Sommario - Innovhub SSIextranet.innovhub-ssi.it/allstd/risg/2009-RISG 2.pdf · 2011. 2. 8. ·...

Autorizzazione del Tribunale di Milano 28.9.1948, N. 591 PUBBLICITÀ INFERIORE al 70%

DIREZIONE E REDAZIONE:Via Giuseppe Colombo, 79 – 20133 Milano – Tel. 02.706497.42 – Fax 02.23.63.953E–mail: [email protected] – internet: www.ssog.it

Abbonamenti 2009: annuo Italia e 100 – annuo estero e 200Numero separato e 30 – Numero arretrato e 40Questa rivista Le è stata inviata tramite abbonamento: l’indirizzo sarà utilizzato, oltre che per l’invio della rivista stessa, anche perl’inoltro di proposte di abbonamento o promozioni commerciali.Ai sensi della legge 675/96 è nel suo diritto richiedere la cessazione dell’invio e/o l’aggiornamento dei dati in nostro possesso.

Sommario

C. Mariani, G. Bellan 75 Sulla possibilità di individuazione di grassi idrogenati inmargarine e miscele di grassi

P. Rovellini, P. Fusari, 85 Contenuto di idrocarburi policiclici aromatici in oli e grassiS. Venturini vegetaliM. Migliorini, C. Cherubini, 92 Influenza delle condizioni operative di gramolatura B. Zanoni, M. Mugelli, sulla qualità dell’olio extra vergine di olivaE. Cini, A. BertiA. Tamendjari, M. Sahnoune, 103 Effet de l’attaque du ravageur Bactrocera oleae sur la S. Mettouchi, F. Angerosa qualité de l’huile d’olive de trois variétés algériennes:

Chemlal, Azzeradj et BouchoukL. Gagliardi, D. De Orsi, 112 La sicurezza chimico-microbiologica di una classe R. Briancesco, S. Della Libera, di prodotti cosmetici: i depigmentanti cutaneiG. Donati, M. Semproni, L. BonadonnaM. Rubio, M. Álvarez-Ortí, 121 A review on the utilization of grape seed oil as an alternativeJ.E. Pardo to conventional edible vegetable oils A.O. Ademiluyi 130 Polyphenol contents and antioxidant capacity of tropical cloveV.O.E. Akpambang, bud (Eugenia aromatica Kuntze)G. Oboh

137 Congressi

Consiglio di Amministrazione

della Stazione Sperimentale Oli e Grassi

Presidente: A. Zoncada

Vice Presidente: C. Ranzani

Membri: A. Arg e ntieri, E. Benelli , A. Fi remi, A. Fonda,

A. Lavagnini, A. Manoukian, G. Mennea, A.M. Menotti,

F. Murizzi, G. Nahmias, G. Papa, G. Pe cci, G. Ri va, U. Sa rd e l l i

Collegio dei Revisori

Presidente: I. Russo

Membri: G. Magliacane, A.M. Malandrino

Commissione te c n i ca per le industrie degli oli

vegetali, grassi vegetali ed animali, delle proteine

vegetali, degli oli minerali, dei colori e vernici, dei

d e te rgenti e te n s i o attivi, dei prodotti cosmetici e di

igiene personale

Presidente: M. Surdi

Membri: F. Apruzze s e, D. At t a rd – Barbini, B. Ba ro l o,

M. Be r n a rdini, A. M. Ca n e, D. Capit ani, G . Ca relli,

G. Carletti, M. Carli, V. Casagrande, G. Ceresa, A. Ceriotti,

A. Co l l a l to, L. Co nte, G . D'Ag o s t i n i s, P. G . Dal ze ro,

G. De Felici, M. De l i s e, G. Di Masi, A. Diblasi, G. Do n ati,

F. Fabietti, P. F. Ferrari, V. Ferrentino, G. Frediani, E. Fuochi,

M. Fusari, L. Ga g l i a rdi, R. Gorni, C. Gozzi, D. Grieco,

G. Le rc ke r, F. Lu cchi, S. Marazzi, L. Marchesi, F. Marconi,

A. Masci, A. Mat tei, D. Misiti, D. Monte l e o n e, L. Novità,

M. Patumi, R. Pedrial i, F. Pe l l a s c h i a r, R. Pe r ro n e,

S. Petriglieri, P. Pi s to l e s e, A. Po l i to, S. Puliga, M. Renna,

D. Ri atti, A. Rizzi, P. Sa l vatori, G. Sc a ra nt i n o, A. Se rani,

S. Serra, L. Sisti, F. Stanga, A. Terrugi, M. Zanardo

Se g retario: S. Tagliabue co a d i u vato da M.G. Fe d r i g u cc i

e–mail: [email protected]

EDITORE, ABBONAMENTI, PUBBLICITÀ

S.E.A. – Servizi Editoriali Associati srl

Via Adamo del Pero, 6 – 22100 Como

Tel. 031.243421

Fax 031.267750

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STAMPA

Grafica Alta Brianza

Via C. Battisti, 2 Lambrugo – 22035 Como

DIRETTORE RESPONSABILE: M. SURDI

Segretaria di redazione: A. FIORE

R I V I S TA U F F I C I A L E D E L L A S TA Z I O N E S P E R I M E N TA L E P E R L E I N D U S T R I E D E G L I O L I E D E I G R A S S I

Commissione tecnica per le industrie degli oli vegetali, grassi vegetali ed animali, delle proteine vegetali, degli oli minerali, dei colori e vernici,

dei detergenti e tensioattivi, dei prodotti cosmetici e di igiene personale

COMITATO ITALIANO DEI DERIVATI TENSIOATTIVI

APRILE/ GIUGNO 2009 – ANNO LXXXV I

2 d u e m i l a n o v e

Comitato di redazioneP. BONDIOLI settore tecnologico e usi industriali sostanze grasseM. CARDILLO settore proteine vegetali e organismi geneticamente modificatiA. GASPAROLI settore cosmetica e termossidazioneG. GASPERINI settore prodotti verniciantiC. MARIANI, P. ROVELLINI settore sostanze grasseD. MARIANI settore detersivi e tensioattiviM. SALA settore lubrificanti

Comitato scientifico di refereeR. APARICIO: Istituto de la Grasa y sus Derivados – Siviglia (E)B. BERRA: Istituto di Fisiologia – Facoltà di Farmacia – Università di MilanoF. CAMURATI: MonzaA. CERT: Instituto de la Grasa y sus Derivados – Siviglia (E)E. CHRISTOPOULOU: Hellenic Republic Ministry of Finance – G.S. of Consumer –Directorate Technical Control – Atene (Gr)G. CONTARINI: Istituto Lattiero Caseario – LodiL. CONTE: Dipartimento di Scienza degli Alimenti – Università di UdineN. CORTESI: MilanoG. DONATI: Istituto Superiore Sanità – RomaH.J. FIEBIG: Federal Research Centre for Nutrition and Food – Institute for Lipid Research – Münster (D)C. GIGLIOTTI: Dipartimento di Scienze Biomediche e Biotecnologiche – Università di BresciaK. GROB: Kantonales Laboratorium – Zurigo (CH)F. LACOSTE: Institut des Corps Gras – ITERG – Pessac (F)G. LERCKER: Dipartimento di Scienze Alimentari – Università di BolognaL. MANNINA: Facoltà di Agraria – Università degli Studi di CampobassoR. SACCHI: Dipartimento Scienze Alimenti - Università Federico II - Portici (NA)C. SCESA: Corso di Laurea in Tecniche Erboristiche – Facoltà di Farmacia – Università di UrbinoM.SERVILI: Dipartimento di Scienze Economico-Estimative e degli Alimenti - Università di PerugiaL. SISTI: Henkel – Divisione Tensioattivi – Lomazzo (CO)E. TISCORNIA: GenovaT. ZELINOTTI: Roma

CID – Comitato Italiano dei Derivati TensioattiviPresidente: A. ZattaVicepresidenti: I. AdamiConsiglieri: P. Costanzo, L. Sisti, M. SurdiTesoriere: ...Membri: M. Barelli, M. Bottiglieri, E. Campana, G. Cassani, R. Cella, E. Cinquini, S. Coccopalmeri, PG. Dalzero, G. Di Giovanni, V. Donelyan, D. Feraboli, A. Fornara, H. Fox, D. Franzoni, A. Gianola, G. Giurini, D. Libretti, F. Maestri, B. Manzoni, F. Marchesi, A. Mea Blasi, F. Monterisi, A. Morandi, M. Paglieri, G. Pecoraro, L. Perani, A. Polito, A. Previ,M. Ramundo, M. Russo, L. Spadoni, F. Spini, A. Sudati, P. Toniolo, E. Verzaro, G. Villa, G. ZuccottiEsperti: : A. Arpino, A. Bertini, G. Bressan, L. Cavalli, C. Divo, C. Pacchetti, V. Riganti, C. Ruffo, E. SantacesariaSegretario: D. Mariani

Segreteria: 20133 Milano Via G. Colombo 79 Tel. 02.2367216 Fax 02.70608944 E–mail: [email protected] – Sito web: www.ciditalia.it

Indexed and abstracted in:• Thomson Scientific services: Science Ci t ation Index Expanded

( Sc i Se a rch®), Journal Ci t ation Report s / Science Edition, Curre n tContents®/Clinical Medicine

• Chemical Abstracts• Elsevier Bibliographic Databases: SCOPUS• FSTA – Food Science and Technology Abstract (IFIS Publishing – UK)

IM PA C T FA C T O R 2007: 0,244

Sulla possibilità di individuazione digrassi idrogenati in margarine e

miscele di grassi

C. MARIANI, G. BELLAN

STA Z I O N E SP E R I M E N TA L E P E R L E

INDUSTRIE DEGLI OLI E DEI GRASSI

MILANO

L’I N D I V I D UA Z I O N E D E L LA P R E S E N Z A D I G R A S S I I D RO G E NAT I È STATA S E M P R E E F F E T T UATATRAMITE IL DOSAGGIO DEGLI ACIDI GRASSI TRANS.NEGLI ULTIMI ANNI QUESTI ACIDI GRASSI SONO STATI PRATICAMENTE MESSI AL BANDO DAIN U T R I Z I O N I ST I, E P E R TA N TO S I P R E F E R I S C E R I CO R R E R E A P RO D OT T I AV E N T I N U M E RO D II O D I O 0 P E R P O I E V E N T UA L M E N T E M I S C E LA R L I O I N T E R E ST E R I F I CA R L I CO N P RO D OT T I NO NIDROGENATI.L’I N D I V I D UA Z I O N E D E L LA P R E S E N Z A D I G R A S S I I D RO G E NAT I P U Ò E S S E R E FAT TA D O SA N D OGLI ACIDI GRASSI SATURI, TUTTAVIA QUANDO QUESTI GRASSI SONO PRESENTI A LIVELLI INFE-RIORI AL 5/10% LA DETERMINAZIONE NON È PIÙ POSSIBILE DATA LA GRANDE VARIABILITÀCOMPOSITIVA DELLE SOSTANZE GRASSE.NEL PRESENTE LAVORO ABBIAMO VALUTATO LA PRESENZA DI IDROGENATI TRAMITE LA VALU-TAZIONE DI COMPONENTI MINORI TOTALMENTE IDROGENATI COME GLI STERANI, ARRIVANDO AINDIVIDUARE LA PRESENZA DI IDROGENATI A LIVELLI INFERIORI AL 2%.

THE DETECTION OF HYDROGENATED FATS IN MARGARINE AND FAT MIXTURESTH E D E T E C T I O N O F H Y D RO G E NAT E D FATS H A S A LWAYS B E E N M A D E BY A S S E S S I NG T H EAMOUNT OF TRANS FATTY ACIDS PRESENT IN THE EXAMINED PRODUCT.THESE FATTY ACIDS HAVE BEEN ALMOST COMPLETELY BANNED BY NUTRITIONISTS OVER THELAST FEW YEARS, THEREFORE, PRODUCTS HAVING THE NUMBER OF IODINE 0 ARE PREFER-RED, BEING MIXED OR INTERESTERIFIED WITH NON-HYDROGENATED PRODUCTS.THE IDENTIFICATION OF HYDROGENATED FATS CAN BE MADE BY ASCERTAINING THE AMOUNTO F SAT U R AT E D FATS, B U T I T I S N’T P O S S I B L E TO D E T E R M I N E S U CH FATS LOW E R T H A N5/10% DUE TO THE VARIABLE COMPOSITION OF THE FATTY SUBSTANCES. IN THE PRESENTWORK, THE TOTALLY HYDROGENATED MINOR COMPOUNDS SUCH AS STERANS, WERE DETERMI-NED, SO DETECTING THE PRESENCE OF HYDROGENATED FATS AT LEVELS LOWER THAN 2%.

CORRISPONDENZA: DR. CARLO MARIANI

[email protected]

L A R I V I S T A I TA L I A N A D E L L E S O S T A N Z E G R A S S E - V O L . L X X X V I - A P R I L E / G I U G N O 2 0 0 9

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INTRODUZIONE

L’individuazione di grassi parzialmente idrogenati èspesso affidata al dosaggio degli acidi grassi t r a n sche si formano durante l’idro g e n a z i o n e .

Poiché gli acidi grassi t r a n s sono praticamentebanditi o quasi [1], i ricercatori per ottenere grassi amaggior punto di fusione hanno pensato di ricorre read idrogenazioni che arrivino a N° di Iodio 0 per poii n t e resterificarli con oli che contengono acidi insaturisino ad arrivare al punto di fusione voluto. Tuttavia lap roduzione di idrogenati con N° di iodio 0 ha apertouna problematica, in quanto o si può contare su diun notevole incremento degli acidi grassi saturi, taleda superare il limite previsto per la sostanza grassa inesame o altrimenti non si riesce a definire in manieracerta la loro presenza in prodotti non idro g e n a t i .

Non dobbiamo inoltre dimenticare che gli acidi gras-si t r a n s non si formano solo durante l’idro g e n a z i o n ema anche durante il processo di raffinazione, special-mente se si opera con alte percentuali di terre decolo-ranti ed a temperature elevate in fase di deodorazione.

I n o l t re alcuni grassi animali, come il burro, con-tengono acidi grassi trans, anche se in questo fran-gente si tratta principalmente di t r a n s vaccenico (t 11 ottadecenoico), mentre nei grassi parzialmenteidrogenati si tratta di una miscela di ottadecenoici,dove il doppio legame trans è collocato in posizionidiverse lunga la catena carboniosa.

L’individuazione di aggiunte di idrogenati a N° diiodio 0 a grassi concreti, come il palma o altri grassitropicali, soprattutto in piccola misura, diventa quin-di un problema di non facile soluzione.

I n o l t re, spesso nei prodotti finiti, in etichetta èdichiarato “oli idrogenati assenti”, ma non si è ingrado di verificare analiticamente questa affermazio-ne. É noto però che gli oli prima di essere idrogenatidebbono essere raffinati onde evitare eventualiavvelenamenti del catalizzatore [2], e che durante laraffinazione si formano, soprattutto in fase di deco-lorazione, prodotti di disidratazione degli stero l i ,meglio noti come stereni.

Gli stereni sono idrocarburi steroidei caratterizzatidal possedere 2 doppi legami coniugati nell’anello Ae B. Questi composti di neoformazione individuatiper la prima volta da Neiwiadomski [3] negli oli raffi-nati, sono stati in seguito utilizzati dal Lanzon [4] perindividuare la presenza di oli rettificati negli oli extravergini di oliva.

Mariani [5] utilizza il colestadiene di neoformazione,

p roveniente dalla disidratazione del colesterolo, pere v i d e n z i a re l’aggiunta di grassi animali al burro, e perd i ff e re n z i a re lo strutto vergine da quello rettificato, epiù in generale per rivelare la presenza, in grassi vergi-ni, di sostanze grasse che hanno subito trattamenti.

Questi composti sono stati inoltre utilizzati daG a s p a roli [6,7] per diff e re n z i a re lo squalene e losqualano di origine vegetale da quello animale.

Ovviamente questi composti, quando la sostanzagrassa viene sottoposta ad idrogenazione, vengonoanch’essi saturati, fornendo nuovi composti, nonp resenti naturalmente, che possono fungere da“marker” per indicare l’avvenuta idrogenazione.

Alla luce di queste premesse nel presente lavoroabbiamo cercato di mettere a punto una metodicache ci consentisse di individuare e dosare questicomponenti minori idrogenati.

MATERIALI

- Esano per pesticidi Fluka (Buchs-Switzerland)- Isottano R.P.E. Carlo Erba (Rodano-Italia)- Etere etilico P.A Fluka (Buchs Switzerland), - Silon BFT Supelco (Bellefonte Ca-USA),- Piridina per sililazione Fluka (Buchs Switzeland)- Gel di silice Merck (Darmstadt-Germany) idratato

con il 2% di acqua, - Colestadiene Sigma (St.Louis Mi-U.S.A)- Colestano Sigma (St.Louis Mi-U.S.A), - α-colestanolo Sigma St.Louis Mi-U.S.A), - Alcol C21 Sigma (St.Louis (Mi-U.S.A), - Lauril arachidato Nu-Check (Elisian Mn-USA)- Colesteril heptadecanoate Sigma (St.Louis Mi-

U.S.A)- Olio di palma grezzo - Olio di palma da raffinazione fisica

Tabella I - Composizione delle miscele pre p a rate da un laborato r i oesterno

Campione Codifica

Olio di colza alto erucico idro g e n ato Colza alto erucico H

Olio di colza idro g e n ato Colza H

Olio di palma idro g e n ato Palma H

mix 98% palma 25 - 2% olio di colza alto erucico idro g e n ato mix 1

mix 98% palma 25 - 2% olio di colza idro g e n ato mix 2

mix 98% palma 25 - 2% olio di palma idro g e n ato mix 3

mix 95% palma 25 - 5% olio di colza alto erucico idro g e n ato mix 4

mix 95% palma 25 - 5% olio di colza idro g e n ato mix 5

mix 95% palma 25 - 5% olio di palma idro g e n ato mix 6


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- Olio di palma da raffinazione chimica- Oli di palma idrogenato a N° di iodio vario- Olio di soia idrogenato- Olio di colza idrogenato- Miscele di palma idrogenato e colza idrogenato in

palma stearina incognite prodotte da un laborato-rio terzo, come riportato in Tabella I

- Margarine con contenuto di idrogenati incognito

METODI

Viene utilizzato il metodo COI relativo alla determi-nazione degli stigmastadieni [8] con le seguentimodifiche:- si aggiunge alla sostanza da analizzare una quan-

tità di α-colestano pari a 5 mg/kg - la prima frazione esanica, invece di essere scarta-

ta, viene analizzata nelle stesse condizioni pre v i-ste per la frazione sterenica,

- la determinazione viene eseguita sia sull’insaponi-ficabile che sul grasso tal quale.

- L’insaponificabile viene preparato secondo [8], glisteroli sono stati determinati per analisi gascroma-tografica e analisi GC/MS.

Analisi gascromatograficaÈ stato utilizzato un gascromatografo Fisons

8560, munito di rivelatore a ionizzazione di fiammae iniettore on column per introduzione diretta a fred-do in colonna, nelle seguenti condizioni analitiche:- Colonna capillare in silice fusa ricoperta con Se

52 lung. 12m φint. 0,32 µm- Temperatura del forno: da 80°C (1min) a 140°C

con incremento di 20°C/min, indi a 330°C conincremento di 5 °C/min.

- Iniezione on column a 80°C - Temperatura del rivelatore: 350°C- Carrier gas: elio a 1,8 ml/min- Gas ausiliari: idrogeno 30 ml/min, aria 310 ml/min

Analisi GC/MSÈ stato utilizzato uno spettro m e t ro da banco

Thermo Voyager interfacciato con un gascro m a t o g r a f oTrace (Thermo) nelle seguenti condizioni analitiche:- Colonna capillare in silice fusa DB5 lunga 20mφ0,32 mm

- Iniezione on column a 80°C- Ionizzazione mediante impatto elettronico a 70 EV - Temperatura dell’ interfaccia: 260°C- Temperatura della sorgente: 220°C

RISULTATI E DISCUSSIONE DEI RISULTATI

Il primo approccio è stato verificare se l’ipotesi dilavoro fosse valida, vale a dire se gli stereni formatidurante la raffinazione venissero effettivamente idro-genati e pertanto potessero costituire un markerdell’avvenuta idrogenazione.

Le analisi condotte su olio di colza idro g e n a t o ,olio di soia idrogenato e olio di palma idro g e n a t ohanno mostrato che gli stereni vengono idrogenati,anche se parzialmente, in quanto non tutto vienesaturato, ma rimangono anche piccole quantità diidrocarburi steroidei monoinsaturi.

In Figura 1 è riportato parte del cromatogrammaGC/MS della frazione idrocarburi saturi di un olio dicolza idrogenato (parte inferiore full scan), mentrenella parte superiore è riportata la registrazione delsingolo ione 217 m/z, che è il picco base degli ste-rani saturi.

Nelle Figure 2 e 3 sono riportati gli spettri dimassa rispettivamente dei picchi 2-3 e 5-6. I picchi2 e 3 presentano lo stesso spettro di massa conpicco base a 217m/z e ione molecolare a 386 m/z,con piccolissime differenze nella parte dello spettroa basso peso molecolare.

A tal i picchi deve attribuirsi la struttura delCampestano e dell’Ergostano probabilmente nelleforme α e β: è noto infatti che le due forme hannospettri similari con ritenzioni gascromatografiche dif-ferenti,e la forma β è quella che usualmente ha unaritenzione inferiore.

L’attribuzione Campestano ed Ergostano derivadal fatto che gli steroli dell’olio di colza a 28 atomi dicarbonio sono i l Brassicasterolo, i l 22,23-Diidrobrassicasterolo con la struttura dell’Ergostanom e n t re il Campesterolo ovviamente deriva dalCampestano [10].

Ovviamente gli stereni prodotti in raffinazione esuccessivamente idrogenati dovrebbero mantenerela stessa configurazione, in quanto la differenza trale due strutture è data dal metile in C17 chedovrebbe mantenere la sua posizione durante tuttiquesti trattamenti.

I picchi 5 e 6 presentano entrambi un picco basea 217 m/z con ione molecolare a 400; a questi pic-chi sulla falsariga di quanto visto in pre c e d e n z adeve attribuirsi la struttura di β e α-Stigmastano.

Alla base dei picchi 3 e 6 si nota una piccola coe-luizione precedente i picchi principali, con piccobase rispettivamente a 384 e 398 m/z: a questi pro-


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so di sego idrogenato e gli spettri di massa dei pic-chi principali; dagli spettri di massa si può eviden-ziare che il picco 1 è verosimilmente un idrocarburo,mentre i picchi 2 e 3 risultano β e α-Colestano.

Tabella II - Contenuto in sterani di alcuni oli esaminati, espresso inmg/kg

Colza idrogenato 200 – 250

Soia idrogenato 50 - 70

Palma idrogenato 50

Sego idrogenato 40

Sego e soia sono produzioni molto vecchie.

Vista la fattibilità di individuare gli sterani, chesono presenti solo negli idrogenati, abbiamo valuta-to quali potessero essere i contenuti nei pro d o t t iesaminati. In Tabella II sono riportati i valori indicativiriscontrati negli oli esaminati.

Alla luce dei risultati ottenuti abbiamo chiesto aduna azienda utilizzatrice di grassi di pre p a r a rci unacampionatura di olio di palma addizionato di quantitàincognite di oli idrogenati; ad analisi terminata l’azien-da ci ha fornito la composizione delle miscele pre p a-rate. Tale composizione è riportata in Tabella I mentrein Figura 6 sono riportati alcuni tracciati GC/MS re l a t i v i

dotti si può assegnare la struttura di Campestene eStigmastene, prodotti dagli steradieni per idrogena-zione di un solo doppio legame.

Il picco 1 di Figura 1 sembra essere un derivatodel Colestadiene del quale conserva lo ione moleco-l a re a 368 m/z pur presentando una frammentazionediversa, mentre il picco 4 è un idro c a r b u ro lineare .

La composizione degli altri oli idrogenati segueg rosso modo quella del colza in quanto gli stero l idegli oli vegetali sono fondamentalmente a 28 e 29atomi di carbonio.

In Figura 4 sono riportati il tracciato GC/MS e glispettri di massa dei picchi principali della frazionesterani dell’olio di palma idrogenato.

Nell’olio di palma sono presenti praticamente glistessi componenti visti in precedenza nell’olio dicolza, vale a dire sterani nelle forme α e β a 28 e 29atomi di carbonio ed è presente anche i l“Colestadiene” (picco 2) insolito sia per polarità siaper dimensione, anche se in questo frangentea p p a re più giustificato, in quanto è noto che ilpalma contiene piccole quantità di Colesterolo, dacui potrebbe derivare.

Come nel colza sono presenti anche prodotti conun solo doppio legame.

In Figura 5 è riportato il tracciato GC/MS del gras-

Figura 1 - Tracciato GC-MS della frazione Sterani di un olio di colza idrogenato a N° di jodio 0; parte inferiore registrazione full scan, parte supe-riore registrazione a 217m/z. Identificazione nelle Figure 2 e 3 .


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Figura 2 - Spettri di massa dei picchi 2 e 3 di Figura 1 identificati come β e α-Campestani e Ergostani.

Figura 3 - Spettri di massa dei picchi 5 e 6 dei picchi 5 e 6 di Figura 1 identificati come β e α-Stigmastani


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Figura 4 - Tracciato GC/MS della frazione sterani di un olio di palma idrogenato a N° di jodio 0. Nella parte superiore tracciato full scan, nella parteinferiore spettri di massa dei picchi 1, 2, 6. Standard Interno α-colestano 1) picco avente ione molecolare del colestadiene, picchi 2 e 3) mix β eα-campestani e ergostani, picchi 4 e 6) β e α-stigmastani, picco 5) stigmastene

Figura 5 - Tracciato GC/MS della frazione sterani di un sego senza aggiunta di standard interno. Nella parte superiore tracciato full scan, nellaparte inferiore spettri di massa dei picchi 1 e 2. Picchi 1 e 2‚ β e α-colestani


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Figura 6 - Tracciati GC/MS di miscele incognite di olio di palma addizionate di colza, colza ad alto erucico e palma idrogenati a N° di jodio 0. Picco1) α-colestano standard interno, picchi 2 e 3)mix. β e α-campestani ed ergostani, picchi 4+ 5) stigmastani

Figura 7 - Tracciati GC/MS della frazione Sterani di 3 margarine prive di acidi grassi trans da idrogenazione. Nella parte inferiore registrazione fullscan, parte superiore a 217m/z. 1) α-colestano standard interno


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alle miscele più significative. Ovviamente, accanto aip rodotti addizionati abbiamo analizzato diversi oli dipalma e di colza senza tro v a re sterani.

Successivamente abbiamo analizzato 3 margari-ne pervenute in laboratorio per l’analisi degli acidigrassi trans: in queste 3 margarine sono stati rilevatisolo acidi grassi trans che si formano nel processodi raffinazione ed in Tabella III sono riportati i valoridi acidi grassi trans rilevati.

Tabella III -Valori di acidi grassi trans delle 3 margarine esaminate

Trans oleici % Trans linoleici % Trans linolenici %

Margarina 1 0,08 0,99 0,40

Margarina 2 0,09 0,69 0,17

Margarina 3 0,08 0,50 0,17

Il contenuto di acidi grassi trans nelle concentra-zioni riscontrate è assolutamente normale per gli oliraffinati; se vi fosse la presenza di oli parzialmenteI d rogenati si sarebbe individuata la presenza ditrans oleici molto più alta accompagnata da isomeriposizionali. Successivamente, su queste 3 margari-

ne abbiamo ricercato gli sterani.Nelle Figura 7 sono riportati i tracciati GC/MS delle

3 margarine; nella parte bassa delle figure il tracciatoregistrato in full scan, mentre nella parte superiore iltracciato ottenuto selezionando lo ione a 217 m/z.

Come si può vedere, tutte e 3 le margarine con-tengono sterani; difficile dire, data la grande varietàdi contenuti, se questi prodotti provengono da olii d rogenati utilizzati per indurire il grasso o da oli idro-genati utilizzati come iniziatori di cristallizzazione.

Successivamente abbiamo acquistato brioches conriportato in etichetta “senza grassi idrogenati”; le brio-ches sono state estratte con etere etilico, ed il grassoottenuto è stato sottoposto all’analisi degli sterani.

In Figura 8 è riportato il tracciato GC/MS della fra-zione idrocarburi del grasso estratto dalle brioches;nella parte inferiore è riportata la registrazione fullscan mentre nella parte superiore è riportata la regi-strazione con lo ione a 217 m/z.

Come si può vedere dalla figura, nella parte supe-riore sono presenti, anche se in bassa quantità, pic-chi i cui spettri di massa coincidono con quelli deglisterani a 28 e 29 atomi di carbonio.


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CONCLUSIONI

L’ i d rogenazione degli oli vegetali sino a N° di iodio 0comporta la saturazione dei doppi legami degli acidigrassi senza ovviamente formazione di acidi grassit r a n s né di isomeri posizionali.

Per quanto riguarda invece gli steroli e i loro deri-vati deidrossilati che si formano durante la raff i n a z i o-ne, gli stadieni, durante l’idrogenazione degli olivegetali spesso non si ha solamente la formazionedel derivato completamente saturo ma un miscugliodi prodotti (Stanoli, Stereni e Sterani), questi due ulti-mi testimoni dell’avvenuta idro g e n a z i o n e .

Nelle margarine analizzate e nel prodotto acquistatop resso la grande distribuzione sono stati rilevati stera-ni a 28 e 29 atomi di carbonio nelle loro forme α e β.

Gli oli completamente idrogenati comunque nonvengono aggiunti solo per ottenere grassi a mag-gior punto di fusione, ma, in piccole quantità, comeacceleratori di cristallizzazione.

Al di là comunque del motivo per cui vengonoaggiunti è innegabile che il ritrovamento degli stera-ni costituisca un marker dell’avvenuta idrogenazio-

ne, in quanto questi prodotti non sono mai statiriscontrati negli oli vegetali non idrogenati.

Riteniamo pertanto che la metodica sperimentatapossa costituire un valido strumento per valutareeventuali aggiunte di idrogenati e per confermarequanto spesso riportato in etichetta su alcuni pro-dotti alimentari.

BIBLIOGRAFIA

[ 1 ] R. Mensink, M.B. Katan, Effect of dietary t r a n sfatty acids on high density and low density lipo-p rotein cholesterol level in healthy subjects.New Engl. J. Med. 3 2 3 , 439-445 (1990)

[ 2 ] P. Capella, E. Fedeli, G. Bonaga, G. Lerc k e r,Manuale degli oli e dei grassi. Ed. Te c n i c h eNuove, Milano, 1997.

[ 3 ] H. Neiwiadomski, J. Sawincki, Fette SeifenAnstrichm. 6 6, 930 (1964)

[ 4 ] A. Lanzon, A. Cert, T. Albi, Grasas y Aceites4 0, 35 (1989)

[ 5 ] C. Mariani, S. Venturini, E. Fedeli, G. Contarini,Detection of refined animal and vegetable fats

Figura 8 - Tracciato GC/MS della frazione Idrocarburi del grasso estratto dalla brioches. Nella parte superiore registrazione a 217 m/ tipico degliSterani, nella parte inferiore registrazione full scan 1) α-Colestano standard interno


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in adulteration of pure milkfat. JAOCS, 7 1,1381-1384 (1994)

[ 6 ] A. Gasparol i, C. Mariani, M.G. Fedrigucci,Squalano: diff e renziazione tra origine vegetale eanimale. Riv. Ital. Sostanze Grasse 7 3, 293 (1996)

[ 7 ] A. Gasparol i , S. Tagliabue, C. Mar iani ,Fitosqualene: genuinità di una materia primauti l izzata nel settore cosmetico. Riv. I ta l.

Sostanze Grasse 7 5, 241 (1998)[ 8 ] Metodo COI/T.20/Doc N°11 e N°16[ 9 ] Metodo COI/T.20/Doc N°10[10] C. Mariani, G. Bellan, K. Grob, Sulla comples-

sità della frazione sterolica delle sostanzegrasse: separazione del campesterolo in dueepimeri. Riv. Ital. Sostanze Grasse 7 2, 97( 1 9 9 5 )


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Contenuto di idrocarburi policicliciaromatici in oli e grassi vegetali

P. ROVELLINI, P. FUSARI, S. VENTURINI

STA Z I O N E SP E R I M E N TA L E P E R L E IN D U ST R I E

D E G L I OL I E D E I GR A S S I

MILANO

IL P R E S E N T E LAVO RO È STATO FO CA L I Z Z ATO A L L E I N D I CA Z I O N I R I S U LTA N T I DA L L’U LT I M OREPORT EFSA (EUROPEAN FOOD SAFETY AUTHORITY) , CIRCA LA VALUTAZIONE DEI DATIR AC CO LT I S U G L I I D RO CA R B U R I P O L I C I C L I C I A RO M AT I C I ( PA HS) N E G L I A L I M E N T I, E M A NATONEL 2007. I L I V E L L I M A S S I M I D I B E N Z O[A]P I R E N E ( B (A)P), U SATO CO M E M A R K E R P E R LA CO N TA M I NA-Z I O N E DA I D RO CA R B U R I A RO M AT I C I, P E R U N VA STO R A NG E D I A L I M E N T I S O NO CO N T E N U T I N E LRE G O LA M E N TO D E L LA CO M M I S S I O N E EU RO P E A N. 18 81/2006, M A Q U E STA A S S U N Z I O N E,I N BA S E A L D O C U M E N TO E F SA R I S U LTA D U B B I A P E R A L C U N E CAT E G O R I E D I A L I M E N T I.IN QUESTO LAVORO, È STATA STUDIATA UNA CORRELAZIONE TRA IL B(A)P (MARKER ATTUA-LE), IL CRISENE (CHR) E GLI ALTRI PAHS PER DIFFERENTI GRASSI ED OLI VEGETALI, PERU NA A P P RO P R I ATA VA LU TA Z I O N E D E L R I S CH I O E V E R I F I CA N E L L’U T I L I Z Z O D I I N D I CATO R IGENERALI DELLA CONTAMINAZIONE DA PAHS. I RISULTATI SONO STATI FOCALIZZATI SUL CONTENUTO DI PAHS, (B(A)P) E (CHR) IN CAM-PIONI DI OLI E GRASSI VEGETALI, PERVENUTI PRESSO IL NOSTRO LABORATORIO E RAPPRE-SENTATIVI DEL MERCATO ITALIANO NEGLI ANNI 2005-2008.

CONTENT OF POLYCYCLIC AROMATIC HYDROCARBONS IN VEGETABLE OILS AND FATSTHIS PAPER IS FOCALIZED TO THE INDICATION RESULTING FROM EFSA (EUROPEAN FOODSA F E TY AU T H O R I TY) R E P O R T A BO U T T H E DATA CO L L E C T I O N O N P O LYC YC L I C A RO M AT I CHYDROCARBONS (PAHS) IN FOOD, IN JUNE 2007. MAXIMUM LEVELS OF BENZO[A]PYRENE (B(A)P), USED AS MARKER FOR PAHS CONTAMI-NAT I O N, I N A R A NG E O F FO O D ST U F F S A R E NOW S P E C I F I E D I N EU RO P E A N CO M M I S S I O NREGULATION 1881/2006, BUT THIS ASSUMPTION WAS PROVED DUBIOUS FOR SOME FOODCATEGORIES. IN T H I S PA P E R, A CO R R E LAT I O N B E TW E E N B (A) P, (E X I ST I NG M A R K E R), CH RYS E N E ( CH R )AND OTHER PAHS WAS STUDIED FOR DIFFERENT VEGETABLE OILS, TO MAKE AN APPROPRIA-TE RISK ASSESSMENT AND VERIFY THAT IT IS THE APPROPRIATE INDICATOR OF A GENERALCONTAMINATION, AS REQUIRED IN EFSA REPORT.THE RESULTS HAVE BEEN FOCUSED ON THE PAHS CONTENT OF VEGETABLE FATS AND OILS,A NA LY Z E D BY O U R LA BO R ATO RY A N D R E P R E S E N TAT I V E O F T H E ITA L I A N M A R K E T I N T H E2005-2008 YEARS.

CORRISPONDENZA: [email protected]


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INTRODUZIONE

Gli idrocarburi policiclici aromatici (PAHs), sonouna classe di composti organici, formati da due opiù anelli benzenici, generati e rilasciati durante unavarietà di processi di combustione e pirolisi: di con-seguenza la loro origine è molto diversificata e l’e-sposizione dell’uomo a tali composti può avvenire indiversi modi.

Si è dimostrato come alcuni PAHs siano cancero-geni e genotossici; in particolare il più studiato sul-l’uomo è stato il benzo[a]pirene (B(a)P) (IARC) [2].

Il comitato scientifico degli alimenti SCF [1] ha re-centemente rivisto la presenza e la tossicità deiPAHs negli al imenti e per 15 composti (ben-zo[a]antracene, benzo[b]fluorantene, benzo[j]fluo-rantene, benzo[k]fluorantene, benzo[g,h,i]perilene,b e n z o [ a ] p i rene, crisene, ciclopenta[c,d]pire n e ,dibenzo[a,h]antracene, dibenzo[a,e]pirene, diben-z o [ a , h ] p i rene, dibenzo[a,i]pirene, dibenzo[a,l]pire n e ,indeno[1,2,3-cd]pirene e 5-metilcrisene) ha conclu-so che esiste chiara evidenza di mutagenicità/geno-tossicità nei riguardi delle cellule somatiche di ani-mali sperimentali in vivo. Nello stesso anno il comi-tato scientifico ha espresso un opinione sui PAHs incui si concludeva che il B(a)P avrebbe potuto esse-re usato come marker per il contenuto e per i pro-babili effetti cancerogeni dei PAHs, stabilendo i livellimassimi di B(a)P in diversi alimenti (Reg. EC N.1881/2006). Tale regolamento specifica un livellomassimo di 2,0 µg/kg per il B(a)P in oli e in grassivegetali (escluso il burro di cacao) intesi per il con-sumo umano diretto o da utilizzare come ingredientiin altri alimenti.

Diversi paesi hanno sottoposto all’EFSA numerosirisultati riguardanti il contenuto di PAHs in differentialimenti, sia per avere informazioni riguardanti il livel-lo di contaminazione delle individuali categorie ali-mentari, sia per trovare eventuali relazioni tra i diffe-renti PAHs.

Nel presente lavoro abbiamo preso in considera-zione la categoria alimentare relativa ad alcuni gras-si ed oli vegetali, effettuando una analisi statisticadescrittiva per i vari composti, in modo da ottenereuna mappatura della reale contaminazione, visto ildata base ormai abbastanza consistente presentenel nostro laboratorio.

Successivamente abbiamo voluto verificare l’eventuale presenza di una relazione tra contenuto diB(a)P, crisene (CHR) e contenuto di PAHs, per con-

fermare o meno la possibilità di utilizzare un markercome indicatore del livello di contaminazione perquesta categoria di prodotti alimentari.

La nostra sperimentazione presenta i risultatir i g u a rdanti 12 diverse categorie commerciali: olioextra vergine di oliva, olio di oliva, olio di sansa eoliva, olio di arachide, olio di colza, olio di mais, oliodi girasole, olio di soia, olio di vinaccioli, olio dicocco, olio di palma e burro di cacao.

MATERIALI E METODI

Il database utilizzato raccoglie i dati ottenuti dacampioni pervenuti al nostro laboratorio negli anni2005-2008, analizzati applicando la metodicaHPLC-FLUO [1], sottoposta precedentemente aprocedura di validazione mediante analisi interlabo-ratorio effettuata dai membri della CommissioneTecnica Governativa.

I risultati di tale validazione hanno dimostrato chela metodica rientra nei criteri di accettabilità relativialle prestazioni per i metodi di analisi del B(a)Prichieste da l la Dirett iva 2005/10/CE dellaCommissione della Comunità Europea.

In totale si sono analizzati 213 campioni di oliocosì suddivisi: 50 campioni di olio extra vergine dioliva, 43 campioni di olio di girasole, 34 campionidi olio di oliva, 18 campioni di olio di sansa e oliva,11 campioni di olio di arachide, 10 campioni di oliodi soia, 9 campioni di olio di colza, 9 campioni diolio di vinaccioli, 9 campioni di burro di cacao, 9campioni di olio di palma, 8 campioni di olio dimais, 3 campioni di olio di cocco. Tutti i dati analiti-ci ottenuti sono stati sottoposti alle valutazioni sta-tistiche dell’analisi descrittiva, della re g ressione edella correlazione.

Per le indagini di correlazione fra il (B(a)P), il (CHR)e gli (PAHs) indicati nella raccomandazione dellaCommissione della Comunità Europea, e cioèbenzo(a)antracene (BaA), benzo(b)fluorantene( B b FA), benzo(c)fluorene (BcF), benzo(k)fluorantene( B k FA), benzo(g,h,i)perilene (Bg,h,i,P), crisene(CHR), dibenzo(a,h)antracene (Db,a,h,A), inde-n o ( 1 , 2 , 3 - c , d ) p i rene (IP), benzo(j)fluorantene (BjFA ) ,c i c l o p e n t a ( c , d ) p i rene (CPP), dibenzo(a,e)pire n e(DBbaeP), dibenzo(a,h)pirene (DBahP), diben-z o ( a , i ) p i rene (DBaiP), dibenzo(a,l)pirene (DBalP), 5-metilcrisene (MCH), sono stati presi in considerazio-ni solo oli con contenuto in benzo(a)pirene e crisene> al valore di LOQ (per la metodica utilizzata corri-


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spondente a 0,5 ng/g).Dobbiamo considerare che con l’utilizzo della

metodica proposta non è stato possibile separarecromatograficamente il B(c)F dal pirene (PYR) e cheper il calcolo dei PAHs totali è stato preso in consi-derazione anche il benzo(e)pirene, B(e)P.

RISULTATI E DISCUSSIONE

Dall’analisi dei dati riportati nelle Tabelle I-XII vienevisualizzato lo stato della contaminazione da PAHsper la maggior parte di oli e grassi vegetali, presentisul mercato italiano negli anni 2005-2008.

Tabella I - Ri s u l t ati analitici dei PAHs pre s e nti negli oli ext ra ve rgini dio l i va e perce ntuale dei prodotti superiori al va l o re di LOQ o di 2 ng/g

n=50 >=LOQ > 2ng/g Mediana Media P95 Max% % ng/g ng/g ng/g ng/g

BaA 60,00 3,33 0,60 0,78 0,24 4,00CHR 82,00 0,00 0,90 0,92 0,09 1,90BeP 20,00 0,00 0,55 0,84 0,55 3,00BbFA 0,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.BkFA 0,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.BaP 0,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.DBahA 0,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.BghiP 0,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.IP 0,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.BcF+Pyr 100,00 86,00 4,20 4,47 0,63 9,70CPP 0,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.MCH 2,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.BjFA 0,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.DBalP 0,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.DBaeP 0,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.DBaiP 0,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.DBahP 0,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.PAHs - -. 4,20 4,50 0,63 9,70

Tabella II - Risultati analitici dei PAHs presenti negli oli di girasole epercentuale dei prodotti superiori al valore di LOQ o di 2 ng/g


BaA 30,20 2,32 0,80 1,38 1,20 7,90CHR 30,20 0,00 0,80 1,48 1,26 8,30BeP 34,90 2,32 0,70 0,91 0,41 3,30BbFA 23,30 2,32 0,60 1,03 0,77 4,00BkFA 13,90 2,32 0,60 1,11 1,14 3,30BaP 20,90 2,32 0,90 1,48 1,57 6,90DBahA n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.BghiP 23,30 2,32 0,80 1,16 0,79 4,20IP n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.BcF+Pyr 69,77 13,95 1,00 2,23 1,83 27,60CPP n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.MCH 2,32 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.BjFA n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.DBalP n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.DBaeP 2,30 2,32 n.d. n.d. n.d. n.d.DBaiP n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.DBahP n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.PAHs - - 0,70 1,58 1,32 28,30

Tabella III - Ri s u l t ati analitici dei PAHs pre s e nti negli oli di oliva epercentuale dei prodotti superiori al valore di LOQ o di 2 ng/g


BaA 72,72 6,06 0,80 0,92 0,21 2,40CHR 72,72 9,09 1,15 1,25 0,25 2,40BeP 39,39 0,00 0,60 0,65 0,10 1,00BbFA 6,06 0,00 0,80 0,80 2,54 1,00BkFA 0,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.BaP 6,06 0,00 0,50 0,50 0,00 0,50DBahA 0,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.BghiP 6,06 0,00 0,50 0,50 0,00 0,50IP 0,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.BcF+Pyr 100,00 54,54 2,50 3,39 1,18 16,20CPP 0,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.MCH 0,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.BjFA 0,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.DBalP 0,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.DBaeP 0,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.DBaiP 0,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.DBahP 3,03 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.PAHs - - 2,35 3,30 1,16 16,20

Tabella IV - Ri s u l t ati analitici dei PAHs pre s e nti negli oli sansa e dioliva e percentuale dei prodotti superiori al valore di LOQ o di 2 ng/g


BaA 100,00 55,56 3,80 11,39 14,36 125,40CHR 100,00 55,55 2,85 15,57 21,39 185,50BeP 88,89 16,67 1,15 9,35 16,30 123,90BbFA 72,22 16,67 0,70 5,12 8,59 52,30BkFA 50,00 16,67 0,90 4,50 7,12 29,00BaP 50,00 16,67 1,20 9,24 18,50 73,40DBahA 5,56 5,56 n.d. n.d. n.d. n.d.BghiP 61,11 16,67 0,90 11,54 22,49 112,40IP 16,67 0,00 0,70 0,80 0,66 1,10BcF+Pyr 94,44 83,33 6,40 64,95 73,60 532,70CPP 0,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.MCH 77,78 22,22 1,30 1,62 0,60 4,30BjFA 0,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.DBalP 5,56 5,56 n.d. n.d. n.d. n.d.DBaeP 11,11 5,56 2,15 2,15 3,17 2,40DBaiP 5,56 5,56 n.d. n.d. n.d. n.d.DBahP 5,56 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.PAHs - - 7,10 63,47 71,25 550,70


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Tabella V - Risultati analitici dei PAHs presenti negli oli di arachide epercentuale dei prodotti superiori al valore di LOQ o di 2 ng/g


BaA 27,27 0,00 0,70 0,70 0,24 0,80CHR 27,27 0,00 0,70 0,67 0,38 0,80BeP 27,27 0,00 0,70 0,63 0,29 0,70BbFA 9,09 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.BkFA 0,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.BaP 0,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.DBahA 0,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.BghiP 0,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.IP 0,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.BcF+Pyr 63,63 0,00 0,80 1,07 0,92 3,30CPP 0,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.MCH 0,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.BjFA 0,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.DBalP 0,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.DBaeP 0,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.DBaiP 0,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.DBahP 0,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.PAHs - - 0,50 0,68 0,63 3,30

Tabella VI - Risultati analitici dei PAHs presenti negli oli di soia e per-centuale dei prodotti superiori al valore di LOQ o di 2 ng/g


BaA 90,00 30,00 1,90 1,95 0,46 2,80CHR 90,00 40,00 1,95 2,04 0,45 2,90BeP 50,00 0,00 0,80 0,94 0,35 1,40BbFA 30,00 0,00 0,80 0,70 0,43 0,80BkFA 0,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.BaP 10,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.DBahA 20,00 0,00 0,60 0,60 1,27 0,70BghiP 0,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.IP 0,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.BcF+Pyr 100,00 80,00 6,25 6,25 1,52 9,70CPP 0,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.MCH 10,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.BjFA 0,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.DBalP 0,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.DBaeP 0,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.DBaiP 0,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.DBahP 0,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.PAHs - - 6,35 6,32 1,52 9,70

Tabella VII - Ri s u l t ati analitici dei PAHs pre s e nti negli oli di colza epercentuale dei prodotti superiori al valore di LOQ o di 2 ng/g


BaA n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.CHR n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.BeP n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.BbFA n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.BkFA n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.BaP n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.DBahA n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.BghiP n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.IP n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.BcF+Pyr 77,77 0,00 0,80 0,76 0,09 0,90CPP n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.MCH n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.BjFA n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.DBalP n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.DBaeP n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.DBaiP n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.DBahP n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.PAHs - - 0,70 0,59 0,26 0,90

Tabella VIII - Risultati analitici dei PAHs presenti negli oli di vinacciolie percentuale dei prodotti superiori al valore di LOQ o di 2 ng/g


BaA 44,44 22,22 1,50 1,73 1,97 3,20CHR 44,44 22,22 2,15 2,38 2,70 4,30BeP 44,44 0,00 1,10 1,08 0,20 1,20BbFA 44,44 22,22 3,20 3,28 4,74 6,10BkFA 11,11 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.BaP 44,44 0,00 0,95 1,03 0,86 1,70DBahA 22,22 0,00 0,55 0,55 0,64 0,60BghiP 66,67 0,00 1,10 1,03 0,36 1,40IP 0,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.BcF+Pyr 66,67 33,33 2,20 2,90 3,23 8,90CPP 0,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.MCH 0,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.BjFA 0,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.DBalP 0,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.DBaeP 33,33 0,00 1,00 0,93 0,76 1,20DBaiP 0,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.DBahP 0,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.PAHs - - 1,30 2,24 2,15 8,90

In base all’attuale limite di legge relativo a questamatrice ( B ( a ) P ≤ 2 n g / g ), i campioni che hannomostrato un valore B(a)P superiore ad esso sonocostituiti da burro di cacao (escluso comunquedalla legislazione) con un contenuto massimo diB(a)P pari a 2,30 ng/g, 11,11% dei campioni con

valori superiori al valore limite, olio di girasole (B(a)Pvalore massimo 6,90 ng/g, 2,32% dei campioni convalori superiori al limite), olio di cocco (B(a)P valoremassimo 8,70 ng/g, 66,67% dei campioni con valo-ri superiori al valore limite) e per ultimo la matriceapparsa più contaminata da questo composto,


89

Tabella IX - Ri s u l t ati analitici dei PAHs pre s e nti nei burri di cacao epercentuale dei prodotti superiori al valore di LOQ o di 2 ng/g


BaA 77,77 33,33 2,00 2,76 1,91 6,10CHR 100,00 22,22 1,50 1,84 1,33 5,90BeP 33,33 0,00 1,20 1,03 1,17 1,40BbFA 11,11 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.BkFA 11,11 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.BaP 33,33 11,11 0,60 1,13 2,51 2,30DBahA 0,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.BghiP 33,33 0,00 0,70 1,00 1,29 1,60IP 0,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.BcF+Pyr 88,89 66,67 2,60 8,96 11,25 39,80CPP 0,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.MCH 22,22 0,00 0,90 0,90 3,81 1,20BjFA 0,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.DBalP 0,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.DBaeP 0,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.DBaiP 0,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.DBahP 0,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.PAHs - - 4,10 13,51 11,60 46,00

Tabella X - Ri s u l t ati analitici dei PAHs pre s e nti negli oli di palma epercentuale dei prodotti superiori al valore di LOQ o di 2 ng/g


BaA 66,67 22,22 1,45 4,17 5,87 15,20CHR 66,67 22,22 0,90 3,42 5,18 13,00BeP 55,56 0,00 0,70 1,06 0,67 1,70BbFA 11,11 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.BkFA 11,11 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.BaP 22,22 0,00 1,15 1,15 5,72 1,60DBahA 0,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.BghiP 77,78 0,00 0,70 0,79 0,33 1,50IP 0,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.BcF+Pyr 22,22 22,22 11,20 11,20 114,36 20,20CPP 0,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.MCH 22,22 11,11 1,50 1,50 10,17 2,30BjFA 0,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.DBalP 0,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.DBaeP 0,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.DBaiP 0,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.DBahP 0,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.PAHs - - 3,40 9,48 12,54 50,70

Tabella XI - Risultati analitici dei PAHs presenti negli oli di mais e per-centuale dei prodotti superiori al valore di LOQ o di 2 ng/g


BaA 12,50 0,00 0,60 0,60 n.d. 0,60CHR 25,00 0,00 0,75 0,75 0,63 0,80BeP 25,00 0,00 0,85 0,85 4,45 1,20BbFA 12,50 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.BkFA 12,50 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.BaP 12,50 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.DBahA n.d. 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.BghiP 12,50 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.IP n.d. 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.BcF+Pyr 75,00 0,00 0,90 0,92 0,36 1,30CPP n.d. 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.MCH n.d. 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.BjFA n.d. 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.DBalP n.d. 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.DBaeP n.d. 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.DBaiP n.d. 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.DBahP n.d. 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.PAHs - - 0,70 0,69 0,43 1,30

Tabella XII - Ri s u l t ati analitici dei PAHs pre s e nti negli oli di co cco epercentuale dei prodotti superiori al valore di LOQ o di 2 ng/g


BaA 100,00 100,00 15,50 23,57 49,12 46,10CHR 100,00 100,00 12,60 33,57 100,00 80,00BeP 100,00 66,67 2,50 4,50 12,67 10,30BbFA 66,67 33,33 4,00 4,00 36,85 6,90BkFA 100,00 33,33 1,30 2,60 7,38 6,00BaP 66,67 66,67 6,10 6,10 33,03 8,70DBahA 0,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.BghiP 66,67 66,67 3,05 3,05 9,53 3,80IP 0,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.BcF+Pyr 100,00 100,00 13,20 23,37 64,56 52,90CPP 0,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.MCH 100,00 66,67 2,90 4,03 7,37 7,40BjFA 0,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.DBalP 33,33 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.DBaeP 66,67 0,00 1,40 1,40 5,08 1,80DBaiP 0,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.DBahP 0,00 0,00 n.d. n.d. n.d. n.d.PAHs - - 45,10 101,53 244,54 215,20

l’olio di sansa e oliva (B(a)P valore massimo 73,40ng/g, con ben il 16,67% dei campioni con valores u p e r i o re al valore limite). È noto che nell’olio disansa di oliva sono presenti alcuni derivati di tra-sformazione ossidativa dei PAHs spesso non com-pletamente risolti dai PAHs contemplati e presenta-no un profilo disomogeneo: in ogni caso, di questicomposti non si conosce il significato tossicologico.

Tutte le altre categorie analizzate rientrano nellimite di legge fissato, e di questi una rilevante per-centuale è addirittura inferiore al limite di quantifica-zione del metodo (LOQ = 0,5 ng/g).

Per quanto riguarda il CHR, per la categoria deglioli extra vergini di oliva, olio di girasole, olio di ara-chide, olio di colza e olio di mais, tale composto intutti i prodotti analizzati non supera mai il valore di 2


90

ng/g. Nell’olio di oliva solo il 9,09 % supera il valoredi 2 ng/g, per l’olio di vinaccioli, olio di palma eburro di cacao il 22,22 % dei campioni supera talelimite, raggiungendo il valore massimo rispettiva-mente di 4,30 ng/g, 13,00 ng/g e 5,90 ng/g.

Nel caso dei campioni di olio di soia, il 40 %supera il valore limite di 2 ng/g, per l’olio di sansa eoliva il 55,55% supera il valore di 2 ng/g, mentre perl’olio di cocco tutti i campioni analizzati hannomostrato un valore superiore al limite di legge convalore massimo di 80 ng/g.

Per quanto riguarda il contenuto totale di PAHs, laseparazione cromatografica messa a punto nonconsente di separare il PYR dal B(c)F, ed è noto cheil primo composto è prevalente rispetto al secondo,ma nonostante sia un PAH leggero è stato conside-rato nella somma totale dei PAHs.- Per la categoria degli oli di sansa e oliva, matrice

apparsa essere la più contaminata, sono statiriscontrati due valori molto diversi di mediana e dimedia, e un valore massimo del totale di 550 ng/g;

- i campioni di olio di palma hanno mostrato uncontenuto totale di PAHs massimo di 50,70ng/g, un valore medio di 9,48 ng/g e una media-na 3,40 ng/g;

- i campioni di burro di cacao hanno mostrato unv a l o re massimo di 46,00 ng/g, una mediana4,10 ng/g e una media di 13,51 ng/g;

- i campioni di olio di cocco hanno mostrato unvalore mediano di 45,10 ng/g, un valore medio di101,53, e un valore massimo di 215,20 ng/g;

- gli oli di semi di girasole, hanno mostrato un valo-re massimo di 28,30 ng/g, ma con una mediache si aggira intorno al valore di 1,58 ng/g e unvalore mediano di 0,70 ng/g;

- i campioni di olio di oliva hanno mostrato unv a l o re massimo di 16,20 ng/g, un valore mediodi 3,30 ng/g e un valore mediano di 2,35 ng/g.

- Per quanto riguarda la categoria degli oli extravergini la somma dei PAHs totale non ha maisuperato il valore di 10,00 ng/g.

- Tutte le altre matrici hanno mostrato un valoreinferiore a 10 ng/g.

Nello studio delle correlazioni, abbiamo preso inconsiderazione le tre variabili su cui ci siamo focaliz-zati, quali il contenuto di B(a)P, CHR e PAHs totali edabbiamo considerato lo studio delle correlazioni traB(a)P e PAHs, tra CHR e PAHs e tra CHR e B(a)P.

Per quanto riguarda la correlazione tra B(a)P ePAHs solo tre matrici hanno mostrato una correla-

Tabella XIII - Relazioni tra le concentrazioni ng/g of BaP, CHR e PAHsquantificate nelle differenti matrici vegetali. Equazione di tipo lineareY=A+B(x) r2= coefficiente di correlazione, n=numero di campioni

Parametri A B r2 n

BaP/PAHs

Olio extra

vergine di oliva - - - 50

Olio di girasole -1,8637 4,3438 0,9721 43

Olio di oliva - - - 34

Olio di sansa e oliva - - - 18

Olio di arachide - - - 11

Olio di soia - - - 10

Olio di colza - - - 9

Olio di vinaccioli -1,3588 5,326 0,6986 9

Olio di palma -8,8111 16,444 1,000 9

Olio di mais - - - 8

Burro di cacao - - - 9

Olio di cocco - - - 3

Parametri A B r2 n

CHR/PAHs

Olio extra


Olio di girasole -1,5602 3,5431 0,971 43


Olio di sansa e oliva - - - 18

Olio di arachide -1,4634 4,1308 0,9107 11



Olio di vinaccioli 1,2577 1,2915 0,4758 9

Olio di palma 0,8449 3,821 0,9989 9


Burro di cacao - - - 9

Olio di cocco 19,639 2,4398 0,9964 3

Parametri A B r2 n

CHR/BaP

Olio extra


Olio di girasole -0,0642 0,8261 0,9746 43


Olio di sansa e oliva -1,3744 1,4875 0,9971 18

Olio di arachide - - - 11



Olio di vinaccioli 0,374 0,2881 0,9508 9

Olio di palma 0,5342 0,2368 1,000 9


Burro di cacao 0,1879 0,3545 0,988 9

Olio di cocco 2,9142 0,0723 1,000 3


91

zione significativa; l’olio di palma (r2 1,000), l’olio digirasole (r2 0,9721) e l’olio di vinaccioli (r2 0,699).

Per quanto riguarda la correlazione tra CHR/PAHsquattro matrici hanno mostrato una buona correla-zione, tra cui l’olio di palma (r2 0,9989), l’olio dicocco (r2 0,9964), l’olio di girasole (r2 0,971), l’oliodi arachide (r2 0,9107), mentre per l’olio di vinaccioliil coefficiente di correlazione è risultato inferiore enon significativo (r2 0,4758). Sulle altre matrici non èrisultata una correlazione di questo tipo.

Per quanto riguarda la correlazione tra CHR/BaP,sei matrici hanno mostrato un coefficiente significa-tivo; in particolare l’olio di palma (r2 1,000), l’ olio dicocco (r2 1,000), l’olio di sansa e oliva (r2 0,9971), ilb u r ro di cacao (r2 0,988), l’olio di girasole (r2

0,9746) e l’olio di vinaccioli (r2 0,9508).La conclusione su tale indagine, è re l a t i v a m e n t e

rassicurante dal punto di vista della sicurezza ali-mentare, solo per alcune categorie, mentre per altretipologie sarebbe opportuno migliorare la tecnologiadi raffinazione per un maggior abbattimento di talicontaminanti.

La sperimentazione effettuata è avvalorata dallametodologia analitica utilizzata, caratterizzata dauna notevole semplificazione della preparazione delcampione, validata per accuratezza, precisione ere c u p e ro, risultato maggiore del 90% per tutti iPAHs considerati [3, 4, 5].

Più in dettaglio rispetto a quanto già detto, perpoter rispondere in maniera adeguata alla racco-mandazione della Commissione sulla rappresentati-vità del benzo(a)pirene come marcatore della conta-minazione da IPA, è possibile affermare che la spe-rimentazione non ha confermato l’ipotesi della rela-zione tra il contenuto in benzo(a)pirene e la sommadel contenuto degli IPA riportati nella Gazzetta uffi-

ciale n. L034 del 08/02/2005 e quindi la validità del-l’uso del benzo(a)pirene come indicatore della con-taminazione generale da IPA per tutte le matrici di

oli e grassi vegetali. Lo stesso dicasi dell’ eventualeipotesi di considerare il CHR come indicatore gene-rale, in quanto la correlazione si è dimostrata positi-va solo per 4 matrici sulle 12 analizzate.

La correlazione tra CHR e BaP, individuata in bensei matrici non ha utilizzo nella definizione globaledella contaminazione.

BIBLIOGRAFIA

[1] S C F, Opinion of the Scientific Committee onFood on the risks to human health ofPolycyclic Aromatic Hydrocarbons in food. 19June 2005 http://ec.euro p a . e u . f o o d / f s / s c / s c f-/out153_en.pdf (2002)

[2] IARC, Overall evaluation of carcinogenicity: Anupdating of IARC monographs Volume I to 42.IARC Monographs on the evaluation of carci-nogenic risks to humans. Supplement 7,International Agency for Research on Cancer,Lyon, 1987.

[3] N. Cortesi, P. Fusari, Progressi nella determi-nazione degli idrocarburi policiclici aromatici inmatrici lipidiche. Riv. Ital. Sostanze Grasse, 82

(Luglio-Agosto) 167-172 (2005).[4] N. Cortesi, P. Fusari, C. Gigliotti, Indagine qua-

driennale sulla contaminazione da idro c a r b u r ipoliciclici aromatici in oli di oliva e valutazionedel contenuto del benzo(a)pirene come indica-t o re della loro presenza. Riv. Ital. SostanzeGrasse 83 ( Luglio-Agosto) 151-156 (2006)

[5] N. Cortesi, P. Fusari, C. Gigliotti, Contenuto dii d rocarburi policiclici aromatici in oli di semi:pr imi r isultati . Poster presentato a l VI IC o n g resso Nazionale di Chimica degliAlimenti, 23-26 giugno 2008, Università degliStudi di Perugia.

Ricevuto 19 marzo 2009, acettato 26 marzo 2009


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Influenza delle condizioni operativedi gramolatura sulla qualità

dell’olio extra vergine di oliva

M. MIGLIORINI1, C. CHERUBINI1,B. ZANONI2, M. MUGELLI1,E. CINI3, A. BERTI4

1) LA BO R ATO R I O CH I M I CO ME RC E O LO G I CO

AZ I E N DA SP E C I A L E D E L LA CA M E R A D I

COMMERCIO DI FIRENZE, ITALIA2) DI PA R T I M E N TO D I BI OT E C NO L O G I E

AG R A R I E - SE Z I O N E D I TE C NO LO G I E

AL I M E N TA R I, UN I V E R S I TÀ D E G L I ST U D I

DI FIRENZE3) DI PA R T I M E N TO D I ING E G N E R I A

AG R A R I A E FO R E S TA L E – SE Z I O N E

MAC CH I N E E IM P I A N T I, UN I V E R S I TÀ

DEGLI STUDI DI FIRENZE4) DI PA R T I M E N TO D I SC I E N Z E BI O CH I M I CH E,

UN I V E R S I TÀ D E G L I ST U D I D I FI R E N Z E

LA Q UA L I TÀ D I U N O L I O E X T R A V E RG I N E D I O L I VA V I E N E VA LU TATA NO N S O LO AT T R AV E R S O LA ST I M A D E I PA R A-M E T R I M E RC E O LO G I C I STA B I L I T I DA L LA NO R M AT I VA V I G E N T E M A A NCH E AT T R AV E R S O LA VA LU TA Z I O N E D E L CO N-T E N U TO I N CO M P O ST I F E NO L I C I E VO LAT I L I. LA Q UA N T I TÀ E LA T I P O LO G I A D E I CO M P O ST I F E NO L I C I E VO LAT I L I

CO N T E N U T I N E L L’O L I O D I P E N D E S I A DA L LA CO M P O S I Z I O N E CH I M I CA D E L L E O L I V E LAVO R AT E CH E DA L L E CO N D I-Z I O N I O P E R AT I V E D I LAVO R A Z I O N E I N F R A N TO I O. OB I E T T I VO D E L LAVO RO È STATO Q U E L LO D I CO M P R E N D E R E CO M E L E CO N D I Z I O N I O P E R AT I V E D I G R A M O LAT U R A

FO S S E RO I N G R A D O D I I N F LU E N Z A R E L E CA R AT T E R I ST I CH E D E L L’O L I O E X T R A V E RG I N E D I O L I VA. DU R A N T E LA

CA M PAG NA O L E A R I A 2 0 07 S O NO STAT E E S E G U I T E A L C U N E P ROV E S OT TO P O N E N D O L E O L I V E F R A N T E A D U E

M O DA L I TÀ A LT E R NAT I V E D I G R A M O LAT U R A: U NA G R A M O LAT U R A I N C U I L E PA ST E S O NO A CO N TAT TO CO N A R I A E

Q U I N D I CO N O S S I G E NO AT M O S F E R I CO (I.E. U SA N D O U NA G R A M O LAT R I C E A P E R TA A D A S S E O R I Z Z O N TA L E), U NA

G R A M O LAT U R A I N C U I L E PA ST E S O NO E S P O ST E A D U N R I D OT TO CO N T E N U TO D’A R I A E Q U I N D I A D U N R I D OT TO

CO N T E N U TOD I O S S I G E NO (I.E. U SA N D O U NA G R A M O LAT R I C E A D A S S E V E R T I CA L E S OT TOV U OTO). I R I S U LTAT I OT T E N U T I H A N NO E V I D E N Z I ATO U N D I F F E R E N T E E F F E T TO D E L L E CO N D I Z I O N I D I R I D OT TO I M PAT TO

O S S I DAT I VO S U L CO N T E N U TO I N S E CO I R I D O I D I TOTA L I E I N CO M P O ST I VO LAT I L I. ES S O P E R M E T T E D I OT T E N E R E

O L I P I Ù R I C CH I I N S E CO I R I D O I D I TOTA L I M A CO N U N M I NO R E CO N T E N U TOI N CO M P O ST I VO LAT I L I. LE P ROV E R E A-L I Z Z AT E H A N NO E V I D E N Z I ATO I NO LT R E CO M E U N M AG G I O R E T E M P O D I G R A M O LAT U R A I N F LU I S CA P O S I T I VA M E N-T E S U L CO N T E N U TO I N S E CO I R I D O I D I TOTA L I, Q UA LO R A V E NGA R I D OT TO L’I M PAT TO O S S I DAT I VO, E CO M E I L T E M P O

D I G R A M O LAT U R A A B B I A U N’I N F LU E N Z A P O S I T I VA S U L CO N T E N U TO I N CO M P O ST I VO LAT I L I S O LTA N TO Q UA N D O

LA G R A M O LAT U R A È E F F E T T UATA I N P R E S E N Z A D I O S S I G E NO.LA R I C E RCA CO N D OT TA H A P E R M E S S O D I E V I D E N Z I A R E CO M E L’O P E R A Z I O N E D I G R A M O LAT U R A A B B I A U N S I G N I-F I CAT I VO I M PAT TO S U L L E CA R AT T E R I ST I CH E Q UA L I TAT I V E D E L L’O L I O E X T R A V E RG I N E D’O L I VA, P U RCH É S I S I A I N

G R A D O D I T E N E R E S OT TO CO N T RO L LO L E N U M E RO S E AT T I V I TÀ E N Z I M AT I CH E D I T R A S FO R M A Z I O N E D E L LA CO M P O-N E N T E L I P I D I CA D E L L E PA ST E AT T R AV E R S O U NA CO N SA P E VO L E E AT T E N TA S C E LTA D E L L E CO N D I Z I O N I O P E R AT I V E.

IN F L U E N C E O F O P E R A T I N G C O N D I T I O N S O F M A L A X A T I O N O N T H E Q U A L I T Y O F E X T R A V I R G I N O L I V E O I LTH E Q UA L I TY O F E X T R A V I RG I N O L I V E O I L CA N B E E VA LUAT E D NOT O N LY BY E ST I M AT I NG I TS P RO D U C T PA R A M E-T E R S, D E T E R M I N E D BY C U R R E N T R E G U LAT I O N S I N FO RC E, B U T A LS O BY A S S E S S I NG I TS VO LAT I L E A N D P H E NO-L I C CO M P O U N D CO N T E N T. TH E Q UA N T I TY A N D TY P E S O F VO LAT I L E A N D P H E NO L I C CO M P O U N D S CO N TA I N E D I N

E X T R A V I RG I N O L I V E O I L I S D E P E N D E N T U P O N BOT H CH E M I CA L CO M P O S I T I O N O F P RO C E S S E D O L I V E S A N D O P E-R AT I NG CO N D I T I O N FO R P RO C E S S I NG I N O L I V E O I L M I L L. TH E A I M O F T H I S WO R K WA S TO I N V E ST I GAT E H OW

M A LA X I NG O P E R AT I NG CO N D I T I O N S CO U L D B E A B L E TO I N F LU E NC E CH A R AC T E R I ST I C S O F E X T R A V I RG I N O L I V E

O I L. DU R I NG 2 0 07 C RO P S E A S O N, S O M E T R I A LS W E R E CA R R I E D O U T A P P LY I NG TWO A LT E R NAT I V E M A LA X A-T I O N S: O N E U N D E R OX I DAT I V E CO N D I T I O N S (I.E. U S I NG A H O R I Z O N TA L-A X I S, O P E N M A LA X ATO R), T H E OT H E R

U N D E R LOW OX I DAT I V E CO N D I T I O N S (I.E. U S I NG A VAC U U M V E R T I CA L-A X I S M A LA X ATO R) .RE S U LTS S H OW E D D I F F E R E N T E F F E C TS O F OX I DAT I V E ST R E S S I M PAC T CO N D I T I O N S O N TOTA L S E CO I R I D O I D A N D

VO LAT I L E CO M P O U N D S CO N T E N TS. A LOW E R OX I DAT I V E ST R E S S I M PAC T A L LOWS O I L TO B E O B TA I N E D, W H I CH I S

R I CH E R I N TOTA L S E CO I R I D O I D CO N T E N T, B U T H A S A LOW E R VO LAT I L E CO M P O U N D S CO N T E N T. TR I A LS A LS O

S H OW E D T H AT A H I G H M A LA X I NG T I M E H A S A P O S I T I V E E F F E C T O N T H E TOTA L S E CO I R I D O I D CO N T E N T, W H E N OX I-DAT I V E ST R E S S I M PAC T I S R E D U C E D, A N D T H AT M A LA X I NG T I M E O N LY H A S A P O S I T I V E E F F E C T O N T H E VO LAT I L E

CO M P O U N D S CO N T E N T W H E N M A LA X I NG I S P E R FO R M E D I N T H E P R E S E NC E O F OX YG E N.RE S E A RCH S H OW E D T H AT M A LA X I NG O P E R AT I O N D O E S H AV E A S I G N I F I CA N T I M PAC T O N Q UA L I TY CH A R AC T E R I-ST I C S O F E X T R A V I RG I N O L I V E O I L, P ROV I D E D T H E LA RG E N U M B E R O F E N Z Y M E AC T I V I T I E S FO R T R A N S FO R M A-T I O N O F T H E L I P I D CO M P O N E N T O F O L I V E PA ST E CA N B E K E P T U N D E R CO N T RO L BY A CO N S C I O U S, CA R E F U L

S E L E C T I O N O F O P E R AT I NG CO N D I T I O N S.

PROF. BRUNO ZANONI

E-MAIL: [email protected]

TEL. +39 055 3220336, FAX +39 055 355995


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INTRODUZIONE

Il peculiare “flavor” dell’olio extra vergine di olivaderiva dalla combinazione del suo contenuto incomposti volatili e fenolici. I primi derivano principal-mente dalla via della lipossigenasi (“LOX Pathway”)e sono responsabili delle note di “fruttato” e di“erba” degli oli [1-3], i secondi derivano dalla degra-dazione dell’oleuropeina e del ligstroside e sonoresponsabili degli attributi “amaro” e “piccante”,nonché delle proprietà salutistiche dell’olio [2-4].

I fenomeni chimici ed enzimatici responsabili dellaformazione dei composti volatili e fenolici nell’olioextra vergine di oliva sono influenzati principalmenteda due fattori:• dalla tipologia di olive: cultivar, stato sanitario,

grado di maturazione tecnologica [2, 3]; • dalle condizioni operative del processo di estra-

zione: tempo, temperatura ed esposizione all’os-sigeno [2, 3, 5, 6].

Gli enzimi polifenolossidasi (PPO) e pero s s i d a s i(POD) catalizzano l’ossidazione dei fenoli riducendoil loro contenuto nelle paste di oliva e quindi nell’olio[2, 3] mentre l’enzima lipossigenasi (LOX) è il primodi una cascata di enzimi che portano alla formazio-ne di aldeidi, alcoli ed esteri, correlati ai descrittori“fruttato” ed “erba” degli oli [2, 3].

I dati presenti in letteratura e l’esperienza dire t t aacquisita nel campo dell’elaiotecnica portano as o s t e n e re che la qualità di un olio extra vergine dioliva si possa migliorare tenendo sotto controllo eindirizzando i fenomeni di sintesi e trasformazione(PPO, POD e LOX pathway) dell’olio nelle olive lungo

l’intera filiera produttiva [3, 5, 6]. In particolare, si ipo-tizza un ruolo significativo dell’esposizione all’ossige-no sulle paste di oliva durante la gramolatura; il con-dizionale è d’obbligo poiché limitate sono ancora leconoscenze sul ruolo dell’ossigeno in gramolaturasulla qualità degli oli extra vergini di oliva [6].

Operando in differenti condizioni operative di gra-molatura delle paste di oliva, si è voluto in questar i c e rca evidenziare e compre n d e re il ruolo dell’e-sposizione all’ossigeno e del tempo di gramolaturasul contenuto fenolico e aromatico dell’olio nellepaste e, quindi, indirettamente sulla qualità dell’olioextra vergine di oliva estraibile.

MATERIALI E METODI

Descrizione del frantoioIl frantoio sperimentale (Toscana Enologica Mori,

F i renze) è stato messo in opera presso l’AziendaAgricola di Torre Bianca a San Casciano Val di Pesa(Firenze). Le olive, tramite cassone ribaltabile, sonostate poste in una vasca e avviate tramite coclea alsistema di lavaggio; sono state poi sottoposte adun forte getto d’acqua che ha provveduto al lavag-gio, seguito da un risciacquo finale. La stessacoclea di lavaggio ha convogliato le olive alla tra-moggia del frangitore (mod. FR250P). La pasta diolive ottenuta è stata sottoposta a due modalitàalternative di gramolatura: una gramolatura in cui lepaste sono a contatto con aria e quindi con ossige-no atmosferico (GrO), una gramolatura in cui lepaste sono esposte ad un ridotto contenuto d’ariae quindi ad un ridotto contenuto di ossigeno (GrV).

Figura 1 - A: gramolatrici verticali; B: particolare del sistema di gramolatura.


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GrO è stata condotta con gramolatrice aperta adasse orizzontale con controllo della temperatura(mod.F2GL200). GrV è stata condotta con gramola-trice ad asse verticale con controllo della tempera-tura (mod. Cultivar V.300), evoluzione del brevetto diinvenzione n. 01307931 (“Macchina gramolatrice asviluppo verticale per la lavorazione della pasta dioleaginose ed in specie di olive”, di proprietà delLaboratorio Chimico Merceologico AziendaSpeciale della CCIAA di Firenze e rilasciato dallaCCIAA di Firenze).

La gramolatrice è costituita da un cilindro chiuso diacciaio inox di volume pari a 0,288 m3, al cui intern oè presente un ro t o re che supporta su più livelli paledi forma elicoidale per l’agitazione della pasta (Fig.1). Lo scarico delle paste avviene dal fondo. Le palesono disegnate in modo da permettere una miscela-zione senza un apprezzabile spostamento di pastatra livelli di pale adiacenti; in tal modo solo lo stratosuperficiale di pasta può venire in contatto con l’e-ventuale ossigeno presente nello spazio di testa. Lagramolatrice è stata riempita completamente

lasciando un limitato spazio di testa di 0,04 m3; nellospazio di testa si è anche ridotta la pre s s i o n emediante estrazione dell’aria con pompa da vuoto.

Le paste sono state inviate mediante pompa alobi ad un “decanter a due fasi” (mod. D.700). L’olioestratto è stato filtrato mediante un filtro pressa acartoni 40 x 40 cm (mod. EUR 20).

Disegno sperimentaleDurante la campagna olearia 2007, olive della cul-

tivar F r a n t o i o sono state raccolte a mano nelle primeo re del mattino, sono state poi trasportate in un cas-sone ribaltabile al frantoio sperimentale e sottopostealla trasformazione entro due ore dalla consegna.

Dopo alcune prove di messa a punto, sono staterealizzate 2 prove sperimentali complete (Fig. 2).Per ciascuna prova sono stati confrontati il proces-so con GrO con quello con GrV; nello spazio ditesta della gramolatrice ad asse verticale è statofatto il vuoto, portando la pressione totale re s i d u aad un valore di 0,18 bar (18 kPa). Se ne può dedur-re che in GrO la pressione parziale di ossigenofosse approssimativamente di 0,21 bar (21 kPa),m e n t re in GrV fosse approssimativamente di 0,04bar (4 kPa). In entrambi i casi la pasta è stata gra-molata per 25 minuti a temperatura ambiente.

Per ciascuna prova è stato lavorato un quantitati-vo di olive pari a 3 quintali ed ogni processo estrat-tivo è stato monitorato dall’arrivo del cassone con-tenente le olive fino all’ottenimento dell’olio.

Durante la lavorazione con GrV sono stati pre l e-vati campioni di pasta a 0 e 25 minuti di gramolatu-ra, mentre durante la lavorazione con GrO sonostati prelevati campioni di pasta a 0, 15 e 25 minutidi gramolatura. Le paste sono state immediatamen-te poste sotto azoto liquido.

Al termine di ciascuna prova l’olio è stato preleva-to e confezionato in bottiglie di vetro scuro.

Le paste di oliva sono state stoccate in congela-tore a -30°C fino al momento delle analisi, mentrel’olio è stato stoccato in frigorifero al buio ad unatemperatura di 14°C fino al momento delle analisi.La Tabella I riporta in sintesi la tipologia dei campio-ni collezionati per ogni sperimentazione condotta.

Ogni campione di olio prelevato è stato sottopostoalle seguenti analisi: acidità, numero di pero s s i d i ,analisi spettrofotometrica, composizione acidica,composti fenolici totali, tocoferoli e analisi sensoriale.

Le paste di oliva congelate sotto azoto liquido,dopo rapido decongelamento con forno a microon-

Figura 2 – Diagramma di flusso delle lavorazioni. A: lavorazione conGrO, B: lavorazione con GrV.


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utilizzando l’acido siringico come standard inter-no e il tirosolo come composto di riferimento peril fattore di risposta. I risultati sono stati espressicome mg di tirosolo su kg di olio.

• La determinazione del contenuto in composti vola-tili è stata eseguita in accordo con il metodo ripor-tato da Vichi et al. [14]. L’analisi quantitativa èstata effettuata utilizzando come standard intern oil 4-metil-2-pentanolo. I risultati sono espressi inmg di composto aromatico per kg di olio [14].

• L’analisi sensoriale è stata eseguita in accord ocon le metodiche comunitarie Reg. CEE2568/1991 [7] e Reg. CE 796/2002 [8]. Per valo-r i z z a re le caratteristiche dell’olio extra vergine dioliva è stata utilizzata una scheda di valutazionemessa a punto secondo le l inee guidaC O I / T.20/Doc.n.22 “Metodo per la valutazioneorganolettica dell'olio di oliva extra vergine adenominazione d’origine”.

Analisi statisticaPer le determinazioni analitiche di acidità, numero

di perossidi, misure spettrofotometriche, contenutoin fenoli totali e tocoferoli, è stata riportata l’incertez-za di misura estesa (U), calcolata secondo quantoriportato nella norma UNI CEI ENV 13005 [15]. Perle determinazioni analitiche del contenuto in compo-sti volatili e composti fenolici per HPLC è stato ripor-tato il valore della deviazione standard (DS).

RISULTATI E DISCUSSIONELa Tabella II mostra i valori delle analisi chimiche

di base dei campioni di olio, estratti mediante lavo-razione con GrO e con GrV. La Tabella III riportainvece i risultati dell’analisi sensoriale. È possibilenotare come tutti gli oli estratti siano sostanzialmen-te risultati extra vergini con bassi valori di acidità,numero di perossidi e spettro UV e privi di difetti.

Esaminando invece la qualità degli oli estratti dallepaste è possibile valutare il ruolo dell’esposizioneall’ossigeno e del tempo di gramolatura sul conte-nuto fenolico e aromatico dell’olio nelle paste.

1. Effetto dell’esposizione all’ossigeno durante

la gramolatura sui composti fenolici e volatili

Per confrontare le condizioni operative di gramo-latura dell’olio, sono stati utilizzati gli oli estratti dallepaste ottenute dopo 25 minuti di gramolaturasecondo le due modalità di produzione.

P rendendo in considerazione il contenuto in

de, sono state utilizzate per l’estrazione dell’oliomediante centrifuga da laboratorio; l’olio estratto èstato utilizzato per determinare il contenuto in com-posti fenolici per HPLC ed in composti volatili.

Determinazione analitiche• Le determinazioni del contenuto in acidità, del

n u m e ro di perossidi e delle misure spettro f o t o m e-triche sono state eseguite in accordo alle metodi-che ufficiali riportate nel Reg. CEE 2568/1991 [7].La determinazione della composizione acidica èstata eseguita in accordo con la metodica uff i c i a l eriportata nel Reg. CE 796/2002 [8].

• La determinazione del contenuto in compostifenolici totali è stata determinata mediante estra-zione con miscela metanolo:acqua 80:20 (V/V).L’estratto idroalcolico così ottenuto è stato utiliz-zato per determinare, per via colorimetrica, il con-tenuto in composti fenolici totali utilizzando il re a t-tivo di Folin Ciocalteau [9]. La lettura è stata ese-guita allo spettro f o t o m e t ro a 765 nm. Il contenutoin composti fenolici totali dell’olio è espre s s ocome mg di acido gallico su kg di olio [10].

• La determinazione del contenuto in tocoferoli èstata eseguita secondo la metodica riportata daTonolo et al. [11]. L’analisi quantitativa è effettua-ta mediante il metodo dello standard esterno. Irisultati sono stati espressi come mg di tocoferolitotali per kg di olio [12].

• La determinazione del contenuto in compostifenolici e la loro identificazione è stata eseguitaper HPLC in accordo con il metodo NGD C 89-2007 [13]. L’analisi quantitativa è stata effettuata

Tabella I - Campioni di paste di oliva e di olio collezionati durante lesperimentazioni condotte

Date di lavorazionePaste di oliva

Olio0 minuti 15 minuti 25 minuti

03/11/07

TBF03O X X X X

TBF03V X X X

17/11/07

TBF17O X X X X

TBF17V X X X

La sigla TB identifica il fra ntoio To r re Bianca, la sigla F identifica la cu l t i va r

Frantoio, il numero dopo la sigla in lettere è la data di sperimentazione, O indica

la lavorazione con la gramolatrice ad asse orizzontale aperta e V la lavorazione

con la gramolatrice chiusa ad asse verticale a ridotto contenuto di ossigeno.


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20%, da intendere come decremento perc e n t u a l edella somma dei composti volatili a sei atomi di car-bonio nella GrV rispetto alla lavorazione con GrO.Ciò può essere imputabile al fatto che un ridottoimpatto ossidativo presupponga limitate attivitàenzimatiche della via della lipossigenasi e di conse-guenza una minor produzione di composti volatili,quali aldeidi, alcoli ed esteri [3, 5]. La possibilità chela componente aromatica nella GrV sia diminuitaper effetto di uno strippaggio dovuto alla messasotto vuoto, è da ritenere improbabile a causa dellaparticolare geometria di GrV che riduce lo spazio ditesta a contatto con le paste e, soprattutto, rendeassente il contatto della gran parte della massa dipasta con lo stesso.

Uno studio analogo condotto da Servili et al. [6]

secoiridoidi nelle date di sperimentazione (Tabella IVe Fig. 3), la lavorazione a ridotto impatto ossidativo(GrV) ha portato ad un contenuto maggiore insecoiridoidi a medio peso molecolare e di conse-guenza ad un contenuto maggiore in secoiridoiditotali (incremento compreso tra il 20% e il 40%).Questo risultato è coerente con i risultati riportati inletteratura [3, 5, 6] ed è imputabile al fatto che unminor contenuto di ossigeno causa limitate attivitàenzimatiche delle PPO e POD, responsabili dell’os-sidazione dei secoiridoidi, per mancanza del sub-strato di reazione.

Nella Figura 4 e nella Tabella V si nota invececome il contenuto in composti volatili derivanti dalla“LOX pathway” sia sempre maggiore nella lavora-zione con GrO. L’entità del fenomeno è di circa il

Tabella III - Mediane dei descrittori relativi alle analisi sensoriali condotte sugli oli sperimentali della campagna olearia 2007

Fruttato Noce Pinolo Mandorla Carciofo Erba Piccante Amaro Amaro

di oliva tannico

03/11/07

TBF03O 3,3 1,9 0,0 2,3 2,1 1,0 4,2 2,6 1,4

TBF03V 3,3 0,8 0,8 2,5 3,3 1,4 4,0 3,3 4,2

17/11/07

TBF17O 3,5 1,3 3,7 1,6 2,6 2,7 4,4 3,3 0,0

TBF17V 1,0 3,3 1,7 1,4 2,4 1,4 3,9 2,6 1,9

Muffa Riscaldo Avvinato Morchia Metallico Rancido Altri

03/11/07

TBF03O 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

TBF03V 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

17/11/07

TBF17O 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

TBF17V 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

Tabella II - Risultati relativi alle analisi chimiche condotte sugli oli della campagna olearia 2007 (U = incertezza di misura estesa)

Acidità Numero di perossidi K232 K270 ΔK Contenuto in Contenuto in

(% acido oleico) (meq di O2/kg di olio) fenoli totali tocoferoli

(mg/kg) (mg/kg)

Media ± U Media ± U Media ± U Media ± U Media ± U Media ± U Media ± U

03/11/07

TBF03O 0,20 ± 0,01 3,8 ± 0,8 1,71 0,2 0,00 434 ± 9 183 ± 10

TBF03V 0,18 ± 0,01 3,6 ± 0,8 1,79 0,2 0,00 506 ± 9 274 ± 10

17/11/07

TBF17O 0,17 ± 0,01 5,9 ± 0,8 1,60 0,2 0,00 382 ± 9 193 ± 10

TBF17V 0,22 ± 0,01 7,8 ± 0,8 1,64 0,1 0,00 468 ± 9 124 ± 10


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Tabella IV - Contenuto in composti fenolici degli oli estratti dalle paste di oliva ottenute dalle sperimentazioni condotte durante la campagnaolearia 2007 (DS = deviazione standard)

Campione (mg/kg)TBF03 TBF03O TBF03O TBF03V TBF17 TBF17O TBF17O TBF17V

DS0 min 15 min 25min 25min 0 min 15 min 25 min 25 min

Oleuropeina glicone 27,0 19,1 21,5 22,0 26,8 14,1 14,9 25,6 ±0,2

Oleuropeina aglicone (3,4-DHPEA-EA) 27,0 28,3 22,4 30,1 16,1 11,1 16,7 19,3 ±0,5

Ligstroside aglicone (p-HPEA-EA) 9,2 9,5 8,7 10,9 4,0 4,9 6,0 7,7 ±0,2

Forma dialdeidica dell’oleuropeina aglicone 30,9 27,9 15,4 26,7 38,3 11,5 21,8 18,4 ±0,4

Forma dialdeidica del ligstroside aglicone 11,8 11,2 10,9 14,9 13,5 5,1 8,4 9,8 ±0,3

Totale secoiridoidi ad alto peso molecolare 105,9 96,1 78,9 104,7 98,6 46,8 67,7 80,9 ±2,9

% Totale secoiridoidi ad alto peso molecolare 36,1 28,5 26,1 24,8 41,4 24,1 24,7 24,5

Forma aldeidica dell'oleuropeina aglicone ossidata 40,2 39,6 37,6 43,4 23,9 22,8 30,4 37,0 ±1,0

Forma aldeidica del ligstroside aglicone ossidato 14,7 14,7 15,1 17,0 9,4 10,4 16,6 15,7 ±0,4

Forma dialdeidica della decarbossimetil oleuropeina aglicone (3,4-DHPEA-EDA) 74,9 109,8 96,8 155,5 54,4 73,2 99,9 119,4 ±3,4

Forma dialdeidica della decarbossimetil oleuropeina aglicone ossidata 14,2 16,3 13,4 19,4 17,3 6,2 9,2 9,8 ±0,3

Forma dialdeidica del decarbossimetil ligstroside aglicone (p-HPEA-EDA) 33,5 50,4 49,7 68,1 21,9 28,8 40,5 55,9 ±1,6

Forma dialdeidica del decarbossimetil ligstroside aglicone ossidato 6,1 6,0 6,6 8,6 10,1 4,1 6,7 6,8 ±0,2

Totale secoiridoidi a medio peso molecolare 183,6 236,9 219,1 312,2 136,9 145,4 203,3 244,4 ±4,9

% Totale secoiridoidi a medio peso molecolare 62,7 70,3 72,5 74,0 57,5 75,0 74,2 74,1

Idrossitirosolo (3,4-DHPEA) 1,0 1,2 1,6 1,6 1,4 0,6 1,3 1,6 ±0,0

Tirosolo (p-HPEA) 2,4 2,7 2,4 3,3 1,2 1,2 1,8 2,9 ±0,1

Totale secoiridoidi a basso peso molecolare 3,4 3,9 4,0 4,9 2,6 1,8 3,0 4,5 ±0,1

% Totale secoiridoidi a basso peso molecolare 1,2 1,2 1,3 1,2 1,1 0,9 1,1 1,4

Totale secoiridoidi 292,9 336,9 302,0 421,7 238,1 194,0 274,1 329,8 ±5,5

Pinoresinolo + 1-acetossipinoresinolo 69,7 66,7 58,4 74,7 27,5 19,2 28,2 53,7 ±1,4

Totale lignani 69,7 66,7 58,4 74,7 27,5 19,2 28,2 53,7 ±1,4

Acido vanillico 2,3 2,7 2,9 2,7 1,0 1,5 2,1 2,8 ±0,1

Vanillina 2,3 2,5 2,3 3,6 1,5 1,5 2,0 2,2 ±0,1

Acido ferulico 7,2 8,2 6,2 10,5 1,1 1,6 2,1 3,0 ±0,1

Luteolina 9,0 9,3 7,6 7,7 8,1 6,7 9,9 7,2 ±0,2

Apigenina 14,9 11,5 6,2 5,8 3,8 4,3 6,0 10,2 ±0,2

Metil luteolina 3,4 3,1 3,5 6,4 3,3 2,7 3,8 2,6 ±0,1

Acido para-cumarico 3,1 3,6 3,4 3,6 0,8 1,0 1,2 2,0 ±0,0

Acido cinnamico 6,3 5,5 5,5 7,3 4,8 2,8 3,8 4,4 0,1

Totale composti fenolici a 280nm 411,3 449,9 398,0 544,0 290,0 235,2 333,1 417,8 ±6,0

% Secoiridoidi 71,2 74,9 75,9 77,5 82,1 82,5 82,3 78,9

% Lignani 16,9 14,8 14,7 13,7 9,5 8,2 8,5 12,9

quanto ottenuto in questa ricerca sulla cultivarF r a n t o i o. Se ne deduce come queste pro b l e m a t i-che debbano essere ulteriormente studiate per unaloro reale comprensione.

2. Effetto del tempo di gramolatura sui compo-

sti fenolici e sui composti volatili

Per individuare l’effetto del tempo di gramolatura, èstato utilizzato l’olio estratto per centrifugazione in labo-ratorio dalle paste di oliva prelevate a diff e renti tempi di

su cultivar Ogliarola e Coratina ha portato a risultatisolo in parte in accordo con quelli da noi trovati. TaliAutori non hanno riscontrato sulla globalità dei risul-tati un effetto statisticamente significativo dell’ossi-geno sul profilo aromatico delle paste. Si è perònotato un comportamento differente tra le due culti-var; in Coratina la quantità di composti volatili non èvariata significativamente negli esperimenti condotti,mentre in Ogliarola la quantità dei composti volatili èvariata in modo significativo ed in accordo con


98

lavorazione per entrambe le linee di pro d u z i o n e .Osservando la Figura 5 e la Tabella IV si nota

innanzitutto come in tre casi su quattro vi sia statauna riduzione del contenuto di oleuropeina tra l’ini-zio e la fine delle gramolature, indipendente dall’im-patto ossidativo, da imputare all’attività della β−glu-cosidasi, responsabile della trasformazione deisecoiridoidi dai corrispettivi agliconi [5, 6]. Si nota

poi come durante la gramolatura vi sia stato uncomplessivo aumento dei secoiridoidi totali. Il feno-meno è risultato maggiore quando è stata utilizzatala GrV; l’entità della variazione del contenuto insecoiridoidi totali è del 3-15% per la lavorazionecon GrO e di circa il 40% per la lavorazione conGrV. Si può ipotizzare che la variazione del contenu-to fenolico sia dovuta alla combinazione di effetti di

Figura 3 - Effetto dell’esposizione all’ossigeno durante la gramolatura sul contenuto in secoiridoidi totali.

Figura 4 - Ef f e t to dell’esposizione all’ossigeno dura nte la gra m o l at u ra sul co nte n u to in composti vo l atili totali derivati dalla “via della lipossigenasi”.


99

solubilizzazione nella componente oleosa, favoritidall’attività glucosidasica, con effetti degradativimediati dall’ossigeno.

Servili et al. [6] hanno invece riscontrato, sia in ridot-te che in elevate condizioni di impatto ossidativo (dap O2 = 0 a pO2 = 100 kPa nello spazio di testa), ungenerale decremento nel tempo (fino a 40 min di gra-molatura) dei secoiridoidi, seppur rallentato in condi-zione di ridotto impatto ossidativo. Tali risultati non

sono direttamente confrontabili con quelli ottenutinella nostra ricerca, poiché tali Autori hanno misuratol’evoluzione dei composti fenolici direttamente nellepaste e non negli oli estratti dalle stesse.

La Figura 6 e la Tabella V mostrano il contenuto incomposti volatili degli oli estratti dalle paste di olivagramolate 25 minuti e gli oli estratti dalle paste dioliva a tempo 0 di gramolatura. Si può notare uni n c remento della componente volatile nella sola

Tabella V - Contenuto in composti volatili degli oli estratti dalle paste di oliva ottenute dalle sperimentazioni condotte durante la campagna olea-ria 2007 (DS = deviazione standard)

Composti volatili TBF03 TBF03O TBF03O TBF03V TBF17 TBF17O TBF17O TBF17V Ds

mg/kg 0 min 15 min 25 min 25 min 0 min 15 min 25 min 25 min

Hexanal+(Z)-3-Hexenal 3,19 2,97 3,47 2,37 2,98 3,61 3,44 3,07 ±0,04

Hexyl alcohol 0,66 0,86 0,86 0,56 1,23 1,45 1,43 1,09 ±0,15

Hexyl acetate 0,34 0,41 0,41 0,25 0,37 0,29 0,30 0,34 ±0,04

Σ C6 from LA 4,20 4,24 4,74 3,18 4,59 5,35 5,17 4,50 ±0,21

(Z)-3-Hexen-1-ol 0,79 1,00 0,97 0,79 1,63 2,04 1,98 1,10 ±0,05

(E)-2-Hexenal 9,34 12,22 12,53 10,62 10,48 12,15 12,23 11,47 ±0,07

(E)-2-Hexen-1-ol 0,81 1,13 1,17 1,02 1,78 2,22 2,19 1,52 ±0,04

(Z)-3-Hexenyl acetate 0,64 0,88 0,86 0,68 1,50 1,42 1,48 0,80 ±0,04

(E)-2-Hexenyl acetate 0,10 0,14 0,15 0,11 0,26 0,18 0,19 0,15 ±0,03

Σ C6 from LnA 11,68 15,36 15,68 13,21 15,66 18,01 18,06 15,04 ±0,12

Σ C6 from LnA + LA 15,88 19,60 20,42 16,39 20,25 23,37 23,23 19,54 ±0,28

% C6 aldehydes/Σ C6 78,93 77,50 78,33 79,25 66,52 67,47 67,46 74,43 ±4,65

% C6 alchols/Σ C6 14,47 15,47 15,39 14,75 23,71 24,91 24,53 19,32 ±1,33

% C6 esters/Σ C6 6,85 7,29 6,96 6,29 10,54 8,09 8,46 6,60 ±1,75

Figura 5 - Effetto del tempo di gramolatura sul contenuto in secoiridoidi totali.


100

lavorazione con GrO (15-30%), dimostrando comeil tempo favorisca una maggiore attività degli enzimidella “LOX Pathway”. Si tratta di un risultato coe-rente con l’ipotesi precedente sull’effetto dell’ossi-geno sulla componente volatile.

CONCLUSIONILa ricerca condotta ha permesso di evidenziare

come l’operazione di gramolatura abbia potenzial-mente un significativo impatto sulle caratteristichequalitative dell’olio extra vergine d’oliva, purché si siain grado di tenere sotto controllo le numerose attivitàenzimatiche di trasformazione della componente lipi-dica delle paste attraverso una consapevole e attentascelta delle condizioni operative. La complessità deifenomeni enzimatici, chimici e fisici che avvengononella gramolatura, unita alla mancanza di tecniched i rette per la misura del ruolo del potenziale di ossido-riduzione nelle paste, rendono tuttavia ancora neces-sari approfonditi studi a proposito. Alcune linee di indi-rizzo sono comunque possibili da delineare .

Lavorazioni con gramolatrici a diff e rente impattoossidativo hanno un differente effetto sul contenutoin composti fenolici e volatili degli oli. La gramolatu-ra a ridotto impatto ossidativo (i.e. ottenuta in que-sta ricerca attraverso l’impiego di una gramola verti-cale chiusa a bassa pressione) permette la forma-

zione di oli con un maggior contenuto di secoiridoidia medio peso molecolare e, di conseguenza, uncontenuto maggiore in composti fenolici totali; laridotta esposizione all’ossigeno riduce l’attività deglienzimi polifenolossidasi e perossidasi, principaliresponsabili del danno ossidativo a carico dei com-posti fenolici. La gramolatura ad elevato impattoossidativo (i.e. ottenuta in questa ricerca attraversol’impiego di una gramola orizzontale aperta edesposta all’aria) porta invece alla formazione di olicon un contenuto maggiore di composti volatili,dovuta ad una maggiore attività degli enzimi dellavia della lipossigenasi.

La ricerca ha poi messo in evidenza come glie ffetti di trasformazione degli oli siano influenzatianche dal tempo di gramolatura. Il tempo di gramo-latura favorisce l’azione dell’enzima‚ β−glucossidasi,responsabile della trasformazione dei secoiridoidinei corrispondenti agliconi, e quindi in composti piùsolubili in olio; tale azione si traduce in un maggiorcontenuto di composti fenolici nell’olio, qualora nevenga garantita la protezione dalle ossidazioni enzi-matiche attraverso una gramolatura a ridotto impat-to ossidativo. In maniera opposta il tempo di gra-molatura favorisce l’azione degli enzimi della viadella lipossigenasi e, quindi, un incremento dellacomponente volatile degli oli, qualora si operi con

Figura 6 - Effetto del tempo di gramolatura sul contenuto in composti volatili totali derivati dalla “via della lipossigenasi”.


101

una gramolatura ad elevato impatto ossidativo. Daquanto esposto ne consegue che, regolando l’im-patto ossidativo attraverso la variazione del conte-nuto di ossigeno nel sistema, l’arricchimento incomposti fenolici in gramolatura può risultare oppo-sto all’arricchimento in composti volatili in gramola-tura; se ne deduce la necessità di un’ottimizzazionedelle condizioni operative, date le numerose combi-nazioni possibili dei parametri operativi nel condizio-nare le attività enzimatiche, a cominciare dal poten-ziale di ossidoriduzione e dal tempo di gramolatura.

RINGRAZIAMENTI

Questa sperimentazione è stata realizzata grazieal finanziamento ARSIA ottenuto in seguito all’asse-gnazione del Bando di Ricerca per lo sviluppo delSettore olivo-oleicolo toscano, “Protocolli innovativiper la produzione di olio extra vergine di oliva nellarealtà aziendale toscana”, pubblicato sul BollettinoUfficiale della Regione Toscana n°25 del 23/06/04.Un particolare ringraziamento al prof. Pier RemigioSalvi, ordinar io di Chimica-Fisica presso i lDipartimento di Chimica dell’Università degli Studidi Firenze, per l’aiuto gentilmente concesso.

BIBLIOGRAFIA

[1] F. Angerosa, R. Mostallino, C. Basti, R. Vi t o ,Food Chem. 72, 19-28 (2001).

[2] A. Bendini, L. Cerretani, G. Lerc k e r, Riv. Ital.Sostanze Grasse 84, 191-202 (2007).

[3] M. Servili, A. Taticchi, S. Esposto, S. Urbani,R. Selvaggini, G.F. Montedoro, J. Agric. FoodChem. 55, 7028-7035 (2007).

[4] M. Servi l i , R. Selvaggini, S. Esposto, A.Taticchi, G.F. Montedoro, G. Morozzi, J.Chrom. 1054, 113-127 (2004).

[5] M. Migliorini, M. Mugelli, C. Cherubini, P. Viti,B. Zanoni, J. Sci. Food Agric. 86, 2140-2146(2006).

[6] M. Servili, A. Taticchi, S. Esposto, S. Urbani,R. Selvaggini, G.F. Montedoro, J. Agric. FoodChem. 56, 10048-10055 (2008).

[7] Commissione Europea, Regolamento (CEE) n.2568/1991 – GU L 248 del 5/9/1991.

[8] Commissione Europea, Regolamento (CE) n.796/2002 – GU L 128 del 15/5/2002.

[9] V.L. Singleton, J.A. Rossi, Am. J. Enol. Vitic.16, 144-158 (1965).

[10] M.I.P. n. 18, Rev. 5. Determinazione dei polife-nol i color imetrici - Laborator io ChimicoMerceologico – Azienda Speciale della CCIAAdi Firenze.

[11] G. Tonolo, S. Marzo, Riv. Ital. Sostanze Grasse66, 3-6 (1989).

[12] M.I.P. n. 22, Rev. 4. Determinazione dei toco-f e roli - Laboratorio Chimico Merceologico –Azienda Speciale della CCIAA di Firenze.

[13] NGD C 89/2007, Commissione Tecnica SSOG(2007).

[14] S. Vichi, A.I. Castellote, L. Piazzale, L.S.Conte, S. Buxaderas, L. Tamamens, J.Chrom. 983, 19-33 (2003).

[15] UNI CEI ENV 13005, Ente Nazionale Italiano diUnificazione (2000).

I N F LUENCE OF OPE RATING CO N D I T I O N SO F MAL AXAT IO N ON THE QUA L I T Y OFEXTRA VIRGIN OLIVE OIL

The quality of extra virgin olive oil is evaluated notonly by estimating its product parameters determi -ned by current regulations in force, but also byassessing its volatile and phenolic compounds con -tent. The quantity and types of volatile and phenoliccompounds contained in extra virgin olive oil isdependent upon both chemical composition of pro -cessed olives and operating conditions for proces -sing applied in olive oil mill. Based on both experi -ments carried out in previous years and literaturedata, it may be assumed that exposure to oxygenmay play a significant role on both olive pasteduring malaxation and, as a result, the quality offinal product.

During 2007 crop season, some trials were car -ried out using a plant equipped with vertical-axismalaxators, which were able to work under low oxi -dative stress impact conditions (Fig. 1). The oilsamples obtained from olive paste, pro c e s s e dusing the above malaxator were compared with oilsamples obtained from olive paste processed usinga horizontal-axis, open malaxator (Fig. 2). Both finaloil and olive paste samples were collected at diffe -rent malaxing times from both production lines(Table I). Basic chemical analyses (i.e. determinationof acidity, number of peroxides, spectrum in theultraviolet region, tocopherol content and total phe -nolic compounds content) were performed on finalextra virgin olive oil, whereas oil extracted from olive


102

paste was used to determine both the phenoliccompounds content by HPLC and the volatile com -pounds content.

All oil samples extracted resulted to be flawlessextra virgin olive oil at low acidity values, pero x i d enumber and UV spectrum (Tables II and III). A studyon analyses performed on oil samples extractedfrom olive pastes, which were malaxed at differenttimes for both production lines, showed the fol -lowing aspects (Tables IV and V):• Effect of exposure to oxygen during malaxation on

both volatile and phenolic compounds

Processing at low oxidative stress impact alwaysrequired a higher medium-molecular-weight secoiri -doid content and, as a result, a higher total secoiri -doid content (Fig. 3) than processing by a horizon -tal-axis malaxator (increase between 20% and40%). This may depend on the fact that a minoroxygen content involved restricted activities ofpolyphenol oxidase and peroxidase enzymes, whichw e re responsible for secoiridoid oxidation, as aresult of the lack of reaction substrate. Processingby using a horizontal-axis malaxator (Fig. 4) alwaysresulted in a higher volatile compound content,because using low-oxidative-stress-impact malaxa -tor involved restricted activities of lipoxygenasepathway enzymes and, as a result, minor pro d u c -

tion of volatile compounds such as aldehydes,alcohols and esters.• Effect of malaxing time on both phenolic compounds

and volatile compounds

The total secoiridoid content increased on increa -sing the malaxing time. This phenomenon washigher when using a vertical-axis malaxator thanusing a horizonal-axis malaxator (Fig. 5). The degreeof variation in total secoiridoid content was 3-15%for processing using a horizontal axis malaxator anda round 40% for processing using a low-oxidative-stress-impact, vertical malaxator.

The oleuropein aglycon content decreased overmalaxing time for both tests (Table IV). This pheno -menon may be ascribed to ß-glucosidase action.

Volatile compounds only increased over time foroil derived from olive paste processed using hori -zontal-axis malaxator at a degree between 15 and30% (Fig. 6). Research showed that malaxing ope -ration does have a significant impact on quality cha -racteristics of extra virgin olive oil, provided the largenumber of enzyme activities for transformation ofthe lipid component of olive paste can be keptunder control by a conscious, careful selection ofoperating conditions.

Ricevuto 29 ottobre 2008, accettato 13 febbraio 2009


103

Effet de l’attaque du ravageurBactrocera oleae sur la qualité

de l’huile d’olive de trois variétésalgériennes: Chemlal, Azzeradj

et Bouchouk

A. TAMENDJARI1, M. SAHNOUNE2, S. METTOUCHI3, F. ANGEROSA4

1) FACULTE DES SCIENCES DE LA NATURE ET

D E LA VI E - UN I V E R S I T E D E BE JA I A,ALGERIE

2) LA BO R ATO I R E D’ ECO LO G I E, FAC U LT E D E S

SCIENCES DE LA NATURE ET DE LA VIE –UNIVERSITE DE BEJAIA, ALGERIE

3) FACULTE DES SCIENCES DE LA NATURE ET

DE LA VIE4) C R A- IST I T U TO SP E R I M E N TA L E P E R LA

EL A I OT E C N I C A , CI T TA’ S. ANG E L O,PESCARA, ITALIE

LE PRÉSENT TRAVAIL A ÉTÉ RÉALISE POUR ÉVALUER L’EFFET DE L’ATTAQUE (TROU DE SOR-TIE) DE LA MOUCHE DE L’OLIVE, BACTROCERA OLEAE, SUR LES CARACTÉRISTIQUES PHYSICO-CHIMIQUES ET ORGANOLEPTIQUES DE L’HUILE D’OLIVE ISSUE DE TROIS VARIÉTÉS ALGÉRIEN-NES (CHEMLAL, BOUCHOUK, AZZERADJ). LES RÉSULTATS OBTENUS MONTRENT QUE L’ATTA-Q U E D U R AVAG E U R E N T R A Î N E D E S P E R T E S E N H U I L E E T D E S VA R I AT I O N S DA N S L E SPA R A M È T R E S D E Q UA L I T É. L’H Y D RO LYS E E T L’OX Y DAT I O N S O N T L E S D E U X P R I NC I PA L E SRÉACTIONS D’ALTÉRATION. LA VARIÉTÉ AZZERADJ S’AVÈRE LA PLUS SENSIBLE; UNE ATTA-QUE SEULEMENT DE 20% ENTRAÎNE LE DÉCLASSEMENT DE L’HUILE ISSUE DE LA CATÉGO-RIE EXTRA-VIERGE À LA CATÉGORIE VIERGE, ALORS QU’UN TAUX D’ATTAQUE DE 40% ESTNÉCESSAIRE POUR DÉTERMINER LE MÊME DÉCLASSEMENT DES HUILES DES DEUX AUTRESVARIÉTÉS (CHEMLAL ET BOUCHOUK). PARMI LES CONSTITUANTS DE L’INSAPONIFIABLE, LESCOMPOSÉS PHÉNOLIQUES SONT BIEN CORRÉLÉS NÉGATIVEMENT AVEC L’ATTAQUE.MOTS CLEF: BACTROCERA OLEAE, VARIÉTÉ, HUILE D’OLIVE, ALTÉRATION, QUALITÉ

EFFECT OF BACTROCERA OLEAE INFESTATION ON THE OLIVE OIL QUALITY OF THREEALGERIAN VARIETIES: CHEMLAL, AZZERADJ AND BOUCHOUKTHE AIM OF THIS WORK IS TO EVALUATE THE INFLUENCE OF THE ATTACK (EXIT HOLE) OFBA C T R O C E R A O L E A E, T H E P E ST O F T H E O L I V E T R E E, O N T H E P H YS I CA L-CH E M I CA L A N DO RGA NO L E P T I C Q UA L I TY O F T H E O I L O F T H R E E ALG E R I A N O L I V E C U LT I VA R S: CH E M L A L,BOUCHOUK and AZZERADJ. THE RESULTS SHOWED THAT THE ATTACK OF THE PEST INDU-CED A REDUCTION IN THE OIL YIELD AND CAUSED DIFFERENT CHANGES ACCORDING TO THEVARIETY AND THE IMPORTANCE OF THE ATTACK IN SOME OF THE PARAMETERS OF QUALITY.OX I DAT I O N A N D H Y D RO LYS I S W E R E T H E M A I N R E AC T I O N S O F A LT E R AT I O N. AZ Z E R A D J I STHE MOST SENSIBLE TO THE PEST ATTACK; 20% OF ATTACK INDUCED THE DEPRECIATIONO F R E S U LT I NG O I L F RO M E X T R A-V I RG I N CAT E G O RY TO V I RG I N CAT E G O RY. A S I M I LA RD E P R E C I AT I O N O C C U R R E D AT 40% AT TACK FO R T H E TWO OT H E R S VA R I E T I E S (CH E M L A L,BO U C H O U K). AM O NG T H E CO N ST I T U E N TS O F T H E U N SA P O N I F I A B L E M AT T E R P H E NO L I CCO M P O U N D S S H OW E D A G O O D N E GAT I V E CO R R E LAT I O N W I T H T H E I M P O R TA NC E O F T H EATTACK OF THE PEST. KEY WORDS: BACTROCERA OLEAE, OLIVE OIL, VARIETY, ALTERATION, OIL QUALITY

CORRESPONDANT: [email protected]


104

INTRODUCTION

Les problèmes phytosanitaires sont parmi les fac-teurs qui conditionnent la production oléicole. Lespertes annuelles sont estimées à plus de 30% dont15% sont provoqués par les insectes ravageurs [1].La mouche de l’olive, Bactrocera oleae, représentel’ennemi principal de l’olivier dans la région méditer-ranéenne. Les dégâts occasionnés se traduisentpar une sanction économique tant sur le plan quan-titatif que qualitatif [2]. Les dégâts quantitatifs, plusp rononcés quand la larve a terminé son cycle dedéveloppement, se résument à une perte non négli-geable de la pulpe, occasionnée par la larve et lachute précoce des fruits [3]. Les modifications qua-litatives des huiles ont été les plus étudiées par den o m b reux chercheurs [4-11]. Leurs travaux ontmontré que l’altération est fonction de l’intensité del’attaque et du type de variété.

Des variations importantes ont été notées dansplusieurs paramètres de qualité de l’huile produite:acidité, indice de peroxyde, absorbance en U.V. ,composition phénolique, fraction volatile et qualitéorganoleptique. La sensibilité variétale à l’attaquepar B. Oleae a été abordée par plusieurs cher-cheurs [12-14], mais leurs résultats ont montré ladifficulté de trouver des critères pour déterminer lasensibilité à la mouche.

En vue d’établir les seuils d’attaque nuisibles à laqualité de l’huile de trois variétés algériennes, l’in-fluence des diff é rents taux d’attaque (0 %, 20%,40%, 60%, 80%, 100% des olives avec trou desortie) a été étudiée.

MATÉRIEL ET MÉTHODES

Origine des échantillons et cara ctéristiques de station derécolte

Les olives des variétés C h e m l a l, A z z e r a d j e tB o u c h o u k ont été utilisées pour l’expérimentation.Les variétés proviennent de la région de Béjaia situéedans le Centre Est de l’Algérie. Cette région estcaractérisée par un climat chaud en été et froid enhiver avec une pluviométrie d’environ 600 mm /an.

Le choix des variétés a été fait sur la base dedeux critères: la représentativité de la variété et lagrosseur des fruits. La variété Chemlal représentantplus de 40% du verger oléicole algérien, est locali-sée surtout dans la région de Kabylie, particulière-ment à Béjaia ou elle représente plus de 50 % du

verger. Elle se caractérise par ses petits fruits (1.5-2g) et est destinée exclusivement à l’huilerie. Lavariété Azzeradj est caractérisée par ses gros fruits(4-5 g) dont la destination est double: huilerie etconserverie. Elle représente environ 10 % du vergeroléicole de la région de Béjaia. La variétéB o u c h o u k, localisée à l’Est du pays et dans larégion de Béjaia, est aussi utilisée à double fin (huileet conserve); les fruits sont assez gros (3-4 g).

L’indice de maturité des olives des diff é re n t e svariétés a été déterminé sur la base de la colorationde la peau et de la pulpe de 100 fruits prélevés auh a s a rd en utilisant la formule de calcul pro p o s é epar Uceda et Frias [15].

Pré p a ration des échantillons et estimation du taux d’i n f e-s t ation

Le taux d’infestation totale des olives (qui reflètecelui de l’arbre) par la mouche B. oleae a été déter-miné en prélevant 100 fruits au hazard, puis encomptant le nombre d’olives attaquées (chaqueolive présente au moins un trou caractéristique desortie de la mouche) et celui d’olives saines.

Pour la préparation des échantillons à diff é re n t staux d’attaque (de 0 à 100%), les olives ont étéséparées en olives saines et olives attaquées. Sixéchantillons ont été préparés pour chaque variété,comme il suit:- Échantillon sain: exclusivement des olives saines;- Échantillon attaqué à 20%: 20 % d’olives atta-

quées et 80% d’olives saines;- Échantillon attaqué à 40%: 40 % d’olives atta-

quées et 60% d’olives saines;- Échantillon attaqué à 60%: 60% d’olives atta-

quées et 40 % d’olives saines;- Échantillon attaqué à 80%: 20% d’olives saines

et 80% d’olives attaquées;- Échantillon attaqué à 100% : exclusivement des

olives attaquées.

Extraction de l’huile Elle a été réalisée à l’aide d’un oléodoseur (S.O.L

20240 CHIOSONACCIA), muni d’un séparateur cen-trifuge à trois phases. Après broyage des olives, lapâte obtenue a été malaxée pendant 15 min à fro i det 15 min à chaud avec de l’eau à 30°C (60 ml pour920 g de pâte), et centrifugée. L’huile, récupéréeaprès décantation pour éliminer les eaux de végéta-tion, a été recueillie dans des flacons en verre fuméet conservée à 4°C en attente d’être analysées.


105

Méthodes d’analyseLe rendement a été évalué par gravimétrie après

extraction de l’huile par de l’hexane au moyen duSoxhlet (6 heures) et distillation du solvant à partird’un broyat d’olives séchées à l’étuve (à 60 °C)jusqu’à poids constant [16].

Les analyses de l’acidité et de l’indice de peroxy-de ont été réalisées suivant les protocoles proposéspar le U.I.C.P.A [17]. L’ absorbance à l’UV à 232 nmet 270 nm est réalisée suivant la méthode établiepar le COI [18].

La détermination de la composition en acidesgras est réalisée avec l’analyse chromatographiqueen phase gazeuse des esters methylés après trans-estérification des triglycérides de l’huile d’olive. Laméthylation des acides gras est réalisée selon laméthode de la Communauté Européenne [19]. Leprincipe de cette méthode est basé sur une métha-nolyse en milieu basique. Ils sont préparés par uneagitation vigoureuse d’une solution contenant 0,2 gd’huile dans 3 ml d’hexane avec 0,4 ml de KOHméthanolique (2N). Les esters méthyl iquesrécupérés dans la phase supérieure, avec uneseringue sont injectés dans un chromatographe enphase gazeuse (Shimadzu) dont les conditions opé-ratoires sont résumées ci-après:- Colonne capillaire (50 m de longueur, 0,25 mm

de diamètre interne, 0,25 µm d’épaisseur);- Température de la colonne: gradient de tempéra-

ture de 160 °C à 220°C à raison de 4°C/min. - Détecteur FID (température 240 °C);- Température de l’injecteur 160°C;- Gaz vecteur: Hydrogène

La méthode de Satue et al. [20], a été utiliséepour l’extraction et le dosage des composés phé-noliques. L’extraction à partir d’un échantillon de 5g d’huile dissoute dans l’hexane a été faite avec duméthanol aqueux (80:20, v/v). L’extrait phénoliquedans l’éthanol (0,2 ml) est additionné d’un ml deréactif de Folin–Ciocalteu (dilué au 1/10) et 0,8 mlde carbonate de sodium (7,5 %, p/v). Après untemps de séjour à l’obscurité, la lecture des absor-bances est effectuée à 765 nm en utilisant l’acidegallique comme étalon.

La teneur en caroténoïdes a été déterminée parsimple lecture de l’absorbance à 450 nm de l’échan-tillon préparé (1 g d’huile dissous dans 9 ml d’hexa-ne). Le β- c a rotène a été utilisé comme étalon [21].

L’analyse sensorielle (panel test) a été eff e c t u é eau laboratoire de l’Istituto de l’Olivicoltura de

Rende-Cosenza (Italie) par un jury composé de 10personnes. La méthode utilisée est celle adoptéepar la Communauté Européenne [19]. Le test pré-voit l’évaluation des caractéristiques positives etnégatives et une évaluation globale avec l’expre s-sion d’un score sur une échelle à neuf points.

Traitement statistique des résultats Traitement statistique, comportant une analyse de

variance et le test de Newman et Keuls pour établirune comparaison intergroupe des moyennes obte-nues. Le logiciel utilisé est le Staticf. Les coefficientsde corré lat ion sont établis avec le logiciel«Statistica».

RÉSULTATS ET DISCUSSION

Indice de maturité et taux d’infestation L’indice de maturité a été 3,02, 3,50 et 4,16 pour

respectivement Chemlal, Bouchouk et A z z e r a d j.Ces valeurs font apparaître les caractéristiques dematuration de chaque variété; la variété Chemlal estla p lus tardive et A z z e r a d j la plus précoce.Concernant leur attaque par la mouche de l’olive, lavariété A z z e r a d j (à gros fruits: 4-5 g) avec 80 %d’infestat ion est la plus attaquée, suiv ie parBouchouk (fruits de cal ibre moyen: 3-4 g) etChemlal (petits fruits: de 1, 4 à 2 g) avec des tauxd’attaque respectivement de 56 % et 54 %.

Les donnés obtenues rejoignent l’observation deGumssay et al. [12] qui constataient que lesvariétés ayant des fruits de forme circulaire sont lesplus attaquées: en effet le cultivar le plus sensible aété Azzeradj qui présente des olives de forme circu-laire, alors que les autres présentent des fruits avecdes formes ovoïdes. En plus, les mêmes donnéesindiquent que l’attaque de la mouche a été plusimportante pour les variétés précoces, ce qui est ennette contradiction avec les résultats de Affelah etal. [13] qui estimaient que les variétés les plus pré-coces sont les moins attaquées. Pro b a b l e m e n t ,comme a été suggéré par Iannotta et al. [14], desfacteurs génétiques sont à la base de la différenterésistance des cultivars à l’attaque de la mouche.

Rendement en huileL’évolution du rendement en huile en fonction de

l’attaque des olives par la mouche est donnée dans leTableau I. L’analyse de la variance montre une influen-ce significative de l’attaque sur le rendement en huile.


106

Une corrélation négative (-0,97) a été notée entrele taux d’attaque et le rendement en huile. Des per-tes de l’ord re de 12,32%, 16,56% et 12,99 %,respectivement pour les variétés Chemlal, Azzeradj

et Bouchouk pour un taux d’attaque de 100% ontété notées. Nos résultats sont comparables à ceuxtrouvés par Cimato [3] et Gaouar [22], qui ont notédes pertes de l’ordre de 14,81% et 13,59% respec-tivement. La disparition de l’huile est liée essentiel-lement au développement de la larve qui consom-me une partie de la pulpe.

Les indices chimiquesL’attaque des olives par B. oleae influence signifi-

cativement l’acidité. La comparaison intergroupe faitressortir des diff é rences significatives entre les diff é-rents échantillons pour la même variété. Les résultatsindiqués dans le Tableau II montrent que l’aciditéaugmente au fur et à mesure que le taux d’attaqueévolue pour atteindre des valeurs supérieures à0,8%, valeur limite pour la catégorie extra viergeselon le COI, pour des taux d’attaque de 100 %.

Comparée à celle de l’huile tirée des fruits sains,l’acidité de l’huile issue des échantillons attaqués à

100% est multipliée par un coefficient de 4,05, 3,8et 2,49, respectivement pour les variétés Azzeradj,C h e m l a l et B o u c h o u k. Un taux d’attaque de 40%de la variété B o u c h o u k entraîne un déclassementde l’huile obtenue de la catégorie extra-vierge à lacatégorie vierge, alors que des taux d’attaque de100% sont nécessaires pour entraîner un teldéclassement pour les deux autres var iétés(C h e m l a l et A z z e r a d j). Les trous de sortie de lamouche entraînent une pénétration et un dévelop-pement des bactéries et des champignons qui vontentraîner l’endommagement et la destruction destissus de la pulpe d’olive. D’autre part des bactériessymbiotiques sont également transmises à l’olivelors de la ponte des œufs [23].

Les principaux microorganismes qui s’y dévelop-pent, selon To r re s - Villa et al. [24] sont des bactéries(X a n t h o m o n a s), des levures (To r u l o p s i s) et à undegré moindre les moisissures (Penici ll ium et

F u s a r i u m). L’augmentation de l’acidité se fait suite àl’activation des enzymes hydrolytiques et l’activitélipolytique des microorganismes. Nos résultats re j o i-gnent ceux de plusieurs auteurs, notammentA n g e rosa et al. [6], Delrio et al. [8], Pereira et al. [11].Ces derniers ont noté des variations plus faibles enfonction de l’attaque pour trois variétés portugaises.

L’indice de peroxyde qui est relié directement à l’au-to oxydation évolue de façon similaire à l’acidité.Toutefois les valeurs atteintes ne dépassent pas lalimite fixée par le COI qui est de 20 meq d’O2/kg. Descorrélations significatives (r >0.90) ont été notéese n t re l’attaque et l’indice de peroxyde pour les échan-tillons des trois variétés. L’augmentation de cet indiceest confirmée par celle du coefficient d’extinction à232 nm (Tableau III) à la suite de la formation de diè-nes conjugués. La production de triènes conjuguésdue à la formation des produits secondaires pardécomposition des hydro p é roxydes est re s p o n s a b l e

Tableau I - Évolution du re n d e m e nt en huile (en %/ ms) en fonct i o ndu taux d’attaque des olives des va r i é tés Ch e m l a l, Az ze radj et Bo u c h o u k

% d’attaque Chemlal Azzeradj Bouchouk

Sain 39,75±0,64 (a) 38,00±0,45 (a) 44,25±0,08 (a)

Attaqué 20% 38,70±0,14 (b) 37,65±0,21 (a) 44,05±0,21 (a)

Attaqué 40 % 38,30±0,28 (b) 35,55±1,34 (b) 43,53±0,11 (a)

Attaqué 60% 37,05±0,49 (bc) 34,60±0,71 (b) 42,65±0,07 (b)

Attaqué 80% 36,15±0,49 (d) 32,80±0,57 (c) 40,35±0,07 (c)

Attaqué 100% 34,85±0,07 (e ) 31,70±0,57 (c) 38,50±0,71 (d)

Les moyennes suivies d’une même lettre dans une même colonne indiquent une

différence non significative à p <0,05

Tableau II - Acidité libre et indice de peroxydes des huiles issues des olives des variétés Chemlal, Azzeradj et Bouchouk à différent taux d’attaque

Acidité (% en acide oléique) Indice de peroxyde (meq d’O2/kg)

Chemlal Azzeradj Bouchouk Chemlal Azzeradj Bouchouk

Sain 0,21 ± 0,02 (g) 0,26±0,02 (f) 0,53±0,04(e) 5,4 ± 04 (e) 8,0± 0,1 (e) 5,8±0,5(c)

Atta.20% 0,25±0,01 (f) 0,34± 0,01 (e) 0,72±0,04 (d) 5,8 ± 0,3 (de) 9,8±0,3 (d) 7,0±0,7 (b)

Atta.40% 0,30± 0,01 (e) 0,52±0,01 (d) 1,0±0,04 (c) 6,5± 0,1 (cd) 10,7± 0,3 (c) 8,0±0,3 (b)

Atta.60% 0,49± 0,01 (c) 0,60± 0,02 (c) 1,12±0,02 (b) 7,5 ± 0,7 (c) 11,0±0,1 (c) 9,0±0,1 (ab)

Atta.80% 0,62± 0,0 1(b) 0,72 ± 0,01 (b) 1, 29±0,08 (a) 9,8± 0,3 (b) 12,8± 0,3 (b) 9,25±0,3 (ab)

Atta.100% 0,80 ± 0,01 (a) 1,05± 0,02 (a) 1,32±0,08 (a) 10,5± 0,7 (a) 17,3±0,3 (a) 10±0,1 (a)

Les moyennes suivies d’une même lettre dans une même colonne indique une différence non significative à p <0.05


107

de l’augmentation de l’absorbance à 270 nm.L’évolution de nos résultats est comparable à celledes résultats d’Angerosa et al. [6]; Delrio et al. [8];Kyriakidis et Dourou [9] et en contradiction avec lestravaux de Pereira et al. [11] qui avaient noté une sta-bilité des coefficients d’extinction.

Composition en acides grasQualitativement, la composition en acides gras est

s i m i l a i re pour les diff é rents échantillons des tro i svariétés. Sur le plan quantitatif, les résultats (Ta b l e a uIV) montrent une nette prédominance de l’acide oléi-que particulièrement pour la variété A z z e r a d j. Lesacides palmitique et linoléique sont présents enquantités appréciables. Globalement, les résultatsm o n t rent une tendance à la diminution de l’acideoléique en fonction du taux d’attaque et ce pour lest rois variétés. L’ e ffet de l’attaque se répercute surl’évolution du rapport acides gras insaturés sur aci-des gras saturés. Toutefois, nous estimons que lesvariations entraînées dans la composition en acidesgras sont très minimes pour qu’elles servent d’indi-cateur à l’évolution de l’attaque par la mouche del’olive. Nos résultats se situent dans l’intervalle deslimites établies par le COI et corro b o rent ceuxt rouvés par Pereira et al. [11].

Les composés phénoliques et les caroténoïdes Malgré un système d’extraction pénalisant (cen-

trifugation à trois phases), la teneur en composésphénoliques des échantillons témoins (sains) sesitue dans l’intervalle 20 à 500 ppm rapporté parPerrin [25]. Les composés phénoliques, qui sontdes puissants antioxydants, paraissent les plusinfluencés par la mouche de l’olive. Des différencessignificatives ont été notées entre les diff é re n t séchantillons. Pour un taux d’attaque de 100%, des

pertes de l’ordre de 67,58 %, 66,9 % et 59,82 %respectivement pour les variétés Azzeradj, Chemlal

et B o u c h o u k ont été enregistrées. Nos résultatssont comparables à ceux de la plupart des auteursdont Angerosa et al. [6], Delrio et al. [8]. Des pertese n c o re plus importantes ont été enregistrées parParlati et al [26]. Une corrélation très étroite (-0,99)a été observée entre l’attaque et les composésphénoliques (Figure 1).

La diminution remarquable de la fraction phénoli-que serait liée 1) à une plus grande activité despolyphénoloxydases favorisée par la destructiondes tissus de la pulpe, 2) à l’exposition de la pulpeaux facteurs externes. Les pertes en composésphénoliques se traduisent en une perte de stabilitédes huiles au cours de leur stockage [11].

La teneur en caroténoïdes diminue au fur et àm e s u re que l’attaque augmente, ce qui entraîneune modification de la couleur de l’huile issue desolives très attaquées comparativement aux huilesissues des échantillons sains.

Analyse sensorielleLes résultats obtenus (Tableau V) ont fait ressortir

l’appartenance des huiles issues des olives saines àla meilleure catégorie dénommée «extra-vierge».L’huile de la variété Chemlal a présenté un pro f i lorganoleptique assez équilibré en attributs positifs:fruité, piquant et amer. La variété Azzeradj était pluspiquante et amère, alors que la variété Bouchouk adonné une huile avec des caractéristiques intermé-diaires. L’influence de l’attaque sur la qualité orga-noleptique a été significative. Un taux d’attaqueseulement de 20 % suffit pour entraîner un déclas-sement de l’huile de la variété Azzeradj de la caté-gorie extra-vierge à la catégorie vierge, alors quedes taux de 40% sont nécessaires pour entraîner le

Tableau III - Extinction spécifique à l’ultraviolet des huiles issues des olives des variétés Chemlal, Azzeradj et Bouchouk à différent taux d’attaque

Absorbance à 232 nm Absorbance à 270 nm

Chemlal Azzeradj Bouchouk Chemlal Azzeradj Bouchouk

Sain 1,74 ± 0,01 (f ) 1,56 ± 0,03 (e) 1,92±0,04(e) 0,08 ±0,00 (c) 0,18± 0,01 (e) 0,12±0,00 (c)

Atta.20% 1,86± 0,01(e) 1,63± 0,03 (d) 2,01±0,01 (d) 0,09 ± 0,00 (b) 0,21± 0,01 (d) 0,13±0,01 (c)

Atta.40% 1,89± 0,01 (d) 1,84± 0,01 (c) 2,14±0,01 (c) 0,09±0,00 (b) 0,22± 0,01 (d) 0,15±0,01 (b)

Atta.60% 2,25± 0,01 (c) 1,79 ± 0,01(c) 2,16±0,04 (c) 0,10± 0,01 (b) 0,24 ± 0,01 (c) 0,16±0,01 (b)

Atta.80% 2,20±,01 (b) 1,85±0,02 (b) 2,26±0,01 (ab) 0,12 ±0,00 (a) 0,26 ±0,01 (b) 0,16±0,01 (b)

Atta.100% 2,70±0,02 (a) 2,09 ± 0,01 (a) 2,32±0,04 (a) 0,13 ±0,01 (a) 0,29±0,01 (a) 0,19 ±0,0 1(a)

Les moyennes suivies d’une même lettre dans une même colonne indiquent une différence non significative à p <0.05


108

Tableau IV - Composition en acides gras (% des acides gras totaux) des huiles issues des olives des variétés Chemlal, Azzeradj et Bouchouk à diffé-rent taux d’attaque

Chemlal

Attaque % Sain 20 40 60 80 100

C14 :0 Traces Traces Traces Traces Traces traces

C16:0 13,04 ± 0,23 13,93 ±0,40 14,42 ± 0,50 14,78 ±0,01 14,78 ± 0,45 15,14 ±1,06

C16:1 1,54 ± 0,08 1,57 ± 0,06 1,85 ± 0,21 1,87 ± 0,05 1,68 ± 0,03 1,79 ±0,02

C17:0 0,05 ± 0,0 0,02 ± 0,00 0,06 ± 0,02 0,07 ± 0,04 0,08 ± 0,01 0,06 ± 0,01

C17:1 0,12 ± 0,01 0,09 ± 0,01 0,10 ± 0,01 0,12 ± 0,04 0,11 ± 0,01 0,10 ± 0,01

C18:0 2,16 ± 0,05 2,01 ± 0,01 2,11 ± 0,04 2,12 ± 0,06 2,12 ± 0,06 2,0 8± 0,02

C18:1 68,91 ± 0,29 67,90 ±0,13 67,33±0,22 67,41 ± 0,42 67,16 ± 0,18 66,94 ± 0,70

C18:2 12,42 ± 0,11 12,63 ± 0,32 12,31 ± 0,16 11,97 ±0,31 11,95 ± 0,23 11,91± 0,29

C20:0 0,47 ± 0,02 0,44 ± 0,01 0,44 ± 0,04 0,39 ± 0,01 0,44 ± 0,02 0,41 ± 0,05

C18:3 0,64 ± 0,02 0,65 ± 0,03 0,67 ± 0,03 0,62 ± 0,02 0,62 ± 0,02 0,62 ± 0,02

C20:1 0,38 ± 0,01 0,36 ± 0,02 0,39 ± 0,01 0,33 ± 0,01 0,35 ± 0,03 0,34 ± 0,04

C22:0 0,15 ± 0,01 0,13 ± 0,01 0,17 ± 0,04 0,12 ± 0,01 0,15 ± 0,02 0,13 ± 0,01

C24:0 Traces Traces Traces traces Traces traces

AGI/AGS 5,28 ± 0,07 5,01 ± 0,14 4,80 ± 0,13 4,71± 0,18 4,66 ± 0,12 4,38 ±0,08

Azzeradj

Attaque % Sain 20 40 60 80 100

C14:0 Traces Traces Traces traces Traces traces

C16:0 9.87±0.10 9.90±0.14 9.92±0.03 10.20±029 10,27±0.29 10.20±0.33

C16:1 0,74±0.02 0,73±0.05 0,65±0.06 0,69±0.05 0,65±0.08 0.56±013

C17:0 0,29±0.00 0,25±0.01 0,28±0.07 0,26±0.05 0,25±0.01 0,23±0.01

C17:1 0,40±0.02 0,36±0.01 0,35±0.02 0,33±0.01 0,37±0.02 0,35±0.01

C18:0 2,90±0.09 2,83±0.04 2,96±0.15 2,97±0.12 2,85±0.12 3,02±0.06

C18:1 74.54±0.14 74.29±0.26 74.15±0.21 74.06±0.08 73,64±0.19 73,43±0.20

C18:2 9,41±0.03 9,55±0.13 9,63±0.04 9,52±0.11 9,69±0.33 9,535±0.32

C20:0 0,51±0.03 0,52±0.06 0,58±0.01 0,60±0.09 0,59±0.09 0,64±0.02

C18:3 0,62±0.04 0,64±0.04 0,67±0.04 0,67±0.01 0,65±0.02 0,65±0.07

C20:1 0,34±0.01 0,35±0.02 0,37±0.01 0,38±0.03 0,35±0.01 0,36±0.04

C22:0 0,12±0.02 0,14±0.03 0,17±0.01 0,18±0.02 0,16±0.03 0,2±0.03

C24:0 Traces Traces Traces traces traces traces

AGI/AGS 6,26±0,12 6,28±0,02 6,22±0,22 6,05±0,13 6,03±0,02 5,94±0,22

Bouchouk

Attaque % Sain 20 40 60 80 100

C16:0 12,22±0,19 12,11±0,14 12,42±0,14 12,65±0,07 12,45±0,07 12,73±0,10

C16:1 1,76±0,05 1,86±0,05 1,86±0,05 2,07±0,09 2,01±0,02 1,93±0,11

C17:0 0,16±0,00 0,17±0,04 0,17±0,01 0,19±0,02 0,18±0,01 0,19±0,01

C18:0 2,71±0,08 2,88±0,05 2,85±0,07 2,88±0,06 3,06±0,08 2,93±0,08

C18:1 71,47±0,46 71,22±0,31 71,33±0,24 70,64±0,22 70,52±0,39 70,07±0,52

C18:2 9,73±0,11 9,85±0,07 9,68±0,07 9,78±0,14 9,56±0,06 9,72±0,12

C20:0 0,39±0,01 0,35±0,03 0,34±0,02 0,32±0,02 0,33±0,03 0,34±0,02

C18:3 0,98±0,03 0,94±0,03 0,94±0,04 0,89±0,04 0,91±0,05 0,94±0,02

C20 :1 0,26±0,01 0,25±0,00 0,28±0,03 0,24±0,02 0,26±0,02 0,27±0,02

C22:0 Traces Traces Traces Traces Traces Traces

C24:0 0,12±0,01 0,11±0,00 0,13±0,01 0,12±0,00 0,11±0,00 0,14±0,01

AGI/AGS 5,39±0,02 5,38±0,08 5,27±0,02 5,17±0,04 5,16±0,11 5,07±0,08


109

même déclassement des hui les des variétésChemlal et Bouchouk.

Les taux d’attaque élevés (60%) engendrent la pro-duction d’huile de qualité médiocre. Les défauts lesplus re m a rqués ont été «ver», lié à la mouche de l’oli-ve, et rance. La dépréciation de la qualité organolep-tique a été signalée par plusieurs auteurs dont

M o n t e d o ro [4], Angerosa et al. [6], même si le seuilde la modification a été diff é remment quantifié et lié àla variété. Angerosa et al. [6] trouvent que des tauxde l’ord re de 50 % sont nécessaires pour un déclas-sement de la qualité de l’huile de la catégorie extra-vierge à la catégorie vierge pour les variétés italien-nes Coratina et N e b b i o. Iannotta et al. [14] avancent

Figure 1 – Evolution des composés phénoloques en fonction du taux d’attaque des olives des varietés Azzeradj, Chemlal et Bouchouk

Tableau V - Évolution des composés phénoliques, des caroténoïdes et de l’évaluation organoleptique des huiles issues des olives des variétésChemlal, Azzeradj et Bouchouk à différents taux d’attaque

Teneur en composés phénoliques (ppm) Teneur en caroténoïdes (ppm) Qualité organoleptique

Chemlal Azzeradj Bouchouk Chemlal Azzeradj Bouchouk Chemlal Azzeradj Bouchouk

Sa i n 278,0±6,39 (a) 2 90,0± 6,99(a) 176±4,76 (a) 5,05 ± 0,07 (a) 5,73± 0,05(a) 6 , 9 0 ± 0 , 2 6 ( a ) E xt ra - E xt a - E xt ra -

v i e rg e v i e rg e v i e rg e

Atta. 20 % 234,4± 3,47 b) 264,8± 7,95 (b) 143±3,53 (b) 4,47 ± 0,20 (b) 5,52± 0,07 (b) 6 , 8 ± 0 , 2 0 ( a ) E xt ra - Vi e rg e E xt ra -

v i e rg e v i e rg e

Atta. 40% 195,6± 9,70 (c ) 222,8 ±7,6 (c ) 133±5,05 (b) 4,22±0,49 (b) 4,20±0,13 (c ) 6,55±0,14 (b) Vi e rg e Vi e rg e Vi e rg e

Atta. 60% 161,6±2,52 (d ) 190,3± 10,0 (d ) 115± 4,4(c ) 4,14 ± 0,03 (c ) 4,66± 0,27 (c ) 5,40 ±0,28(b) Vi e rg e Vi e rg e Vi e rg e

Atta. 80% 115 ,0 ±8,5 (e ) 130,0± 7,21 (e ) 88,2±3,70 (d ) 3,60 ± 0,06 (d ) 3,65± 0,17 (d ) 4,93±0,08 (c ) Vi e rg e Vi e rg e Vi e rg e

co u ra nte

Atta. 100% 98,0± 4,2 (f) 94,0± 2,93 (f) 70,7±1,85 (e ) 3,51± 0,01 (e ) 3,79 ± 0,07 (d ) 4,90±0,25 (c ) Vi e rg e Vi e rg e Vi e rg e

co u ra nte co u ra nte

* Les moyennes dans une même colonne suivies d’une même lettre indiquent une différence non significative à p<0,05


110

un intervalle de 25% à 50% d’attaque pour plusieursvariétés. Nos résultats confirment la dépendance dudommage organoleptique de la variété.

CONCLUSION

Les résultats obtenus montrent la sensibilité de lavariété A z z e r a d j à l’attaque par B. oleae par rapportaux deux autres variétés Chemlal et B o u c h o u k.L’ h y d rolyse et l’oxydation ont représenté les principa-les réactions qui se produisent avec une intensitéplus re m a rquable pour la variété A z z e r a d j. Lesp a r a m è t res de qualité, acidité libre, indice de pero x y-des et absorbances en UV, ont été influencés négati-vement par l’attaque de la mouche. La qualité orga-noleptique est compromise par des attaques de l’or-d re de 20 – 40% qui vont à déterminer un déclasse-ment de l’huile de la catégorie extra-vierge à la caté-gorie vierge respectivement pour la variété A z z e r a d j

(20%) et les autres (40%). L’attaque des olives par lamouche réduit considérablement la teneur en com-posés phénoliques et par conséquent la stabilité del’huile à l’oxydation d’une façon proportionnelle àl’importance de l’attaque. En plus des modificationsqualitatives et de la couleur des huiles, il se pro d u i tune nette diminution du rendement en huile.

BIBLIOGRAPHIE

[ 1 ] A. Bueno, O. Jones, Alternative methods for con-t rolling the olive fly, Bactrocera oleae, involvingsemio-chemicals. Bulletin of Intern a t i o n a lOrganization of Biological Contro l 2 5, 1-10 (2002)

[2] S. Michaelakis, Influence des ravageurs et desmaladies sur la quantité et la qualité de l’huiled’olive. Olivae 30, 38-40 (1990)

[3] A. Cimato, La qualité de l’huile d’olive vierge etles facteurs agronomiques. Olivae 3 1, 20-31(1990)

[4] F. Montedoro, L. Garofolo, A. Sensidoni,Infestazione di olive da Dacus oleae e caratte-ristiche qualitative degli oli vergini. Riv. Ital.Sostanze Grasse 62, 565-567 (1985)

[5] S. Longo, M. V. Parlati, D. Benefatto, A Russo,Studies on relationships among Dacus oleae

infestation, fruit removal penetration re s i s t a n-ce, and physical-chemical characteristic ofoils. Acta Horticulturae 286, 379-382 (1990)

[6] F. Angerosa, L. Di Giacinto, M. Solinas,Influence of Dacus oleae infestation on flavour

of oils, extracted from attacked olive fruits, byHPLC and HRGC analyses of volatile com-pounds. Grasas Aceites 43, 134-142 (1992)

[7] F. Evangelisti, P. Zunin., C. Calcagno, E.Tiscornia, R. Petacchi, Dacus oleae infestationand its consequences on the phenolic com-pounds of virgin olive oil. Riv. Ital. SostanzeGrasse 71, 507-511(1994)

[8] G. Delrio , A. Lentini ,V. Vacca, G. Serra,Influenza dell’infestazione di Bactrocera oleae

(Gmel) sulla produzione e sulle caracteristichequalitative dell’olio di oliva. Riv. Ital. SostanzeGrasse 72, 5-9 (1995)

[9] N. B. Kyriakidis, E. Dourou, Effect of storageand Dacus infection of olive fruits on the qua-lity of the produced virgin olive oil. J. FoodLipids 9, 47-57 (2002)

[10] A. Tamendjar i, M.M. Bellal, R. Lar ib i F.Angerosa, Impact de l’attaque de Bactrocera

oleae et du stockage des olives de la variétéChemlal sur la qualité de l’huile. Riv. Ital.Sostanze Grasse 81, 23-27 (2004)

[11] J. A. Pereira, M. R. Alves, S. Casal, M. B. P. P.Oliveira, Effect of olive fruit fly infestation onthe quali ty of ol ive oi l f rom cul tivarsCobrancosa, Madural and Verdial transmonta-na. Ital. J. Food Sci. 16, 355-365 (2004)

[ 1 2 ] B. Gumassay, U. Ozilbey, G. Ertem, A. Oktar,Studies on the susceptibility of some importanttable and oil olive cultivars of Aegean region toolive fly (Dacus oleae Gmel.) in Tu r k e y. ActaHorticulturae 2 8 6, 359-362 (1990)

[13] M. Afellah, C. Smaili, I. Ben Hamadi, A. Hillal,M. Chemsseddine, Influence de la variété etdu type de piège sur la courbe des vols de lamouche de l’olive Bactrocera oleae G m e l .dans la région de Ain Toujdate au Maro c .Ecologia Mediterranea 23, 57-64 (1997)

[14] N. Iannotta, E. Perri, C. Occi, F. Zaffina, Thebehaviour of diff e rent olive cultivars followingattacks by B. oleae (Gmel) . ISHS ActaHorticulturae 474, 545-548 (1999)

[15] M. Uceda, L. Frias, Epocas de re c o l e c c i o n .Evolucion del contenido graso del fruto y de lacomposicion y calidad del aceite. ProceedingsII Seminario oleicolo Internacional. Cord o b a ,Spain, 1975

[16] J.M. Garcia, S. Seller, M. C. Pere z - C a m i n o ,Influence of fruit ripening on olive oil quality. J.Agric. Food Chem. 44, 3516-3520 (1996)


111

[17] U . I . C . P.A, Méthodes d’analyses des matière sgrasses et dérivées. 6éme édition. EditionETIG. Paris, 1979

[18] Conseil Oléicole International (C.O.I.). Analyses p e c t rophotométrique dans l’ultraviolet.COI/T20/Doc. N°19 du 6 juin 1996

[19] Communauté Européenne (CE) Journal Officielde la Commission de la CommunautéE u ropéenne. Règlement CEE N°2568/91,L248, 5 septembre 1991.

[20] M. T. Satue, S. Huang, E. N. Frankel, Effect ofnatural antioxidants in virgin olive oil on oxida-tive stability of refined, bleached, and deodori-zed olive oil. J. Am. Oil. Chem. Soc. 72, 1131-1137 (1995)

[21] A. Rougereau, Les vitamines. In B. Deymie, J.Multon, D. Sinon, Technique d’analyse et decontrôle dans les industries agro-alimentaires.Ed. Technique et Documentation, Lavoisier,Paris, 1981, pp.245-263

[22] N. Gaouar, Apport de la biologie des popula-tions de la mouche d’olive Bactrocera oleae àl’optimisation de son contrôle dans la région

de Tlemcen. Thèse de Doctorat d’état.Université de Tlemcen, Algérie, 1996.

[23] A. Crovetti, La défense phytosanitaire: déve-loppement de méthodologies et sauvegard ede la production et de l’environnement. InE.Fedeli (ed.) Encyclopédie Mondiale deL’olivier. Plaza et Janes, Barcelone, 1997, pp.225-239.

[24] L. M. Torres-Villa, M. C. Rodriguez-Molina, J. A.Martinez, Effectos del dano de la mosca delolivo y del atroje sobre la microflora en pasta yla acidez del aceite virgen de oliva. GrasasAceites 354, 285-294 (2003)

[25] J.L. Perrin, Les composés mineurs et lesantioxygènes naturels de l’olive et de sonhuile. Rev. Franç. Corps Gras 3 9, 25-32(1992)

[ 2 6 ] M. V. Parlati, N. Iannotta, La qualita dell’olio inrapporto alla difesa de B. oleae (Gmel). Atti con-vegno «techniche, norme e qualità in olivicoltu-ra», Potenza, Italie 15-17 Décembre 1993.

Ricevuto 18 dicembre 2008, accettato 29 gennaio 2009


112

I PRODOTTI DEPIGMENTANTI CONTENGONO SOSTANZE FUNZIONALI IN GRADO DI BLOCCARE O INIBIRE LAS I N T E S I D I M E LA N I NA CO N D I V E R S I M E C CA N I S M I D I A Z I O N E. L'I D RO CH I NO N E, I N PA R T I CO LA R E, P U ÒAGIRE SIA BLOCCANDO LA MELANOGENESI COME SUBSTRATO ALTERNATIVO DELLA TIROSINASI, SIA COMEAGENTE CITOTOSSICO SELETTIVO PER I MELANOCITI. L'IMPIEGO DELL'IDROCHINONE SI ASSOCIA SPESSO AF E NO M E N I I R R I TAT I V I E P R E S E N TA I L R I S CH I O D I TO S S I C I TÀ CO R R E LATO A L L'U S O P RO LU NGATO. DA L2001 NE È STATO BANDITO L’USO COME AGENTE PER SCHIARIRE LOCALMENTE LA PELLE. TUTTAVIA, SONOSPESSO SEGNALATI SUL MERCATO EUROPEO, E QUINDI ANCHE IN ITALIA, PRODOTTI COSMETICI DI IMPOR-TAZIONE ILLEGALE UTILIZZABILI COME SCHIARENTI CUTANEI. È STATO QUINDI SVILUPPATO UNO STUDIO SUP RO D OT T I CO S M E T I C I D E P I G M E N TA N T I S I A P E R LA V E R I F I CA D I P O S S I B I L I A LT E R A Z I O N I D E L LA Q UA L I TÀMICROBIOLOGICA, SIA PER LA DETERMINAZIONE DI EVENTUALI CONCENTRAZIONI DI IDROCHINONE UTILIZ-ZANDO ANCHE UN METODO ALTERNATIVO “GREEN” IN PARALLELO A QUELLO UFFICIALE DI RIFERIMENTO. DA L P U N TO D I V I STA M I C RO B I O LO G I CO, S O NO E M E R S E CO N D I Z I O N I VA R I A B I L I D I STA B I L I TÀ E P U R E Z Z AMICROBIOLOGICA IN FUNZIONE ANCHE DELLE CONDIZIONI DELLA CONFEZIONE (SIGILLATA O GIÀ APERTA).LE CARATTERISTICHE DI QUALITÀ MICROBIOLOGICA DEI COSMETICI ANALIZZATI ERANO MEDIAMENTE ACCET-TA B I L I, S E I P RO D OT T I E R A NO A S S I M I L AT I A P R E PA R A Z I O N I FA R M AC E U T I CH E P E R U S O TO P I CO.DI V E R SA M E N T E, S U L LA BA S E D E L L E D E T E R M I NA Z I O N I D E L L’I D RO CH I NO N E, U N’A LTA P E RC E N T UA L E D IP RO D OT T I (88%) CO N T E N E VA, N E L LA FO R M U LA Z I O N E, I L CO M P O STO, R A P P R E S E N TA N D O Q U I N D I U NR I S CH I O P E R LA SA LU T E. L’A NA L I S I CO N I D U E M E TO D I I N PA R A L L E LO H A D I M O ST R ATO LA CO M P L E TASOVRAPPONIBILITÀ DEI DUE PROTOCOLLI SPERIMENTALI. IL METODO ALTERNATIVO – “METODO GREEN” SIÈ DIMOSTRATO UNA VALIDA SOLUZIONE PER LA VERIFICA DELLA EVENTUALE PRESENZA DI IDROCHINONEIN PRODOTTI COSMETICI.PAROLE CHIAVE: AGENTI DEPIGMENTANTI, COSMETICI, IDROCHINONE, MICRORGANISMI

CHEMICAL-MICROBIOLOGICAL SAFETY OF A CLASS OF COSMETICS: THE SKIN DEPIGMENTANTAGENTSHYDROQUINONE, AS A BLEACHING AGENT, HAS BEEN USED FOR MANY YEARS TO REDUCE PIGMENTATIONBY AC T I NG O N M E LA N I N P RO D U C I NG C E L LS. TH I S AC T I O N CA N D E ST ROY T H E P I G M E N T M A K I NG C E L LS(MELANOCYTES) AND ALTER THE STRUCTURE OF MELANOSOMES.HYDROQUINONE WAS BANNED IN JANUARY 2001 IN COSMETICS SUCH AS CREAMS FOR SKIN LIGHTE-NING BECAUSE OF THE POTENTIAL DAMAGE THEY CAN DO TO THE SKIN IN TERMS OF SKIN SENSITIZATIONA N D I R R I TAT I NG. TO P I CA L LY A P P L I E D H Y D RO Q U I NO N E-CO N TA I N I NG C R E A M S CO U L D A LS O CAU S E D NADAMAGE AND MUTATIONS. SIGNIFICANT IMPORTATION OF HYDROQUINONE CREAMS STILL OCCURS FROM COUNTRIES WHERE IT IS YETTO BE BANNED AND A STRONG BLACK MARKET TRADE EXISTS IN EUROPE AND IN ITALY.TH E IST I T U TO SU P E R I O R E D I SA N I TÀ S E T U P A ST U DY O N D E P I G M E N TA N T CO S M E T I C S I N O R D E R TOCHECK THEIR POSSIBLE MICROBIAL CONTAMINATION AND TO VERIFY, IF EXISTING, THE HYDROQUINONECONCENTRATIONS USING IN PARALLEL TWO METHODS, AN ALTERNATIVE “GREEN” METHOD, USING ETHA-NOL AS A SOLVENT, AND THE REFERENCE METHOD, NOT FRIENDLY FOR ENVIRONMENT. RESULTS OBTAI-NED ANALYZING 25 BLEACHING PRODUCTS, ILLEGALLY SOLD ON ITALIAN MARKET, ARE PRESENTED. WITH REFERENCE TO MICROBIOLOGICAL CHARACTERISTICS, A VARIABLE STABILITY WAS OBSERVED ACCOR-DING TO THE TYPE OF THE PACKAGE (STILL SEALED OR ALREADY OPEN). THE MICROBIAL QUALITY WASON THE AVERAGE ACCEPTABLE, IF PRODUCTS WERE EQUATED TO DRUGS FOR TOPICAL USE. CONVERSELY, AHIGH PERCENTAGE OF COSMETICS (88%) CONTAINED THE COMPOUND, THUS REPRESENTING AN HEALTHR I S K FO R CO N S U M E R S. TH E R E S U LTS O B TA I N E D W I T H BOT H M E T H O D S W E R E OV E R LA P P I NG A N D T H EALTERNATIVE “GREEN” METHOD COULD BE A VALID SOLUTION FOR THE DETERMINATION OF HYDROQUI-NONE IN COSMETICS.KEY WORDS: BLEACHING AGENTS, COSMETICS, HYDROQUINONE, MICROORGANISMS

La sicurezza chimico-microbiologica di una classe di prodotti cosmetici:

i depigmentanti cutanei

*L. GAGLIARDI, *D. DE ORSI,**R. BRIANCESCO, **S. DELLA LIBERA,**G. DONATI, **M. SEMPRONI,**L. BONADONNA

* DI PA R T I M E N TO D E L FA R M ACO, IST I T U TO

SUPERIORE DI SANITÀ, ROMA

** DI PA R T I M E N TO D I AM B I E N T E E

CO N N E S SA PR E V E N Z I O N E PR I M A R I A,ISTITUTO SUPERIORE DI SANITÀ, ROMA


113

INTRODUZIONE

Il colore della pelle, diverso in funzione del sesso edella razza, delle regioni corporee e dell'età, è dovutoalla presenza di alcuni pigmenti, il più importante deiquali è la melanina, prodotta da cellule specializzatesituate nell’epidermide e denominate melanociti [9].L’assenza di melanociti o, più frequentemente, la loroincapacità di sintetizzare la tirosinasi, enzima cupro-p roteico caratteristico dei melanociti e in grado dic a t a l i z z a re l’ossidazione di mono e di-idrofenoli aortochinoni, è alla base di alcune patologie.

Esistono, tuttavia, anche sostanze funzionali ingrado di bloccare o inibire la sintesi della melanina [4].

È il caso dell’idrochinone [C6H4( O H )2], compostofenolico della famiglia degli alcoli aromatici sensibileall’ossidazione in presenza di alte concentrazioni diossigeno, di luce e ioni metallo. La molecola si ritro v anell’ambiente come composto di sintesi e come pro-dotto naturale sintetizzato da microrganismi, piante eanimali. Non sono tuttavia osservati fenomeni di bioac-cumulo perché nelle acque la sua degradazione si re a-lizza come risultato di processi fotochimici e biologici.In ambito cosmetico, l’idrochinone, noto anche conuna serie di sinonimi (ad esempio, 1,4-idro s s i b e n z e n e ,1,4-benzenediol, Idrochinolo), agisce sia bloccando lamelanogenesi come substrato alternativo della tiro s i-nasi, sia come agente citotossico selettivo per i mela-nociti. Nelle formulazioni cosmetiche viene general-mente associato a solfito e metabisolfito di sodio pere v i t a rne l'ossidazione. Nei prodotti in cui non è stabiliz-zato risulta meno attivo. È noto, tuttavia, che l’impiegodi idrochinone a dosi elevate può pro v o c a re fenomeniirritativi e rappre s e n t a re una condizione di rischio cor-relato all’uso prolungato. Può anche essere re s p o n s a-bile di casi di ocronosi esogena. Nella scheda di sicu-rezza, l’idrochinone è classificato come estre m a m e n t etossico; è nocivo per inalazione e ingestione e la tossi-cità acuta nell’uomo corrisponde a una DLLo orale(LDLo, Lethal Dose LOw) di 29 mg/kg [15].

Per questa ragione, con la XXIV modifica dellaD i rettiva della Commissione Europea 76/768/CEE(2000/6/CE) [16] ne è stato bandito l’uso comeagente per schiarire localmente la pelle, mentrerimane confermato il suo impiego nelle tinture percapelli come colorante di ossidazione (concentra-zione massima: 0,3%) e nei kit per unghie finte(concentrazione massima: 0,02%).

Al momento, i prodotti depigmentanti contenentiidrochinone sono molto richiesti e commercializzati

nel mercato asiatico ed africano. La globalizzazione,i fenomeni di immigrazione e la contemporaneaproibizione in Europa dell’impiego di questo princi-pio attivo hanno, altresì, favorito l’immissione, sulmercato europeo, di prodotti di importazione illegaleanche dagli Stati Uniti dove l’idrochinone è ingre-diente attivo in farmaci da banco (OTC).

P rodotti depigmentanti di importazione illegale,soprattutto da paesi in cui è spesso difficile individua-re normative o regolamenti di produzione cosmeticac o e renti con la realtà europea, potre b b e ro rappre-s e n t a re un rischio per la salute, non solo per la pre-senza di concentrazioni più o meno elevate di idro-chinone, ma anche di altri tipi di sostanze, come direcente segnalato per alcuni prodotti sbiancanti pro-venienti dal mercato asiatico che contenevano eleva-te concentrazioni di elementi metallici. Inoltre, pro d o t-ti cosmetici di provenienza incerta potre b b e ro mani-f e s t a re una intrinseca debolezza rispetto all’instaurar-si di condizioni che favoriscono la contaminazionem i c robica che può comportare un deterioramentodella qualità del prodotto e rappre s e n t a re un fattoredi rischio aggiuntivo per i consumatori.

Per l’esame di prodotti contenenti idrochinone esisteun metodo analitico ufficiale, basato sull’analisi conHPLC, che utilizza come fase mobile una miscela dit e t r a i d rofurano/acqua [2]. Di recente, dal nostro labo-ratorio, per una maggiore salvaguardia ambientale, èstato messo a punto un metodo che, in sostituzionedel tetraidrofurano, sostanza con elevata pericolositàper l’ambiente acquatico e molto tossico per i pesci aitest di ecotossicità, prevede l’uso dell’etanolo.

Alla luce delle considerazioni sopra pre s e n t a t e ,l’Istituto Superiore di Sanità ha sviluppato uno stu-dio su prodotti cosmetici depigmentanti cutanei diimportazione illegale per la verifica di possibili altera-zioni della qualità microbiologica e per la determina-zione di eventuali concentrazioni di idro c h i n o n e .L’indagine è stata condotta anche al fine di accerta-re, qualora i dati lo avessero confermato, la sovrap-ponibilità tra il metodo che prevede l’uso dell’etano-lo, “metodo green”, e quello ufficiale di riferimentoper il rilevamento del composto fenolico.

MATERIALI E METODI

Sono state effettuate analisi microbiologiche echimiche su prodotti depigmentanti di importazioneillegale (25 campioni costituiti da oli, emulsioni esaponi), valutando le caratteristiche di qualità micro-


114

così suddivisi: 3 soluzioni oleose, un sapone e 21emulsioni. Per l’analisi delle concentrazioni di idro-chinone sono stati utilizzati, in parallelo, i due meto-di cromatografici di seguito descritti.

ReagentiTutti i reagenti devono essere di purezza analitica

ed idonei per HPLCI) acqua per HPLC o di purezza almeno equiva-

lente;II) etanolo;III) idrochinone;IV) miscela di estrazione acqua (1)/etanolo (2) 1:1

(v/v).

Sistema cromatografico È stato utilizzato un sistema HPLC Agilent 1100

costituito da una pompa binaria, un auto-campio-n a t o re, un detector a fotodiodi ed un softwareChemstation Re.

Metodi cromatograficiSono stati utilizzati due metodi cromatografici. Un

metodo è stato elaborato nei nostri laboratori e uti-lizza l’etanolo, in sostituzione del tetraidrofurano. Inconsiderazione di questa modifica, utile ai finiambientali, viene definito “green method”. L’ a l t rometodo utilizzato è il metodo ufficiale [2] che utilizzanella fase mobile il tetraidrofurano.

Colonna: Lichrosorb RP18 10µm 250 x 4 mmFase mobile: A = etanolo B = acqua

%A %B T0 5 95T5 5 95 T15 50 50 T20 90 10

Temperatura della colonna: 36°CFlusso: 1,5 ml/minVolume di iniezione: 10 µlΛ : 294 nm

Preparazione dello standardSoluzione A: sono stati pesati 80,0 mg di idro c h i n o n e

[8], trasferiti in un matraccio tarato scuro da 100 ml eportato a volume con la miscela [7]. Dalla soluzione A,per diluizione, rispettivamente 8, 6, 4, 2 ml di soluzioneA sono stati diluiti a 10 ml con la miscela [7]; sono stateottenute soluzioni contenenti una concentrazione dii d rochinone compresa tra 160 ÷ 640 µg / m l .

biologica (campioni riportati con il numero seguitoda “A”) e determinando le eventuali concentrazionidi idrochinone (per gli stessi campioni, il numeroseguito da “B”) sulla base di due metodi analitici.

Analisi microbiologicheDei 25 campioni analizzati (da 1A a 25A), sette,

costituiti da 3 emulsioni, una soluzione oleosa e 3saponi erano in confezione sigillata e sono statiaperti al momento dell’analisi seguendo le comuniregole di asepsi. I restanti 18 campioni erano costi-tuiti da confezioni aperte in precedenza.

I parametri microbiologici ricercati nei prodotti esami-nati e considerati dal punto di vista igienico-sanitariosignificativi per questa tipologia di prodotti sono statiquelli proposti dalla Farmacopea Ufficiale [1], assimi-lando i campioni analizzati a preparazioni farmaceuti-che per uso topico. In funzione del loro diverso ruolo,come indicatori di contaminazione o di rischio per lasalute dei consumatori, le specie o i gruppi di micro r-ganismi presi in esame hanno compre s o :

I) batteri mesofili aerobi;II) Pseudomonas aeruginosa;III) Staphylococcus aureus e spp.;IV) Escherichia coli;V) Funghi (muffe).

Al prelievo di ciascun campione da analizzare ,e ffettuato in condizioni di sterilità, hanno fatto seguitofasi di omogeneizzazione e neutralizzazione degliagenti antimicrobici e dei conservanti, eventualmentep resenti, sulla base della norma UNI ISO 21148 [10].Dopo dissoluzione e solubilizzazione di ciascun pro-dotto, sono state preparate le diluizioni successiva-mente sottoposte ad esame. Le analisi per ciascunp a r a m e t ro sono state condotte in duplicato.

I metodi utilizzati per lo svolgimento delle analisifanno riferimento a pro c e d u re standardizzate esono quelli indicati di seguito:

• Conteggio dei batteri mesofili aerobi - UNI ISO21149 [11];

• Pseudomonas aeruginosa - UNI ISO 22717[13];

• Staphylococcus aureus - UNI ISO 22718 [14];• Escherichia coli - UNI ISO 21150 [12];• Funghi (muffe) – ISO 16212 [6].

Procedure per la determinazione delle concentrazioni di idro-chinone

Sono stati analizzati 25 campioni (da 1B a 25B)


115

Di ciascuna soluzione sono stati iniettati, in duplica-to, 10 µl e, dalle aree ottenute, in funzione della con-centrazione, è stata costruita una curva di taratura.

Preparazione del campioneIn un matraccio tarato scuro da 100 ml sono stati

trasferiti 2,0 g di campione esattamente pesati. Ilcampione è stato disperso in 50 ml di miscela [7].Dopo agitazione per almeno 1 minuto, fino ad otte-n e re una sospensione omogenea, il matraccio èstato posto in un bagno ad acqua mantenuto aduna temperatura di 60°C per favorire l’estrazione.Dopo raffreddamento e dopo aver portato a volumecon la miscela [7], il campione è stato centrifugato,filtrato e analizzato entro 24 ore dalla preparazione.

Le aree ottenute sono state interpolate sulla curvadi taratura.

Dai campioni in cui le concentrazioni di idrochino-ne risultavano eccedere il valore del 2% sono statepreparate opportune diluizioni.

Le analisi sono state effettuate entro 24 ore dallap reparazione delle soluzioni standard e del campione.

RISULTATI

Dall’esame dei 25 prodotti analizzati dal punto divista microbiologico sono emerse condizioni variabilidi stabilità e purezza microbiologica in funzioneanche delle condizioni della confezione (sigillata o giàaperta) (Tabella I). Per le basse concentrazioni micro-biche rilevate e per l’assenza, in tutti i prodotti, diindicatori di contaminazione (E. coli) e di potenzialibatteri patogeni (Pseudomonas aeruginosa eStaphylococcus aureus), si può aff e r m a re che le

Tabella I - Risultati delle analisi microbiologiche effettuate sui pro-dotti considerati

COSMETICI Batteri Funghi (muffe)

DEPIGMENTANTI mesofili aerobi

Campione n°

1 A (confezione aperta) 10 10















16 A (confezione sigillata) 80 0










Tabella II - Risultati delle concentrazioni di idrochinone misurate coni due metodi

COSMETICI “Metodo green” Metodo ufficiale

DEPIGMENTANTI

Campione n°

1 B 3,2 % 3,0 %

2 B 6,3 % 6,2 %

3 B 2,6 % 2,4 %

4 B 5,0 % 5,0 %

5 B 3,7 % 3,8 %

6 B 3,3 % 3,5 %

7 B 2,1% 2,0 %

8 B 2,8 % 2,5 %

9 B 3,7 % 3,9 %

10 B 5,2 % 5,3 %

11 B 5,0 % 4,8 %

12 B 8,1% 8,0 %

13 B 3,0 % 3,0 %

14 B 5,3 % 4,9 %

15 B 5,8 % 5,9 %

16 B 1,4 % 1,5 %

17 B 0,0 % 0,0 %

18 B 0,0 % 0,0 %

19 B 0,0 % 0,0 %

20 B 5,3 % 5,1 %

21 B 4,6 % 4,5 %

22 B 2,1 % 2,2 %

23 B 1,9 % 2,0 %

24 B 2,1 % 2,2 %

25 B 2,0 % 1,9 %


116

caratteristiche di qualità dei cosmetici analizzati sianomediamente accettabili. Infatti, nel 48% del totale deicampioni non sono stati rilevati microrganismi e nellospecifico, nel 57% dei prodotti sigillati e nel 39% diquelli aperti. Dall’analisi è emerso che il 16% del tota-le dei campioni era contaminato da un unico gruppo

m i c robico, valore di positività identico per i batterimesofili aerobi e per i funghi. Entrambi i gruppi micro-bici erano invece presenti nel 24% dei prodotti esa-minati. Nei campioni positivi, i valori medi di concen-trazione per i batteri mesofili aerobi erano pari a 19UFC/g, con un valore massimo di 80 UFC/g rilevato

Figura 1 – Idrochinone: standard metodo ufficiale

Figura 2 - Campione 3 B metodo ufficiale


117

in un prodotto in confezione sigillata, e con valoriminimi di 10 UFC/g. Le concentrazioni di funghi sonorisultate completamente uniformi (10 UFC/g) in tutti icampioni positivi per questo parametro .

In Tabella II sono riportati i risultati, ottenuti sugli stes-si campioni, relativi alle concentrazioni di idro c h i n o n e

determinate con i due metodi messi a confro n t o .In tre dei campioni analizzati (2 emulsioni e un

sapone) non è stato rilevato idrochinone con nessu-no dei metodi impiegati. Negli altri campioni, il meto-do ufficiale ha fornito valori percentuali compresi tra1,5% e 8,0% di idrochinone, con una media pari a

Figura 3 - Idrochinone: standard “metodo green”

Figura 4 - Campione 3 B “metodo green”


118

3,80%. Per gli stessi prodotti, con il metodo altern a t i-vo (valori medi pari a 3,84%) sono state ottenuteconcentrazioni variabili tra 1,4% e 8,1%. Il valore dic o r relazione tra i due metodi è stato calcolato pari a0,995 [3]. Le Figure 1 e 3 riportano i valori per los t a n d a rd forniti dal metodo ufficiale e dal “metodog reen” e le Figure 2 e 4 un esempio di rilevamento,relativo al campione 3B, dei valori di idro c h i n o n edeterminati con gli stessi due metodi.

DISCUSSIONE E CONCLUSIONI

Le ricerche sulla biosintesi della melanina hannochiarito alcuni meccanismi biochimici ancora oscurie suggerito nuove possibili applicazioni nello svilup-po di prodotti cosmetici. Tra i prodotti che, da diver-si anni, si sono dimostrati efficaci per il trattamentodelle iperpigmentazioni e per re n d e re la pelle piùchiara ed omogenea, i depigmentanti, regolando lamelanogenesi, sono utilizzati in tutto il mondo.

L’uso di prodotti depigmentanti varia a secondadella cultura e della razza. Infatti, se nei paesi occi-dentali il loro utilizzo spesso è primariamente miratoalla prevenzione e alla cura delle macchie senili, inaltri paesi, dove la pelle chiara è sintomo di bellezzae femminilità, il loro uso come schiarenti della pelleè molto diffuso.

N u m e rose molecole mostrano proprietà depigmen-tanti; tuttavia, la loro efficacia non sempre coincidecon la sicurezza d’uso. Alcuni agenti depigmentantidel mercato cosmetico attuale posseggono infattidiverse controindicazioni. Tra essi, l’idrochinone puòe s s e re considerato un potente agente citotossico suimelanociti, ed è stato anche identificato come possi-bile induttore di mutazioni [5]. I suoi effetti secondaripiù frequenti sono irritazione cutanea e dermatite dacontatto. Per questi motivi il suo uso come schiare n t edella pelle è vietato dal 1 gennaio 2001.

Nonostante la scarsa presenza di dati in letteratu-ra, l’esistenza in commercio di cosmetici contraffattio contenenti sostanze messe al bando, soprattuttoprovenienti da paesi extraeuropei, rappresenta unarealtà diffusa anche in Italia. In questo ambito, l’in-dagine svolta fornisce un contributo alla verifica delpotenziale rischio per la salute associato all’uso dip rodotti cosmetici diffusi da un mercato parallelorispetto a quello ufficiale.

Dal punto di vista microbiologico, i risultati ottenutidall’esame dei prodotti considerati dimostrano chela formulazione, associata alla presenza di sistemi

preservanti sufficientemente adeguati, in alcuni casi,ha contribuito alla stabilità dei prodotti, sebbene trai componenti riportati sulla confezione, non sempref o s s e ro elencate sostanze conservanti (24% deicampioni). Di converso, si è verificato che, in cam-pioni tra i cui componenti erano invece elencatiagenti preservanti, sono stati isolati micro r g a n i s m i ;significativo è il risultato dell’analisi dell’emulsionesigillata 16A in cui sono stati rilevati i valori più alti diconcentrazione microbica (80 UFC/g). In generale, icampioni esaminati hanno manifestato caratteristi-che di qualità microbiologica variabili e discord a n t iin funzione sia delle condizioni della confezione(sigillata o aperta), sia delle indicazioni relative agliingredienti (presenza o meno di agenti preservanti)riportate nella composizione. Tuttavia, l’assenza diindicatori specifici di contaminazione e di patogenipotenzialmente responsabili di infezioni cutanee,anche nelle confezioni già aperte, nonché i valoriaccettabili di concentrazione microbica rilevati nel40% dei campioni positivi, permette di riconoscerel’esistenza di caratteristiche microbiologiche soddi-sfacenti. Infatti, qualora si assimilino i campioni ana-lizzati a preparazioni farmaceutiche per uso topico,è da considerare che i valori ottenuti dall’analisirisultano, per questi campioni, conformi ai criteristabiliti dalla Farmacopea [“Non più di 102 microrga-nismi (batteri aerobi e funghi) per grammo o per mil-lilitro”] [1], mentre solo il 12% delle formulazioni hasuperato i valori prescritti.

Diversamente, nell’88% dei campioni esaminati èstata confermata la presenza di concentrazioni varia-bili ed elevate di idrochinone. Sebbene tutti i pro d o t t ir i p o r t a s s e ro tra i componenti della formulazioneanche l’idrochinone, e nella gran parte dei casi con laspecifica della concentrazione (“non superiore al2%”), valori superiori a questa soglia sono stati deter-minati nel 76% dei campioni. La presenza di idro c h i-none, comunque a qualsiasi concentrazione, in basealla normativa vigente, rende questi prodotti poten-zialmente dannosi e non commerc i a b i l i .

La determinazione delle concentrazioni di idro c h i-none con i due metodi in parallelo, fornendo valorip ressoché coincidenti, conferma la completasovrapponibilità dei due protocolli sperimentali utiliz-zati. In virtù del ridotto impatto ambientale, grazieall’utilizzo di etanolo rispetto al tetraidrofurano, ilmetodo alternativo – “metodo green” - può rappre-s e n t a re una valida soluzione per la verifica dell’even-tuale presenza di idrochinone in prodotti cosmetici.


119

BIBLIOGRAFIA

[1] A.A. V. V. Farmacopea Ufficiale del laRepubblica Italiana 2002 con 1° supplemento2005. Istituto Poligrafico dello Stato, Roma.

[2] A.A. V. V. “Individuazione e dosaggio dell’idro-chinone, dell’idrochinone monometiletere, del-l ’ i d rochinone monoetiletere e dell’idro c h i n o n emonobenziletere nei cosmetici. Metodo ufficia-le” Gazzetta Ufficiale n. 29 del 5 aprile 1997.

[3] E. Camusi, Metodi Stat ist ici per laSper imentazione Biologica, Zanichell i ,Bologna, 1989, pp. 239.

[4] T. P. Dooley, Topical skin depigmentationagents: current products and discovery ofnovel inhibitors of melanogenesis. Journal ofDermatology Treatments 8, 275-279 (1997).

[5] I n t e rnational Programme on Chemical Safety(IPCS). Hydroquinone: health and safety guide.Health and safety guide no. 101. World HealthOrganization, 1996.

[6] ISO 16212. Cosmetics - Microbiology -Enumeration of yeast and mould. ISO 2008,International Organization for Standardization.

[7] N. Kittipongpatana, A. Chaiwan, U.P. O. S.Kittipongpatana, High-performance liquidc h romatographic method for separation andquantitative analysis of Arbutin in plant tissuec u l t u res. Chiang Mai University Journal ofNatural Sciences 6, 65-74 (2007).

[8] Lin Cheng-Hui, SheuJeun-Yuan, Wu Hsin-Lung, Huang Yeou-Lih, Determination ofh y d roquinone in cosmetic emulsion usingm i c rodialysis sampling coupled with high-

performance liquid chromatography. Journal ofpharmaceutical and biomedical analysis 38 (3)414-419 (2005).

[9] T. Ta d o k o ro, Y. Yamaguchi, J. Batzer, S.G.Coelho, B.Z Zmudzka, S.A. Miller, R. Wo l b e r,J.Z. Beer and V.J. Hearing, Mechanisms ofskin tanning in different racial/ethnic groups inresponse to ultraviolet radiation. Journal ofInvestigative Dermatology 1 2 4, 1326–1332(2005).

[10] UNI ISO 21148. Cosmetici - Microbiologia -Istruzioni generali per l'analisi micro b i o l o g i c a .Milano: 2007, Ente Nazionale Ital iano diUnificazione.

[11] UNI ISO 21149. Cosmetici - Microbiologia -Conta e ricerca dei batteri mesofili aero b i .Milano: 2007, Ente Nazionale Ital iano diUnificazione.

[12] UNI ISO 21150. Cosmetici - Microbiologia -Ricerca di Escherichia coli. Milano: 2007, EnteNazionale Italiano di Unificazione.

[13] UNI ISO 22717. Cosmetici – Microbiologia -R i c e rca di Pseudomonas aeruginosa. Milano:2007, Ente Nazionale Italiano di Unificazione.

[14] UNI ISO 22718. Cosmetici - Microbiologia -R i c e rca di Staphylococcus aureus. Milano:2007, Ente Nazionale Italiano di Unificazione.

[15] W. Westerhof, T.J. Kooywers, Hydro q u i n o n eand its analogues in dermatology – a potentialrisk. Journal of Cosmetic Dermatology 4, 55-59 (2005).

[16] XXIV Direttiva 2000/6/CE della Commissione.L 56/42 Gazzetta Ufficiale delle Comunitàeuropee del 1 marzo 2000.

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sperimentale, tecnologico o divulgativo, su oli e grassi alimentari ed industriali di origine

vegetale o animale, detersivi, tensioattivi, prodotti cosmetici, oli minerali, pro d o t t i

vernicianti e sui loro impieghi nel settore alimentare, mangimistico e dell’industria in genere.

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Ad esempio:

[1] O. Rossi, A. Bianchi, Riv. ItaI. Sostanze Grasse 70, 520-526 (1993).

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121

IN THIS STUDY AN AMPLE BIBLIOGRAPHIC REVIEW WAS CARRIED OUT ON GRAPE SEED OIL,EMPHASISING ASPECTS RELATED TO CHEMICAL COMPOSITION AND EXTRACTION METHODS.THE AIM WAS TO DETERMINE WHETHER GRAPE SEED OIL COULD BE USED AS AN ALTERNATI-V E TO CO N V E N T I O NA L E D I B L E V E G E TA B L E O I LS (S U CH A S S U N F LOW E R, S OY, E T C). ASR E GA R D S CO M P O S I T I O N, G R A P E S E E D O I L H A D A H I G H CO N T E N T O F L I NO L E I C AC I D A N DTOCOPHEROLS AND A LOW CONTENT OF LINOLENIC ACID, SATURATED FATTY ACIDS AND CHO-LESTEROL. THE MOST COMMON METHODS TO EXTRACT OIL FROM GRAPE SEED ARE PRESSU-R E SYST E M S, E X T R AC T I O N W I T H O RGA N I C S O LV E N TS, AQ U E O U S E X T R AC T I O N, E N Z Y M AT I CHYDROLYSIS (COMBINED WITH THE ABOVE METHODS) AND SUPERCRITICAL CARBON DIOXI-DE EXTRACTION.KEYWORDS: CHEMICAL COMPOSITION, EXTRACTION, GRAPE, GRAPE SEED, OIL

RASSEGNA BIBLIOGRAFICA SULL’UTILIZZO DELL’OLIO DI SEMI DI VINACCIOLI COMEALTERNATIVA AGLI OLI VEGETALI CONVENZIONALIVI E N E R I P O R TATA U N’A M P I A R A S S E G NA B I B L I O G R A F I CA S U L L’O L I O D I S E M I D I V I NAC C I O L IFACENDO PARTICOLARE RIFERIMENTO ALLA SUA COMPOSIZIONE CHIMICA ED AI METODI DIESTRAZIONE. SCOPO DEL LAVORO ERA DI DETERMINARE SE L’OLIO DI SEMI DI VINACCIOLIPUÒ ESSERE USATO COME ALTERNATIVA AGLI OLI VEGETALI CONVENZIONALI COME GIRASOLE,SOIA, ECC. PER QUANTO RIGUARDA LA COMPOSIZIONE L’OLIO DI SEMI DI VINACCIOLI PRE-S E N TA A LTO CO N T E N U TO D I AC I D O L I NO L E I CO E D I TO CO F E RO L I E BA S S O CO N T E N U TO D IACIDO LINOLENICO, DI ACIDI GRASSI SATURI E DI COLESTEROLO.I METODI PIÙ COMUNI DI ESTRAZIONE DELL’OLIO SONO I SISTEMI A PRESSIONE, L’ESTRAZIO-NE CON SOLVENTI ORGANICI, L’ESTRAZIONE ALL’ACQUA, L’IDROLISI ENZIMATICA (COMBINATACON I METODI CITATI) E L’ESTRAZIONE SUPERCRITICA CON CO2 .PAROLE CHIAVE: COMPOSIZIONE CHIMICA, ESTRAZIONE, UVA, SEMI DI VINACCIOLI, OLIO

A review on the utilization of grapeseed oil as an alternative to

conventional edible vegetable oils

M. RUBIO, M. ÁLVAREZ-ORTÍ,J.E. PARDO*

ES C U E L A TÉ C N I C A SU P E R I O R D E

INGENIEROS AGRÓNOMOS,UNIVERSIDAD DE CASTILLA-LA MANCHA

ALBACETE - SPAIN

CORRESPONDENCE: [email protected]


122

1. THE EDIBLE FATS

The Spanish Alimentary Code (CAE) defines fats as“ p roducts of animal or vegetable origin, whose mainconstituents are natural glycerides from fatty acids,containing other lipids as minor components” [1].

Natural glycerides are esters formed from glyceri-ne and fatty acids, while amongst minor compo-nents there are phospholipids (phosphoglycerides,sphingolipids, etc.), alcohols with a large carbonchain, sterols and hydrocarbons (which form the nonsaponificable residue), waxes and free fatty acids [2].

Fats with a predominance of unsaturated fatty acidsliquefy at 25 ºC and are specifically called oils, are richin oleic and linoleic acid, and saturated fatty acids arereduced to less than 20 %. These are the vegetableoils from olive, sunflower, soybean, etc. Fats witha round 30-80 % in saturated fatty acids, are solid, anda re animal fats, although some have a vegetable originlike the ones from cacao bean or palm kernel [2].

The term lipid is more extensive, and comprisesall substances that can be extracted with ether orother non-polar solvents like hexane [2]. Each kindof fat has a constant fatty acid composition,between some given limits [1]. The main classes offatty acids are saturated, monounsaturated andpolyunsaturated. Saturated (butirric acid, caprilicacid, palmitic acid, etc.) and monounsaturated fattyacids can be synthesized in the human body,however, the two more simple polyunsaturated fattyacids (linoleic and α-linoleic acids) are sythesizedonly in plants. These acids are absolutely necessaryfor life and human health and must be ingested inthe diet; they are called essential fatty acids [3].

2. THE GRAPE SEED: FROM RESIDUE TORICHNESS SOURCE

Man produces a large amount of waste nowadays,c reating a pro g ressive degradation of the enviro n m e n t ,which is sometimes irreversible. It is there f o re necessaryto look into this problem, and find alternative uses forthese residues that would not only prevent enviro n m e n-tal damage but could also be profitable for industry [4].

Spain and Italy are two of the major wine-produ-cing countries worldwide. The main by-pro d u c tgenerated by the wine industry is the grape poma-ce, composed of stalks, pulp, skins and seeds, invarying proportions. Considering that the yield ofthe process is around 30 kg pomace per 100 liters

of wine, the average production of pomace is esti-mated about 1,350,000 tons per year [4]. Thegrape pomace contains about 60-70 % humidity,which is reduced to 45-55 % after pressing. Wi t hregards to grape weight, the pomace represents 17% approximately, in which 8 % refers to skins andpulp, 5 % to seeds and 4 % to stalks [5].

The pomace can be used for different purposes,including organic fertilizer for agricultural land, toproduce ethanol, animal feed, dyes extraction, oilsextraction and energy purposes [5].

The grape pomace is mainly used for the pro d u c t i o nof vinic alcohol, although it is more easily obtainedf rom distillation of the wine surplus that exists nowa-days. An alternative way for the industrial use of thepomace could be the oil extraction from the seeds [4].

3. THE GRAPE SEED OIL

The seed is a very important component of thesolid residue from the grape, and can represent 3-5% of the fruit weight [5, 6]. The seed oil is incorpo-rated in a wide range of cosmetics, dietary pro-ducts and food, containing procianidins, polyphe-nols, anthocyanins, flavonols, tannins, fiber, protein,oil, etc. [7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14].

The average composition of the grape seed is:polyphenols 7%; protein 11%; oil 16%; humidity10%; fiber 40%; other 16% [15]. There is a highercontent of polyphenols and fibre compared to otherseed oils, due to the high percentage of testa andtegumen in the total seed. All the oil from the grapeseed, as well as most of the protein, is found in thealbumen, however, most of the phenolic com-pounds are located in the outer covering [15].

According to literature, the oil content in the seedmay range between 11 to 22 %, depending on thevariety of grape used and the environmental condi-tions during development [16, 17, 18].

In a study conducted by Izzo and Muratore [19], itwas noted that the oil content of the seeds from re dvarieties was higher than that from seeds of whiteones. Likewise those varieties with high sugar con-tent contain a greater quantity of oil in its seeds [20].

Nunan et al. [21] pointed out that the cell wall ofthe grape seed contained approximately 90 % byweight of polysaccharides and less than 10 % ofproteins. The main constituents of cell wall are cel-lulose and polygalacturonic acid, each re s p o n s i b l efor 30-40 % of total polysaccharides.


123

3.1. Chemical composition of grape seed oilThe main chemical components usually used in the

chemical characterization of edible vegetable oils arefatty acids, sterols and antioxidant compounds.Among the fatty acids of grape seed oil, linoleic acid,an essential fatty acid in the human diet, is found at arate higher than that found in other vegetable oils:69.4 % in grape seed oil compared with 7.3 % in vir-gin olive oil, 59.1 % in sunflower oil, 55.1 % in soy-bean oil. On the other and, the linolenic acid contentis one of the lowest (0.2 %), being higher in soybeanoil (5.6 %) or in rapeseed oil (7.1 %) [22].

Linoleic acid content ranges between 50.1 and74.6 % (Table I). The various studies considered dif-fer in terms of the varieties evaluated and the oilextraction system used [6, 15, 22, 23, 24, 25, 26,27, 28]. The highest values were found in the studyby Crews et al. [27], in samples of French originextracted with hexane, while the lowest values werefound by Martínez et al. [24], in Spanish samplesfrom the Palomino variety.

Linoleic acid is found at a much higher proportionin the seed endosperm than in the episperm, whereit is almost not detected. However, the saturatedfatty acid proportion is higher in the episperm [24].

Linoleic acid is an important component of cellmembranes and structures, precursor of pro s t a g l a n-dins (substances needed to reduce the aggre g a t i o nof platelets and any kind of inflammation) and con-t roller of blood lipid content [15]. It has also beenp roved to be effective as an inhibitor agent of bre a s t ,colon, stomach and skin cancers due to lymphocy-tes modulation and macrophages activity [29].

R e g a rding the content in linolenic acid, oscillationsbetween 0.2 and 5.0 % (Table I) are found according tovariety selected and type of oil extraction process used.The highest values were found in the investigations car-ried out by Martínez et al. [24] while the lowest values

a p p e a red in that conducted by Hidalgo et al. [22].The low linolenic acid content gives the oils a gre a t

s t a b i l i t y, as they are protected from oxidation [15].Table I shows content fluctuations of other fatty acidsfound in appreciable quantities in the grape seed oilsuch as oleic acid (12.6-27.6 %), stearic acid (2.8 -8.6 %), palmitoleic acid (<0.1-0.9 %) and palmiticacid (6.3-14.2 %) [6, 15, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28].

Content values for the different fatty acids analy-zed (Table I) complied in all cases with the maxi-mum re q u i red by the Sanitary Regulations of theedible vegetable oils for grape seed (palmitic = 5-10%; stearic = 3-5 %; oleic = 12-26 %; linoleic = 58-77 %; linolenic ≤ 1) [30].

The oil from varieties grown in cold climates con-tains more unsaturated fatty acids and lower unsa-ponifiable fraction. In addition, the proportion of lino-leic acid decreases in the ratio linoleic/oleic whenmoving from cold climates to warmer climates [15].

The low saturated fatty acid content makes thegrape seed oil resistant to cloudiness at low tempe-ratures. Its resistance to heat makes it suitable forfrying, with a higher digestibility than olive oil [15].

Table II shows the results obtained on the compo-sition of sterols in grape seed oil [15, 27, 28]. In astudy conducted by Crews et al. [27], the totalamount of sterols expressed in mg/100g rangedfrom 257.6 to 1125.1 in grape seed oil samples col-lected in France, Italy and Spain (Table II).

The β- s i t o s t e rol is the sterol with a greater pro p o r-tion in all cases, with a range of 62.9 % to 77.6 %.The lowest values of β- s i t o s t e rol have been re p o r t e dby Rubio et al. [28], in a study in which several varie-ties currently cultivated in the autonomous communityof Castilla-La Mancha such as M o n a s t r e l l, G a r n a c h a

Ti n t o r e r a, Petit Verdot and Syrah w e re evaluated.Stigmasterol is the second largest sterol in terms

of concentration (5.4-14.8 %), followed by campe-

Table I - Fatty acids composition (%) of grape seed oil

Fatty Acids Kinsella Galán Martínez Sineiro Molero Bonnarme Hidalgo et al. Beveridge Crews et al. Rubio Extreme

[6] et al. [23] et al. [24] et al. [15] et al. [25] et al. (1997) et al.[22] [26] [27] et al. [28] values

Palmitic C16:0 6.3-7.9 8.1 7.6-14.2 7.0-12.8 7.9-10.5 7.5 6.6 6.3-8.6 6.6-11.6 7.9-9.2 6.3-14.2

Palmitoleic C16:1 0.2-0.5 0.1 0.1-0.9 0.1-0.9 0.1-0.2 - 0.1 0.1-0.2 0.1-0.2 - 0.1-0.9

Stearic C18:0 3.0-5.7 5.4 4.6-8.5 2.8-6.2 5.1-7.5 5.0 4.2 3.6-5.3 3.5-5.4 4.4-5.9 2.8-8.6

Oleic C18:1 16.0-19.6 19.1 18.3-26.5 14.6-24.6 19.1-27.6 18.6 18.8 12.6-18.9 14.0-20.9 16.1-24.9 12.6-27.6

Linoleic C18:2 68.2-72.6 67.0 50.0-66.9 61.2-72.4 56.3-67.4 66.0 69.4 66.8-73.6 61.3-74.6 60.9-69.2 50.1-74.6

Linolenic C18:3 0.3-0.7 0.3 0.3-4.9 0.3-0.6 0.3-0.4 - 0.2 0.4-1.1 0.3-1.8 0.3-0.6 0.2-5.0


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sterol (6.6-11.5 %) (Table II). The grape seed oil hasvery low cholesterol levels, ranging between 0.1and 1.1 % (Table II). Its consumption raises the“good” cholesterol HDL and reduces the “bad” cho-lesterol LDL, being considered as an anticholestero-lemic agent and a protective agent against heartand circulatory diseases [15, 26, 31].

The sterols have antioxidant properties, whichconfer stability to the oil against oxidation. The con-tent of total sterols of the grape seed oil is higherthan sunflower or rapeseed oil, although lower thansoybean oil. However, soybean oil has a gre a t e rp roportion of linolenic acid, which makes it moreunstable to self-oxidation [15].

To c o p h e rols are a group of vitamin E active com-pounds which can be found in all vegetable oils.They exist in four diff e rent isomers: α- ,β- ‚γ- ,δ-t o c o p h e rol. In grape seed oil the most abundantt o c o p h e rol is the α- t o c o p h e rol with values rangingf rom less than 10 mg/kg to 229 mg/kg (Table III). Thisis the most studied vitamin E form, and a powerfulantioxidant which provides stability against oxidationand prevents against arteriosclerosis [32]. In addition,four isomers of tocotrienols (α- ,β- ‚γ- ,δ- t o c o t r i e n o l )can also be found. The total amount of tocotrienolsin a commercial sample of grape seed oil has beenreported to be 44.18 mg/100g [33], although theirantioxidant activity is weaker than for the corre s p o n-ding tocopherols. The tocopherols and tocotrienolscomposition of grape seed oil is shown in Table III.

Table III - Tocopherols and tocotrienols composition of grape seed oil(mg/kg)

Oomah et al. [33] Crews et al. [27]

α-tocopherol 55.9 nd-229

β-tocopherol 23.1 nd-133

γ-tocopherol 33.1 nd-168

δ-tocopherol - nd-69

α-tocotrienol 157.0 nd-352

β-tocotrienol - nd-125

γ-tocotrienol 284.8 nd-785

δ-tocotrienol - nd-82

Total 554.0 63-1208

nd = less than 10 mg/kg

The total amount of tocopherols and tocotrienolsin the grape seed oil range from 63 to 1208 mg/kg[27], considerably wider than the CodexAlimentarius range (240-410 mg/kg). This widerange may be due to different extraction and stora-ge methods of the grape seed oil. However, thecontent in vitamin E active compounds in grapeseed oil is lower in comparison to other commonlyused vegetable oils like rapeseed or soybean oil.

P a rdo et al. [34], studied the values of free acidity,p e roxide rate and ultraviolet absorbance (K2 7 0) ingrape seed oil samples from diff e rent grape varie-ties. The study showed that the values of free acidityexceeded in all cases the maximum allowed (0.2d e g rees) by the Sanitary Regulations of the edible

Table II - Sterols composition of grape seed oil

Sterols Sineiro et al. [15] % Crews et al. [27] % Rubio et al. [28] % Crews et al. [27] mg/100 g Extreme values %

Cholesterol 0.2-1.1 0.1-1.0 0.10-0.14 0.8-5.1 0.10-1.10

Brassicasterol - nd 0.50-0.98 nd nd-0.98

24-methylencholesterol - 0.1-0.9 0.07-0.18 0.2-4.2 0.07-0.90

Campesterol 9.2-11.2 6.6-10.2 6.73-11.47 27.0-94.4 6.60-11.47

Campestanol - nd-0.5 0.14-0.63 nd-3.5 nd-0.63

Stigmasterol - 5.4-12.3 10.53-14.81 34.5-96.1 5.40-14.81

∆7-campesterol - nd-1.0 0.16-0.26 nd-3.8 nd-1.00

∆5,23-stigmadienol - nd-0.8 0.09-0.34 nd-5.6 0.09-0.80

Clerosterol - 0.4-1.0 0.87-1.04 1.7-8.5 0.40-1.04

β-sitosterol 71.7-77.6 66.9-77.4 62.86-67.37 172.3-823.5 62.86-77.60

Sitostanol - 2.4-4.8 3.65-4.98 8.6-40.4 2.40-4.98

∆5-avenasterol 0.5-4.2 0.3-4.5 1.78-2.92 1.4-21.4 0.30-4.50

∆5,24-stigmastadienol - nd-1.2 0.41-0.84 nd-5.3 nd-1.20

∆7-stigmastenol 0.9-2.9 0.4-4.3 1.21-2.36 1.7-37.1 0.40-4.30

∆7-avenasterol - nd-1.6 0.75-0.93 nd-8.1 nd-1.60

nd = less than 0.1


125

vegetable oils [30, 35], although it should be born ein mind that such a regulation applies to "re f i n e d "grape seed oil, and not to oils obtained by "pre s-sing" and unrefined, the ones used for this study.

R e g a rding the peroxide rate, only the varieties P e t i t

Ve r d o t and S y r a h exceeded the maximum allowed(10 meq kg- 1 sample) for the regulation quotedabove. However the K2 7 0, an indicator of a more evol-ved oxidative state, exceeded the maximum permit-ted, which seems to be due to evolution of pero x i d ecompounds toward other more oxidized substances,responsible for the bad smell and taste of the oils,and which are measured at the wavelength of 270nm [36]. The values found in this study were lowerthan those obtained before by Galan et al. [23] andM o l e ro et al. [25]. Other interesting products found ingrape seed oil are the so-called “oligomer phenoliccompounds” (OPCs). These substances show stro n gantioxidant activity, which result in radical scavenginga c t i v i t y. High amounts of OPCs can be found in theseeds, with a complex composition comprising somemonomeric flavonols such as catechin, epicatechinand epicatechin-3-O-gallate, as well as diff e rent oligo-mer procyanidins. During the oil pressing pro c e s s ,most of these compounds remain in the re s i d u e ,which means that the amount of phenolic com-pounds in grape seed oil is not remarkably high incomparison to other vegetable oils like rapeseed orlinseed oil, while sunflower oil and specially olive oilcontain many more of these compounds [37].

3.2. Grape seed oil extraction methodsT h e re are diff e rent grape seed oil extraction

methods. Since it is a seed oil with a thick and hardc o v e r, preliminary operations are of great importance.

3.2.1. Preliminary treatmentsTo obtain grape seed oil some preliminary opera-

tions are needed such as washing, grinding, sifting,drying, and removing of the seed coat. The last pro-cess allows up to 30 % of oil to be obtained in theextraction, compared with 16 % achieved withwhole seeds with the coat. The optimal conditionsfor carrying out this process are: humidity 18-20 %and temperature 50 ° C [38].

Galán et al. [23] studied the influence of the sizeof the seeds in the extraction yield. Smaller fractionsare rich in endosperm, where the oil is concentra-ted. The use of these fractions leads to a betterperformance in the oil extraction. On the other

hand, the larger fractions are rich in episperm, har-der to break and with lower oil content.

Drying the seed, prior to processing may alsoa ffect the composition of the oil. Dave et al. [39] stu-died the effect of drying the seeds in a micro w a v eoven and noticed that changes in the quality of oilsw e re produced. The use of the microwave impro v e dthe extraction yield, decreased the level of chlo-rophyll and increased α- t o c o p h e rol and α- and γ-tocotrienols. The high concentration of tocotrienolsobtained in the oil provides an added benefit for thehuman diet, as positive and healthy biological eff e c t shave been demonstrated for these compounds [40].

Rubio et al. [28] studied the diff e rences betweennatural air drying and through a fluidized bed dryer, forthe same variety (Monastrell). They concluded that thetype of drying had no influence on the fatty acids com-position, however, it had a significant on the stero l scomposition. Lower values in free acidity, peroxide rateand K2 7 0 in the samples that were quickly dried werealso observed, demonstrating that oils with highervalues for the physical and chemical parameters wereobtained with the use of fluidized bed dryers.

Martínez et al. [24] compared samples of groundseeds with and without drying, and observed thatdrying the seed prior to grinding did not affect thecomposition of the oil, although it could improve theextraction performance.

3.2.2. Extraction by pressingThe extraction by pressing can be done using

discontinuous hydraulic presses or through conti-nuous screw presses [28, 34, 38]. The hydraulicp ress produces a higher quality of oil than thescrew press as it is a cold process that better pre-serve the oil properties, including Vitamin E [38].However it is now being used less as it requires toomuch manpower.

The screw presses require a mechanical and ther-mal conditioning of the material, which is subjectedto greater increases in temperature during the ope-ration [38].

3.2.3. Extraction by solventsThe solvent extraction process is one of the most

widely used in industry. The removal of the seedcoat is very important, because the protein and theoil are found in the endosperm, while the phenoliccompounds are found in the outer layer. The solventcommonly used hexane. The oil obtained thro u g h


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this system has to be refined following the techno-logy applied to oil from seeds: filtering, degumming,neutralization, bleaching and deodorization. Theresulting flour has a high fiber content (25-45 %)and a protein richness between 8-12 % [15].

3.2.4. Aqueous extraction This technique is emerging as an alternative to

the use of hazardous and toxic organic solvents. Ithas been used for the production of oil and flour ofpeanuts, sunflower, soybean and palm seed. It hasno problems of safety and cost but the extractionyield is low and re q u i res stages of emulsificationand evaporation. This process produces oil andprotein with a high quality, so in some cases, is notnecessary to refine it [15].

3.2.5. Enzymatic treatmentThe high antioxidant power of the grape seed,

combined with the low extraction yields of somemethods, make it necessary to seek an alternativemethod which maintains active compounds of theoil and improve its yield. This aim has been achie-ved through the use of enzymatic technology.

The yield extraction, both by pressure and by theuse of solvents, increases significantly with theaddition of enzymes [15], which degrade the cellwall of the seed [41]. Using enzymes also avoidsexposing the oils and proteins to high temperatures[15]. This technology has been studied with suc-cess in obtaining vegetable oil from sunflower, rape-seed, soybeans, rice bran, coconut, peanuts, corn,avocado, olive and palm, among others, thro u g haqueous extraction techniques [42, 43, 44, 45],using an organic solvent [46, 47, 48], and by pres-sing [31].

The extraction by pressing, with the use of enzy-mes, has environmental advantages over the use ofhexane and productivity advantages compared withthe aqueous extraction [31]. Guerra and Zuñiga [31]studied the performance of oil extraction by coldp ressing with an enzyme treatment prior to theextraction process. The grinding was made in asimple disk mill and the fraction less than 0.6 mm indiameter was used for extraction. The seeds weresubjected to heat treatment, enzyme treatment anddrying before cold pressing (hydraulic press). Theincorporation of enzymes to 2 % (w/w) incre a s e dthe yield of oil extraction by approximately 26 %compared to control samples.

3.2.6. Extraction with supercritical CO2Another alternative to using organic solvents is the

extraction with supercritical CO2. This extractionsystem offers similar yields to those obtained with orga-nic solvents, but it is non-toxic, flammable or corro s i v e .It is cheap and it can be used to obtain oil in largequantities with high purity and allows low temperature sextraction, which helps to minimize the thermal degra-dation of the products [25, 49].

M o l e ro et al. [25] studied the processing of grapeseeds through liquid extraction and through extractionwith supercritical CO2, for certain conditions of pre s s u-re, temperature and flow solvent, and for a certain pre-t reatment of the grape seed (humidity and size). Theoptimum conditions for the oil extraction were a pre s-s u re of 200 bars, at a temperature of 40º C, with a par-ticle size of 0.35 mm, 6.5 % humidity and pro c e s s i n gtime of two hours. One of the conclusions reached bythese re s e a rchers was that the oil extraction yield wasslightly lower with supercritical CO2 than with hexane,due to greater selectivity of this with triglycerides.Refining and solvent distilling, which consume largeamounts of energy were not necessary. They also noti-ced that the yield for washed seeds was a little lowerthan for not washed seeds and that the acidity of the oilextracted with hexane was higher than that obtainedf rom the extraction with supercritical CO2.

The extraction with supercritical CO2 has also beenstudied by Bravi et al. [49] with re g a rd obtaining an α-t o c o p h e rol enriched oil, because of its potential uses inthe food industry and in pharmaceuticals. To obtain theα- t o c o p h e rol enriched oil, the extraction was carriedout at a pre s s u re of 25 Mpa, optimal conditions of tem-p e r a t u re (80º C) and particle size (0.425 mm). Theseresults were compared with those obtained in theextraction with hexane, concluding that the concentra-tion on α- t o c o p h e rol was higher in the oil extractedwith supercritical CO2 extraction, while the yield on oilwas higher in the oil extracted with hexane.

Beveridge et al. [26] conducted a study on the yieldand composition of grape seed oil in eight grape varie-ties using supercritical CO2 extraction and petro l e u me t h e r. The conditions for the extraction were a pre s s u reof 37 Mpa and a temperature of 65ºC, for 6 hours and aflow of solvent of 60 g/min. The yields obtained for theextraction with supercritical CO2 ranged from 5.85 to13.6 (w/w) while with petroleum ether was 6.64 to 11.17(w/w). The quantity of total sterols was higher when theoil was extracted with supercritical CO2 than with petro-leum ether in seven of the eight varieties studied.


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3.3. Sensory evaluationThe virgin grape seed oil has some characteristics

a p p reciated by the consumer such as a pleasantvinous and fruity smell and taste, which is similar toraisins [37]. However, during storage, the triacylgly-c e rol and microbial degradations give off a disa-greable smell and taste. In a study by Pardo et al.[50] the oils were judged to be unsuitable for humanconsumption unless they underwent a refining pro-cess to remove these defects.

The refining process of grape seed oil has been stu-died by Martinello et al. [51], using physical pro c e s s e swith molecular distillation. In this physical refining, sta-ges of deodorization and neutralization are combinedin a single operation. It is possible to use great flows toobtain high yields, and high temperatures to get re f i-ned oils with free fatty acid content sufficiently low anda high recovery of tocopherols. The result of the re f i-ning process is an oil neutral in smell and taste.H o w e v e r, with re g a rd to taste and smell, the high-qua-lity virgin grape seed oil is considered a valuable addi-tion to the market of virgin edible vegetable oils [37].

3.4. Use of grape seed oilThe better known utility of the grape seed oil is in

the diet, due to its high linoleic acid content and itslow concentration in saturated fatty acids. At pre-sent it is used in frying and for fresh consumption.

The oil is also used in the field of cosmetics as thelinoleic acid provides a fluid product, making it suita-ble for massages creams/oils. It is a hydrating pro-duct as it easily penetrates the skin and it is an excel-lent regenerator of tissues and cell membranes [15].

It is also used to obtain 6-pentyl-α- p y rona (6PP)f rom the strain Trichoderma viride TSP2. This lactonehas antimicrobial properties and has been used re c e n-tly for fungal and microbial control of plant diseases.

Finally, Dorado [52] has investigated the possibilityof biodiesel obtaining from this oil through transe-sterification of the fatty acids contained in it, usingbasic catalysts both homogeneous and hetero g e-neous (zeolites).

4. REFERENCES

[ 1 ] I.J. Larrañaga, J.M. Carballo, M.M. Rodríguez,J.A. Fernández, Control e higiene de alimentos.Grado superior, Ed. McGraw-Hill/Interamericanade España, S.A.U., Madrid. (1999)

[ 2 ] E. Primo, Química de los al imentos. Ed.

Síntesis, Madrid. (1997).[ 3 ] M.I. Gurr, J.L. Harwood, Lipid Biochemistry: An

I n t roduction, 4t h, Ed. Chapman & Hall, London( 1 9 9 1 ) .

[ 4 ] UCA, Aprovechamiento de subproductos agrí-colas. http://www2.uca.es (18/12/06) (2006).

[ 5 ] J. Fernández, Los residuos de las agro i n d u s t r i a scomo biocombustibles sólidos (I). Vida Rural2 3 3, 14-18. (2006).

[ 6 ] . J. Kinsella, A rich source of linoleic acid. FoodTechnology 2 8, 58-60 (1974).

[ 7 ] M. Bourzeix, D. Weyland, N. Heredia, Study ofcatechins and procyanidins in grape clusters,wine, and other wine products. Bull. O.I.V. 5 9,1171-1254 (1986)

[ 8 ] G. Mazza, Anthocyanins in grapes and grapep roducts. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 3 5, 341-371( 1 9 9 5 ) .

[ 9 ] R. Pezet, P. Cuenat, Resveratrol in wine:Extraction from skin during fermentation andpost-fermentation standing of must from gamaygrapes. Am. J. Enol. 4 7, 287-290 (1996).

[ 1 0 ] . T. Fuleki, J.M. Ricardo Da Silva, Catechin andp rocyanidin composition of seeds from grapecultivars in Ontario. J. Agric. Food Chem. 4 5,1156-1160 (1997).

[ 1 1 ] J.M. Igartuburu, F. Pando, F. Rodríguez, A. Gil-Serrano, An acidic xyloglucan from grape skins.Phytochemistry 4 6, 1307-1312 (1997).

[ 1 2 ] B. Girars, G. Mazza, Functional grape and citrusp roducts. (Ed.) Functional Foods, Biochemicaland Processing Aspects, 139-191. Te c h n o m i cPublishing, Lancaster, PA. (1998).

[ 1 3 ] FEDNA, Tablas FEDNA de composición y valornutritivo de alimentos para la formulación depiensos compuestos, Ed. Fundación Españolapara el Desarrollo de la Nutrición Animal,Madrid, (2003).

[ 1 4 ] J.M. Adzet, X. Marginet, R. Sabé, S. Balsells,Obtención de un nuevo extracto curtiente pro-cedente de los residuos de la industria vitiviníco-la, Ed. AIICA, Barcelona (2006).

[ 1 5 ] J. Sineiro, H. Domínguez, M.J. Núñez, Pepitasde uva como fuente de aceite y pro t e í n a .Alimentación, Equipos y Tecnología 1 4 (3) 49-56( 1 9 9 5 ) .

[ 1 6 ] A.C. Rice, Solid waste generation and by pro-duct recovery potential from winery re s i d u e s .Am. J. Enol. Vitic. 2 7, 21-26 (1976).

[ 1 7 ] R. Tarandzhiiska, S. Stamenov, Tr i g l y c e r i d e


128

composition of diff e rent grapeseed oils.Khranitelna Promishlenost 3 8, 20-22. (1989).

[ 1 8 ] M. Miric, Z. Lalic, I. Miletic, Composition of gra-peseeds. Hrana Ishrana 1 8, 227-232 (1997).

[ 1 9 ] R. Izzo, G. Muratore, Seed lipids from somevarieties of grapes grown in Sicily. I. Fatty acidcomposition. Riv. Ital. Sostanze Grasse 7 0, 601-604 (1993).

[ 2 0 ] S. Te o d o rescu, V. Doholici, N. Hudea, A.Ionescu, T. Giosanu, Production and utilizationof secondary products of winemaking.Romanian report. Bull. O.I.V. 4 7, 578-588( 1 9 7 4 ) .

[ 2 1 ] K.J. Nunan, I.M. Sims, A. Bacic, S.P. Robinson,G.B. Fincher, Isolation and characterization ofcell wall from the mesocarp of mature grapeberries (Vitis vinifera). Planta 2 0 3, 93-100 (1997).

[ 2 2 ] F. Hidalgo, G. Gómez,, J. Navarro, R. Zamora,Oil stability prediction by high resolution 1 3Cnuclear magnetic resonance spectro s c o p y. J.Agric. Food Chem. 5 0, 5825-5831 (2002).

[ 2 3 ] M. Galán, G. Martínez, J.A. Montiel, E. Pando, F.Rodríguez, Estudio de subproductos agrícolas.I. Aceites de pepitas de uva Palomino.Extracción, constantes y ácidos grasos. GrasasAceites 3 7 (5), 233-236 (1986).

[ 2 4 ] G. Mart ínez, J.A. Montiel, E. Pando, F.Rodríguez, Estudio de subproductos agrícolas.II. Composición en ácidos grasos del aceite desemilla de uva Palomino. Grasas Aceites 3 7 ( 5 ) ,233-236 (1986).

[ 2 5 ] A. Molero, C. Pereyra, E. Martínez De La Osa,Recovery of grape seed oil by liquid and super-critical carbon dioxide extraction: a comparisonwith solvent extraction. The ChemicalEngineering Journal 6 1, 227-231 (1996).

[ 2 6 ] T.H.J. Beveridge, B. Girard, T. Kopp, J.C.G.D ro v e r, Yield and composition of grape seed oilsextracted by supercritical carbon dioxide andp e t roleum ether: Varietal effects. J. Agric. FoodChem. 5 3, 1799-1804 (2005).

[ 2 7 ] C. Crews, P. Hough, J. Godward, P. Bre re t o n ,M. Lees, S. Guiet, W. Winkelmann, Quantitationof the main constituents of some authenticgrape-seed oils of diff e rent origin. J. Agric. FoodC h e m . 5 4, 6261-6265 (2006).

[ 2 8 ] M. Rubio, J.E. Pardo, E. Fernández, A. Alvarruiz,E. López, J.M. Núñez, A. Alfaro, G.L. Alonso,Caracterización del aceite de semilla pro c e d e n t ede distintas variedades de uva. II. Composición

en ácidos grasos y esteroles. Actas deHorticultura 4 8, 206-209 (2007).

[ 2 9 ] X. Cao, Y. Ito, Supercritical fluid extraction ofgrape seed oil and subsequent separation off ree fatty acids by high-speed counter- c u r re n tc h ro m a t o g r a p h y. Journal of Chromatography A1 0 2 1, 117-124 (2003).

[ 3 0 ] BOE, Real Decreto 308/1983, de 25 de enero(BOE de 21 de febre ro), por el que se apruebala Reglamentación Técnico-Sanitaria de aceitesvegetales comestibles (1983).

[ 3 1 ] E.G. Guerra, M.E. Zuñiga, Tratamiento enzimáti-co en la extracción de aceite de pipa de uva,Vitis vinífera, por prensado en frío. GrasasAceites 5 4 (1) 53-57 (2003).

[32] H . B . W. Patterson, Quality standards for oils,fats, seeds and meals. (Ed.) Handling and sto-rage of oilseeds, oils, fats and meal, 105-107.Elsevier Applied Science, London & New York(1989).

[ 3 3 ] B.D. Oomah, J. Liang, D. Godfre y, G. Mazza,M i c rowave heating of grapeseed: effect on oilq u a l i t y. J. Agric. Food Sci. 4 6, 4017-4021( 1 9 9 8 ) .

[34] J.E. Pardo, E. Fernández, M. Rubio, E. López,J.M. Núñez, A. Alfaro, A. Alvarruiz, G.L.Alonso, Caracterización del aceite de semillaprocedente de distintas variedades de uva. I.Calidad físico-química. Actas de Horticultura48, 205-205 (2007).

[35] A. Madrid, I. Cenzano, J.M. Vicente, Manualde aceites y grasas comestibles. Ed. AMVEdiciones & Mundi-Prensa, Madrid (1997).

[36] M. Hermoso, M. Uceda, A. García-Ortiz, J.Morales, L. Frías, A. Fernández, Elaboraciónde aceite de oliva de calidad. Ed. Dire c c i ó nGeneral de Invest igación, Tecnología yFormación Agroalimentaria y Pesquera, Sevilla(1991).

[37] B. Matthäus, Virgin grape seed oil: is it really anutritional highlight? Eur. J. Lipid Sci. Technol.11, 645-650 (2008).

[ 3 8 ] G. Rohner, Extracción del aceite de la granilla deuva. Grasas Aceites 2 2 (5) 393-400 (1971).

[ 3 9 ] B. Dave, J. Liang, D. Godfre y, G. Mazza,M i c rowave heating of grapeseed: effect on oilq u a l i t y. J. Agric. Food Chem. 4 6, 4017-4021( 1 9 9 8 ) .

[ 4 0 ] T.R. Watkins, M.L. Bierenbaum, A. Giampaola,Tocotrienols: biological and health effects. Ed.


129

CRC Press, Boca Raton, FL. (1998).[ 4 1 ] H. Domínguez, M.J. Núñez, J.M. Lema,

Enzymatic pre t reatment to enhance oil extrac-tion from fruits and oilseeds: A re v i e w. FoodChem. 4 9, 271-286 (1994).

[ 4 2 ] S . P. Freitas, R.C.A. Lago, F.H. Jablonka, L.Hartman, Aqueous enzymatic extraction of avo-cado oil from fresh pulp. Revue Française desCorps Gras 4 0, 365-371 (1993).

[ 4 3 ] Y.B. Che Man, A.B. Suhardiyono, A.B. Asbi,M.N. Azudin, L.S. Wei, Aqueous enzymaticextraction of coconut oil. J. Am. Oil Chem. Soc.7 3, 683-686 (1996).

[44] A. Rosenthal, D.L. Pyle, K. Niranjan, Aqueousand enzymatic processes for edible oil extrac-tion. Enzyme Microb. Technol. 1 9, 402-420(1996).

[ 4 5 ] K. Tano, Y. Ohta, Aqueous extraction of coconutoil by an enzyme-assisted process. J. Sci. Food.Agric. 7 4, 497-502 (1997).

[ 4 6 ] S. Bhatnagar, B.N. Johari, Microbial enzymes inthe processing of oil seeds. Current Science 5 6(15) 775-776 (1987).

[ 4 7 ] H. Domínguez, M.J. Núñez, J.M. Lema,P rocesado acuoso de soja con tecnologíaenzimática: extracción de aceite y pro d u c c i ó nde aislados. Grasas Aceites 4 6 (1) 11-20 (1995)

[ 4 8 ] R. Sengupta, D.K. Bhattacharyya, Enzymaticextraction of mustard seed and rice bran. J. Am.Oil Chem. Soc. 7 3 (6) 687-692 (1996).

[ 4 9 ] M. Bravi, F. Spinoglio, N. Ve rdone, M. Adami, A.Aliboni, A. D’andrea, A. De Santis, D. Ferri,I m p roving the extraction of α- t o c o p h e ro l - e n r i-ched oil from grape seeds by supercritical CO2.Optimisation of the extraction conditions.J o u rnal of Food Engineering 7 8, 488-493( 2 0 0 7 ) .

[ 5 0 ] J.E. Pardo, E. Fernández, M. Rubio, A. Alvarruiz,Characterization of grape seed oil from diff e re n tgrape varieties (Vitis vinifera). Eur. J. Lipid Sci.Technol. (accepted for publication)

[ 5 1 ] M. Martinello, G. Hecker, M.C. Pramparo, Grapeseed oil deacidification by molecular distillation:Analisys of operative variables influence usingthe response surface methodology. Journal ofFood Engineering 8 1, 60-64 (2007).

[ 5 2 ] F. Dorado, Valorización de subproductos de lafabricación del vino elaborado en Castilla-LaMancha: producción de biodiesel e hidrógeno.http://educa.jccm.es (18/12/2007) (2007).

Receveid August 13th 2008,accepted October 10th 2008


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PO LY P H E NO LS E X H I B I T A W I D E R A NG E O F B I O LO G I CA L AC T I V I T I E S B E CAU S E O F T H E I RANTIOXIDANT PROPERTIES. THIS STUDY SOUGHT TO CARRY OUT COMPARATIVE STUDIES ONTHE ANTIOXIDANT CAPACITY OF THE SOLUBLE FREE AND BOUND POLYPHENOL EXTRACTS OFEUGENIA AROMATICA. FREE POLYPHENOLS OF EUGENIA AROMATICA WERE EXTRACTED WITH80 % ACETONE, WHILE THE BOUND POLYPHENOLS WERE EXTRACTED WITH ETHYL ACETATEF RO M AC I D A N D A L K A L I N E H Y D RO LY Z E D R E S I D U E F RO M F R E E P O LY P H E NO L E X T R AC T I O N.THE PHENOL CONTENT, FLAVONOID CONTENT, FERRIC REDUCING CAPACITY, FREE RADICALS CAV E NG I NG A B I L I TY A N D FE2 +CH E LAT I NG A B I L I TY W E R E S U B S E Q U E N T LY D E T E R M I N E D.TH E R E S U LT O F T H E ST U DY R E V E A L E D T H AT T H E F R E E P O LY P H E NO L ( 215.8 M G/G O FSAMPLE) CONTENT OF EUGENIA AROMATICA WAS SIGNIFICANTLY HIGHER (P<0.05) THANT H E BO U N D P O LY P H E NO L ( 12.3 M G/G O F SA M P L E). FU R T H E R M O R E, T H E TOTA L F LAVO-NOID CONTENT OF THE FREE POLYPHENOL (69.7 MG/G OF SAMPLE) WAS ALSO SIGNIFICAN-TLY HIGHER (P<0.05) THAN THE BOUND POLYPHENOL (9.1 MG/G OF SAMPLE). IN ADDI-TION, THE SOLUBLE FREE PHENOLICS HAD SIGNIFICANTLY (P<0.05) HIGHER ANTIOXIDANTI N D I C E S; F E R R I C R E D U C I NG CA PAC I TY, 1,1 -D I P H E N Y L- 2 -P I C RY L H Y D R A Z Y L (DPPH) F R E ERADICAL SCAVENGING ABILITY AND FE2+CHELATING ABILITY, THAN THE BOUND PHENOLICSWITH A DOSE-RESPONSE PATTERN OBTAINED FOR FREE RADICAL SCAVENGING ABILITY.KEY WORDS: ANTIOXIDANT, CLOVE, EUGENIA AROMATICA, PHENOLICS

CONTENUTO FENOLICO E PROPRIETA’ ANTIOSSIDANTE DEI CHIODI DI GAROFANO(EUGENIA AROMATICA KUNTZE)I P O L I F E NO L I P O S S I E D O NO M O LT E P RO P R I E TÀ B I O LO G I CH E G R A Z I E A L L E LO RO CA PAC I TÀA N T I O S S I DA N T I. GL I AU TO R I H A N NO E F F E T T UATO ST U D I CO M PA R AT I V I S U L L E P RO P R I E TÀA N T I O S S I DA N T I D E G L I E ST R AT T I S O LU B I L I L I B E R I D I P O L I F E NO L I L I B E R I E L E GAT ID E L L’EU G E N I A A R O M A T I C A. I P O L I F E NO L I L I B E R I S O NO STAT I E ST R AT T I CO N 80% D I AC E TO N EM E N T R E I P O L I F E NO L I L E GAT I S O NO STAT I E ST R AT T I CO N E T I L AC E TATO DA L R E S I D U O D I I D RO-L I S I AC I DA E D A L CA L I NA I D RO L I Z Z ATO D E R I VATO DA L L’E ST R A Z I O N E D E I P O L I F E NO L I L I B E R I.SUCCESSIVAMENTE, SONO STATI DETERMINATI IL CONTENUTO DI FENOLI, DI FLAVONOIDI, LACAPACITÀ FERRICO RIDUCENTE, LA CAPACITÀ DI ELIMINARE I RADICALI LIBERI E LA CAPACITÀDI CHELARE IL FE2+.IL RISULTATO DELLO STUDIO HA RIVELATO CHE I POLIFENOLI LIBERI (215,8 MG/G CAMPIO-NE) DI EUGENIA AROMATICA ERANO SIGNIFICATIVAMENTE PIÙ ALTI (P<0,05) DEI POLIFE-NOLI LEGATI (12,3 MG/G CAMPIONE). INOLTRE, IL CONTENUTO DI FLAVONOIDI NEI POLIFE-NOLI LIBERI (69,7 MG/G CAMPIONE) ERA NOTEVOLMENTE PIÙ ALTO (P<0,05) DI QUELLON E I P O L I F E NO L I L E GAT I ( 9 ,1 M G/G). I F E NO L I L I B E R I S O LU B I L I P R E S E N TAVA NO I N D I C IANTIOSSIDANTI NOTEVOLMENTE PIÙ ALTI (P<0,05), COSÌ COME LA CAPACITÀ DI RIDURRELO IONE FERRICO, LA CAPACITÀ DI ELIMINARE I RADICALI LIBERI 1,1-DIFENIL-2-PICRILIDRA-ZIL (DPPH) E LA CAPACITÀ DI CHELARE LO IONE FE2+, RISPETTO AI POLIFENOLI LEGATI,CO N U NA R I S P O STA D O S E D I P E N D E N T E P E R Q UA N TO R I G UA R DA LA CA PAC I TÀ F E R R I CORIDUCENTE. PA R O L E C H I A V E: A N T I O S S I DA N T I, CH I O D I D I GA RO FA NO (EU G E N I A A R O M A T I C A KU N T Z E) ,POLIFENOLI

Polyphenol contents and antioxidantcapacity of tropical clove bud

(Eugenia aromatica Kuntze)

A.O. ADEMILUYI 1,*,V.O.E. AKPAMBANG2 AND G. OBOH1

1) DE PA R T M E N T O F BI O CH E M I S T R Y,FE D E R A L UN I V E R S I TY O F TE CH NO LO GY,AKURE, NIGERIA

2) DE PA R T M E N T O F CH E M I ST RY, FE D E R A L

UN I V E R S I TY O F TE CH NO LO GY, AK U R E,NIGERIA

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TEL; +2348038044248


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INTRODUCTION

Antioxidant compounds in food play important ro l e sas health-protecting factors, and they are widely usedas additives in fats and oils and in food processing top revent or delay spoilage of foods. Spices and someherbs have received increased attention as dietarys o u rces of many effective phytochemicals givinghealth benefits; plant phytochemicals confer stro n gantioxidant and antimicrobial properties, whichexceed many curre n t l y, used natural and syntheticantioxidants [1]. These properties are due to manysubstances, including some vitamins, flavonoids, ter-penoids, carotenoids, phytoestrogens, minerals, etc.so rendering spices and some herbs or their antioxi-dant components as preservative agents in food [2].

Dietary antioxidants protect against free radicalssuch as reactive oxygen species in the human bodyand prevent rancidity in foods [3]. Free radicals areknown to be a major contributor to degenerativediseases of aging [4, 5]. Epidemiological studieshave shown inverse relationship between risks ofcertain diseases such as cancer and card i o v a s c u l a rdisease, and dietary intake of food componentsfound in fruits and vegetables. Some of these phyto-chemicals include phenols and flavonoids, which actas antioxidants, remove reactive oxygen species,scavenge free radicals, chelate metal catalyst andact as the saviour of the cell [6]. Recently, there hasbeen an increasing interest in condiments and spi-ces as sources of natural antioxidants, and especial-ly worthy of note, are those already used for manyyears to enhance the sensory features of food.

Clove (Eugenia aromatica Kuntze) belongs to thefamily Myrtaceae which is widely cultivated inM a d a g a s c a r, Zanzibar, Sri Lanka, Indonesia andChina [7]. The clove is the sun-dried flower bud ofthe clove tree, it is small and brown, about 1/2-inchlong with a 1/6-inch bulbous head at one end.Traditionally, cloves have been used as a spice forculinary and medicinal purposes for many years. Infact, in Nigeria, dry clove buds are used as a spicewith Capsicum spp in the preparation of local deli-cacies such as pepper soup and the local barbecue(Suya) which gives their characteristic pungenttaste, highly desirable by local consumers.

Clove bud oils have biological activities, such asantibacterial, antifungal, insecticidal and antioxidantp roperties, and are used traditionally as flavoringagents and antimicrobial material in food [8, 9, 10].

A n t i m i c robial agents in Clove s p p a re effective again-st oral bacteria that are commonly associated withdental caries and periodontal disease [11] and it wasreported that clove has been successfully used forasthma and various allergic disorders by oral admini-stration [12]. In addition cloves are widely used in tra-ditional medicine for the treatment of many diseasessuch as digestive systems disorders [13].

The major aroma constituents of clove buds areeugenol and eugenyl acetate [9]. Eugenol wasreported to have antifungal activity [14] and inhibi-ted malonaldehyde formation from cod liver oil andoxidation of hexanal [9]. The high levels of eugenolcontained in clove essential oil give it a strong biolo-gical activity and antimicrobial activity [7] andsesquiterpenes, found in clove, were reported aspotential anticarcinogenic agents [15].

So far, most of the work carried out on Eugenia

a r o m a t i c a was on the volatile aroma compoundand the essential oil from the plant [9]. However,since the clove is consumed as a spice and condi-ment in various food preparations, it is pertinent toinvestigate its phenolic and flavonoid constituentsas well as its antioxidant properties.

MATERIALS AND METHODS

MaterialsM a t u red Eugenia aromatica Kuntze buds were

procured from a local market in Akure, Nigeria. Theauthentication was carried out in the Crop, Soil andPest management Department of the FederalUniversity of Technology, Nigeria. All chemicals andreagents used were of analytical grade and thewater used was glass distilled.

Extraction of soluble free phenolic compoundsFor the extraction of soluble free phenolic com-

pounds, 10 g of Eugenia aromatica seeds werehomogenized in 80 % acetone (1:2 w/v) using chil-led Waring blender for 5 mins. The sample wasfurther homogenized using a Polytron homogenizerfor additional 3 mins. to obtain a thoroughly homo-genized sample. Then, the homogenate was filteredthrough Whatman No. 2 filter paper on a Buchnerfunnel under vacuum. The residue was kept for theextraction of bound phytochemicals while the filtratewas evaporated under vacuum at 45 °C. The eva-porated filtrate was designated a soluble free phe-nolic extract, which was then frozen at -40 °C [16].


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Extraction of bound phenolic compoundsThe residue from the above soluble free extraction

was drained and hydrolyzed directly with 20 ml of 4M NaOH at room temperature for 1 hr with shaking.The mixture was later acidified to pH 2 with con-centrated HCl and extracted six times with ethylacetate. The ethyl acetate fraction was later evapo-rated at 45 °C under vacuum to dryness and thiswas designated bound phenolic extract [16].

Total phenol determinationThe total phenol content was determined by

mixing 0.5 ml of the phenolic extracts with 2.5 ml10% Folin-Ciocalteau reagent (v/v) and 2.0 ml of7.5% Na2CO3 was subsequently added. The reac-tion mixture was incubated at 45 °C for 40 min, andthe absorbance was measured at 765 nm using a‘Jenway 6305’ spectrophotometer. Tannic acid wasused as standard phenol [17].

Total flavonoid determinationThe flavonoid content of the extracts was determi-

ned using the method of Zhishen et al. [18]. 0.5 ml ofthe extracts was added to a 10 ml volumetric flask.Distilled water was added to make a volume of 5 ml.At zero time, 0.3 ml of 5 % w/v NaNO2 was added tothe flask. After 5 min, 0.6 ml of 10 % w/v AlCl3 w a sadded and after 6 min, 2 ml of 1M NaOH solutionwas added to the mixture and this was followed byaddition of 2.1 ml distilled water. Absorbance re a d i n gwas measured at 510 nm and the total flavonoid con-tent was subsequently calculated and expressed asmg Rutin equivalent/g of the sample.

Determination of ferric reducing propertyThe reducing property was determined by asses-

sing the ability of the phenolic extracts to re d u c eF e C l3 solution as described by Pulido et al., [19].Appropriate dilutions (0 – 1.0 ml) of the reconstitu-ted extracts in water were mixed with 2.5 ml 200mM sodium phosphate buffer (pH 6.6) and 2.5 mlof 1% potassium ferricyanide. The mixtures wereincubated at 50 °C for 20 min. There a f t e r, 2.5 ml10% trichloroacetic acid was added and subse-quently centrifuged at 4000 rpm for 10 min. Then 5ml of the resulting supernatant was mixed with anequal volume of water and 1 ml of 0.1% ferric chlo-ride. The absorbance was read at 700 nm and theferric reducing antioxidant property was subse-quently calculated.

Free radical scavenging assayThe free radical scavenging ability of the phenolic

extracts against DPPH (1,1-diphenyl-2 picrylhy-drazyl) free radical was evaluated. Appropriate dilu-tion of the extracts (0 – 1.0 ml) of the reconstitutedextracts in water was mixed with 1 ml 0.4 mMmethanolic DPPH radical solution. The mixture wasleft in the dark for 30 min and the absorbance wastaken at 516 nm [20].

Fe2+ chelation assayThe ability of the sample extracts to chelate Fe2 +

was determined using a modified method of Minottiand Aust [20] with a slight modification by Puntel etal. [22]. 150 µl of freshly pre p a red 500 µM FeSO4

was added to a reaction mixture containing 168 µl of0.1 M Tris-HCl (pH 7.4), 218 µl of 0.85 % saline andthe reconstituted extracts (0 – 500 µl). The re a c t i o nm i x t u re was incubated for 5 mins., before the addi-tion of 13 µl of 0.25% 1,10-phenanthroline (w/v). Theabsorbance was subsequently measured at 510 nmand Fe2 + chelating ability was then calculated.

Analysis of dataThe result of three replicates were pooled and

e x p ressed as mean ± standard error (S.E). A oneway analysis of variance (ANOVA) and the LeastSignificant Diff e rence (LSD) were carried out.Significance was accepted at P≤0.05 [23].

RESULTS AND DISCUSSIONS

Most of the previous researches on the phenoliccontents of plant foods only determine the solublef ree phenolics based on solvent extract ion.H o w e v e r, recent reports have shown that in addi-tion to the soluble free phenolics, there are boundphenolics which exist mainly in the form of β-glyco-sides that are usually released and absorbed in thecolon [16, 24, 5, 25]. This study therefore providesinformation on the phenolic content of Eugenia aro-

matica and their antioxidant properties.The phenolic content in Eugenia aromatica is pre-

sented in Table I. The result revealed that the solublef ree phenolic content (215.8 mg/g) was significantlyhigher (P<0.05) than the bound phenolic content(12.3 mg/g). These results were in agreement withearlier reports by Chu et al., [16]; Sun et al., [25],and Oboh and Rocha [5]. However, the soluble fre ephenolic content of Eugenia aromatica was signifi-


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cantly higher (P<0.05) than the soluble free phenolof red pepper reported by Oboh and Rocha, [5] andalso, potato, lettuce, cucumber, carrot, onion, spina-ch and broccoli as reported by Chu et al., [16].

Table I – Total phenol and flavonoid co nte nts of Eugenia aro m at i caphenolic extracts

Sample Total phenol (mg/g) Total flavonoid (mg/g)

Free 215.8±2.5 67.7±3.0

Bound 12.3±3.2 9.1±2.0

F ree phenolics are more readily absorbed andthus, exert their beneficial bioactivities in early dige-stion, however, the significant health benefit ofbound phytochemicals are yet to be fully under-stood [16, 24, 5]. Nevertheless, it is possible thatdifferent plant foods with different amounts of phy-tochemicals are digested and absorbed at differentsites of the gastrointestinal tract where they exerttheir unique health benefit. Bound phytochemicals,mainly in the form of β-glycosides are not digestibleby human enzymes and could survive stomach andsmall intestine digestion to reach the colon, wherethey are digested by bacterial flora to release locallythe phytochemicals to have health benefit [5].Epidemiological studies have shown an inverse rela-tionship between vegetable consumption and coloncancer incidence [26].

The total flavonoid contents of Eugenia aromatica

is presented in Table I. The result also revealed thatthe soluble free phenolic extract had significantlyhigher (P<0.05) flavonoid content (67.7 mg/g) thanthe bound phenolic extracts (9.1 mg/g). This resultis in agreement with the total phenol content (TableI), where the soluble free phenolic extract had signi-ficantly higher (P<0.05) phenolic content than thebound phenolic extract. Flavonoids are polyphenoliccompounds known for their high antioxidant pro-perties and free radical scavenging ability [27].Recent studies have indicated that flavonoid-richfood and plants aid in the management of hyper-tension [28]. Fruits and vegetables are the mains o u rce of dietary polyphenolic antioxidants whilelegumes are rich in flavonoids such as isoflavones.

Soybean consumption has been linked to a re d u-ced risk for certain cancers and diseases of old ageand these health benefits are associated with theaction of isoflavonoids, the major phenolic phytoche-micals found in soybean [29]. Isoflavonoids were also

reported to have both sterile and estrogenic activities[30]. Furthermore, the EC5 0 of the soluble free andbound phenolic extracts are presented in Table II; thesoluble free phenolics had significantly lower EC5 0,higher antioxidant activity than bound phenolics. TheE C5 0 of soluble free phenolic extracts compare sfavourably with that reported for Capsicum annum

v a r. aviculare by Oboh and Rocha [5].

Table II – EC50 of the Eugenia aromatica phenolic extracts

Sa m p l e E C5 0 ( m g / m l )

Fre e 0 . 1 5 ± 0 . 0 3

Bo u n d 0 . 7 3 ± 0 . 0 2

The ferric reducing antioxidant ability of the phe-nolic extracts expressed as Vitamin C equivalent ispresented in Figure 1.

Figure 1 - Reducing property of Eugenia aromatica phenolic extracts

This is a measure of the ability of the phenolicextracts to reduce Fe3+ to Fe2+, a measure of theirantioxidant properties i.e. the higher the re d u c i n gp roperty the higher the antioxidant activity. Bothextracts showed good ferric reducing antioxidantp ro p e r t y. Nevertheless, soluble free phenolic hadsignificantly (P<0.05) higher reducing power thanthe bound phenolics. This correlates with their totalphenol and flavonoid contents (Table I) and is ina g reement with earlier reports that the antioxidantproperty is directly proportional to the phenolic con-tent of plant foods [24, 16]. Antioxidants (phenolics)a re strong reducing agents and this is principallybased on the redox properties of their hydro x y l


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groups and the structural relationships between dif-ferent parts of their chemical structure [31, 32, 5].

Antioxidants carry out their protective pro p e r t i e son cells either by preventing the production of freeradicals or by neutralizing/scavenging free radicalsp roduced in the body [4, 5]. The free radical sca-venging ability of the phenolic extracts were testedagainst stable DPPH radical in solution and it is pre-sented in Figure 2.

Figure 2 - Free radical scavenging ability of Eugenia aromatica phe-nolic extracts

The result revealed that their radical scavengingability followed a dose-response (0.05 – 0.4 mg/ml)p a t t e rn. Soluble free phenolics had significantlyhigher (P<0.05) percentage radical scavenging abilitythan the bound phenolics, which is in agreement withtheir total phenol and flavonoid content. The basis forthe diff e rence in the free radical scavenging ability ofthe extracts cannot be categorically stated, however,t h e re is a possibility that, the glucose moiety ofbound polyphenols may have reduced its free radicalscavenging ability by distorting the structural compo-nents of the phenolics. Structurally, phenolic com-pounds comprise an aromatic ring, bearing one orm o re hydroxyl constituents, and range from simplephenolic molecules to highly polymerized com-pounds [33]. The structure of phenolic compounds isa key determinant of their radical scavenging andmetal chelating activity, and this is re f e r red to ass t r u c t u re–activity relationships [34].

Fe2+ chelation properties of the phenolic extractsa re presented in Figure 3. Both extracts showedhigh Fe2 + chelation ability, but as observed for allother antioxidant indices, the Fe2 + chelating abilityof both extracts agreed with their total phenol andflavonoid contents where soluble free phenolics had

significantly (P<0.05) higher Fe2 + chelating abilitythan the bound phenolics. This is in agreement withan earlier work by Oboh and Rocha [5], where solu-ble free phenolics had higher Fe2 + chelating abilityand caused higher inhibitory effect on Fe2+-inducedlipid peroxidation in rats’ brain and liver in-vitro.

Fi g u re 3 - Fe2 + c h e l ating ability of Eugenia aro m at i ca p h e n o l i cextracts

The presence of glucose moiety in bound pheno-lics, may have altered the structural activity of boundphenolics thus, responsible for the lower Fe2 + c h e l a-ting ability observed in bound phenolics. Metal chela-ting ability is a function of structural composition andarrangement of phenolics [34]. Fe usually accumula-tes in the brain with age, and could also be stored inthe liver inducing oxidative stress, which is largelyresponsible for both liver and brain damage [5]. Themechanism by which iron can cause this deleteriouse ffect is that Fe2 + reacts with hydrogen pero x i d e( H2O2) to produce the hydroxyl radicals (OH•) viaFenton reaction. Superoxide can also react with Fe3 +

to regenerate Fe2 + that again goes into the Fentonreaction [35, 36, 5]. The hydroxyl radicals generatedcause the oxidation of lipids, proteins, DNA and cand i rectly attack the polyunsaturated fatty acids of thecell membranes and induce lipid peroxidation. Obohand Rocha [5] reported that the domineering mecha-nism through which Capsicum annum var aviculare

( Tepin) polyphenols protect brain and liver is thro u g htheir Fe2 + chelating ability.

CONCLUSIONS

In conclusion, Eugenia aromatica contains solublefree phenolics (215.8 mg TA/g) and bound pheno-lics (12.3 mg TA/g), with flavonoid content (69.7 mg


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Rutin/g) and (9.09 mg Rutin/g) soluble free pheno-lics and bound phenolics respectively. However, thesoluble free phenolic had higher antioxidant proper-ties than bound phenolics. Nevertheless, bothextracts had good reducing power. Antioxidant acti-vity of phenolics is mainly because of their re d o xp roperties, which allow them to act as re d u c i n gagents, hydrogen donors, free radical scavengers,singlet oxygen quenchers and metal chelator.

REFERENCES

[1] M. Suhaj, Spice antioxidants isolation and theirantiradical activity: a re v i e w. Journal of FoodComposition and Analysis 1 9, 531 – 537(2006)

[ 2 ] L. Calucci, C. Pinzono, M. Zandomeneghi, A.Capocchi, Effects of gamma-irradiation on thef ree radical and antioxidant contents in nine aro-matic herbs and spices. Journal of AgriculturalFood Chemistry 5 1, 927 – 934 (2003)

[3] L.S. Lai, S.T. Chou, W. W. Chao, Studies onthe ant ioxidative activities of Hsian-tsao(Mesona procumbens Hemsl ) leaf gum.Journal of Agricultural and Food Chemistry 49,

963 – 968 (2001)[4] G. Oboh, Antioxidant properties of some com-

monly consumed and underutilized tro p i c a llegumes. European Food Research andTechnology 224, 61 – 65 (2006)

[5] G. Oboh, J.B.T. Rocha, Polyphenols in re dpepper [Capsicum annuum var. aviculare

( Tepin)] and their protective effect on somep ro-oxidants induced lipid peroxidation inbrain and l iver- i n - v i t r o. European FoodR e s e a rch and Technology 2 2 5, 237 – 247(2007)

[6] G. Oboh, A.A. Akindahunsi, Change in theascorbic acid, total phenol and antioxidantactivity of sun-dried commonly consumedgreen leafy vegetables in Nigeria. Nutrition andHealth 18, 29 – 36 (2004)

[7] W. Guan, S. Li, R. Yan, S. Tang, C. Quan,Comparison of essential oils of clove budsextracted with supercritical carbon dioxide andother three traditional extraction methods.Food Chemistry 101, 1558 – 1564 (2007)

[8] Y. Huang, S.H. Ho, H.C. Lee, Y.L. Ya p ,Insecticidal properties of eugenol, isoeugenoland methyleugenol and their effects on nutri-

tion of Sitophilus zeamais Motsch; (Coleo-ptera: Curculionidae) and Tribolium castaneum

(Herbst); (Coleoptera: Tenebrionidae). Journ a lof Stored Products Research, 3 8, 403 – 412(2002)

[9] K.G. Lee, T. Shibamoto, Antioxidant pro p e r t yof aroma extract isolated from clove buds[Syzygium aromaticum (L.) Merr. Et Perry].Food Chemistry 74, 443 – 448 (2001)

[10] A. Velluti, V. Sanchis, A.J. Ramos, S. Marin,Inhibitory effect of cinnamon, clove, lemon-grass, oregano and palmarose essential oilson growth and fumonisin B1 production byFusar ium prol i feratum in maize grain.International Journal of Food Microbiology 89,145–154 (2003)

[11] L. Cai, C.D. Wu, Compounds from S y z y g i u m

aromaticum possessing growth inhibitory acti-vity against oral pathogens. Journal of NaturalProducts 59, 987 – 990 (1996)

[12] H.M. Kim, E.H. Lee, S.H. Hong, Effect ofSyzygium aromaticum extract on immediatehypersensitivity in rats. Journal of Ethno-pharmacology 60, 125 – 131 (1998)

[13] T. Baytop, Therapy with medicinal plants inTurkey (Past and Present), vol. 3255, 2nd ed.,Publications of the Istanbul University, Istanbul244 – 245 (1999)

[14] H. Martini, M. We i d e n b o rn e r, S. Adams, B.Kunz, Eugenol and carvacrol: the main fungici-dal compounds in clove. Italian Journal ofFood Sciences 63 – 67 (1996)

[15] G.Q. Zheng, P.M. Kenny, K.T. Lam,Sesqui terpenes from clove (E u g e n i a

c a ry o p h y l l a t a) as potential anticarc i n o g e n i cagents. Journal of Natural Products 55, 999 –1003 (1992)

[16] Y. Chu, J. Sun, X. Wu, R.H. Liu, Antioxidantand antiproliferative activity of common vege-tables. Journal of Agricultural and FoodChemistry 50, 6910 – 6916 (2002)

[17] V.L. Singleton, R. Orthofer, R.M. Lamuela-Raventos, Analysis of total phenols and otheroxidation substrates and antioxidants bymeans of Folin-Ciocalteau Reagent. Methodsin Enzymology 299, 152 – 178 (1999)

[18] J. Zhishen, T. Mengcheng, W. Jianming, Thedetermination of flavonoid content in mulberryand their scavenging effects on supero x i d eradicals. Food Chemistry 64, 555 – 559 (1999)


136

[19] R. Pulido, L. Bravo, F. Saura-Cal ixto,Antioxidant activity of dietary polyphenols asdetermined by modified ferric reducing/antioxi-dant power assay. Journal of Agricultural andFood Chemistry 48, 3396 – 3402 (2000)

[20] F. Ursini, M. Maiorino, P. Morazzoni, A. Roveri,G. Pifferi, A novel antioxidant (IdB 1031) affec-ting molecular mechanisms of cellular. Fre eRadical Biology and Medicine 1 6, 547 – 553(1994)

[21] G. Minotti, S.D. Aust, An investigation into themechanism of citrate-Fe2 +-dependent lipidp e roxidat ion. Free Radical Biology andMedicine 3, 379 – 387 (1987)

[22] R.L. Puntel, C.W. Nogueira, J.B.T. Rocha,Krebs cycle intermediates modulate thiobarbi-turic reactive species (TBARS) production inrat brain in vitro. Neurochemical Research 30

(2) 225 – 235 (2005)[23] J.H. Zar, Biostatistical analysis. USA: Prentice-

Hall, Inc., p. 620 (1984)[24] J. Sun, Y. Chu, X. Wu, R. Liu, Antioxidant and

a n t i p roliferative activities of common fruits.Journal of Agricultural and Food Chemistry 50,7449 – 7454 (2002)

[25] G. Oboh, A.O. Ademiluyi, A.A. Akindahunsi,Change in the polyphenol distribution andantioxidant activities during fermentation ofsome underutilized legumes. Food Scienceand Technology International. In press (DOI:10.1177/1082013208101022)

[26] L.E. Voorrips, R.A. Goldbohm, G. van Poppel,F. Sturmans, R.J.J. Hermus, P.A. van denBrandt, Am. J. Epidemiol 1 5 2, 1081 – 1092(2000)

[27] R. Schere r, H.T. Godoy, Antioxidant activityindex (AAI) by the 2,2-diphenyl-1-picrylhy-drazyl method. Food Chemistry 1 1 2, 654 –658 (2009)

[28] Y.I. Kwon, D.A. Vattem, K. Shetty, Clonalherbs of Lamiaceae species against diabetesand hypertension. Asia Pac. J. Clin. Nutr. 5,424 - 432 (2006)

[29] P. Mccue, K. Shetty, Health benefits of soyisoflavonoids and strategies for enhancement:a review. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 44, 361 –367 (2004)

[30] K.R. Price, G.R. Fenwick, Naturally occurringo e s t rogens in foods – a re v i e w. Food Add.Contam., 2, 73 - 106 (1985)

[31] C. Rice-Evans, N.J. Mil ler, G. Paganga,S t r u c t u re-antioxidant activity relationships offlavonoids and phenolic acids. Free RadicalBiology and Medicine 20, 933 – 956 (1996)

[32] C. Rice-Evans, N.J. Mil ler, G. Paganga,Antioxidant propert ies of phenolic com-pounds. Trends in Plant Science 2, 152 – 159(1997)

[33] L. Bravo, Phenolic phytochemicals: Chemistry,dietary sources, metabolism, and nutritionalsignificance. Nutr. Rev. 56, 317 – 333 (1998)

[34] N. Balasundram, K. Sundram, S. Samman,Phenolic compounds in plants and agri-indu-strial by-products: Antioxidant activity, occur-rence, and potential uses. Food Chemistry 99,191 – 203 (2006)

[35] M.L. Harr is, H.J. Shil ler, P.M. Reil ly, M.Donowitz, M.B. Grisham, G.B. Bulkley, Fre eradicals and other reactive oxygen metabolitesin inflammatory bowel disease: cause, conse-quence or epiphenomena. Pharmacology andTherapeutics 53, 375 – 408 (1992)

[36] C.G. Fraga, P.I. Oteiza, Iron toxicity andantioxidant nutrients. Toxicology 180, 23 – 32(2002)

Received November 11th, 2008,accepted February 2nd, 2009

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World Congress on oils and fats and

28th ISF Congress

Sydney, 27-30 settembre 2009

I congressi della ISF vengono organizzati ogni dueanni. Il primo fu organizzato a Milano nel 1956 edhanno mantenuto cadenza biennale. I più recenti sisono tenuti a Berlino nel 2001, a Bordeaux nel2003, a Praga nel 2005.Il programma del congresso includerà temi relativi asalute e nutrizione, processi di produzione, chimicadei lipidi, olio di oliva, acquacultura, bioscienza deilipidi, oleochimica, antiossidanti, biodiesel e lipidinella scienza animale.Il programma è molto complesso; informazioni det-tagliate si possono re p e r i re nel sito www. i s f s y d-ney2009/comNei giorni immediatamente precedenti all’inizio delc o n g resso saranno tenuti brevi corsi su argomentispecifici.Lipid oxidation and antioxidants short course

26-27 settembre 2009

Il corso é sponsorizzato da AOCS e dalla sezioneaustraliana di AOCS. Organizzatore Dr. Edwin Frankeldel Dept of Food Science and Te c h n o l o g y, Universityof California, Davis.Il corso di un giorno e mezzo ha lo scopo di insegnareai partecipanti i principali fattori che influenzano la sta-bilità degli alimenti contenenti oli; come gli antiossidantipossono essere usati per minimizzare gli effetti dell’os-sidazione lipidica in alimenti ed in sistemi biologici;come gli antiossidanti aumentano la loro stabilità inmodo da sviluppare prodotti sicuri per la salute.

In modo più specifico il programma sarà il seguente:• Free radical oxidation and methods to determine

oxidative stability• Control of oxidation and antioxidants• Nutritional aspects of lipid oxidation• Nutritional aspects of antioxidants• Nutritional aspects of vitamin E and natural

antioxidants• Antioxidants in food emulsions• Mechanism of lipid oxidation and antioxidants in

multi-phase emulsion systems• Quality and safety implications of lipid oxidation• Advanced analytical methods for volatile oxidation

products from omega-3 fish oils• Frying performance and evaluation of modified

vegetable oilsPer la registrazione online consultare il sito del congresso

www.isfsydney2009.com

9th AOCS practical edible oil refining short course


O r g a n i z z a t o re del corso: Dr. S. Sefa Koseoglu diFiltration and Membrane World LLC, USA.Il programma provvisorio (può subire cambiamentinel tempo) è il seguente:• A. Richards (Food Science Australia, Australia)The chemistry of fats and oils• K.-P. Eickhoff (GEA Westfalia, D)Review of current degumming technologies• G. Boemer (ÃHMI Engineering, D) Bleaching tech-

nologies and potentials in savings of bleachingearth

• N. Andria (Süd Chemie, D) Bealching cost calcu-lation

• F. Veldkamp (Amafilter-LFC, NL) How to deal withfiltration problems

• L. Inturissi (Cargill, Australia) New approaches tophysical refining

• H . C r. Holm (Novozymes, DK) Enzymatic degum-ming and interesterification of oils and fats: funda-mentals, enzymes, and industrial applications

• F. Galhardo (Bunge, USA) Process optimizationstudies on enzymatic degumming using PLA andPLC enzymes

• M. Kellens (DeSmet-Ballestra, B) Considerationson winterization and fractionation

• K. Carlson (Danisco Inc., USA) Deodorizer designand optimization

• I. Debruyne (ID&A, B) Mechanism of oxidation andquality criteria in frying and cooking oils

• G. Hatfield (Bunge North America, Canada)Critical considerations in processing crude rape-seed and canola oils

• A. Marangoni (Universiity of Guelph, Canada)Review of fat crystallization and structure

• C. Wijesundera (Food Science Australia) Newhealthy vegetable oil products

• D. Bell (Connell Wagner Ltd, New Zealand) Fish oil( E PA and DHA) and its refining to achieve pro-ducts used by the food and natural health pro-ducts industries

• R. Verhe (University of Gent, B) Separation ofminor components of oils and fats

• L. Eyres (Eyres Commercial Group, New Zealand)Boutique oils in New Zealand: avocado, olive, flaxand boutique oils

• R. Daniell (Nutrizeal, New Zealand) Global busi-ness and opportunities for supercritical carbondioxide processing of lipid materials

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• P. Gerstenberg (Gerstenberg Schröder A/S, DK)Critical parameters and points in margarine pro-duction: how to identify and solve problems

Per la registrazione on line a questo corso consulta-re il sito del congresso www.isfsydney2009.com

Per maggiori informazioni: American Oil Chemists Society

www.aocs.org/meetings

7th Euro Fed Lipid Congress

Graz (Austria) 18-21 ottobre 2009

Il settimo congresso dell’Euro Fed Lipid avrà pertema: Lipids, fats and oils: from knowledge to appli-cation.Si terrà presso il Palazzo congressi di Graz, il capo-luogo della Stiria.Riportiamo i titoli delle 4 conferenze plenarie e dellekeynote lectures in programma.Conferenze plenarie

• Gary R. List (NCAUR-USDA, Peoria, IL. USA)E u ropean Lipid Technology Aw a rd Lecture :Impact of trans fat nutrition labelling on the USedible oil industry

• R. Zechner (University of Graz, A) European LipidScience Award Lecture, Pathway under construc-tion. The catabolism of fat in adipose and non-adipose tissues

• J.O. Metzger (Univers ity of Oldenburg, D) DGF Norman Medal Lecture, Fats and oils asrenewable feedstock for chemistry

• A. Dijkstra (St. Eutro p e - d e - B o rn, F) AFECG Chevreul Medal Lecture, Questions noone is asking

Keynote lectures

• Lipid sources- Olive oil: R. Sacchi (Napoli) - Virgin olive oil and

molecular gastronomy: cooking, antioxidants andflavour

- Palm oil: M.B. Wahid (Kajang, Selangor, Malesia) –Versatility of the palm oil along the whole supplychain

- Virgin oils: L. Brühl (Münster, D) – Virgin oils.Exiting potentials

- Plant seed oils: L. Kunst (Va n c o u v e r, Canada) –Control of seed oil accumulation in arabidopsis

- Microbial lipids: C. Schmidt-Dannert (St. Paul,MN, USA) – Engineering microbial cells for isopre-noid biosynthesis

- Fish oil: R. Hole (Oslo, N) – Surplus demand of fishoil, farmed fish still a healthy food product in 2025

• Lipid technology- O l e o c h e m i s t ry: J. Barrault (Poitiers, F) – Solid

catalysts for the selective use of glycerol as natu-ral organic building block

- F rying oils and frying technologies: Ch. Gertz(Hagen, D) – Means of prolonging the stability offrying fats and oils

- Developments in processing technology: Ph.S.Kerr (St. Olous, MO, USA) – The development ofhealthy, shelf-stable foods enriched with stearido-nic acid

- Physical propert ies of lipids: G.J.T. Ti d d y( M a n c h e s t e r, GB) – How lipid chemical structuredetermines physical structure: a practical appro a c h

• Lipid bioscience- Lipid analytical techniques: I. Feussner (Göttingen,

D) – From lipid profiling to lipid fingerprinting. Newlipidomic techniques of metabolomic analysis

- A u t h e n t i c i t y: P.A. Bre reton (York, GB) – Newapproaches to authenticating food: an overview

- L i p i d o m i c s: A.V. - P. Vidal-Puig (Cambridge, GB) –Lipidomics, lipotoxicity and the metabolic syndro m e

- Enzymatic modification of lipids: H. Kühn (Belin, D)– Enzymatic lipid peroxidation. From mechanismsto biological implications

- Lipid oxidation: H. Sies (Düsseldorf, D) – Oxidativestress: plasma lipoprotein oxidation and the pro-tective role of micronutrients

• Lipids in health and nutrition- Lipid associated disorders: Th.J.C. Van Berkel

(Leiden, NL) – Partners in crime for cardiovasculardisease. Lipids and inflammation

- Lipids in human nutrit ion : P.C. Calder(Southampton, GB) – Polyunsaturated fatty acidsand inflammatory processes. Mechanisms ofaction and therapeutic possibilities

- Lipids in dairy products: J.M. Chard i g n y(Clermont-Ferrand, F) – Trans fatty acids fro mruminants. A health issue of not?

- Lipids in pharmaceutics and cosmetics: I.F.Uchegbu (London, GB) - Engineering nanoparti-cles for pharmaceutical applications

- Lipids in animal science: D.I. Givens (Reading, GB)– Animal nutrition and lipids in animal products andtheir contribution to human intake and health

Per informazioni dettagliate e le modalità di registrazione

all’evento consultare il sito www.eurofedlipid.org/meetings/graz

che sarà costantemente aggiornato

e-mail: [email protected]

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World soybean re s e a rch confere n c e

VIII – WSRC

Pechino, 10-15 agosto 2009

La manifestazione, la prima delle varie edizioni cheviene organizzata in Cina, s i terrà pre s s ol’International Convention Center di Pechino, ospita-ta da Chinese Academy of Agricultural Sciences eCrop Science Society of China. O r g a n i z z a t o re l’Institute of Crop Sciences dellaChinese Academy of Agricultural Sciences in colla-borazione con China Soybean Industry Association,Chinese Cereals and Oils Association, HeilongjiangAcademy of Agricultural Sciences, Jilin Academy ofAgricultural Sciences, Argentine Soybean ChainAssociation (ACSOJA), Bean Products Committeeof China National Food Industry Associat ion,Soyatech, LLC, USA. Supporters: Ministerodell’Agricoltura e Ministero di Scienze e Tecnologia,Chinese Academy of Engineers, China Associationfor Science and Technology, State Administration ofF o reign Experts Affairs, National Natural ScienceFoundation of China, United Nations DevelopmentP rogramme China, Jil in Provincial AgriculturalCommittee, Heilongjang Provincial AgriculturalCommittee. Il programma scientifico verterà sui seguenti princi-pali argomenti:1.International trade and safe and secure supply2.Livestock and aquaculture feed industry needs3.Biotechnology and its innovation4.Conservation and sustainable utilization of wild

soybeans (UNDP China Forum)5.Sustainable farming practices6.Intellectual property protection7.Health and nutrition8.Food safety and quality management

Per informazioni dettagliate:

http://www.wsrc2009.cn/en/forum.asp

Oils+fats

Fiera Internazionale di Monaco,


La manifestazione, Fiera commerciale internazionalesulla produzione e il processo di oli e grassi da fontirinnovabili, riguarderà tutti gli argomenti del settore,le materie prime e prodotti ausiliari per il processo,l’assicurazione di qualità, il packaging ed i trasporti,informando i visitatori sulle ultime tendenze di mer-cato e sugli sviluppi tecnologici.

Settori della mostra saranno: Materie prime ed ausi-liari, Produzione e processing, Logistica, Contro l l oqualità e sicurezza, Ricerca, Istituzioni ed editoria.La mostra è dedicata a produttori di oli e grassigrezzi e raffinati, margarina e oli e grassi alimentari,mangimi, biodiesel, glicerina, lanolina, lubrificanti,c e re, a commercianti del settore, ad associazionidel settore dell’agricoltura.

Per informazioni dettagliate:

http://www.oils-and-fats.com/link/en/16331430

CHEM-MED 2009

Fieramilano, Rho, 25-27 novembre 2009

Chem-Med, l’evento internazionale della chimicache si terrà nel novembre prossimo presso i padi-glioni della Fiera di Milano a Rho, riunisce nel suoambito diverse esposizioni:RICHMac, la storica rassegna internazionale sull’a-nalisi strumentale e di processo e delle tecnologieper il laboratorioBiotech Expo, il nuovo salone della biotecnologiaS-CHEM, la mostra dedicata all’industria chimica ealla sostenibilità che coinvolge le aziende di prodottichimici in un’ottica sostenibileBond-Tech Expo, il salone conferenza sulle tecnolo-gie per sigillanti e adesivi che completa CPSA Expo,il salone dedicato al coating, industria delle pitture,trattamenti di superficie e applicazioniCompomat Lightweight Expo, il salone internaziona-le dei materiali compositi e ultraleggeri.Chem-Med 2009 è nato da una joint-venture traFiera di Milano Tech, che organizza mostre ad altocontenuto tecnologico, e Artenergy Publishing,società specializzata nell’organizzazione di fiere econvegni rivolti al trade ed all’industria.

Per informazioni dettagliate

www.chem-med.eu

40° Giornate CED

Barcellona, 14-15 aprile 2010

La 40° ediz ione delle Giornate del ComitatoSpagnolo delle Detergenza si terrà a Barc e l l o n a ,organizzata in col laborazione con Centro deInvestigacion y Desarrol lo (CSIC), AsociacionEspañola de Pro d u c t o res de Sustancias paraAplicaciones Tensioactivas (AEPSAT), Asociacion deE m p resas de Detergentes y de Productos deLimpieza, Mantenimiento y Afines (ADELMA),

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Sociedad Española de Quimicos Cosmeticos.Il programma scientifico consisterà in confere n z eplenarie, letture e poster sui seguenti argomenti:Materie primeSintesi e analisiNuovi sviluppi ed applicazioniChimica-fisicaAmbienteLegislazioneMarketingConsumi/distribuzione

Data limite per la presentazione di lavori il 30 settem-b re 2009. Gli interessati troveranno il modulo per lap resentazione nel sito internet www. c e d m e e t i n g . c o m .Il comitato scientifico valuterà i lavori e darà confermasull’accettazione entro il mese di novembre 2009.

Informazioni:

Comité Español de la Detergencia,

Tensioactivos y Afines

Roger de Lluria, 44, 2n – E-08009 Barcelona, España

www.cedmeeting.com

Sommario - Innovhub SSIextranet.innovhub-ssi.it/allstd/risg/2009-RISG 2.pdf · 2011. 2. 8. ·...

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