dosati in base alla clearance della creatinina (per esempio i citostatici). La misura precisa di questo parametro è quindi estremamente importante. Il metodo di riferimento internazionale (“gold standard”) per la determinazione della creatinina è l’HPLC, preciso ed affidabile, ma inadatto ad un impiego in laboratori di routine in quanto lento, costoso e di difficile automazione. I metodi utilizzati normalmente negli ospedali sono il metodo secondo Jaffé oppure il metodo enzimatico. La determinazione secondo Jaffé è un metodo largamente diffuso in quanto molto economico. È però sensibile all’interferenza delle cosiddette pseudocreatinine (acetone, piruvato, glucosio, fruttosio, acido urico, acido ascorbico, cefalosporine, ecc.) che possono causare una sovrastima del risultato di 20-30 µmol/l. Il metodo enzimatico è insensibile alle pseudocreatinine e fornisce risultati equivalenti al metodo di riferimento internazionale. Per questo motivo è sempre più diffuso, anche se piuttosto costoso. Lo scopo del lavoro di diploma era di valutare l’eventuale sostituzione del metodo di determinazione della creatinina secondo Jaffé con il metodo enzimatico dal punto di vista qualitativo ed economico. Per quanto riguarda la precisione, i due metodi si sono dimostrati buoni e sostanzialmente equivalenti. Il coefficiente di variazione per tutte le analisi è inferiore al 5%. I valori trovati rispecchiano le dichiarazioni fornite dal produttore. Il confronto metodi è stato eseguito secondo un metodo parametrico (Deming) e secondo un metodo non parametrico (Passing-Bablock). I risultati del confronto sono inoltre stati rappresentati secondo il metodo di Altman e Bland che fornisce un’idea immediata delle differenze tra i 2 metodi a seconda del valore di misura. Un metodo di confronto parametrico è più sensibile (meno robusto) di un metodo di confronto non parametrico a singole misure molto discrepanti. Il confronto metodi mostra che la determinazione della creatinina nel siero è leggermente sottostimata a valori bassi e leggermente sovrastimata a valori alti. Questo risultato non sorprende in quanto l’incidenza delle cosiddette pseudocreatinine (di ca 20-30 µmol/l secondo il produttore del test) è superiore a valori bassi. Diverso è il discorso per quel che riguarda la creatinina nell’urina, dove sostanzialmente i due metodi si dimostrano equivalenti: il bias di 181 è infatti trascurabile rispetto agli usuali valori di creatinina urinaria. Per quanto riguardano le misure di clearance, il metodo enzimatico tende a sovrastimare leggermente i pazienti con clearance superiore a 50, mentre al di sotto di questo valore le misure possono essere considerate identiche. In sostanza si può affermare che, dal punto di vista qualitativo, l’introduzione del nuovo metodo non dovrebbe porre alcun problema, permetterebbe anzi ai laboratori dell’EOC di dare risultati perfettamente allineati agli standard internazionali.

25

In vista della possibile introduzione del nuovo metodo, i clinici devono comunque essere informati della leggera sottostima del nuovo metodo a valori bassi di creatinina plasmatica. Questi valori, osservati principalmente nei reparti di pediatria e oncologia, possono portare a calcoli della clearance leggermente differenti nel caso quest’ultima sia calcolata a partire unicamente dalla creatinina plasmatica/sierica.

6. COSTI I costi dei due metodi di analisi sono stati stimati confrontando il prezzo di listino tra la determinazione della creatinina secondo Jaffé e la determinazione enzimatica. Il prezzo unitario di un Kit di analisi adatto a circa 2000 determinazioni è di 251.80 CHF. per quanto riguarda la creatinina secondo Jaffé e di 1334.20 CHF. per quanto riguarda la creatinina enzimatica. La creatinina enzimatica è quindi 5.3 volte più costosa. Durante tutto il 2004, sono state determinate presso l’EOC 116949 creatinine secondo Jaffé, spendendo 3168.40 CHF. in reagenti, calibrazioni, controlli e ripetizioni compresi. Poichè l’incidenza di calibrazioni, controlli e ripetizioni sarebbe stata simile utilizzando il metodo enzimatico, si può ipotizzare una spesa annuale di 3168.4 * 5.3 = 16792.5 CHF. L’introduzione della determinazione enzimatica della creatinina in tutti i laboratori dell’EOC comporterebbe quindi una spesa in reagenti superiore di 16792.5 - 3168.4 = 13624.1 CHF. all’anno.

26

7. CONCLUSIONI Il metodo enzimatico per la determinazione della creatinina è preciso, accurato, e permetterebbe di avere risultati perfettamente allineati agli standard internazionali. Questo punto è particolarmente importante in quanto sempre più spesso vengono condotti studi clinici a livello internazionale cui partecipano medici dell’EOC. I laboratori devono comunque calcolare un aumento dei costi per reagenti annuale di circa 14000 Fr. Dal punto di vista qualitativo, il nuovo test potrebbe quindi essere introdotto subito.

27

8. BIBLIOGRAFIA

Dispense: (2) Dispense consegnate dal docente di chimica clinica G. Togni; 2004-2005. Referenze incluse. (4) Dispense consegnate dal responsabile del lavoro R. della Bruna; 2005. Referenze incluse. (5) SOP del laboratorio dell’Ospedale Civico di Lugano. Letteratura: (6) “Introduzione pratica alla cromatografia in fase liquida (HPLC), R. W. Yost, L. S. Ettre, R. D. Colon. Seconda edizione riveduta e aggiornata da S. Gallo; 2003. (10) “Labor und Diagnose”, L. Thomas. Fünfte Auflage, TH-Books Verlagsgesellschaft mbH; 1998. Metodiche: (7) Metodica originale Crea Plus della ditta Roche Diagnostics. (8) Metodica originale Crea della ditta Roche Diagnostics. Internet: (1) www.sportmedicina.com/creatina.htm (3) www.eoc.ch/vademecum_eolab.pdf (9) www.roche-diagnostics.it Figure: L’immagine in copertina è presa da: www.sportsonly.com Figura 1 e 2: www.scienceandsociety.co.uk Figura 3, 4, 5, 6, 7, 8 e 9: le foto sono state fatte dall’autrice del lavoro.

28

9. RINGRAZIAMENTI

I miei ringraziamenti vanno a coloro che mi hanno permesso e mi hanno aiutato a svolgere il lavoro. La prima persona che ringrazio è il Dr. Damiano Castelli, che mi ha dato l’opportunità di svolgere questo lavoro. Roberto della Bruna, responsabile, che mi ha seguito durante il lavoro e mi ha aiutato nell’analisi statistica. Marcello Niosi, capo laboratorio dell’Ospedale Civico di Lugano, che mi ha concesso l’uso degli apparecchi e del laboratorio per le misurazioni. Le laboratoriste dell’OCL per la loro disponibilità. Andrea Boffini, docente di metodologia, per averci indicato la strada nello svolgere il lavoro e per aver risposto alle nostre domande. Francesco Bezzola, docente di informatica e statistica, che ci ha introdotto nel mondo della statistica e che ci ha aiutato ad ampliare le nostre conoscenze informatiche. Susan Gilbert, docente di inglese, per aver corretto l’abstract (riassunto). La mia famiglia e Felice, che hanno sopportato i momenti di nervosismo avuti durante lo svolgimento del lavoro. Infine me stessa, perché sono riuscita a svolgere e a gestire il lavoro con impegno, arrivando fino alla fine. A tutti loro dico grazie!

Valentina Galiani

29

ALLEGATO 1

L’HPLC L’HPLC, ovvero la cromatografia in fase liquida ad alta prestazione (risoluzione). La cromatografia è essenzialmente una tecnica di separazione e come tale, è forse la migliore oggi disponibile. L’obiettivo della maggior parte delle indagini cromatografiche è quello di analizzare il campione. La determinazione di quali o quanti componenti sono presenti nel campione, viene detta analisi qualitativa; mentre la determinazione della quantità di alcuni o di tutti i componenti presenti, viene detta analisi quantitativa. Tutta via essa è un metodo “cieco”. Essa indica la presenza di una sostanza senza dire quale essa sia, e da luogo ad un segnale che può essere messo in relazione con la quantità presente senza rilevarne effettivamente l’identità. Lo schema che segue presenta lo schema funzionale di un sistema per cromatografia in fase liquida. Come si può vedere, i componenti fondamentali di tale sistema sono:

- una pompa che regola e mantiene il flusso della fase mobile; - un dispositivo per l’introduzione del campione; - una colonna contenente la fase stazionaria ed un rivelatore per evidenziare,

mediante, opportuni segnali elettrici, i componenti separati dalla colonna.

Contenitore della fase mobile

Pompa

Filtro

Iniettore

Rivelatore

Collettore di frazione

Colonna

Registratore Calcolatore

Manometro

30

Il ciclo analitico della cromatografia consiste nel trasporto delle sostanze contenute nel campione attraverso il letto di fase stazionaria mediante la fase mobile. Durante questo percorso le singole sostanze vengono rallentate dalla fase stazionaria in funzione delle interazioni che si generano tra i componenti del campione, la fase mobile e la fase stazionaria stessa. Questo rallentamento è selettivo, ciò significa che con un dato sistema di fasi mobili e stazionarie, l’entità del rallentamento sarà differente per ogni componente del campione. La valutazione qualitativa e quantitativa dei risultati viene eseguita registrando semplicemente la risposta del rivelatore sottoforma di cromatogramma (una curva di risposta in funzione del tempo) ed elaborando i dati con opportuni sistemi computerizzati. Quanta più luce viene assorbita o deflessa dalle sostanze che passano nella cella del rivelatore, tanto più forte sarà il segnale. I singoli componenti separati nella colonna possono essere inoltre facilmente raccolti per effettuare l’identificazione con altre tecniche analitiche, preparare standard ad elevata purezza o per altri impieghi. Nell’analisi cromatografia lo scopo è sempre quello di determinare la composizione del campione originale, e si assume che i picchi che appaiono sul cromatogramma si riferiscano ai singoli costituenti del campione. Tuttavia questo non è sempre vero, ed alcune volte possono apparire nel cromatogramma anche picchi artefatti, cioè non presenti nel campione originale. Tali picchi artefatti possono avere origini diverse. Una fonte primaria di picchi artefatti è il materiale proveniente da campioni analizzati in precedenza, che può essere stato adsorbito (ritenuto) sulla colonna o nel sistema di iniezione. Altri artefatti provengono da molti campioni in cui sono contenuti, in tracce, impurità di cui l’analista non è al corrente. Un’altra fonte di picchi artefatti può essere ricercata in sostanze fuoriuscite in qualche punto del sistema; il più probabile di tali punti è il raccordo tra la colonna e l’iniettore, oppure l’iniettore stesso. (6)

31

ALLEGATO 2

ROCHE/HITACHI 912 L’Hitachi 912 è un analizzatore automatico di chimica clinica. La sua produttività è ideale per esami di routine ed esami speciali, è predisposto per l’esecuzione di analisi di chimica clinica, di elettroliti, di proteine specifiche, dosaggi di droghe e monitoraggio di farmaci. È un analizzatore automatico di facile utilizzo, composto da un sistema analitico con un’unità di gestione e controllo separata (PC Pentium, tastiera alfanumerica, video e stampante). L’analizzatore, cioè la parte dove avvengono le analisi è suddiviso in 4 piatti o rotori:

- un piatto per la gestione dei campioni, delle urgenze, dei controlli e delle calibrazioni;

- due piatti per i reagenti; - un piatto di reazione.

Per la lettura delle reazioni, l’Hitachi 912 è disposto di uno spettrofotometro con diverse lunghezze d’onda. Il principio fotometrico (spettrofotometrico): Una luce policromatica emessa da una sorgente è resa monocromatica passando attraverso un selettore di lunghezze d’onda (λ). Il raggio reso monocromatico attraversa la soluzione contenuta in una cella di misurazione (cuvetta) e viene parzialmente assorbito. Il raggio non assorbito colpisce una fotocellula che trasforma in corrente elettrica l’energia luminosa del raggio incidente su di essa. Altre particolarità sul sistema e caratteristiche tecniche:

- prediluizione automatica; - accesso 24h/24; - reagenti liquidi e pronti all’uso; - 50 posizioni per routine e 20posizioni per urgenze; - 17 posizioni per calibratori e otto posizioni per controlli; - identificazione dei campioni e dei reagenti tramite barcone; - rotori porta-reagenti refrigerati; - 120 cuvette lavabili. (9)

32

ALLEGATO 3

36

ALLEGATO 4

40

ALLEGATO 5 analysed with: Analyse-it + Clinical Laboratory 1.65

Test Bias plots CREA SIERICA: Jaffé v Plus

Performed by LABDER Date 2 maggio 2005 n 54

Bias 2.759

95% CI -1.577 to 7.095


Lower -28.377 -35.619to -21.136 Upper 33.896 26.655to 41.137

Identity line A=B

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

0 200 400


CR

EA S

IER

ICA

- Pl

us

Zero bias

-40

-30

-20

-10

0

10

20

30

40

50

0 200 400


Diff

eren

ce b

etw

een

met

hods

0 10 20 30

41

Zero bias

-30

-25

-20

-15

-10

-50

5

10

15

20

0 200 400


Diff

eren

ce b

etw

een

met

hods

(%)

42

analysed with: Analyse-it + Clinical Laboratory 1.65

Test Passing & Bablok method conversion CREA SIERICA: Jaffé v Plus


Coefficient 95% CI



y = 1.1329x - 18.808

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

50 150 250 350 450


CR

EA S

IER

ICA

- Pl

us

-30

-20

-10

0

10

20

0 10 20 30 40 50

Running no.

Res

idua

ls

43

-7

-5

-3

-1

1

3

5

7

0 10 20 30 40 50

Running no.

Cus

um

44


Test Deming regression CREA SIERICA: Jaffé v Plus


Imprecision SD 1.0000 1.0000

Variance ratio 1.0000

Coefficient SE 95% CI


y = 1.1358x - 18.589

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

50 150 250 350 450


CR

EA S

IER

ICA

- Pl

us

-4

-3

-2

-1

0

1

2

3

50 150 250 350 450

Estimate of True Value

Stan

dard

ized

resi

dual

45


Test Bias plots CREA URINARIA: Jaffé v Plus


Bias 181.296

95% CI 116.736 to 245.856


Lower -282.293 -390.109to -174.477 Upper 644.885 537.070to 752.701

Identity line A=B

0

5000

10000

15000

20000

25000

0 5000 10000 15000 20000 25000


CR

EA U

RIN

AR

IA -

Plus

Zero bias

-400

-200

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

0 5000 10000 15000 20000 25000


Diff

eren

ce b

etw

een

met

hods

0 10 20 30 40

46

Zero bias

-10

-5

0

5

10

15

20

0 10000 20000


Diff

eren

ce b

etw

een

met

hods

(%)

47


Test Passing & Bablok method conversion CREA URINARIA: Jaffé v Plus


Coefficient 95% CI

Intercept 57.970 -52.793to 141.378 Slope 1.025 1.001to 1.049


y = 1.0254x + 57.97

0

5000

10000

15000

20000

25000

0 5000 10000 15000 20000CREA URINARIA - Jaffé

CR

EA U

RIN

AR

IA -

Plus

-400

-300

-200

-100

0

100

200

300

400

500

0 10 20 30 40 50Running no.

Res

idua

ls

48

-6

-4

-2

0

2

4

6

0 10 20 30 40 50

Running no.

Cus

um

49


Test Deming regression CREA URINARIA: Jaffé v Plus





Intercept -7.2837 50.4538 -108.5266to 93.9592 Slope 1.0389 0.0086 1.0215to 1.0562

y = 1.0389x - 7.2837

0

5000

10000

15000

20000

25000

0 5000 10000 15000 20000CREA URINARIA - Jaffé

CR

EA U

RIN

AR

IA -

Plus

-2.5

-2

-1.5

-1

-0.5

0

0.5

1

1.5

2

2.5

0 5000 10000 15000 20000Estimate of True Value

Stan

dard

ized

resi

dual

50


Test Bias plots CLEARANCE: Jaffé v Plus


Bias 4.7

95% CI 2.6 to 6.7


Lower -9.9 -13.3to -6.5 Upper 19.2 15.8to 22.6

Identity line A=B

0

20

40

60

80

100

120

140

160

0 50 100 150

CLEARANCE - Jaffé

CLE

AR

AN

CE

- Plu

s

Zero bias

-10

-5

0

5

10

15

20

25

30

0 50 100 150

Mean of CLEARANCE

Diff

eren

ce b

etw

een

met

hods

0 10 20 30 40

51

Zero bias

-10

-5

0

5

10

15

20

25

0 50 100 150

Mean of CLEARANCE

Diff

eren

ce b

etw

een

met

hods

(%)

52


Test Passing & Bablok method conversion CLEARANCE: Jaffé v Plus


Coefficient 95% CI


Cusum test for linearity - p 0.01 > p < 0.05 (non-linear relationship between X and Y detected)

y = 1.1303x - 1.7619

0

20

40

60

80

100

120

140

160

0 50 100CLEARANCE - Jaffé

CLE

AR

AN

CE

- Plu

s

-6

-4

-2

0

2

4

6

8

10

0 10 20 30 40 50Running no.

Res

idua

ls

53

-9-7-5-3-113579

0 10 20 30 40 50

Running no.

Cus

um

54


Test Deming regression CLEARANCE: Jaffé v Plus






y = 1.205x - 3.9106

0

20

40

60

80

100

120

140

160

0 50 100CLEARANCE - Jaffé

CLE

AR

AN

CE

- Plu

s

-2.5

-1.5

-0.5

0.5

1.5

2.5

0 50 100Estimate of True Value

Stan

dard

ized

resi

dual

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