SINTESI E CARATTERIZZAZIONE DI MOLECOLE PER IL … famiglia dei recettori per la colecistochinina....

UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI PADOVA

DIPARTIMENTO DI SCIENZE DEL FARMACO

CORSO DI LAUREA MAGISTRALE IN FARMACIA

TESI DI LAUREA

SINTESI E CARATTERIZZAZIONE DI

MOLECOLE PER IL TARGETING

ATTIVO SUL RECETTORE CCK2R

RELATORE: CH.MO PROF. GIOVANNI MARZARO

CORRELATORI: CH.MO PROF. NICOLA REALDON

DOTT. ALBERTO ANDRIGHETTO1

DOTT.SSA FRANCESCA BORGNA1

DOTT.SSA FRANCESCA MASTROTTO

DOTT. MATTIA ASTI2

1Istituto Nazionale di Fisica Nucleare 2Arcispedale Santa Maria Nuova

LAUREANDO: MARCO VERONA

ANNO ACCADEMICO: 2017/2018

Ai miei genitori

A mia sorella Giulia

I

INDICE

1. RIASSUNTO ................................................................................................................ pag. 1

2. INTRODUZIONE ................................................................................................. pag. 3

2.1 TARGETED THERAPY E SOVRAESPRESSIONE

RECETTORIALE ......................................................................................................... pag. 4

2.1.1 COLECISTOCHININA E SUE TIPOLOGIE

RECETTORIALI ............................................................................................... pag. 6

2.1.2 SOVRAESPRESSIONE DI CCK2R NEL CANCRO .............. pag. 7

2.1.3 STRUTTURA RECETTORIALE E RAZIONALE

IMPIEGATO NELL’IDEAZIONE DEI LIGANDI .................. pag. 9

2.2 RADIOFARMACI ..................................................................................................... pag. 10

2.2.1 RADIONUCLIDI IN CAMPO MEDICO ...................................... pag. 11

2.2.2 RADIONUCLIDI PER LA DIAGNOSTICA .............................. pag. 13

2.2.3 RADIONUCLIDI IMPIEGATI IN TERAPIA .......................... pag. 17

2.2.3.1 EMETTITORI α ....................................................................... pag. 17

2.2.3.2 EMETTITORI β ....................................................................... pag. 19

2.2.3.3 EMETTITORI γ ....................................................................... pag. 20

2.2.4 PRODUZIONE DI RADIONUCLIDI AD INTERESSE

MEDICO ................................................................................................................ pag. 20

2.3 PROGETTO SPES: NUOVA FRONTIERA PER LA

PRODUZIONE DI FASCI DI IONI ESOTICI

RADIOATTIVI ............................................................................................................. pag. 23

2.3.1 PRODUZIONE DI FASCI DI IONI RADIOATTIVI ........... pag. 24

2.3.2 PROGETTO ISOLPHARM .................................................................... pag. 26

2.3.2.1 PRODUZIONE DI RADIOFARMACI MEDIANTE

L’UTILIZZO DELLA TECNICA ISOL .................... pag. 26

2.3.2.2 NUCLIDI DI INTERESSE MEDICO OTTENIBILI

CON IL TARGET SPES......................................................... pag. 27

3. OBIETTIVO .............................................................................................................. pag. 29

4. RISULTATI E DISCUSSIONE ...................................................... pag. 31

4.1 SINTESI DI Z-360 (NASTORAZEPIDE)............................................ pag. 31

4.2 SINTESI DI IP1 (ISOLPHARM 1) .............................................................. pag. 35

II

4.3 SINTESI DI IP2 (ISOLPHARM 2) ................................................................. pag. 38

4.4 TENTATIVO DI SINTESI DI UN LINKER IDROFILICO

MEDIANTE RAFT POLYMERIZATION ............................................ pag. 44

5. PARTE SPERIMENTALE ....................................................................... pag. 53

5.1 MATERIALI ....................................................................................................................... pag. 53

5.2 STRUMENTAZIONE ................................................................................................ pag. 53

5.3 METODI ................................................................................................................................. pag. 55

5.3.1 SINTESI DI NASTORAZEPIDE (Z-360) ......................................... pag. 55

5.3.2 SINTESI DI IP1 .................................................................................................... pag. 66

5.3.3 SINTESI DI IP2 .................................................................................................... pag. 75

5.3.3.1 SINTESI DIVERGENTE DA Z-360 .............................. pag. 75

5.3.3.2 SINTESI CONVERGENTE SU Z-360 ......................... pag. 81

5.3.3.3 SINTESI DI IP2 ............................................................................ pag. 88

5.3.4 TENTATIVO DI SINTESI DEL LINKER IDROFILICO

POLIMERICO ...................................................................................................... pag. 92

5.3.5 ANALISI TNBS: IDENTIFICAZIONE DEI GRUPPI

AMMINICI PRIMARI .................................................................................. pag. 100

6. BIBLIOGRAFIA ............................................................................................... pag. 103

III

INDICE DEGLI SCHEMI

Schema 1 Sintesi di Nastorazepide (Z.360) pag. 31

Schema 2 Formazione dell’isocianato: meccanismo di reazione pag. 34

Schema 3 Sintesi di IP1 (Isolpharm 1) pag. 35

Schema 4 Sintesi di IP2 (Isolpharm 2) pag. 38

Schema 5 Meccanismo di attivazione dell’acido mediante CDI pag. 39

Schema 6 Deprotezione del gruppo Fmoc mediata da CDI pag. 40

Schema 7 Meccaniscmo di acil migrazione pag. 41

Schema 8 Tentativo di sintesi del linker polimerico pag. 45

Schema 9 Meccanismo di polimerizzazione RAFT pag. 46

Schema 10 Sintesi del linker polimerico pag. 49

IV

INDICE DELLE FIGURE

Figura 1 Struttura generale della famiglia recettoriale GPCR pag. 7

Figura 2 Struttura dell’Aspericina e dei suoi derivati di origine pag. 8

sintetica impiegati nello studio della terapia mirata sul

recettore CCK2R

Figura 3 Caratteristica strutturale relativa alla connessione small pag. 9

molecule-ligando mediante una corta catena alchilica

Figura 4 Carta dei nuclidi pag. 10

Figura 5 Esemplificazione della struttura e funzione di un pag. 13

Radiofarmaco coniugato ad una molecola

Figura 6 Strumentazione impiegata nell’analisi diagnostica pag. 14

SPECT

Figura 7 Schema riassuntivo della tecnica di analisi PET pag. 16

Figura 8 Formula di struttura 18FDG pag. 17

Figura 9 Reattore nucleare, acceleratore, generatore di pag. 22

radionuclidi

Figura 10 Schema del sistema di produzione dei RIB pag. 25

Figura 11 Schema a blocchi del progetto ISOLPHARM pag. 27

Figura 12 Struttura generale di un radioligando pag. 30

Figura 13 Nastorazepide (Z-360) pag. 30

Figura 14 DOTA tris-(tert-butil estere) pag. 37

Figura 15 Sottoprodotto ottenuto in seguito alla ciclizzazione pag. 40

Figura 16 Struttura generale RAFT agent pag. 44

Figura 17 Analisi di massa del polimero pag. 48

Figura 18 Cicloaddizione di Huisgen azide-alchino pag. 50

V

Figura 19 Retta di taratura utilizzata per l’analisi TNBS pag. 101

Figura 20 Polimero analizzato mediante saggio TNBS pag. 101

INDICE DELLE TABELLE

Tabella 1 Esempi di tipologie tumorali presentanti pag. 4

sovraespressione recettoriale

Tabella 2 Alcuni dei farmaci attualmente in commercio pag. 5

impiegati nella terapia mirata di diverse tipologie

tumorali

Tabella 3 Dati relativi al volume dei campioni e loro pag. 100

assorbanza per la costruzione della retta di

taratura. (Analisi TNBS)

Tabella 4 Valori di assorbanza del campione incognito e pag. 102

concentrazione dei gruppi aminici presenti

VI

ABBREVIAZIONI

A Numero di massa

ABS Assorbanza

Boc-Dap-OH acido (S)-2-[(tert-Butilossicarbonil)ammino]-3-

amminopropionico

BOP Benzotriazol-1-ilossitris(dimetilammino)fosfonio

esafluorofosfato

CDI Carbonildiimidazolo

CE Cicloesano

DCM Diclorometano

DMF N,N-Dimetilformammide

EDCl 1-Etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimmide

EGFR Epidermal growth factor receptor

EtOAc Acetato di etile

EtOH Etanolo

GPC Gel permeation chromatography

GPCR G protein coupled receptor

IP1 IsolPharm 1

IP2 IsolPharm 2

LET Linear energy transfer

LiHMDs Litio bis(trimetilsili)ammide

MeOH Metanolo

MW Microwaves

N Numero di neutroni

NHS N-idrossisuccinimmide

PET Tomografia ad emissione di positroni

PMSA Prostate specific membrane antigen

SPECT Tomografia ad emissione di fotone singolo

TEA Trietilammina

TFA Acido trifluoroacetico

THF Tetraidrofurano

TLC Thin Layer Cromatography

TMS Tetrametilsilano

TNBs Acido 2,4,6-trinitrobenzen solfonico

Z Numero atomico

VII

d Doppietto

dd Doppietto di doppietti

m Multipletto

q Quartetto

s Singoletto

s all Singoletto allargato

t Tripletto

1

1. RIASSUNTO

In questo lavoro di tesi è descritta la messa a punto di una via di sintesi efficace

per la preparazione di ligandi adibiti al targeting attivo di radioisotopi ad

elevata purezza prodotti mediante metodo ISOL. Il target preso in

considerazione in questo operato di tesi è il recettore CCK2R, una sottoclasse

recettoriale sovraespressa in alcune tipologie tumorali appartenente alla

famiglia dei recettori per la colecistochinina.

In primo luogo, è stato individuato un direzionante, molecola avente il

compito di riconoscere e indirizzare il ligando verso il recettore d’interesse. A

tale scopo è stata presa in considerazione la Nastorazepide o Z-360, un

derivato benzodiazepinico antagonista del recettore CCK2R. È stata quindi

delineata la via di sintesi per l’ottenimento di quest’ultima basandosi su un

processo sintetico riportato in letteratura, apportando diverse modifiche per

migliorarne l’efficienza generale.

Successivamente sono stati ideati e sintetizzati ex novo alcuni linker idrofilici

aventi il compito di incrementare l’affinità dei ligandi verso il recettore e

contestualmente modularne la solubilità e la farmacocinetica.

In seguito al loro assemblamento, mediante condensazione di direzionante,

linker e chelante, i ligandi ottenuti sono stati caratterizzati e sottoposti a studi

preliminari volti a determinarne la solubilità e la stabilità.

Riassunto

2

3

2. INTRODUZIONE

Il cancro è una patologia al giorno d’oggi ampiamente diffusa e una delle

principali cause di morte nel mondo. Tale patologia è causata da un

progressivo accumulo di mutazioni non riparate a carico del genoma cellulare.

Aneuploidia, riarrangiamenti genetici e cromosomici, amplificazioni,

delezioni, mutazioni che portano alla perdita o all'acquisto di una funzione

sono fra le cause più comuni alla base della genesi tumorale. La conseguenza

di queste mutazioni è l’assunzione da parte delle cellule neoplastiche di un

comportamento anormale che porta a crescita cellulare incontrollata, perdita

della capacità auto-apoptotica, mancanza di inibizione da contatto, instabilità

genomica e propensione alla metastasi 1.

Negli ultimi anni, un grande contributo in campo terapeutico è stato fornito

dalla targeted therapy, strategia terapeutica innovativa comprendente una

nuova generazione di farmaci antitumorali a bersaglio molecolare sviluppata

in maniera tale da colpire in modo selettivo un target specifico presente

soltanto nelle cellule tumorali, o comunque con una maggiore espressione in

queste rispetto alle cellule normali. L’azione più specifica di questi farmaci ha

permesso di limitarne gli effetti collaterali rispetto a quanto avviene con i

farmaci chemioterapici convenzionali, con notevole miglioramento della

qualità della vita dei pazienti affetti da tumore.

La lotta contro il cancro ha inoltre portato ad approcci multidisciplinari,

traendo preziose opportunità da ambiti scientifici diversi dalla medicina. La

condivisione delle conoscenze e delle potenzialità di discipline quali la

bioingegneria, la fisica e la chimica delle particelle subatomiche hanno portato

ad un grande sviluppo in campo medico nucleare e radiofarmaceutico. Questo

ha permesso lo sviluppo di nuovi campi di ricerca volti alla produzione di

nuovi radiofarmaci ad azione mirata verso il tessuto neoplastico e allo

sviluppo di nuove tecnologie di imaging sempre più accurate e affidabili 2.

La sperimentazione e la realizzazione di questi nuovi approcci di cura e

diagnosi in ambito oncologico porterà a migliorare la qualità di vita e la

sopravvivenza dei pazienti affetti da questa patologia offrendo una possibile

alternativa alle terapie convenzionali.

Introduzione

4

2.1 TARGETED THERAPY E SOVRAESPRESSIONE

RECETTORIALE

Negli ultimi anni le ricerche svolte in campo immunologico, genetico e

biologico molecolare hanno permesso di sviluppare nuove competenze in

ambito oncologico; è stato possibile identificare e comprendere la genesi, la

progressione e le caratteristiche di diverse tipologie tumorali. È stato inoltre

possibile identificare una specifica correlazione target-patologia la quale ha

permesso lo sviluppo di un nuovo modello di terapia a bersaglio molecolare

nota come targeted therapy. Quest’ultima a differenza della tradizionale

chemioterapia, scarsamente specifica e causa di innumerevoli effetti

indesiderati, presenta un’azione diretta in modo specifico contro un bersaglio

presente solamente nelle cellule neoplastiche, o comunque con una maggiore

espressione in queste rispetto alle cellule normali.

Una caratteristica frequente del tessuto tumorale è la sovraespressione

recettoriale. Tale fenomeno è solitamente dovuto alle numerose aberrazioni

genetiche a cui le cellule neoplastiche sono sottoposte. Al giorno d’oggi sono

note molte tipologie tumorali caratterizzate da una sovraespressione

recettoriale, alcune delle quali sono riportate in (Tabella 1).

Tipologia recettoriale Tumori in cui sono sovraespressi

Recettore per la Bombesina (BnR) Polmone, prostata, seno, pancreas, testa / collo, colon, utero, ovaio, rene, glioblastoma, neuroblastoma, carcinoidi intestinali e carcinoidi bronchiali.

Recettori per la Somatostatina (SSTRs) SSTR (1-5)

Prostata, Tumore polmonare a piccole cellule, tumore neuroendocrino, carcinoma mammario, carcinoma del colon-retto, carcinoma gastrico.

Recettori per le integrine Glioblastoma (U87MG), ovaio, seno

Recettori per le Transferrine (FRs) FRα, FRβ, FRα

Seno, ovaio, gliomi, glioblastomi

Recettore per la colecistochinina (CCK2R) Colon, polmone, seno ovaio, tratto G.I.

Recettore del fattore di crescita endoteliale (EGFR)

Polmone, seno vescica, ovaio

Recettori per la Biotina (BRs) Leucemia

Tabella 1. Esempi di tipologie tumorali presentanti sovraespressione

recettoriale

Introduzione

5

Questo fenomeno può essere sfruttato in diversi modi per comprendere la

biologia del cancro ed ottenere una terapia mirata sul tessuto neoplastico.

Essendo l’attività di questi recettori il più delle volte associata alla divisione e

alla differenziazione cellulare, una loro sovraespressione può essere

facilmente associata all’insorgenza di neoplasie o all’induzione di metastasi.

Una prima strategia terapeutica quindi prevede la modulazione o l’inibizione

di questi recettori mediante la somministrazione di anticorpi o sostanze

organiche di diversa natura in grado di inibirne l’attività, bloccando quindi gli

stimoli e le vie di segnale coinvolte nella progressione tumorale. Alcuni

farmaci a bersaglio molecolare entrati da diversi anni nella pratica clinica sono

gli anticorpi monoclonali “anti EGFR”, quali il cetuximab, in grado di

interagire e bloccare il fattore di crescita epidermico (EGFR) inducendo

inoltre una risposta immunitaria verso il tumore. Oltre a questi, altri farmaci

sono attualmente impiegati in terapia per il trattamento di diversi tumori

(Tabella 2).

Tabella 2. Alcuni dei farmaci attualmente in commercio impiegati nella

terapia mirata di diverse tipologie tumorali 3.

Introduzione

6

Vi sono poi altri approcci terapeutici attualmente in studio, i quali non vanno

ad interferire con la funzione propria del recettore, ma prevedono la

somministrazione di farmaci in grado di riconoscerlo ed interagire con esso,

indirizzando così l’azione farmacologica verso i tessuti in cui questo è

sovraespresso. Questo targeting attivo può essere ottenuto legando il farmaco

a molecole organiche di diversa natura quali anticorpi, peptidi, small

molecules o altre in grado di riconoscere il target d’interesse4.

Un esempio di notevole importanza è rappresentato dal DOTATOC, ligando

analogo della somatostatina impiegato nel trattamento di tumori di origine

neuroendocrina. Il DOTATOC è attualmente impiegato sia nella terapia che

nella diagnosi di queste tipologie tumorali, a seconda se sia marcato con 177Lu

o 68Ga rispettivamente.

Più recentemente l'antigene di membrana specifico prostatico (PSMA) è

risultato un target promettente nel trattamento del cancro alla prostata

metastatico resistente alla castrazione. I ligandi sviluppati per effettuarne la

diagnosi (68Ga-PSMA-11) e la terapia (177Lu-PSMA-617) sono attualmente

in fase clinica.

Altri siti target attualmente in studio sono il recettore dell’acido folico, della

bombesina e della colecistochinina (CCK2R) i quali risultano sovraespressi in

diverse tipologie tumorali, o il recettore per l’acido glutammico (NMDAR),

potenziale target per la diagnosi di Alzheimer, schizofrenia ed epilessia.

2.1.1 COLECISTOCHININA E SUE TIPOLOGIE

RECETTORIALI

La colecistochinina (CCK) o pancreozimina (pZ) è un ormone di natura

peptidica sintetizzato nelle cellule enteroendocrine duodenali avente funzioni

diverse a seconda della tipologia di recettori a cui si lega. I recettori per la

CCK, nonostante le differenze funzionali e la diversa distribuzione

nell’organismo, appartengo alla stessa famiglia recettoriale GPCR

presentando quindi una caratteristica strutturale comune data dalla presenza

delle sette eliche transmembrana, di un dominio extracellulare N-terminale di

lunghezza variabile e un dominio intracellulare C-terminale.

Introduzione

7

Figura 1. Struttura generale della famiglia recettoriale GPCR

Nell’organismo sono presenti diverse tipologie recettoriali, coinvolte nel

legame con la colecistochinina: CCKAR (o CCK1R) e CCKBR (o CCK2R)

rispettivamente.

CCKAR (CCK1R), la cui sigla “A” indica alimentary, è un recettore presente

a livello del tratto gastro-intestinale la cui funzione è adibita alla secrezione

della bile da parte della cistifellea e degli enzimi pancreatici impiegati nel

processo digestivo di grassi e proteine. Questa tipologia recettoriale è inoltre

coinvolta nella stimolazione della secrezione insulinica.

CCKBR (CCK2R), la cui sigla “B” indica brain, è un recettore presente a

livello del sistema nervoso centrale il cui funzionamento sembrerebbe essere

associato alla regolazione di diversi fattori come ansia e depressione in seguito

all’inibizione dell’attività dopaminergica a livello cerebrale5, senso di sazietà

in seguito all’inibizione del tasso di svuotamento gastrico6, memoria,

nocicezione e stimolazione della crescita nervosa in seguito all’induzione del

rilascio di nerve grow factor (NGF)7.

2.1.2 SOVRAESPRESSIONE DI CCK2R NEL CANCRO

Negli ultimi anni diversi studi hanno riportato una correlazione tra il recettore

CCK2R e il cancro. I dati presenti in letteratura infatti indicano una

sovraespressione di CCK2R in diverse tipologie tumorali di natura

neuroendocrina, quali adenocarcinomi gastrici, carcinoma midollare della

Introduzione

8

tiroide, carcinoma del colon retto, carcinoma polmonare a piccole cellule e

carcinoma al pancreas8.

Questa sovraesressione nelle cellule neoplastiche ha suscitato un grande

interesse per lo studio e la produzione di agenti terapeutici e di imaging aventi

come target d’interesse questo recettore per la colecistochinina8.

Per l’ottenimento di questi ligandi sono stati presi in considerazione diversi

composti aventi affinità verso CCK2R, come ad esempio CCK octapepitide

(CCK-8), neuropeptide di natura endogena e agonista del recettore, o come le

small molecules Devazepide, Netazepide (YF476) e Nastorazepide (Z-360),

antagonisti del recettore CCK2R e derivati dell’Aspericina, analogo

benzodiazepinico di origine naturale9.

N

N

O

NH

O

N

HN

O

HO

H

Aspericina

HN NH

O

NH

N

NO

N

O

Netazepide

N

NO

NH

O

HN

Devazepide

N

N

OO

HN

O

HN

O OH

Nastorazepide

Figura 2. Struttura dell’Aspericina e dei suoi analoghi di origine sintetica

impiegati nello studio della terapia mirata sul recettore CCK2R.

Introduzione

9

Gli studi volti all’ideazione di questi ligandi hanno portato ad investigare sulla

tipologia di interazione tra small molecules e recettore per poter ottenere valori

di affinità recettoriali elevati con un conseguente incremento della selettività.

Da tali studi è emerso che entrambi i recettori CCK legano i peptidi endogeni

mediante interazioni con i loop extracellulari o i domini N-terminali, mentre

per l’interazione con small molecules o altri ligandi di natura comparabile,

presentano una tasca interna avente dimensioni e residui amminoacidici

diversi tra le tue tipologie CCK1R e CCK2R.

2.1.3 STRUTTURA RECETTORIALE E RAZIONALE

IMPIEGATO NELL’IDEAZIONE DEI LIGANDI

Le considerazioni riguardanti l’interazione small molecules-recettore

precedentemente esposte sono state impiegate per delineare la struttura dei

ligandi presenti in questo operato di tesi. Considerando i dati relativi ad uno

studio analogo10, per agevolarne l’accesso alla tasca recettoriale interna, la

small molecule è stata connessa alla restante porzione del ligando mediante

una corta catena alchilica lineare, come riportato in figura 3.

Figura 3. Caratteristica strutturale relativa alla connessione small molecule-

ligando mediante una corta catena alchilica.

L’introduzione di una porzione alchilica dovrebbe permette di avere un ridotto

ingombro sterico e una notevole libertà di rotazione impedendo così che la

restante porzione del ligando, molto più strutturata e ingombrante, possa

interferire riducendo così l’affinità verso il recettore.

Introduzione

10

2.2 RADIOFARAMACI

I radiofarmaci sono medicinali aventi la funzione di veicolare un radioisotopo,

ovvero un elemento presentante un nucleo atomico radioattivo. Il nucleo

atomico rappresenta il punto in cui la quasi totalità (99.9%) della massa

atomica viene concentrata. Esso è costituito da due tipi di particelle: i protoni

e i neutroni. Queste due particelle hanno masse molto simili tra loro (1.67*10-

24) ma presentano carica differente, positiva per i protoni (1.6*10-19C) e nulla

per i neutroni.

Generalmente per poter determinare la stabilità di un nucleo viene valutato il

rapporto tra il numero di protoni (Z) e il numero di neutroni (N). Uno

strumento molto utile per poter avere una panoramica generale riguardo alla

stabilità dei nuclei è la carta dei nuclidi, riportata in figura 4.

Figura 4. Carta dei nuclidi.

Introduzione

11

Ogni nuclide è definito da uno specifico valore di A e di Z, in cui il valore di

A, indicante il numero di massa, è dato dalla somma del numero atomico (Z)

e del numero di neutroni (N). Generalmente, per bassi valori di Z, i nuclidi

che risultano stabili presentano un ugual numero di protoni e neutroni (Z=N)

in quanto le interazioni protone-neutrone in questo caso sono più forti delle

interazioni protone-protone o neutrone-neutrone e riescono quindi a garantire

una maggiore stabilità del nucleo. Per masse atomiche maggiori invece (A ≥

40), la curva di stabilità tende a divergere verso nuclei aventi un numero di

neutroni maggiore rispetto al numero di protoni (nuclei neutron-rich). Tale

fenomeno è giustificato dal fatto che in questa situazione, la forza di

repulsione elettrostatica tra i protoni risulta essere superiore rispetto alle altre

forze in gioco. Perché il nucleo risulti stabile è necessario quindi che questo

presenti un maggior numero di neutroni, particelle elettricamente neutre e

quindi non in grado di generare forze di repulsione. Per valori di massa

atomica ancora maggiori (A > 109), l’interazione forte tra neutroni e protoni

viene vinta dalla forza di repulsione elettrostatica con una conseguente

diminuzione di stabilità dei nuclidi.

È possibile che due atomi di uno stesso elemento aventi lo stesso valore Z

possano presentare un numero di massa atomica (A) differente. Questi atomi

differiscono per il loro numero di protoni e vengono chiamati isotopi (dal

greco ìsos, "stesso" e tòpos, "posto") in quanto occupano la stessa posizione

nella tavola periodica. Gli isotopi vengono indicati con la dicitura 𝐸𝑍𝐴 , in cui

E indica l’elemento.

2.2.1 RADIONUCLIDI IN CAMPO MEDICO

Le caratteristiche prese in considerazione per identificare possibili

radionuclidi candidati per l’applicazione medica sono le seguenti11:

• Proprietà di decadimento: a seconda della tipologia di nuclide preso in

considerazione si possono avere diversi tipi di decadimento con diverse

radiazioni ionizzanti emesse. In campo diagnostico solitamente vengono

impiegati nuclidi in grado di emettere radiazioni altamente penetranti a bassa

energia lineare trasferita (LET). Queste radiazioni possono essere rilevate da

Introduzione

12

opportuni dispositivi posti esternamente al corpo del paziente e, presentando

una bassa energia, riducono al minimo le quantità di radiazioni a cui questo è

sottoposto. Per la terapia invece vengono generalmente impiegati nuclidi in

grado di emettere radiazioni altamente energetiche a corto raggio, capaci di

focalizzare la radiazione nel tessuto bersaglio inducendo morte cellulare.

• Emivita o Tempo di dimezzamento (T1/2): questo valore indica il tempo

occorrente perché la metà degli atomi di un campione puro dell’isotopo

decadano in un altro elemento. L’emivita è indice di stabilità di un nuclide:

più breve è l’emivita, meno l’atomo è stabile. Questo tempo di dimezzamento

del radiofarmaco deve essere sufficientemente lungo per consentirne il

trasporto dal sito di produzione all’ospedale e una sua corretta

biodistribuzione in seguito a somministrazione. Tuttavia, l’emivita non deve

essere troppo lunga per evitare un’eccessiva esposizione del paziente alle

radiazioni al termine dell’indagine diagnostica.

• Proprietà chimiche: Queste riguardano la capacità di accumulo del nuclide

su uno specifico tessuto. Per raggiungere il tessuto bersaglio, i radionuclidi

possono essere somministrati come tali, oppure essere legati a molecole

organiche adibite al riconoscimento del target. Nel primo caso, le

caratteristiche chimiche del radiofarmaco devono essere tali da consentire uno

spontaneo accumulo del nuclide nel tessuto malato. Come possibile esempio

può essere preso in considerazione lo 89Sr il quale, accumulandosi

selettivamente nel tessuto osseo, grazie al suo comportamento chimico

analogo al calcio, è impiegato nella cura palliativa del dolore osseo

metastatico; un altro esempio può essere dato dallo 131I che, accumulandosi

spontaneamente nella tiroide, è impiegato nel tumore tiroideo o in casi gravi

di ipertiroidismo autoimmune. Nel caso in cui il farmaco non presenti

caratteristiche chimiche tali da consentirne lo spontaneo accumulo, deve

essere legato a molecole che fungano da trasportatore verso il bersaglio

(Figura 5). Un esempio è dato dal glucosio, molecola coinvolta nei processi

energetici cellulari, impiegato per la produzione di 18FDG, radiotracciante

notevolmente impiegato nella tomografia ad emissione di positroni (PET)

costituito da una molecola di glucosio in cui un ossidrile è sostituito da un

atomo di 18F. Altre molecole di natura più complessa possono essere impiegate

per indirizzare i radionuclidi al tessuto target; è il caso di peptidi ed anticorpi

Introduzione

13

monoclonali, o small molecules, disegnate appositamente per riconoscere e

legare uno specifico bersaglio. Un esempio è dato da PSMA-11 e del PSMA-

617, ligandi marcati con 68Ga e 177Lu rispettivamente, in grado di riconoscere

lo specifico antigene superficiale (PSMA) presente nelle cellule tumorali

prostatiche. Pure in questo caso il fattore chimo è importante in quanto la

struttura di questi complessi radionuclide-ligando deve essere

sufficientemente stabile per impedire il rilascio del radioisotopo in circolo.

Figura 5. Esemplificazione della struttura e funzione di un radiofarmaco

coniugato ad una molecola.

• Facilità di produzione su larga scala: I radionuclidi, specialmente

quelli impiegati in diagnostica, a causa della loro breve emivita devono

essere prodotti giornalmente dalle rispettive sedi ospedaliere. Per

questa ragione la loro produzione deve essere agevole ed efficiente per

far sì di poterne ottenere la quantità necessaria in tempi ragionevoli.

2.2.2 RADIONUCLIDI PER LA DIAGNOSTICA

I radionuclidi utilizzati in campo diagnostico sono caratterizzati da

un’emissione altamente penetrante e una bassa energia lineare trasferita

(LET). Queste radiazioni sono in grado di lasciare il corpo del paziente ed

essere dunque rilevate da apposite apparecchiature poste esternamente. Le

principali tecniche di imaging che utilizzano radiofarmaci sono la scintigrafia,

la tomografia a emissione di fotone singolo (SPECT) e la tomografia a

emissione di positroni (PET).

Introduzione

14

Scintigrafia e Tomografia ad emissione di fotone singolo (SPECT)

Entrambe queste tecniche diagnostiche si basano sull’utilizzo di gamma

camere in grado di rilevare raggi γ emessi da radioisotopi somministrati al

paziente. In seguito alla rielaborazione dei dati ottenuti, è possibile quindi

ottenere un’immagine accurata della distribuzione dei radioisotopi

nell’organismo. La sostanziale differenza tra le due tecniche diagnostiche sta

nella diversa tipologia di immagine che queste sono in grado di fornire.

Mentre la scintigrafia fornisce immagini planari in 2D, la SPECT (Figura 6)

offre la possibilità di avere immagini tomografiche in 3D.

Figura 6. Strumentazione impiegata nell’analisi diagnostica SPECT

La scintigrafia viene utilizzata comunemente per lo studio del funzionamento

di cuore, polmone o tiroide, per il rilevamento di metastasi e per lo studio della

circolazione sanguigna.

La SPECT, invece, è utilizzata quando sia utile, ai fini della diagnosi, ottenere

un’immagine tridimensionale specialmente per lo studio di tumori, tiroide e

ossa. Viene utilizzata anche per lo studio della funzionalità cardiaca e

cerebrale.

Introduzione

15

Essendo entrambe le tecniche diagnostiche basate sulla rilevazione di raggi γ,

queste prevedono l’utilizzo degli stessi radiotraccianti. Le radiazioni emesse

devono risultare sufficientemente energetiche (in un range tra 100 e 200 keV)

per poter lasciare il corpo del paziente senza essere eccessivamente attenuate,

permettendone quindi il rilevamento esterno. L’isotopo utilizzato

maggiormente è l’isomero 99mTc, il quale possiede la maggior parte delle

caratteristiche desiderabili per questo tipo di applicazione. Esso emette una

radiazione γ di 141 keV, ideale per la SPECT e decade per transizione interna

a 99gTc, isotopo con emivita di 0,2 milioni di anni e considerato per questo

stabile; non è presente emissione di radiazione γ nel decadimento e l’emivita

di 6 ore lo rende abbastanza stabile per il legame a molecole carrier8.

Introduzione

16

Tomografia ad emissione di positroni (PET)

La tomografia ad emissione di positroni (Figura 7) rappresenta un metodo

diagnostico in grado di fornire una rappresentazione quantitativa della

distribuzione del tracciante grazie a cui studiare funzioni fisiologiche,

informazioni complementari agli studi morfologici.

I radioisotopi utilizzati sono emettitori di positroni (β+). La particella β+

emessa va incontro ad annichilazione non appena incontra un elettrone e

questa reazione dà origine all’emissione di due fotoni γ emessi in direzioni

opposte a 180° tra loro con un’energia pari a 511 keV. La rilevazione

simultanea di questi due fotoni permette una localizzazione molto accurata del

punto di emissione favorendo quindi la localizzazione del tracciante.

I principali radioisotopi utilizzati per la PET sono quattro: 18F, 15O, 11C e 13N.

Figura 7. Schema riassuntivo della tecnica di analisi PET

18F è sicuramente il radioisotopo più utilizzato in quanto presenta una grande

capacità nel legare atomi di C. Per questo motivo infatti viene incorporato

facilmente in diverse molecole organiche, andando a sostituire gruppi

funzionali come –H o –OH. Il composto predominante in campo diagnostico

è il 18FDG, una molecola di glucosio modificata in cui un gruppo ossidrilico è

stato sostituito da un atomo di 18F (Figura 8). 18FDG viene incorporato dalle

cellule in seguito a fosforilazione ma non è soggetto a metabolismo. Per

Introduzione

17

questo motivo rimane nella cellula abbastanza a lungo da consentire una

rilevazione del segnale. Le cellule tumorali, presentando un aumentato up-

take di glucosio, inducono l’accumulo di 18FDG sul tessuto neoplastico,

permettendone quindi la sua identificazione mediante analisi PET8.

Figura 8. Formula di struttura 18FDG

2.2.3 RADIONUCLIDI IMPIEGATI IN TERAPIA

I radionuclidi utilizzati a scopo terapeutico presentano emissioni poco

penetranti (radiazioni corpuscolate quali α e β- non rilevabili dall’esterno) ma

con un’alta energia lineare trasferita (LET), in grado di danneggiare il tessuto

irradiato mediante attacco diretto al DNA cellulare e grazie alla produzione di

radicali liberi. L’entità del danno indotto da queste radiazioni è tale da

sovrastare i sistemi endogeni di riparazione presenti, inducendo quindi la

morte cellulare. I radionuclidi utilizzati in ambito terapeutico possono essere

classificati in base al loro modo di decadimento in emettitori α, β e γ11.

2.2.3.1 Emettitori α

Gli emettitori α mostrano un ampio potenziale terapeutico grazie alle

caratteristiche della loro radiazione. Queste presentano un’elevata energia

lineare trasferita (LET), pari a circa 100 KeV e una bassissima penetrazione

tissutale, pari a 0.1 mm. Un’energia così elevata, può provocare un massivo

danno a livello del materiale genetico all’interno del nucleo della cellula,

provocando così la morte di quest’ultima. Un’altra caratteristica importante è

che, esseno il meccanismo di danneggiamento cellulare radicale-indipendente,

non richiede la presenza di ossigeno per ottenere un buon tasso di efficacia.

Introduzione

18

Questo fa sì che le cellule ipossiche, situate in zone del tumore poco perfuse,

siano sensibili alle radiazioni tanto quanto le altre.

Un’altra importante caratteristica degli emettitori α riguarda la loro elevata

recoil energy: dopo l’emissione, il nuclide generato (figlio) presenta un

elevato valore di energia, compreso tra 100 e 160 KeV. Solitamente, il

decadimento del nuclide originario (padre) porta alla rottura del legame

nuclide-vettore con una conseguente distribuzione del nuclide figlio in aree

non desiderate. Il nuclide generato può presentare caratteristiche diverse:

qualora fosse stabile o emettitore α o β, il suo rilascio potrebbe essere tollerato;

se invece fosse un emettitore γ, sarebbe necessario valutarne l’emivita, in

quanto, se questa risultasse molto breve (da µs a ms) porterebbe ad un

istantaneo decadimento senza recare alcun danno, mentre se risultasse più

lunga (da s a h) darebbe la possibilità al nuclide figlio di diffondere all’interno

dell’organismo. In tal caso la loro applicazione in terapia dovrebbe essere

valutata molto attentamente.

La terapia con emettitori α, a causa del breve raggio delle radiazioni, è

generalmente di scarsa efficienza nella cura dei tumori solidi. Per superare

questo problema è stata ideata una strategia terapeutica chiamata DART

(diffusing alpha-emitters radiation therapy), la quale prevede l’impianto di

fonti radioattive all’interno del tumore. Gli effetti combinati, derivanti dalla

diffusione interstiziale e dalla convezione vascolare consente un’omogenea

diffusione dell’attività radioattiva all’interno della massa tumorale

aumentando così l’efficacia terapeutica.

Il primo emettitore α impiegato in terapia fu il 222Rn, per la cura dell’artrite

reumatoide all’inizio del XX secolo. Sebbene la terapia portasse ad un effetto

antinfiammatorio a lungo termine, vi erano però dei gravi effetti indesiderati

dovuti all’esposizione dei tessuti sani alla radiazione. La terapia in questione

prevedeva delle immersioni in una miscela di acqua e 222Rn avente una

concentrazione di 0.3-3 KBq/L o l’esposizione ad una miscela di aria e 222Rn

avente una concentrazione pari a 30-150 KNq/m3.

Altri emettitore α storicamente impiegato in terapia sono i due isotopi 236Ra e

223Ra, il primo impiegato nel trattamento della spondilite anchilosante mentre

il secondo nella cura delle metastasi ossee di vari tumori grazie alla sua

capacità di accumularsi nel tessuto osseo.

Introduzione

19

2.2.3.2 Emettitori β

Molti radionuclidi emettitori di particelle β- sono attualmente utilizzati in

terapia. Questi sono caratterizzati da radiazioni aventi una bassa energia

lineare trasferita (≤1 keV/µm) ed un raggio d’azione variabile, dell’ordine di

qualche mm. I radionuclidi capaci di emettere unicamente particelle β sono

pochi, più frequenti invece sono quelli che durante il loro decadimento portano

anche all’emissione di radiazioni γ, talvolta molto energetiche. Mentre da un

lato questo fenomeno può aumentare l’azione citotossica del farmaco,

dall’altro può portare ad un incremento dell’attività radioattiva a cui le cellule

sane sono esposte; inoltre dal punto di vista della sicurezza sarebbero richieste

ulteriori precauzioni per il trasporto e lo stoccaggio del radiofarmaco.

Emettitori β sono utilizzati sia in terapie loco-regionali che sistemiche. Per

quanto riguarda le prime, si tratta di alcune applicazioni nella brachiterapia.

Questa strategia terapeutica prevede il posizionamento chirurgico di fonti

radioattive (solitamente emettitori γ) in prossimità del sito tumorale. In

alternativa, per evitare l’utilizzo di emettitori γ, può essere preso in

considerazione il 188R che, essendo caratterizzato da un’alta energia di

emissione β può risultare una valida alternativa nella cura di tumori della pelle

diversi dal melanoma. Alternativamente emettitori β sono utilizzati per la cura

di infiammazioni articolari, come artriti, grazie ad iniezioni di colloidi

nell’articolazione. A seconda delle dimensioni di quest’ultima si utilizzano

diversi tipi di radionuclidi: 90Y per grandi articolazioni come l’anca o il

ginocchio, 186Re per articolazioni di medie dimensioni come il gomito e 169Er

per piccole articolazioni come le dita.

Terapie sistemiche prevedono invece la somministrazione orale o iniettabile

al paziente di nuclidi liberi o veicolati mediante carrier. Tra questi può essere

ricordato lo 131I, nuclide impiegato nella terapia contro il tumore alla tiroide

grazie alla sua innata capacità di accumulo nel sito bersaglio.

Altri emettitori β, come lo 89Sr e 153Sm, sono inoltre utilizzati nella terapia

palliativa del dolore osseo metastatico, in quanto capaci di accularsi a livello

del tessuto osseo. Questa capacità è dovuta alle loro proprietà chimiche, simili

a quelle del calcio, e all’aumentato metabolismo delle cellule metastatiche. I

radionuclidi aventi questa capacità di accumulo a livello osseo sono chiamati

bone-seeking radioisotopes.

Introduzione

20

Infine, emettitori β come 90Y, 131I e 177Lu, possono essere utilizzati nella

radioimmunotherapy (RIP) o nella peptide receptor radionuclide therapy

(PRRT) in seguito al loro legame con anticorpi monoclonali o peptidi

rispettivamente.

2.2.3.3 Emettitori γ

In genere gli emettitori γ sono utilizzati per terapie loco-regionali come la

brachiterapia, la quale prevede il posizionamento chirurgico di sorgenti

radioattive in prossimità della massa tumorale. Questo genere di terapia si può

dividere in due tipologie: high dose rate (HDR) e low dose rate (LDR). La

prima prevede l’esposizione per un breve periodo di tempo (minuti) ad intense

sorgenti di radiazioni, costituite solitamente da nuclidi come 60Co, 153Gd,

169Yb o 192Ir. La seconda, invece, consiste nel posizionare per periodi più

lunghi (giorni, mesi o anni) fonti ad energia minore e a corto raggio, questo

per poter minimizzare la dose assorbita dai tessuti sani. I nuclidi ricercati per

questo genere di terapia presentano solitamente una lunga emivita, alcuni

esempi sono 103Pd, 125I e 131Cs.

2.2.4 PRODUZIONE DI RADIONUCLIDI AD INTERESSE

MEDICO

La produzione di radionuclidi per applicazioni in medicina nucleare risulta

essere un aspetto delicato e di fondamentale importanza. Ciò che determina la

bontà di un metodo di produzione è sicuramente la facilità di produrre su larga

scala, ma è fondamentale anche considerare due ulteriori aspetti: l’attività

specifica e la purezza radionuclidica11.

• Attività specifica: si riferisce alla radioattività di un radionuclide per un’unità

di massa dell’elemento o della forma chimica considerata e generalmente

viene espressa in GBq/mg o Ci/mg (1 curie, Ci, equivale a 37 GBq). Questo

valore rappresenta un parametro molto critico in quanto spesso, per motivi

Introduzione

21

legati al metodo di produzione, oltre all’isotopo di interesse sono presenti altri

isotopi stabili dello stesso elemento definiti cold isotopes. Questi non hanno

nessun tipo di effetto a fine diagnostico o terapeutico ma diluiscono solamente

il radioisotopo di interesse. Uno degli obiettivi dei metodi di produzione di

radiofarmaci è proprio ottenere radioisotopi ad alta attività specifica.

I radioisotopi puri, cioè senza la presenza di cold isotopes, sono chiamati

carrier-free, mentre quelli accompagnati da molti isotopi stabili sono detti

carrier-added.

• Purezza radionuclidica: Questo valore è indice di un’eventuale presenza nel

farmaco di altre specie radioattive non desiderate; fenomeno il più delle volte

riconducibile al processo produttivo. Generalmente è da evitare la

contaminazione da parte di nuclidi aventi lunga emivita, questo per non

sottoporre il paziente ad una radiazione eccessiva.

L’ottenimento di radionuclidi può avvenire in diversi modi, ognuno dei quali

presenta i rispettivi vantaggi e svantaggi. Il più comune metodo di produzione

prevede l’utilizzo di un reattore nucleare (Figura 9); metodo molto efficiente

per quanto riguarda la produzione su larga scala ma causa di una elevata

produzione di scorie radioattive con le rispettive problematiche di

smaltimento. Un’opzione alternativa è data dalla produzione con acceleratore

(Figura 9), il quale prevede l’ottenimento dei nuclidi d’interesse in seguito alla

collisione di particelle ad altissima velocità (protoni, deuteroni o particelle α)

su specifici target. Questo metodo di produzione è impiegato per

l’ottenimento della maggior parte degli isotopi utilizzati nelle tecniche di

diagnosi PET e SPECT. I principali vantaggi derivanti dall’uso di acceleratori

sono l’alta attività specifica dei radioisotopi ottenibili, la minor quantità di

rifiuti radioattivi e il più facile accesso rispetto ai precedenti reattori.

Per la produzione e l’utilizzo di radioisotopi a breve emivita è invece preferito

l’utilizzo dei generatori di radionuclidi (Figura 9). Questi si basano sulla

produzione di un radionuclide genitore a lunga emivita che, in seguito a

decadimento, genera il radioisotopo di interesse. Il figlio, presentando

caratteristiche chimiche diverse dal padre, può essere successivamente isolato

mediante separazione chimica.

Introduzione

22

Figura 9. Da sinistra a destra: reattore nucleare, acceleratore, generatore di

radionuclidi.

Introduzione

23

2.3 PROGETTO SPES: NUOVA FRONTIERA PER

LA PRODUZIONE DI FASCI DI IONI ESOTICI

RADIOATTIVI

SPES (Selective Production of Exotic Species) è un progetto multidisciplinare

avente come obiettivo quello di creare un apparato sperimentale per la

produzione di fasci di ioni radioattivi (Radioactive Ion Beam - RIB) da poter

utilizzare in studi di fisica nucleare e di interesse sanitario. Il progetto SPES è

coordinato a livello nazionale da INFN-LNL (Istituto Nazionale di Fisica

Nucleare – Laboratori Nazionali di Legnaro – PD), Dipartimenti di Scienze

Chimiche, Scienze del Farmaco ed Ingegneria Meccanica dell’Università

degli Studi di Padova, ed a livello internazionale prevede strette collaborazioni

con CERN (Svizzera) ed i Laboratori di Oak Ridge (USA).

È suddiviso in quattro fasi:

• • SPES-α: prevede l’acquisizione, l’installazione e la messa in opera di

un ciclotrone ad alte prestazioni con un’alta corrente in uscita (≈ 0.7 mA) e ad

alta energia (fino a 70 MeV). Il ciclotrone sarà provvisto di due fasci: uno

dedicato alla facility di fisica dei fasci di ioni radioattivi ed il secondo a studi

di fisica applicata.

• • SPES-β: prevede la produzione di nuclei nuovi, neutron-rich, simili a

quelli generati nelle fasi terminali della vita delle stelle ed assenti sulla Terra

a causa della loro brevissima emivita.

• • SPES-γ: riguarda la produzione di radionuclidi di interesse medico

mediante l’uso del ciclotrone SPES-α. L’obiettivo è la produzione di

radiofarmaci innovativi e di radionuclidi convenzionali con nuovi approcci.

• • SPES-δ: prevede lo sviluppo di un’intensa sorgente neutronica dal

ciclotrone e/o da un acceleratore lineare ad alta densità. Le applicazioni si

estendono dall’astrofisica nucleare ai test per il comportamento

dell’elettronica nello spazio, dalla caratterizzazione dei rifiuti nucleari ai

trattamenti sperimentale dei tumori.

Introduzione

24

2.3.1 PRODUZIONE DI FASCI DI IONI RADIOATTIVI

La produzione di RIB ad elevata purezza, intensità ed energia prevista dal

progetto SPES richiede la costruzione di apparati, detti facilities, che si basano

principalmente sulla tecnica ISOL (Isotope Separation On-Line) ovvero sulla

separazione degli isotopi in linea.

Le unità chiave costituenti le facilities sono12:

• l’acceleratore primario (ciclotrone);

• il Front-End, ovvero l’insieme dei dispositivi necessari alla produzione

ed al trasporto dei fasci di ioni radioattivi costituito dal complesso

target-sistema di estrazione e ionizzazione;

• i separatori di massa e di isobari;

• il post acceleratore.

Il fascio di particelle ad una certa energia, prodotto dal ciclotrone, viene fatto

collidere su un bersaglio (target) di materiale fissile (carburo di uranio - UCx)

con produzione di isotopi radioattivi a seguito di reazioni nucleari. Il target di

produzione di radioisotopi ed il sistema di estrazione e ionizzazione sono

contenuti all’interno di una camera (camera target) raffreddata mediante un

circuito ad acqua per poter dissipare il calore derivante dalle elevate potenze

in gioco, e mantenuta in alto vuoto (10-6 mbar) per evitare l’ossidazione dei

componenti presenti ed aumentare il cammino libero medio delle particelle

radioattive prodotte. Per poter migliorare l’estrazione dei prodotti di fissione,

la camera viene mantenuta ad una temperatura media di 2000°C grazie ad un

dispositivo di riscaldamento (heater).

I radioisotopi prodotti in seguito al bombardamento dal target vengono

indirizzati verso la sorgente di ionizzazione, dove vengono ionizzati

positivamente e, grazie alla carica acquisita, possono essere estratti ed

accelerati applicando una differenza di potenziale portando alla formazione di

un RIB. Il fascio estratto dalla sorgente di ionizzazione è sottoposto ad una

prima fase di purificazione mediante un separatore di massa (Wien Filter) il

quale, tramite l’applicazione di un campo elettrico statico ed un campo

magnetico variabile, consente di deviare tutti gli isotopi di massa non

Introduzione

25

desiderata, focalizzando e separando quelli della massa voluta fino ad ottenere

un fascio isobarico9 (Figura 10).

Infine, il RIB ottenuto può essere convogliato alle sale sperimentali ed

utilizzato in esperimenti che richiedono fasci a bassissima energia oppure

essere post accelerato.

In ambito europeo le opportunità scientifiche offerte dai RIB, ed i problemi

tecnologici ad essi associati, hanno portato la comunità scientifica a proporre

la costruzione di una facility europea di tipo ISOL (progetto EURISOL); è in

tale ambito che si focalizza il progetto SPES presso LNL13.

Figura 10. Schema del sistema di produzione dei RIB

Introduzione

26

2.3.2 PROGETTO ISOLPHARM

2.3.2.1 PRODUZIONE DI RADIOFARMACI MEDIANTE

L’UTILIZZO DELLA TECNICA ISOL

Tra le masse prodotte mediante l’impiego delle facility ISOL presente ai LNL-

INFN (Figura 11) sono presenti radioisotopi che rivestono un potenziale

interesse per applicazioni diagnostiche e terapeutiche. All’interno del progetto

SPES si apre, quindi, il progetto ISOLPHARM il cui scopo è la produzione di

radionuclidi estremamente puri da poter impiegare in ambito medico.

Al giorno d’oggi diversi ospedali sono muniti di piccoli ciclotroni e producono

in loco i radioisotopi utilizzati in diagnostico seguendo la procedura

tradizionale. Tale processo prevede l’irraggiamento di un target su cui sono

generate le specie isotopiche di interesse, le quali sono successivamente

estratte mediante processi chimici. Tali processi tuttavia non permettono la

separazione degli eventuali contaminanti isotopici presenti, che entrando

successivamente nel farmaco, ne riducono l’attività specifica e quindi

l’efficacia.

I radioisotopi usati in terapia sono invece prodotti dalle grandi case

farmaceutiche attraverso l’uso estensivo di reattori nucleari, per cui, oltre al

problema della purezza radionuclidica, si presenta anche la questione della

gestione e lo smaltimento delle scorie radioattive prodotte.

Il progetto ISOLPHARM è estremamente innovativo in quanto permette di

ottenere radionuclidi carrier-free 12. Generando un fascio isobarico (isobaric

beam), l'elemento desiderato è presente solamente in una forma isotopica

dando luogo a valori di attività specifica elevatissimi. Teoricamente, infatti,

non sono presenti contaminanti dello stesso elemento chimico. Gli unici

contaminanti presenti sono rappresentati dagli isotopi di altri elementi dello

stesso peso atomico, ma chimicamente differenti e per questo separabili a

posteriori.

Gli atomi presenti nel fascio isobarico sono raccolti utilizzando il target

secondario, un disco di materiale appositamente selezionato in grado di

trattenere la maggior quantità di ioni radioattivi impattanti e rilasciarli

successivamente in seguito a processi di dissoluzione chimica. La

Introduzione

27

purificazione finale viene effettuata sfruttando le diverse caratteristiche

chimiche dei contaminanti isotopici eventualmente presenti.

Figura 11. Schema a blocchi del progetto ISOLPHARM. Esso è composto

da due fasi: la produzione di isotopi con la tecnica ISOL e la marcatura di

radiofarmaci (PHARM) con i nuclei prodotti, a seguito della purificazione

radionuclidica 12.

2.3.2.2 NUCLIDI DI INTERESSE MEDICO OTTENIBILI CON

I TARGET SPES

A seconda del materiale utilizzato per il target possono essere prodotti diversi

radionuclidi di interesse clinico. Il target UCx è formato da 238U, pertanto gli

isotopi radioattivi neutron-rich prodotti appartengono agli elementi con

numeri atomici tra 28 e 57 (tra Ni e La). Tra essi sono presenti radionuclidi

rilevanti già utilizzati nella medicina nucleare: 89Sr (utilizzato nel trattamento

delle metastasi ossee), 90Y (usato nella radioimmunoterapia), 125/131I (il primo

è sfruttato per la brachiterapia, il secondo per le patologie della tiroide) e

133Xe.

Utilizzando dei target diversi, costituiti da materiale non fissile, si possono

invece produrre radioisotopi proton-rich innovativi aventi potenzialità molto

interessanti da poter sfruttare in ambito medico. Di particolare interessante è

il target in carburo di titanio (TiC) per la produzione di isotopi di Sc, elemento

Introduzione

28

ideale per la radioteranostica in quanto i radionuclidi 43/44Sc sono impiegati

nella diagnostica mediante PET, mentre 47Sc presentando un’emivita più

lunga è utilizzato per la terapia. Un altro materiale oggetto di studio

utilizzabile per il target è il germaniuro di zirconio (ZrGe). Tra i radioisotopi

che possono essere prodotti con ZrGe è presente la coppia teranostica

costituita dai nuclidi 64Cu e 67Cu, impiegati rispettivamente per scopi

diagnostici e terapeutici.

29

3. OBIETTIVO

Sempre più al giorno d’oggi è nota la fondamentale importanza della medicina

nucleare in ambito oncologico. Gli studi e le ricerche svolte in questo campo

negli ultimi decenni hanno permesso di effettuare dei grandi passi avanti sia

in ambito diagnostico che terapeutico grazie allo sviluppo di radiofarmaci con

azione mirata al tessuto tumorale.

La possibilità di direzionare il farmaco su uno specifico target caratterizzante

il tessuto tumorale ha implementato l’efficacia diagnostica permettendo di

individuare i tumori nel loro stadio iniziale aumentando quindi i tassi di

sopravvivenza e remissione completa dalla malattia. Ha permesso inoltre di

incrementare la specificità d’azione del farmaco aumentando l’efficacia della

terapia e riducendo notevolmente gli effetti indesiderati.

ISOLPHARM, motore di questo lavoro di tesi, è un progetto di ricerca

multidisciplinare nato grazie alla collaborazione tra i laboratori INFN di

Legnaro, il Dipartimento di Scienze del Farmaco e il Dipartimento di Scienze

Chimiche volto allo studio e allo sviluppo di una tecnologia innovativa

finalizzata alla produzione di radionuclidi beta emettitori isotopicamente puri

da poter impiegare nella produzione di radiofarmaci aventi attività specifica

estremamente elevata.

Presso i laboratori di ricerca del Dipartimento di Scienze del Farmaco è stato

condotto lo studio finalizzato all’ideazione di possibili ligandi da poter

impiegare come carrier nel targeting attivo di radionuclidi sul recettore per la

colecistochinina CCK2R, tipologia recettoriale sovraespressa in diverse

tipologie tumorali nonché target di riferimento preso in considerazione in

questo studio. Nonostante le possibili differenze tra i diversi ligandi è stata

delineata una struttura comune, costituita da tre unità chiave aventi specifiche

funzioni:

1. Molecola direzionante: unità necessaria al riconoscimento del target

d’interesse sovraespresso nel tessuto tumorale.

2. Linker idrofilico: porzione volta alla modulazione di solubilità,

farmacocinetica e affinità verso il recettore target nonché collegamento

tra molecola direzionante e chelante.

3. Chelante: unità adibita alla complessazione del radionuclide.

Obiettivo

30

Figura 12. Struttura generale di un radioligando

Prima tappa per l’attuazione di tale progetto è l’identificazione e la messa a

punto di una via sintetica per l’ottenimento di Z-360 (Nastorazepide),

antagonista del recettore CCK2R e molecola direzionante presa in

considerazione per l’ottenimento dei ligandi.

Figura 13. Nastorazepide (Z-360)

Lo step successivo riguarda l’identificazione e la sintesi di alcuni linker

idrofilici basandosi su dati presenti in letteratura per prevederne l’influenza

sui ligandi finali i quali verranno successivamente sottoposti a studi di

solubilità, stabilità, radiomarcatura e affinità recettoriale.

Obiettivi di questa tesi sono quindi la messa a punto di una via sintetica

efficiente per l’ottenimento di Z-360 (Nastorazepide), l’identificazione e

l’ottenimento di possibili linker idrofilici idonei, la pianificazione e messa a

punto di vie sintetiche efficenti per l’ottenimento dei ligandi finali e il loro

studio preliminare volto a determinarne solubilità e stabilità in soluzione

acquosa.

31

4. RISULTATI E DISCUSSIONE

4.1 SINTESI DI Z-360 (NASTORAZEPIDE)

Per la sintesi di Z-360 è stata opportunamente modificata la via descritta in

WO2017/030859 14 (Schema 1).

F

NO2 NO2

NHCOOH

NHBoc

NH2

NHCOOH

NHBoc

NH

HN

O

NHBocN

HN

O

NHBoc

N

NO

NHBoc

O

N

NO

NH

O

NH

O

COOH

N

NO

NH2

O

a b

c

de

f

g

1 2 3

4

5

6

7 8

Schema 1. Sintesi di Nastorazepide (Z-360). Condizioni di reazione:

a. Boc-Dap-OH, K2CO3, EtOH, 78°C, 7 ore, resa 70%

b. 10% Pd/C, MeOH, H2, 3 ore, resa 91%

c. EDCl, DMF, 1(0°C), 2(R.T.), 18 ore, resa 83%

d. Cicloesanone, PtO2, CH3COOH, H2, 6 ore, resa 80%

e. Cloropinacolone, LiHDMS, THF, N2, 1(-78°C), 2(R.T.), 1 ore, resa 80%

f. TFA (30%), DCM, 1(0°C), 2(R.T), 1 ora, resa quantitativa

g. Acido 3-ammino benzoico, TEA, THF, 1(0°C), 2(R.T), 16 ore, resa 87%

Risultati e Discussione

32

La via sintetica prevede l’iniziale formazione del nucleo benzodiazepinico con

la successiva addizione a quest’ultimo di appositi gruppi funzionali andando

così a costituire la molecola finale.

Il primo step della via consiste in una reazione di sostituzione nucleofila tra

l’-fluoro-2-nitrobenzene (1), e Boc-Dap-OH. La reazione è stata condotta a

reflusso in presenza di K2CO3 ed etanolo. Il prodotto 2 è stato isolato mediante

precipitazione in acqua in seguito ad acidificazione volta a ripristinare il

gruppo acido della molecola. Per favorire tale processo, il work-up è stato

condotto in bagno di ghiaccio. L’aggiunta di acido è stata eseguita molto

lentamente monitorando costantemente i valori di pH in quanto un

abbassamento eccessivo del pH avrebbe portato ad una contestuale

eliminazione del gruppo protettore della funzione amminica (Boc).

Il composto 2 è stato successivamente sottoposto a riduzione mediante Pd/C

10% in atmosfera di H2 per ottenere il composto 3 che è stato successivamente

ciclizzato in seguito all’attivazione del gruppo acido mediante EDCl in

presenza di DMF anidra, portando alla formazione del nucleo

benzodiazepinico 4. Un requisito fondamentale per questo step della via

sintetica è la totale assenza di acqua nell’ambiente di reazione in quanto

quest’ultima potrebbe portare all’inattivazione di EDCl. La funzione

amminica del composto 4 è stata utilizzata quindi per l’amminazione riduttiva

con cicloesanone ottenere il composto 5.

Questo passaggio è risultato essere il punto più critico dell’intera via sintetica

in quanto la metodica riportata in letteratura non ha portato all’ottenimento

del prodotto d’interesse. Per questo motivo sono stati adottati doversi

approcci.

Dapprima è stata seguita la metodica presente in WO2017/030859 la quale

prevedeva una reazione di amminazione riduttiva in acido acetico e

diclorometano mediata da sodio acetossiboroidruro come agente riducente.

Non avendo ottenuto nessun prodotto diverso da quelli di partenza è stato

necessario abbandonare tale metodo.

Si è ipotizzato che l’insuccesso fosse dovuto ad un’eccessiva quantità di acido

acetico presente nella miscela di reazione che, essendo in largo eccesso,

avrebbe potuto competere per la reazione di riduzione andando a sottrare il

sodio acetossiboroidruro all’equilibrio ostacolando così la reazione di

amminazione riduttiva voluta. Sulla base di questa teoria, è stata adottata la

stessa metodica iniziale riportata in WO2017/030859 aggiungendo però un


33

numero di moli di acido acetico equivalenti alle moli di sodio

acetossiboroidruro, non ottenendo però il risultato sperato.

Alla luce di questi risultati, è stata avanzata una seconda ipotesi ovvero che

l’insuccesso delle precedenti reazioni fosse dovuto ad un’incapacità di sodio

acetossiboroidruro di ridurre l’immina formatasi. Si è quindi deciso di

impiegare sodio boroidruro, agente riducente più aggressivo, che è stato

aggiunto a più riprese fino ad un eccesso molare di 12 volte rispetto all’anello

benzodiazepinico. La reazione ha però portato all’ottenimento di un prodotto

diverso da quello sperato, probabilmente derivante da una riduzione del

gruppo ammidico presente nell’anello anziché all’amminazione riduttiva

voluta. Questa ipotesi è stata successivamente confermata da una ricerca in

letteratura, la quale ha confermato la capacità di sodio boroidruro di ridurre i

gruppi ammidici se posto in acido acetico e solventi clorurati. Alla luce di ciò

è stato eseguito un ulteriore tentativo seguendo la medesima metodica

utilizzando però THF come solvente di reazione. Stando a quanto riportato in

letteratura, l’utilizzo di un solvente non clorurato avrebbe infatti dovuto

evitare eventuali reazioni secondarie ma nonostante questo il prodotto

desiderato non è stato ottenuto.

Si è deciso, quindi, di passare ad una metodica completamente diversa tratta

da WO2013/126797 15, che ha previsto l’utilizzo di idrogeno gassoso come

agente riducente in presenza di platino ossido come catalizzatore. La reazione,

condotta in acido acetico, ha così permesso di ottenere il composto 5. Il

successivo step di reazione ha portato all’addizione di cloropinacolone

all’azoto ammidico dell’anello benzodiazepinico mediante una reazione di

sostituzione nucleofila ottenendo il composto 6. Tale reazione è stata condotta

in atmosfera di azoto in THF utilizzando una base forte come litio bis-

trimetilsililammide per deprotonare l’azoto ammidico ad una temperatura di -

78 °C, raggiunta grazie alla combinazione di ghiaccio secco e acetone.

Condizioni di reazione così drastiche sono necessarie in quanto il litio bis-

trimetilsililammide, essendo molto reattivo potrebbe degradarsi impedendo

quindi il corretto svolgimento della reazione. Questo step di sintesi ha

presentato delle problematiche legate allo scale-up: aumentando la quantità di

sostanza posta a reagire la reazione non è andata a completezza e per questo

motivo è stato necessario recuperare il prodotto non reagito mediante colonna

cromatografica e porlo nuovamente a reagire. Il composto 6 è stato

successivamente trattato con una soluzione di acido trifluoroacetico al 30% in


34

diclorometano per ottenere la deprotezione del gruppo amminico in seguito

all’eliminazione del gruppo protettore Boc ottenendo il composto 7.

L’aggiunta di acido trifluoroacetico è avvenuta molto lentamente mantenendo

il composto 6 in bagno di ghiaccio per evitare che l’eccessiva acidità potesse

portare a reazioni di idrolisi collaterali non desiderate.

Il composto 7 è stato infine fatto reagire con l’acido 3-isocianatobenzoico con

la conseguente ottenimento di Z-360 in seguito alla formazione del legame

ureidico.

Quest’ultimo step di reazione può essere diviso in due parti. Nella prima parte

si ha la formazione dell’acido 3-isocianatobenzoico ottenuto dalla reazione tra

acido 3-amminobenzoico e trifosgene in rapporto 3:1 in presenza di

trietilammina. Questo specifico rapporto stechiometrico è dettato dal fatto che

un equivalente di trifosgene libera 3 equivalenti di fosgene secondo il

meccanismo di reazione riportato nello schema 2 che reagiscono con

altrettanti equivalenti di acido 3-amminobenzoico dando come prodotto di

reazione l’isocianato d’interesse.

Schema 2. Formazione dell’isocianato: meccanismo di reazione.

La miscela di reazione è stata mantenuta costantemente sotto vigorosa

agitazione per evitare la formazione di cristalli eccessivamente voluminosi

derivanti dai sali di trietilammina formatisi nell’ambiente di reazione.

COOH

NH

H

O O

O

Cl

ClCl

Cl

ClCl

B:

N O

O

Cl

ClCl

H

COOH

N

COOH

C O

B:

Cl Cl

O

NH

COOH

HB:

Cl Cl

O

NH

COOH

HB:

N Cl

O

H

COOH

B:

N Cl

O

H

COOH

B:

N

COOH

C O N

COOH

C O


35

Nella seconda parte si ha la formazione del legame ureidico in seguito alla

reazione tra il gruppo amminico dell’anello benzodiazepinico e l’isocianato

neoformato con l’ottenimento del composto 8.

4.2 SINTESI DI IP1 (IsolPharm 1)

Per l’ottenimento di IP1 è stata delineata una via sintetica ex novo il cui

razionale è stato tratto da uno studio presente in letteratura16, 17.

Schema 3. Sintesi di IP1 (Isolpharm 1). Condizioni di reazione:

a. N-Boc-1,6-esandiammina, CDI, TEA, CH3CN, 1(95°C), 2(R.T.), 4 ore,

resa 70%

b. TFA (30%), DCM, 1(0°C), 2(R.T), 1 ora, resa quantitativa

c. DOTA-tris(tert-butil estere), CDI, TEA, CH3CN, 1(95°C), 2(R.T.), 4 ore,

resa 17%

d. TFA (30%), DCM, 1(0°C), 2(R.T), 1 ora, resa quantitativa

N

N

O HN

OHN

O

NH

O

HN

Boc

N

N

O HN

OHN

O

NH

O

HN N

NN

N

OO

O

O

OO

O

N

N

O HN

OHN

O

NH

ONH2

N

N

O HN

OHN

O

OHO

8 9

10

11

a

b

c

d

N

N

O HN

OHN

O

NH

O

HN N

NN

N

OOH

O

OH

OHO

O

12

X

N

N

O HN

OHN

O

NH

O

HN N

NN

N

OOH

O

OH

OHO

O

12


36

La via di sintesi, riportata nello schema 3, è strutturata in quattro step e

prevede dapprima la connessione tra molecola direzionante (Z-360) e linker e

successivamente la condensazione del chelante DOTA con l’ottenimento del

ligando finale d’interesse. Il primo step di reazione consiste nella

condensazione tra il gruppo acido del composto 8 e il gruppo amminico di N-

Boc-1,6-esandiammina con l’ottenimento del composto 9.

La reazione è stata inizialmente eseguita attivando il gruppo acido con EDCl

seguendo la metodica già impiegata precedentemente per la ciclizzazione

dell’anello benzodiazepinico costituente Z-360. A causa delle basse rese di

reazione è stato deciso di impiegare una strategia diversa. La scarsa efficienza

potrebbe essere giustificata dal fatto che la metodica impiegata era stata

inizialmente ideata per una reazione di condensazione intramolecolare,

reazione molto più favorita rispetto ad una condensazione tra due molecole

distinte. Si è quindi deciso di impiegare il CDI come attivatore dell’acido

ottenendo ottimi risultati con una resa di reazione pari al 70%.

Il composto 9 è stato successivamente trattato con una soluzione di acido

trifluoroacetico al 30% in diclorometano per ottenere la deprotezione del

gruppo amminico in seguito all’eliminazione del gruppo protettore Boc

ottenendo il composto 10.

Il composto 10 è stato quindi posto a reagire inizialmente con il chelante

DOTA, presente in eccesso rispetto all’ammina per favorire la reazione con

uno solo dei quattro gruppi acidi del chelante. Il tentativo iniziale però non ha

portato all’ottenimento del prodotto desiderato. Una delle possibili cause di

questo insuccesso potrebbe essere attribuita all’interazione tra i quattro gruppi

acidi presenti sul DOTA che impedirebbero il corretto andamento della

reazione. Alla luce di questi fatti è stata svolta una ricerca in letteratura per

valutare una diversa strategia. Basandosi su uno studio presente in

letteratura18, si è deciso di utilizzare il DOTA-tris(tert-butil estere), un

derivato del DOTA la cui struttura è riportata in figura 14 avente però tre

gruppi acidi protetti da dei tert-butili e quindi non disponibili per eventuali

reazioni secondarie o interazioni indesiderate.


37

Figura 14. Struttura di DOTA tris-(tert-butil estere)

Il composto 10 è stato quindi posto a reagire con il DOTA-tris(tert-butil estere)

in seguito a sua attivazione con CDI secondo la medesima procedura utilizzata

per l’ottenimento del composto 9, ottenendo il composto 11. Il composto 11 è

stato successivamente sottoposto a trattamento in ambiente acido per acido

trifluoroacetico ottenendo il composto 12.

A causa della difficile interpretazione dei loro spettri 1H-NMR, i composti 9,

10, 11 e 12 sono stati ulteriormente caratterizzati mediante spettroscopia di

massa, la quale ha permesso una caratterizzazione certa ed accurata dei

prodotti di reazione ottenuti.

N

N

N

N

OO

O

O

HO O

OO


38

4.3 SINTESI DI IP2 (IsolPharm 2)

La sintesi ideata per l’ottenimento di IP2 ha previsto l’introduzione di una

porzione idrofilica, costituita da una corta catena di PEG, volta ad

incrementare l’idrofilia e conseguentemente la solubilità finale del ligando in

veicolo acquoso. A causa della limitata quantità di molecola direzionante il

percorso sintetico delineato inizialmente è stato modificato permettendo di

ridurre le perdite di Z-360 dovute alle rese di reazione.

Schema 4. Sintesi di IP2 (Isolpharm 2). Condizioni di reazione:

a. N-Fmoc-N″-succinil-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine CDI, TEA,

CH3CN, 1(95°C), 2(R.T.), 4 ore, resa 36%

b. Morfolina 50%, DMF, 1(0°C), 2(R.T.), 1,5 ore, resa 97%

c. DOTA tris(tert-butil estere), BOP, TEA, DMF, 24 ore, resa

d. TFA (30%), DCM, 1(0°C), 2(R.T), 1 ora, resa quantitativa

e. CDI, TEA, CH3CN, 1(95°C), 2(R.T.), 4 ore, resa 46%

f. TFA (30%), DCM, 1(0°C), 2(R.T), 1 ora, resa quantitativa

g. CDI, TEA, CH3CN, 1(95°C), 2(R.T.), 4 ore, resa 32%

N

N

OHN

O

HN

O

NH

ONH2

O

NH

O

O NH

N

N

OHN

O

HN

O

NH

O

HN

HO

OHN

O

OHN

Fmoc

H2N

HN

Boc

3

HN

O

NH

O

O NH

Fmoc

3NH

Boc

HN

O

NH

O

O NH

Fmoc

3H2N

N

N

OO

HN

HN

O

OHO

a

b

e

f

g

10

13

14

15

16

17

18

19

20

8

Fmoc

O

NH

O

O NH2

N

N

OHN

O

HN

O

NH

O

HN

N

N

N

N

OO

O

O

OO

O

O

NH

O

O NH

N

N

OHN

O

HN

O

NH

O

HN

3

3

3

N

N

N

N

OOH

O

OH

OHO

O

O

NH

O

O NH

N

N

OHN

O

HN

O

NH

O

HN

3

c

d


39

Il percorso sintetico iniziale, riportato nello schema 4, ha previsto la

condensazione tra la catena di PEG (composto 18) e il composto 10 in seguito

ad attivazione del gruppo acido mediata da CDI ottenendo il composto 13.

Una delle criticità riscontrate in questo step riguarda l’ambiente di reazione

che si viene a creare in seguito all’aggiunta di CDI il quale, durante il processo

di attivazione del gruppo acido, libera imidazolo secondo quanto riportato

nello schema 5 andando a conferire un carattere basico alla miscela di

reazione.

R OH

O

NNH

N N

O

N N

R O

O

+ N N

O

N N

R O

O

N

O

N

NNH

R O

O

N

O

N

N

N

H

N

N

O

O

O

R

N

N

O

O

O

R

NNH

R N

O

N

CO2

R O

O

N

O

N

Schema 5. Meccanismo di attivazione dell’acido mediante CDI.

L’aumento del valore di pH fa si che il composto 18 sia coinvolto in alcune

reazioni secondarie che portano come risultato alla formazione del

sottoprodotto riportato nella figura 6, derivante dalla ciclizzazione della

porzione succinica del composto 18 ed una parziale eliminazione del gruppo

protettore Fmoc, sensibile a pH basici, con conseguente librazione

dell’ammina terminale alla catena, secondo il meccanismo di reazione

riportato in figura 15 e sua successiva reazione con uno dei gruppi acidi

attivati.


40

N OO

O NH

O

O

HO

HN O

OO

O

O

HN

Fmoc

Fmoc

Figura 15. Sottoprodotto ottenuto in seguito alla ciclizzazione.

Schema 6. Deprotezione del gruppo Fmoc mediata da CDI.

La strategia attuata per impedire l’eliminazione del gruppo protettore Fmoc è

stata quella di ridurre la concentrazione di imidazolo presente nella miscela di

reazione. Essendo il CDI presente in quantità stechiometrica e quindi non

modificabile, è stato aumentato il volume di solvente riducendo drasticamente

la concentrazione di imidazolo presente in seguito all’attivazione dei gruppi

acidi. Sono state inoltre apportate ulteriori modifiche al work-up di reazione

il quale prevedeva la concentrazione a secchezza della miscela di reazione;

per evitare che l’aumento di concentrazione dell’imidazolo, conseguente alla

rimozione del solvente, provocasse l’eliminazione del gruppo Fmoc, si è

O

O

NH

ONH

O

O

NN

H

N

HN

NH

O

O

NH

O

O

-CO2

3

O

O

NH

O

NN

3

O

O

NH

O

NN

3

H2N

O

O

NH

O

NN

3


41

provveduto a neutralizzare la miscela di reazione con una soluzione di acido

acetico prima che questa fosse concentrata a secchezza. Le modifiche

apportate hanno permesso di evitare l’eliminazione del gruppo protettore ma

non sono state in grado di impedire la formazione del sottoprodotto in seguito

alla ciclizzazione del composto 18. Il composto 13 è stato successivamente

posto in una soluzione basica di piperidina al 20% in DMF come riportato in

letteratura19 con conseguente deprotezione del gruppo amminico, ottenendo

così il composto 14 desiderato. La reazione ha presentato fin da subito una

resa molto bassa, dovuta alla formazione di diversi sottoprodotti e al parziale

passaggio in fase acquosa del composto 14 durante il work-up di reazione.

Quest’ultimo ha previsto dei lavaggi del crudo di reazione con una soluzione

acquosa satura di cloruro d’ammonio che ha però causato la protonazione del

gruppo amminico libero con un ulteriore aumento di idrofilia della molecola.

Per evitare ciò è stata apportata una modifica al work-up di reazione,

eliminando la DMF mediante la formazione di una miscela azeotropica con

toluene evitando quindi di utilizzare soluzioni acquose.

È stata inoltre eseguita una ricerca in letteratura per motivare l’inefficienza

della reazione legata alla formazione di sottoprodotti. Basandosi su quanto

riportato in letteratura20, è stata presa in considerazione la possibilità che

l’inefficienza della reazione fosse legata ad eventuali reazioni

secondarie dovute ad acil migrazioni intra o intermolecolari, indotte

dalle elevate concentrazioni di piperidina nell’ambiente di reazione

secondo il meccanismo riportato nello schema 7.

H2NX R

O

NH

X

O

X = Eteroatomo

Schema 7. Meccanismo di acil migrazione

Basandosi su quanto riportato in letteratura la reazione di deprotezione è stata

quindi condotta in bagno di ghiaccio alla temperatura di 0 °C senza però

ottenere nessun miglioramento rispetto alla precedente metodica.


42

Si è giunti quindi alla conclusione che il linker idrofilico introdotto nella

molecola fosse instabile in ambiente basico; con ciò, basandosi su quanto

riportato in letteratura21 è stata scelta una metodica di reazione che prevedesse

l’utilizzo di una base più debole della piperidina. La morfolina, base utilizzata

nella successiva reazione, ha permesso di ottenere una deprotezione del

gruppo amminico con resa del 97%, evitando la formazione di sottoprodotti

indesiderati.

Il composto 14 ottenuto è stato successivamente condensato con DOTA tris-

(tert-butil etere) in presenza di BOP secondo quanto riportato in un precedente

lavoro di tesi22, ottenendo il composto 15. La reazione era stata

precedentemente eseguita seguendo la metodica con CDI utilizzata fino ad ora

per le precedenti reazioni di condensazione senza però ottenere il composto

desiderato. Il composto 15 è stato successivamente sottoposto a trattamento in

ambiente acido per acido trifluoroacetico ottenendo di IP2 (composto 16).

In parallelo alla via sintetica appena descritta è stata ideata una strategia

alternativa per ridurre il più possibile il quantitativo di Z-360 impiegato, la

quale, oltre ad essere molto costosa, era presente in quantità limitata rispetto

agli altri reattivi.

La nuova metodica proposta, ha previsto l’iniziale costituzione del linker

idrofilico, la cui condensazione con Z-360 è avvenuta solamente in un

secondo momento. In questo modo è stato possibile dissociare la prima parte

della via sintetica e far si che eventuali abbattimenti di resa associati ad essa,

non andassero ad influire sul quantitativo di Z-360 a disposizione.

Inizialmente sono stati quindi condensati il composto 17 e il composto 18 in

presenza di CDI come attivatore dei gruppi acidi ottenendo il composto 19.

La reazione ha portato alla formazione del medesimo sottoprodotto descritto

in precedenza riportato in figura 15. Il composto 19 è stato successivamente

trattato con una soluzione di morfolina al 50% in DMF ottenendo così il

composto 20 in seguito ad eliminazione del gruppo protettore Fmoc.

Il composto 8, in seguito all’attivazione del suo gruppo acido mediante CDI è

stato condensato al composto 20 con l’ottenimento del composto 13 il quale è

stato posto a reagire con le medesime condizioni di reazione precedentemente

descritte fino all’ottenimento del composto 16 (IP2).


43

A causa della difficile interpretazione dei loro spettri 1H-NMR, i composti

13, 14, 15 e 16 sono stati ulteriormente caratterizzati mediante spettroscopia

di massa, la quale ha permesso una caratterizzazione certa ed accurata dei

prodotti di reazione ottenuti.


44

4.4 TENTATIVO DI SINTESI DI UN LINKER

IDROFILICO MEDIANTE RAFT

POLYMERIZATION

Per il terzo ligando IP3 era stato previsto un linker avente notevoli

caratteristiche idrofile costituito da un polimero composto da 10 unità

comprendenti 5 monomeri di mannosio e 5 monomeri di N-etossiacrilammide

rispettivamente. La strategia sintetica attuata per l’ottenimento del polimero

d’interesse si è basata sulla Reversible Addition-Fragmentation chain

Transfer polymerization anche chiamata RAFT polymerization. Quest’ultima

è una tecnica di polimerizzazione molto versatile e innovativa che permette

un controllo molto preciso dell’accrescimento del polimero consentendo una

previsione relativa al suo peso molecolare finale e l’ottenimento di una bassa

polidispersività. Il nucleo principale, motore di questa reazione, è l’agente di

polimerizzazione RAFT, un tiolo derivato la cui struttura è riportata in figura

16.

S

S

RZ

Figura 16. Struttura generale RAFT agent

L’agente di polimerizzazione RAFT presenta due gruppi: un gruppo R,

chiamato “gruppo dormiente”, il quale non partecipa alla reazione e un gruppo

Z, chiamato “gruppo vivente”, il quale prende parte alla reazione permettendo

l’allungamento della catena polimerica.

La via sintetica ideata, riportata nello schema 8, ha previsto l’iniziale

condensazione del composto 17 all’agente di polimerizzazione RAFT

(composto 21) in seguito all’attivazione del suo gruppo acido mediata da

EDCl ottenendo il composto 22.


45

OO O

H2N

N

O

O

NH2

HN

Boc

O

HOS

NC

S

S

NH

HN

Boc

O

S

NC S

S

O

HOHO

HOOH

ONH

O

NH

O

HO

NH

HN

O

CNS

NHO

NHO

HO OOHO

OH

HOOH

nm

N

O

O

a

b

c

17

21

22

23

24

26

2728

29

NH

NH2

O

CNS

NHO

NHO

HO OOHO

OH

HOOH

nm

N

O

O

31

N N

N

HN

NH

HN

Boc

O

NCS S

S

HNO

HNO

OHOOHO

OH

HO OH

m n

25

Boc

NH

NH2

O

CNS

NHO

NHO

HO OOHO

OH

HOOH

nm

N

O

O

30

d

e

?

?

O

H2N


46

Schema 8. Tentativo di sintesi del linker polimerico. Condizioni di reazione:

a. EDCl, NHS, DCM, N2 1(0°C), 2(R.T.), 24 ore, resa 68%

b. VA-044, Acqua/Diossano 80:20, 1(0°C), 2(60°C), overnight, resa 97%

c. Acetone, 65°C, 2 ore, resa 15 %

d. Esilammina, TEA, DMF, N2, 8 ore, resa 75%

e. TFA (30%), DCM, 1(0°C), 2(R.T), 1 ora.

Il composto 22 è stato successivamente posto reagire con i composti 23

e 24, monomeri costituenti il polimero. La reazione è stata condotta in

una miscela di acqua e diossano in rapporto 80:20, in presenza

dell’attivatore radicalico VA-044. La miscela di reazione è stata

inizialmente posta a degasare con N2 in bagno di ghiaccio, passaggio

fondamentale per eliminare l’ossigeno dall’ambiente di reazione il

quale avrebbe potuto portare a reazioni radicaliche indesiderate. In

seguito, la miscela è stata posta in bagno d’olio termostatato alla

temperatura di 60 °C per tutta la notte. L’aumento di temperatura,

necessario per la formazione della specie radicalica mediata da VA-

044, ha permesso l’avvio del processo di polimerizzazione RAFT, il cui

meccanismo è riportato nello schema 9, con l’ottenimento del composto

25.

Schema 9. Meccanismo di di polimerizzazione RAFT23.

S

S

RZ + R

1

S

S

RZ

R 1

S

S

RZ

R 1R

1

R1

Z

HS

S

R

R 1 S

S

R

R1

R1

ZS

S

R

R1

Z + R1

RAFT Monomeroattivato

R1

+ A R1

Monomeroattivato

AttivatoreMonomero


47

La reazione ha presentato fin da subito diversi problemi tra cui l’immiscibilità

tra le due fasi costituenti la miscela di reazione. Il composto 22, solubilizzato

in diossano, è risultato inizialmente immiscibile con i composti 23 e 24

solubilizzati in acqua a causa dell’aumento di lipofilia dell’agente RAFT in

seguito alla condensazione con il composto 17. Nonostante la netta

separazione di fase, la reazione è stata ugualmente condotta seguendo quanto

riportato in letteratura, ottenendo non più una miscela presentante una

separazione di fase ma una miscela opalescente con caratteristiche correlabili

ad un’emulsione. Questa variazione fisica è stata successivamente associata

alla formazione del polimero, il quale, presentando una struttura anfifilica, ha

portato all’emulsionamento della miscela di reazione. Il composto 25 è stato

successivamente sottoposto ad analisi GPC la quale ha riportato un buon

valore di polidispersività (1.17) ma un eccessivo tempo di ritenzione, indice

di un peso molecolare superiore rispetto al valore atteso. Si è ipotizzato che il

valore relativo al peso molecolare ottenuto, fosse dovuto ad una

micellizzazione del polimero posto in acqua, solvente utilizzato per effettuare

l’analisi, oppure fosse dovuto ad una incompleta reazione del RAFT agent a

causa della difficoltà di miscelazione iniziale, con conseguente formazione di

polimeri aventi catene polimeriche di lunghezza maggiore. Per determinare

l’esatto peso molecolare del polimero sono state proposte diverse alternative,

tra cui proseguire con la via di sintesi addizionando il composto 28, ottenuto

ponendo a reflusso una soluzione dei composti 26 e 27 in acetone, al composto

25. Il prodotto di reazione risultante (composto 29), avendo un gruppo

alchino, avrebbe dovuto presentare un segnale caratteristico allo spettro 1H-

NMR il quale, rapportandolo con gli altri segnali presenti, avrebbe permesso

di risalire al numero di monomeri costituenti il polimero e quindi al suo peso

molecolare. Questa strategia non ha però portato al risultato sperato in quanto

lo spettro 1H-NMR eseguito è risultato di difficile interpretazione e, a causa

di questo, il segnale relativo all’alchino non è stato identificato.

Si è deciso quindi di sottoporre il prodotto di reazione all’analisi di massa

(ESI) la quale però non ha fornito un risultato soddisfacente. Il grafico

ottenuto, riportato in figura 17, riporta un ampio range di pesi molecolari,

risultato non affidabile e quindi non preso in considerazione.


48

Figura 17. Analisi di Massa del polimero.

Non avendo ottenuto risultati soddisfacenti è stata presa in considerazione una

strategia alternativa la quale prevedeva la deprotezione del gruppo amminico

presente nel polimero mediante trattamento in ambiente acido con

l’ottenimento del composto 30 e sua successiva analisi mediante saggio TNBS

per poter quantificare i gruppi amminici primari presenti sulla molecola.

Questi, essendo in rapporto 1:1 con il polimero, avrebbero permesso di risalire

alla sua concentrazione e indirettamente al suo peso molecolare. I risultati

ottenuti hanno però indicato un peso molecolare di gran lunga superiore

rispetto a quanto riportato dalla precedente analisi GPC. Questo divario

potrebbe essere dovuto ad una errata pesata iniziale del campione con un

conseguente errore nel calcolo del suo peso molecolare o ad una incompleta

deprotezione dei gruppi amminici con una successiva perdita del loro rapporto

1:1 con il polimero.

A causa di tutti questi fattori di incertezza la metodica è stata abbandonata.

Si è deciso quindi di delineare una via sintetica alternativa, riportata nello

schema 10, la quale non prevedeva l’iniziale condensazione della N-Boc-1,6-

esandiammina al RAFT agent per evitare i problemi di miscelazione

riscontrati nella metodica precedente, possibile causa dell’insuccesso iniziale.


49

Schema 10. Sintesi del linker polimerico. Condizioni di reazione:

a. VA-044, Acqua/Diossano 80:20, 1(0°C), 2(60°C), overnight, resa 97%

b. Esilammina, TEA, DMF, N2, 8 ore.

c. CuSO4, sodio ascorbato, t-BuOH, 80°C, 100 W, 1 minuto

HO

O

S

NC S

S

O

HOHO

HOOH

ONH

O

NH

O

HO

HO

O

NCS S

S

HNO

HNO

OHOOHO

OH

HO OH

5 5

N

O

O

HO

O

NCS

HNO

HNO

OHOOHO

OH

HO OH

5 5

N

O

O

N3NH

NH

O

NCS

HNO

HNO

OHOOHO

OH

HO OH

5 5

N

O

O

NH

Boc

N N

N

HN

a

b?

?

21

23

24

28

32

33

HO

O

NCS

HNO

HNO

OHOOHO

OH

HO OH

5 5

N

O

ON N

N

HN

34

35

31

c

O

NH2

O

NH2

O

NH2


50

Il primo step della via sintetica ha previsto la reazione di polimerizzazione tra

il RAFT agent privo di catena alchilica (composto 21) e i due monomeri

(composti 23 e 24) con l’ottenimento del composto 32. Come previsto

l’ottenimento del polimero, avvenuto seguendo le stesse condizioni di

reazione riportate in precedenza, non ha riportato problemi relativi a

separazione di fase in quanto tutti i componenti risultavano perfettamente

miscibili tra loro. Il composto 32 è stato successivamente sottoposto ad analisi

GPC la quale ha riportato un buon valore di polidispersività (1.10) e un tempo

di ritenzione riconducibile al peso molecolare atteso (2500 Da). In luce a ciò

è stato possibile confermare le ipotesi avanzata in precedenza, le quali

attribuivano la causa dell’insuccesso alla natura lipofila della N-Boc-1,6-

esandiammina condensata al RAFT agent.

Il composto 32 è stato successivamente posto a reagire con il composto 28

seguendo la medesima metodica impiegata in precedenza. Lo spettro 1H-NMR

eseguito sul prodotto ottenuto non ha però permesso di identificare con

chiarezza il segnale derivante dal gruppo alchino, caratteristico del composto

33. Non avendo la possibilità di caratterizzare con certezza il prodotto di

reazione si è deciso di proseguire con la via di sintesi la quale prevedeva una

cicloaddizione di Huisgen azide-alchino rame-catalizzata tra il composto 34 e

l’alchino terminale del composto 33 con la conseguente formazione di un

1,2,3-triazolo, come riportato in figura 18, il quale avrebbe dovuto fornire un

segnale caratteristico se sottoposto ad analisi 1H-NMR.

R1 NN

N

R2

NN N

R2

R1

+

Figura 18. Cicloaddizione di Huisgen azide-alchino


51

La reazione di cicloaddizione è stata condotta in microonde in presenza di

CuSO4 e sodio ascorbato, agente antiossidante necessario per mantenere il

rame liberato da CuSO4 nella sua forma ridotta Cu(I), fattore fondamentale

per la buona riuscita della reazione.

Il prodotto di reazione è stato successivamente sottoposto ad analisi 1H-NMR

la quale però non presentava i segnali attesi derivanti dal’1,2,3-triazolo.

Non avendo avuto la possibilità di caratterizzare con precisione i composti 33

e 35 non è stato possibile risalire con certezza ad un’eventuale causa e

associare quest’ultima ad uno specifico step di reazione.

A causa dei problemi riscontrati nelle metodiche precedentemente descritte si

è deciso di abbandonare definitivamente la sintesi del linker polimerico.


52

53

5. PARTE SPERIMENTALE

5.1 MATERIALI

I prodotti ed i reagenti (Acros, Aldrich, IrisBiotech) sono stati utilizzati come

tali, senza purificazioni.

La purezza dei solventi organici (Carlo Erba e Lab Scan) è di grado analitico.

I solventi deuterati utilizzati per NMR (Isotec) presentano un grado di purezza

isotopica del 99,5%.

La cromatografia su strato sottile è stata effettuata su lastre al gel di silice 60

F245 (0.2 mm, Merck), eluendo come indicato volt per volta.

La cromatografia su colonna è stata eseguita utilizzando gel di silice 60 (0.063

– 0.100 mm, Merck), eluendo con i solventi di volta in volta indicati.

5.2 STRUMENTAZIONE

Gli spettri 1H.NMR sono stati eseguiti con spettrometro Bruker 300-AMX e

400-AMX, utilizzando TMS come standard interno (δ=0) ed i solventi

deuterati di volta in volta indicati; i valori di assorbimento sono espressi in δ

e le costanti in Hz.

Gli Spettri di massa sono stati eseguiti su un Applied Biosystem Mariner

System 5220 per iniezione diretta del campione e mediante un analizzatore

MALDI TOF/TOF 400 Plus AB Sciex, (MA, USA).

Per le reazioni assistite da microonde è stato utilizzato un reattore di tipo

monomodale (CEM Discover) con sistema di controllo della potenza e della

temperatura automatici.

Le analisi GPC sono state eseguite utilizzando un rilevatore a tripla serie

Marvel Viscotek (modello 302) dotato di difrattometro, light scattering

(diffusione della luce a basso angolo-LALS e scattering della luce ad angolo

retto-RALS) e viscosimetro differenziale. Sono state impiegate colonne

accoppiate TSKgel G3000 (7 μm, 7.8×300 mm) e TSKgel G4000 (10 μm,

Parte Sperimentale

54

7.8 × 300 mm) termostatate a 40°C e utilizzando come eluente NaNO3 0,1 M

integrato con NaN3 alla concentrazione di 0.02% peso/peso (pH 7,4) con una

portata pari a 0,6 mL/min. I pullulani impiegati come stadard nella

calibrazione delle colonne sono stati forniti da Malvern Instruments Ltd.,

U.K.

Le misure spettrofotometriche di assorbimento UV sono state eseguite

mediante uno spettrofotometro UV-Vis λ25 Perkin Elmer (Norworlk, CT,

USA).

Parte Sperimentale

55

5.3 METODI

5.3.1. SINTESI DI NASTORAZEPIDE (Z-360)

Sintesi di acido 2-tert-butossicarbonilamino-3-(2’-

nitrofenil)amminopropionico

F

NO2

COOHNH

NH2

Boc

K2CO3, Etanolo

HN

NO2

COOH

HNBoc

Una soluzione di 2-fluoronitrobenzene (0.9 g, 6.7 mmoli), Boc-Dap-OH (2.0

g, 10.0 mmoli) e K2CO3 (2.8 g, 20.0 mmoli) in EtOH (15 mL) è stata posta a

reflusso per 16 ore (TLC: CHCl3/MeOH 9:1 + 1% HCOOH).

Dopo raffreddamento la miscela di reazione è stata concentrata a secchezza e

il residuo è stato ripreso con H2O (50 mL) lavato con dietil etere (3 x 50 mL).

La fase acquosa è stata posta in bagno di ghiaccio e acidificata sotto agitazione

con HCl 1M fino a pH 4. Il precipitato giallo formatosi è stato recuperato

mediante filtrazione ottenendo così l’acido 2-tert-butossicarbonilammino-

3-(2’-nitrofenil)amminopropionico.

La fase acquosa è stata ulteriormente estratta con EtOAc (25mL x 2). La fase

organica anidrificata è stata concentrata a secchezza e il residuo giallo ottenuto

riunito al precedente precipitato (2.0 g, resa 93%).

1H-NMR (CDCl3): 8.25 (s all, 1H, NH); 8.15

(d, J=8.2, 1H, 3’-H); 7.46 (t, J=8.2, 1H, 5’-

H); 7.00 (d, J=8.2, 1H, 6’-H); 6.70 (t, J=8.2,

1H, 4’-H); 5.40-5.30 (s all, 1H, NH); 4.65-

4.56 (m, 1H, 2-H); 3.90-3.67 (m, 2H, 3-H);

1.44 (s, 9H, 3 x CH3).

Parte Sperimentale

56

Sintesi di acido 2-tert-butossicarbonilamino-3-(2’-

amminofenil)amminopropionico

HN

NO2

COOH

HNBoc

10% Pd/C

Metanolo

HN

NH2

COOH

HNBoc

Una sospensione di Pd/C 10% (0.2 g) in MeOH (60 mL) e stata posta sotto

agitazione in atmosfera di H2 per 1 ora. Alla sospensione è stata aggiunta una

soluzione di acido 2-tert-butossicarbonilammino-3-(2’-nitrofenil)

amminopropionico (2.0 g, 6.2 mmoli) in MeOH. L’atmosfera di H2 è stata

ripristinata e la miscela di reazione è stata lasciata in agitazione per 3 ore

(TLC: EtOAC/MeOH 8:2).

La miscela di reazione è stata filtrata su celite. Il filtrato è stato concentrato a

secchezza ottenendo così l’acido 2-tert-butossicarbonilamino-3-(2’-

amminofenil)-amminopropionico (1.8 g, resa quantitativa).

1H-NMR (CDCl3): 6.95-6.70 (m, 4H, 4 x Ar-

H); 5.80 (s all, 1H, NH); 4.54-4.46 (m, 1H, 2-

H); 3.60-3.40 (m, 2H, 3-H); 1.42 (s, 9H, 3 x

CH3).

Parte Sperimentale

57

Sintesi di 3-tert-butossicarbonilammino-1,3,4,5-tetrahydro-2H-

benzo[b][1,4]diazepin-2-one

HN

NH2

COOH

HNBoc

EDCl

N,N-DimetilformammideNH

HN

O

NH

Boc

Una soluzione di acido 2-tert-butossicarbonilamino-3-(2’-amminofenil)-

amminopropionico (0.7 g, 2.3 mmoli) in DMF anidra (25 mL) è stata posta in

agitazione in bagno di ghiaccio. Alla soluzione è stata aggiunta EDCl (0.5 g,

2.6 mmoli) e la miscela di reazione è stata mantenuta in agitazione per 18 ore,

mantenendola al riparo dall’umidità mediante pipa di cloruro calcio (TLC:

CHCl3/MeOH 9:1).

La miscela di reazione è stata ripresa con una soluzione acquosa satura di

NH4Cl (500 mL) e successivamente estratta con EtOAc (3 x 150 mL).

La fase organica è stata sottoposta a lavaggi con una soluzione acquosa satura

di NaHCO3 (2 x 150mL), anidrificata e infine concentrata a secchezza

ottenendo così il 3-tert-butossicarbonilammino-1,3,4,5-tetrahydro-2H-

benzo[b][1,4]diazepin-2-one (0.6 g, resa 97%).

1H-NMR (CDCl3): 7.42 (s all, 1H, NH);

7.05-6.97 (m, 1H, Ar-H); 6.90-6.75 (m, 3H,

3 x Ar-H) 5.70 (s all, 1H, NH); 4.56-4.49 (m,

1H, 3-H); 3.92-3.85 (m, 1H, 4-Ha); 3.47-3.40

(m, 1H, 4-Hb); 1.44 (s, 9H, 3 x CH3).

Parte Sperimentale

58

Tentativo di sintesi di 5-cicloesil-3-tert-butossicarbonilammino-

1,3,4,5-tetrahydro-2H-benzo[b][1,4]diazepin-2-one

NH

HN

O

NH

Boc

NH

N

O

NH

Boc

O

METODO A

Ad una soluzione di 3-tert-butossicarbonilammino-1,3,4,5-tetrahydro-2H-

benzo[b][1,4]diazepin-2-one (0.6 g, 2.3 mmoli) in AcOH/DCM 1:1 (15 mL)

è stato aggiunto cicloesanone (0.3 g, 2.9 mmoli) goccia a goccia sotto

agitazione. La soluzione è stata lasciata in agitazione per 1 ora. Dopo aver

aggiunto NaBH(OAc)3 (0.8 g, 3.6 mmoli) la miscela è stata lasciata in

agitazione (TLC: CE/EtOAc 6:4). Poiché non si è assistiti alla formazione di

alcun prodotto diverso da quello di partenza questo metodo è stato

abbandonato.

METODO B


benzo[b][1,4]diazepin-2-one (0.1 g, 0.5 mmoli) in AcOH/DCM 1:1 (5 mL) è

stato aggiunto cicloesanone (60.0 mg, 0.7 mmoli) goccia a goccia sotto

agitazione. La soluzione è stata lasciata in agitazione per 1 ora. Dopo aver

aggiunto NaBH(OAc)3 (0.6 g, 3.0 mmoli) la miscela è stata lasciata in

agitazione (TLC: CE/EtOAc 6:4). Poiché non si è assistito alla formazione di

alcun prodotto diverso da quello di partenza questo metodo è stato

abbandonato.

METODO C


benzo[b][1,4]diazepin-2-one (60.0 mg, 0.2 mmoli) in DCM (1 mL) e AcOH

Parte Sperimentale

59

(20.0 mg, 0.4 mmoli) è stato aggiunto cicloesanone (30.0 mg, 0.3 mmoli)

goccia a goccia sotto agitazione. La soluzione è stata lasciata in agitazione per

1 ora. Dopo aver aggiunto NaBH(OAc)3 (80.0 mg, 0.4 mmoli) la miscela è

stata lasciata in agitazione (TLC: CE/EtOAc 6:4). Poiché non si è assistiti alla

formazione di alcun prodotto diverso da quello di partenza questo metodo è

stato abbandonato.

METODO D


benzo[b][1,4]diazepin-2-one (0.3 g, 1.0 mmoli) in AcOH/DCM 1:1 (10 mL)

è stato aggiunto cicloesanone (0.1 g, 1.3 mmoli) goccia a goccia sotto

agitazione. La soluzione è stata lasciata in agitazione per 1 ora.

Successivamente alla miscela di reazione è stato aggiunto NaBH4 (0.4 g, 12.0

mmoli) in due porzioni equivalenti a distanza di 30 minuti (TLC: CE/EtOAc

6:4). La miscela di reazione è stata ripresa con acqua, alcalinizzata con NaOH

2M fino a pH 10 e successivamente estratta con EtOAc (3 x 50 ml). La fase

organica è stata anidrificata e concentrata a secchezza. Poiché non è stato

ottenuto il prodotto desiderato questo metodo è stato abbandonato.

METODO E


benzo[b][1,4]diazepin-2-one (60.0 mg, 0.2 mmoli) e cicloesanone (80.0 mg,

0.8 mmoli) in THF (1 mL) è stato aggiunto sotto agitazione AcOH (50.0 mg,

0.8 mmoli). La soluzione è stata posta a reflusso sotto agitazione per 1 ora.

Dopo raffreddamento alla miscela di reazione è stato aggiunto NaBH4 (0.1 g,

2.8 mmoli) in tre porzioni ad intervalli di 30 minuti (TLC: CE/EtOAc 6:4).

La miscela di reazione è stata diluita con acqua (5 mL), alcalinizzata con

Na2CO3 fino a pH 10 ed estratta con EtOAc (2 x 3 mL). La fase organica è

stata anidrificata e concentrata a secchezza. Poiché non è stato ottenuto il

prodotto desiderato questo metodo è stato abbandonato.

Parte Sperimentale

60

Sintesi di 5-cicloesil-3-tert-butossicarbonilammino-1,3,4,5-

tetrahydro-2H-benzo[b][1,4]diazepin-2-one

NH

HN

O

NH

Boc

NH

N

O

NH

Boc

O

Acido acetico

PtO2


benzo[b][1,4]diazepin-2-one (2.1 g, 7.5 mmoli) in AcOH (16.5 mL) è stato

aggiunto PtO2 (59.0 mg, 0.2 mmoli). La miscela di reazione è stata posta in

atmosfera di H2 e lasciata in agitazione per 16 ore (TLC: CE/EtOAc 8:2). La

miscela di reazione è stata ripresa con EtOAc (10 mL), filtrata e

successivamente neutralizzata con una soluzione acquosa di NaOH 2M fino a

pH 7. Dopo aver anidrificato la fase organica il solvente è stato rimosso

mediante evaporatore rotante; il residuo ottenuto è stato precipitato in etere

ottenendo il 5-cicloesil-3-tert-butossicarbonilammino-1,3,4,5-tetrahydro-

2H-benzo[b][1,4]diazepin-2-one (2.1 g, resa 80%).

1H-NMR (CDCl3): 7.20-7.13 (m, 2H, 7-H e

8-H); 7.03-6.91 (m, 2H, 6-H e 9-H); 5.51-

5.46 (m, 1H, NH); 4.49-4.39 (m, 1H, 3-H);

3.78-3.70 (m, 1H, 4-Ha); 3.39-3.31 (m, 1H,

4-Hb); 3.29-3.20 (m, 1H, H-cicloesano);

2.01-1.93 (m, 1H , H-cicloesano); 1.89-1.81

(m, 1H, H-cicloesano); 1.79-1.70 (m, 2H, 2 x

H-cicloesano); 1.64-1.56 (m, 2H, 2 x H-

cicloesano) 1.41 (s, 9H, 3 x CH3); 1.37-

1.10 (m, 4H, 4 x H-cicloesano).

Parte Sperimentale

61

Sintesi di 1-(3’,3’-dimetil-2’-osso)butil-5-cicloesil-3-tert-

butossicarbonilammino-1,3,4,5-tetrahydro-2H-

benzo[b][1,4]diazepin-2-one

NH

N

O

NH

Boc

N

N

O

NH

Boc

O

O

LiHMDs, Tetraidrofurano

-78 °C

Cl

METODO A

Una soluzione di 5-cicloesil-3-tert-butossicarbonilammino-1,3,4,5-

tetrahydro-2H-benzo[b][1,4]diazepin-2-one (0.2 g, 0.5 mmoli) in THF (5mL)

è stata posta a -78 °C in atmosfera di N2.

Dopo 20 minuti è stata aggiunta una soluzione di LiHMDs 1M in THF (0.7

mL, 0.7 mmoli) goccia a goccia. La miscela di reazione è stata mantenuta in

agitazione a -78 °C per 30 minuti trascorsi i quali è stato aggiunto

cloropinacolone (0.1 g, 0.7 mmoli). La miscela di reazione è stata mantenuta

in agitazione a temperatura ambiente per 1 ora (TLC: CE/EtOAc 6:4). Tale

processo di aggiunta di LiHMDS e cloropinacolone è stato ripetuto per un

totale di 3 volte fino al completamento della reazione. La miscela di reazione

è stata diluita con una soluzione acquosa satura di NH4Cl fino a pH 7 e

successivamente estratta con EtOAc (3 x 20 mL). La fase organica è stata

anidrificata e concentrata a secchezza ottenendo l’1-(3’,3’-dimetil-2’-

osso)butil-5-cicloesil-3-tert-butossicarbonilammino-1,3,4,5-tetrahydro-

2H-benzo[b][1,4]diazepin-2-one (0.2 g, resa 80%).

Parte Sperimentale

62

1H-NMR (CDCl3): 7.18-7.14 (m, 2H, 7-H e

8-H); 7.02-6.94 (m, 2H, 6-H e 9-H); 5.58-

5.53 (m, 1H, NH); 5.16 (d, J=17.9, 1H, 1’-

Ha); 4.48-4.40 (m, 1H, 3-H); 4.12 (d, J=17.9,

1H, 1’-Hb); 3.65-3.58 (m, 1H, 4-Ha); 3.31-

3.15 (m, 2H, 4-Hb e H-cicloesano); 2.04-1.96

(m, 1H, H-cicloesano); 1.87-1.78 (m, 1H, H-

cicloesano); 1.77-1.58 (m, 4H, 4 x H-

cicloesano); 1.39 (s, 9H, 3 x CH3); 1.26 (s,

9H, 3 x CH3) 1.23-1.14 (m, 4H, 4 x H-

cicloesano).

Parte Sperimentale

63

Sintesi di 3-ammino-1-(3’,3’-dimetil-2’-osso)butil-5-cicloesil-1,3,4,5-

tetrahydro-2H-benzo[b][1,4]diazepin-2-one

N

N

O

NH

Boc

O

N

N

O

NH2

ODiclorometano

Acido Trifluoroacetico 30%,

Una soluzione di 1-(3’,3’-dimetil-2’-osso)butil-5-cicloesil-3-tert-

butossicarbonilammino-1,3,4,5-tetrahydro-2H-benzo[b][1,4]diazepin-2-one

(1.5 g, 3.2 mmoli) in DCM (20 mL) è stata posta in bagno di ghiaccio. Alla

soluzione è stato aggiunto TFA (6 mL) goccia a goccia e la miscela di reazione

è stata lasciata in agitazione per 1 ora a temperatura ambiente (TLC:

CE/EtOAc 6:4).

La soluzione è stata quindi concentrata a secchezza ottenendo il 3-ammino-

1-(3’,3’-dimetil-2’-osso)butil-5-cicloesil-1,3,4,5-tetrahydro-2H-

benzo[b][1,4]diazepin-2-one (1.2 g, resa quantitativa)

1H-NMR (CDCl3): 7.51-7.37 (m, 3H, 3 x Ar-H);

7.20-715 (m, 1H, Ar-H); 4.82 (s, 2H, 1’-H); 4.27-

4.07 (m, 3H, 3-H e 4-H); 3.77-3.68 (m, 1H, H-

cicloesano); 2.25-2.16 (m, 1H, H-cicloesano); 2.04-

1.55 (m, 2H, 2 x H-cicloesano); 1.80-1.55 (m, 3H,

3 x H-cicloesano); 1.45-1.25 (m, 4H, 4 x H-

cicloesano); 1.21 (s, 9H, 3 x CH3).

Parte Sperimentale

64

Sintesi di Nastorazepide (Z-360)

N

N

O

NH2

O

Trietilammina,

Tetraidrofurano

N

N

O

NH

O

NH

O

HOOC

H2N

COOH

N

COOH

CO

Una soluzione di acido 3-amminobenzoico (82.0 mg, 0.6 mmoli) in THF

anidro (2 mL) è stata posta in bagno di ghiaccio fino al raggiungimento di 0

°C. Alla soluzione è stato successivamente aggiunto bis-triclorometil

carbonato (45.0 mg, 0.2 mmoli) sotto vigorosa agitazione la quale è proseguita

per ulteriori 10 minuti.

Alla miscela è stata aggiunta TEA (0.3 g, 2.0 mmoli) goccia a goccia nell’arco

di 5 minuti e successivamente la miscela di reazione è stata mantenuta in

agitazione per altri 5 minuti, trascorsi i quali è stata aggiunta una soluzione di

3-ammino-1-(3’,3’-dimetil-2’-osso)butil-5-cicloesil-1,3,4,5-tetrahydro-2H-

benzo[b][1,4]diazepin-2-one (0.1 g, 0.2 mmoli) in THF anidro (1.5 mL). La

miscela è stata lasciata in agitazione a temperatura ambiente per 16 ore (TLC:

CHCl3/MeOH 9:1 + 1% HCOOH).

La miscela di reazione è stata ripresa con EtOAc (10 mL) e sottoposta a

lavaggi con una soluzione acquosa satura di NH4Cl (2 x 10). La fase organica

è stata anidrificata e successivamente concentrata a secchezza ottenendo così

la Nastorazepide (Z-360) (70.0 mg, resa 87%).

Parte Sperimentale

65

1H-NMR (CDCl3): 8.34 (d, J=7.8, 1H, 4”-

H); 8.22 (s all, 1H, NH); 7.72 (s, 1H, 2”-

H); 7.60 (d, J=7.8, 1H, 6”-H); 7.41-7.31

(m, 3H, 3 x Ar-H); 7.12-7.02 (m, 2H, Ar-

H); 5.30-5.22 (d, J=17.6, 1H, 1’-Ha);

4.72-4.64 (m, 1H, 3-H); 4.22-4.14 (d,

J=17.6, 1H, 1’-Hb); 3.90-3.82 (m, 1H, 4-

Ha); 3.54-3.46 (m, 1H, 4-Hb); 3.36-3.28

(m, 1H, H-cicloesano); 2.10-2.02 (m, 1H,

H-cicloesano); 1.90-1.44 (m, 9H, H-

cicloesano); 1.24-1.18 (s, 9H, 3 x CH3).

Parte Sperimentale

66

5.3.2. SINTESI IP1

Sintesi di Z-360-NH-Ex-NH-Boc

METODO A

N

N

OHN

O

HN

O

COOH

H2N

HN

BocN

N

OHN

O

HN

O

NH

O

HN

Boc

EDCl,

N,N-Dimetilformammide

Una soluzione di Nastorazepide (52.0 mg, 0.1 mmoli) e N-Boc-1,6-

esandiammina (35.0 mg, 0.2 mmoli) in DMF anidra (0.5 mL) è stata posta in

atmosfera di N2 in bagno di ghiaccio per 10 minuti fino al raggiungimento di

0 °C. Alla soluzione è stato aggiunto EDCl (38.0 mg, 0.2 mmoli) e, dopo aver

ripristinalo l’atmosfera di N2, la miscela di reazione è stata lasciata in

agitazione a temperatura ambiente per 24 ore (TLC: DCM/EtOAc/MeOH

6:3:1). La miscela di reazione è stata ripresa con EtOAc (5 mL) e sottoposta a

dei lavaggi con una soluzione acquosa satura di NH4Cl (3mL x 2). La fase

organica è stata anidrificata e concentrata a secchezza. Il residuo ottenuto è

stato purificato mediante colonna cromatografica (DCM/EtOAc/MeOH 6:3:1)

ottenendo così Z-360-NH-Ex-NH-Boc (20.0 mg, resa 30 %).

Parte Sperimentale

67

METODO B

N

N

OHN

O

HN

O

COOH

H2N

HN

BocN

N

OHN

O

HN

O

NH

O

HN

Boc

Carbonildiimidazolo,

Trietilammina, Acetonitrile

Ad una soluzione di Nastorazepide (52.0 mg, 0.1 mmoli) in acetonitrile (1

mL) è stato aggiunto CDI (24.0 mg, 0.2 mmoli). La miscela è stata posta sotto

agitazione a reflusso con pipa di calcio per 3 ore. Dopo raffreddamento

un’aliquota della miscela di reazione è stata diluita in MeOH ed analizzata

mediante TLC (TLC CHCl3/MeOH 9:1).

Alla miscela è stata aggiunta TEA (15.0 mg, 0.2 mmoli) e successivamente, a

distanza di 10 minuti, una soluzione di N-Boc-1,6-esandiammina (26.0 mg,

0.1 mmoli) in acetonitrile (1 mL). La miscela è rimasta in agitazione a

temperatura ambiente con pipa di calcio per 1 ora e successivamente

concentrata a secchezza. Il residuo è stato ripreso con EtOAc (10 mL) e

sottoposto a lavaggi con una soluzione acquosa satura di NH4Cl (5 mL x 2).

La fase organica è stata anidrificata e purificata mediante colonna

cromatografica (eluente: CHCl3/MeOH 95:5) ottenendo così Z-360-NH-Ex-

NH-Boc (50.0 mg, resa 70 %), con spettro 1H-NMR identico a quello

precedentemente ottenuto.

Parte Sperimentale

68

1H-NMR (CDCl3): 7.49 (s all, 1H, NH); 7.35 (d, J=8.3, 1H, 6”-H); 7.28-7.22

(m, 2H, Ar-H x 2); 7.14-7.07 (m, 2H, Ar-H x 2); 7.01-6.95 (m, 3H, Ar-H x 3);

6.65-6.60 (m, 1H, NH); 5.31 (d, J=17.6, 1H, 1’-Ha); 4.86-4.74 (m, 1H, 3-H);

4.62 (s all, 1H, NH); 4.10 (d, J=17.6, 1H, 1’-Hb); 3.56-3.32 (m, 4H, 1”’-CH2

e 6”’-CH2); 3.30-3.20 (m, 1H, 3-H); 3.10-3.00 (m, 2H, 4-H); 2.12-2.00 (m,

1H, H-cicloesano]); 1.90-1.50 (m, 10H, H-alifatici); 1.45-1.41 (s, 9H,

COOtBu); 1.38-1.29 (m, 7H, H-alifatici); 1.15-1.11 (s, 9H, COtBu).

Parte Sperimentale

69

Sintesi di Z-360-NH-Ex-NH2

N

N

O HN

O

HN

O

NH

O

HN

BocAcido Trifluoroacetico 30%,

Diclorometano

N

N

O HN

O

HN

O

NH

ONH2

Una soluzione di Z-360-NH-Ex-NH-Boc (50.0 mg, 0.1 mmoli) in DCM (1

mL) è stata posta in bagno di ghiaccio per 20 minuti fino al raggiungimento

di 0 °C.

Alla soluzione è stato aggiunto TFA (0.3 mL) goccia a goccia. La miscela di

reazione è stata lasciata in agitazione per 1 ora a temperatura ambiente (TLC:

CHCl3/MeOH 9:1).

La soluzione è stata concentrata a secchezza ottenendo Z-360-NH-Ex-NH2

(40.0 mg, resa quantitativa).

N

NO

O

HN

O

HN

O NH

NH2

1'

2''

3

4

5''

67

89

4''

6''

1'''

2'''

3'''

4'''

5'''

6'''

1H-NMR (CDCl3): 7.80-7.70 (s all, H, 2”-H); 7.43-7.29 (m, 3H, Ar-H x 3);

7.24-7.16 (m, 2H, Ar-H x 2); 7.09-7.01 (m, 2H, Ar-H x 2); 5.25-5.18 (d,

J=17.60, 1H, 1’-Ha); 4.70.-4.62 (m, 1H, 3-H); 4.28-4.20 (d, j=17.60 1H, 1’-

Hb); 3.50-3.30 (m, 4H, 1”’-CH2 e 6”’-CH2); 3.30-3.20 (m, 1H, H-cicloesano);

3.10-3.00 (m, 2H, 4-CH2); 2.12-2.00 (m, 1H, H-cicloesano); 1.90-1.80 (m,

2H, H-cicloesano x 2); 1.75-1.50 (m, 7H, H-alifatici); 1.46-1.36 (m, 4H, H-

cicloesano x 4); 1,33-1.24 (m, 4H, 3”’-CH2 e 4”’-CH2); 1.16-1.13 (s, 9H,

COtBu).

Parte Sperimentale

70

Tentativo di sintesi di IP1-tris(tert-butil estere)

Una soluzione di Z-360-NH-Ex-NH2 (20.0 mg, 30.0 µmoli) e DOTA (24.0

mg, 60.0 µmoli) in DMF anidra (0.3 mL) è stata posta in bagno di ghiaccio

sotto agitazione in atmosfera di N2 per 15 minuti fino al raggiungimento di 0

°C. Successivamente è stato aggiunto EDCl (13.0 mg, 70.0 µmoli). Dopo aver

ripristinato l’atmosfera di N2 la miscela è stata mantenuta in costante

agitazione per 14 ore a temperatura ambiente. (TLC: DCM/EtOAc/MeOH

6:3:1).

La miscela di reazione è stata ripresa con una soluzione acquosa satura di

NH4Cl (5 mL) e successivamente estratta con EtOAc (5 mL x 2). La fase

organica è stata anidrificata e concentrata a secchezza. Poiché non è stata

ottenuto il prodotto d’interesse questa metodica è stata abbandonata.

N

N

OHN

O

HN

O

NH

ONH2

N N

N N

O

HO OOH

O

OHHO O

EDCl,

N,N-Dimetilformammide

N

N

OHN

O

HN

O

NH

O

HN N

NN

N

OOH

O

OH

OHO

O

Parte Sperimentale

71

Sintesi di IP1-tris(tert-butil estere)

Ad una soluzione di DOTA-tris(tert-butil estere) (33.0 mg, 58.0 µmoli) in

acetonitrile (1 mL) è stato aggiunto CDI (14.0 mg, 87.0 µmoli). La miscela è

stata posta sotto agitazione a reflusso con pipa di calcio per 3 ore. Dopo

raffreddamento un’aliquota della miscela di reazione è stata diluita in MeOH

ed analizzata mediante TLC (TLC CHCl3/MeOH 9:1-N.B. far correre oltre il

fronte).

Alla miscela è stata aggiunta TEA (9.0 mg, 87.0 µmoli) e successivamente, a

distanza di 10 minuti, una soluzione di Z-360-NH-Ex-NH2 (40.0 mg, 70.0

µmoli) in acetonitrile (1 mL). La miscela è rimasta in agitazione a temperatura

ambiente con pipa di calcio per tutta la notte (TLC CHCl3/MeOH 9:1).

La miscela di reazione è stata concentrata a secchezza, il residuo è stato ripreso

con EtOAc (10 mL) e sottoposto a lavaggi con una soluzione acquosa satura

di NH4Cl (5 mL x 2) e una soluzione acquosa stura di NaHCO3 (5 mL x 2). La

fase organica è stata anidrificata e purificata mediante colonna cromatografica

(CHCl3/MeOH 95:5) ottenendo così IP1-tris(tert-butil estere) (11.0 mg, resa

17%).

N

N

O HN

O

HN

O

NH

ONH2

N N

N N

O

O O O

O

OHO O

N

N

OHN

O

HN

O

NH

O

HN N

NN

N

OO

O

O

OO

O



Parte Sperimentale

72

N

N

OHN

O

HN

O

NH

O

HN N

N

N

N

O O

O

O

OO

O

8

7 6

4

3

1' 4''

5''

6''2''

1'''

2'''

3'''

4'''

5'''

6'''

9

1''''

2""

3""

4""

1H-NMR (CDCl3): 9.16-9.10 (s, 1H, 2”-H); 8.16-8.10 (m, 1H, NH); 7.95-7.90

(d, J=7.70, 1H, 4”-H); 7.74-7.70 (s, 1H, 6”-H); 7.50-7.44 (d, J=7.70, 1H, 5”-

H); 7.38-7.31 ( s all, 1H, NH); 7.22-7.14 (m, 2H, Ar-H x 2); 7.00-6.92 (m, 2H,

Ar-H x 2); 6.66-6.62 (s all, 1H, NH); 5.16-5.08 (d, J=17.60, 1H, 1’-Ha); 4.75-

4.67 (m, 1H, 3-H); 4.19-4.12 (d, J=17.60, 1H, 1’-Hb); 3.78-3.04 (m, 14H, H-

alifatici); 3.00-1.80 (m, 23H, H-alifatici); 1.88-1.46 (m, 8H, H-alifatici); 1.46-

1.38 (m, 27H, COOtBu-DOTA x 3); 1.26-1.22 (m, 4H, 3”’-CH2 e 4”’-CH2);

1.21-1.17 (s, 9H, s, 9H, COtBu).

HRMS per C63H101N10011 [M+H+]: 1173.7651 (teorico); 1173.7620 (trovato)

Parte Sperimentale

73

Sintesi di IP1

Una soluzione di IP1-tris(tert-butil estere)(11.0 mg, 10.0 µmoli) in DCM (2


di 0 °C.


reazione è stata lasciata in agitazione per 24 ore a temperatura ambiente (TLC:

CE/EtOAc 6:4).

La soluzione è stata concentrata a secchezza ottenendo IP1 (9.6 mg, resa

quantitativa).

N

N

O HN

O

HN

O

NH

O

HN N

NN

N

OO

O

O

OO

O

N

N

O HN

O

HN

O

NH

O

HN N

NN

N

OOH

O

OH

OHO

O

Acido Trifluoroacetico 30%,

Diclorometano

Parte Sperimentale

74

N

N

OHN

O

HN

O

NH

O

HN N

N

N

N

O OH

O

OH

OHO

O

8

7 6

4

3

1' 4''

5''

6''2''

1'''

2'''

3'''

4'''

5'''

6'''

9

1''''

2""

3""

4""

1H-NMR (MeOD-d4): 7.86-7.82 (s, 1H, 2”-H); 7.40-7.24 (m, 6H, Ar-H x 6);

7.16-7.02 (m, 2H, Ar-H e NH); 5.26-5.16 (d, J=17.75, 1H, 1’-Ha); 4.61-4.52

(m, 1H, 3-H); 4.42-4.32 (d, J=17.75, 1H, 1’-Hb); 4.05-3.65 (m, 6H, 2””-CH2,

3””-CH2 e 4””-CH2); 3.50-3.00 (m, 25H, H-cicloesano e H-DOTA); 2.12-

2.00 (m, 2H, H-cicloesano x 2); 1.90-1.30 (m, 16H, H-alifatici); 1.26-1.21 (s,

9H, COtBu).


Parte Sperimentale

75

5.3.3. SINTESI IP2

5.3.3.1 Sintesi divergente da Z-360

Sintesi di Z-360-NH-Ex-NH-Boc (sintesi divergente)

N

N

OHN

O

HN

O

COOH

H2N

HN

BocN

N

OHN

O

HN

O

NH

O

HN

Boc



Ad una soluzione di Nastorazepide (52.0 mg, 0.1 mmoli) in acetonitrile (1

mL) è stato aggiunto CDI (24.0 mg, 0.2 mmoli). La miscela è stata posta sotto

agitazione a reflusso con pipa di calcio per 3 ore. Dopo raffreddamento

un’aliquota della miscela di reazione è stata diluita in MeOH ed analizzata

mediante TLC (TLC CHCl3/MeOH 9:1).


distanza di 10 minuti, una soluzione di N-Boc-1,6-esandiammina (26.0 mg,

0.1 mmoli) in acetonitrile (1 mL). La miscela è rimasta in agitazione a

temperatura ambiente con pipa di calcio per 1 ora e successivamente

concentrata a secchezza. Il residuo è stato ripreso con EtOAc (10 mL) e

sottoposto a lavaggi con una soluzione acquosa satura di NH4Cl (5 mL x 2).

La fase organica è stata anidrificata e purificata mediante colonna

cromatografica (CHCl3/MeOH 95:5) ottenendo così Z-360-NH-Ex-NH-Boc

(50.0 mg, resa 70 %).

Parte Sperimentale

76

1H-NMR (CDCl3): 7.49 (s all, 1H, NH); 7.35 (d, J=8.3, 1H, 6”-H); 7.28-7.22

(m, 2H, Ar-H x 2); 7.14-7.07 (m, 2H, Ar-H x 2); 7.01-6.95 (m, 3H, Ar-H x 3);

6.65-6.60 (m, 1H, NH); 5.31 (d, J=17.6, 1H, 1’-Ha); 4.86-4.74 (m, 1H, 3-H);

4.62 (s all, 1H, NH); 4.10 (d, J=17.6, 1H, 1’-Hb); 3.56-3.32 (m, 4H, 1”’-CH2

e 6”’-CH2); 3.30-3.20 (m, 1H, 3-H); 3.10-3.00 (m, 2H, 4-H); 2.12-2.00 (m,

1H, H-cicloesano]); 1.90-1.50 (m, 10H, H-alifatici); 1.45-1.41 (s, 9H,

COOtBu); 1.38-1.29 (m, 7H, H-alifatici); 1.15-1.11 (s, 9H, COtBu).

Parte Sperimentale

77

Sintesi di Z-360-NH-Ex-NH2 (sintesi divergente)

N

N

O HN

O

HN

O

NH

O

HN

BocAcido Trifluoroacetico 30%,

Diclorometano

N

N

O HN

O

HN

O

NH

ONH2

Una soluzione di Z-360-NH-Ex-NH-Boc (50.0 mg, 70.0 µmoli) in DCM (1


di 0 °C.



CHCl3/MeOH 9:1).

La soluzione è stata concentrata a secchezza ottenendo Z-360-NH-Ex-NH2

(40.0 mg, resa quantitativa).

N

NO

O

HN

O

HN

O NH

NH2

1'

2''

3

4

5''

67

89

4''

6''

1'''

2'''

3'''

4'''

5'''

6'''

1H-NMR (CDCl3): 7.80-7.70 (s all, H, 2”-H); 7.43-7.29 (m,3H, Ar-H x 3);

7.24-7.16 (m, 2H, Ar-H x 2); 7.09-7.01 (m, 2H, Ar-H x 2); 5.25-5.18 (d,

J=17.60, 1H, 1’-Ha); 4.70.-4.62 (m, 1H, 3-H); 4.28-4.20 (d, j=17.60 1H, 1’-

Hb); 3.50-3.30 (m, 4H, 1”’-CH2 e 6”’-CH2); 3.30-3.20 (m, 1H, H-cicloesano);

3.10-3.00 (m, 2H, 4-CH2); 2.12-2.00 (m, 1H, H-cicloesano); 1.90-1.80 (m,

2H, H-cicloesano x 2); 1.75-1.50 (m, 7H, H-alifatici); 1.46-1.36 (m, 4H, H-

cicloesano x 4); 1,33-1.24 (m, 4H, 3”’-CH2 e 4”’-CH2); 1.16-1.13 (s, 9H,

COtBu).

Parte Sperimentale

78

Sintesi di Z-360-NH-Ex-NH-Peg-Fmoc (sintesi divergente)

METODO A

Ad una soluzione di N-Fmoc-N″-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-

tridecanediamine (0.5 g, 0.8 mmoli) in acetonitrile (3.5 mL) è stato aggiunto

CDI (0.2 g, 1.3 mmoli). La miscela è stata posta sotto agitazione a reflusso

con pipa di calcio per 2 ore. Dopo raffreddamento un’aliquota della miscela

di reazione è stata diluita in MeOH ed analizzata mediante TLC (TLC

CHCl3/MeOH 9:1).

A causa della formazione di un sottoprodotto dovuto alla rimozione del

gruppo protettore Fmoc questa metodica è stata abbandonata.

METODO B


tridecanediamine (0.1 g, 0.2 mmoli) in acetonitrile (6.4 mL) è stato aggiunto

CDI (49.0 mg, 0.3 mmoli). La miscela è stata posta sotto agitazione a reflusso


HO

O HN

O

OHN

Fmoc

N

N

O HN

OHN

O

NH

ONH2

ONH

O

O NH

Fmoc

N

N

OHN

O

HN

O

NH

O

HN


Trietilammina, Acetonitrile3

3

Parte Sperimentale

79


CHCl3/MeOH 9:1).


distanza di 10 minuti, una soluzione di Z-360-NH-Ex-NH2 (0.2g, 0.2 mmoli)

in acetonitrile (3 mL). La miscela è rimasta in agitazione a temperatura

ambiente con pipa di calcio per 2 ore e successivamente concentrata a

secchezza.

A causa della formazione di un sottoprodotto dovuto alla rimozione del

gruppo protettore Fmoc questa metodica è stata abbandonata.

METODO C


tridecanediamine (0.2 g, 0.4 mmoli) in acetonitrile (11 mL) è stato aggiunto

CDI (85.0 mg, 0.5 mmoli). La miscela è stata posta sotto agitazione a reflusso



CHCl3/MeOH 9:1).

Alla miscela è stata aggiunta TEA (53.0 mg, 0.5 mmoli) e, a distanza di 10

minuti, una soluzione di Z-360-NH-Ex-NH2 (0.2g, 0.2 mmoli) in acetonitrile

(15 mL) goccia a goccia nell’arco di 15 minuti. La miscela è rimasta in

agitazione a temperatura ambiente con pipa di calcio per 2 ore (TLC

CHCl3/MeOH 9:1).

La miscela è stata acidificata con una soluzione 1M di CH3COOH in

acetonitrile fino a pH 5 e successivamente concentrata a secchezza. Il residuo

ottenuto è stato ripreso con EtOAc (40 mL) e lavato con una soluzione

acquosa satura di NH4Cl (20 mL x 2). La fase organica è stata anidrificata e

concentrata a secchezza. Il residuo ottenuto è stato purificato mediante

colonna cromatografica (CHCl3/MeOH 97:3 e CHCl3/MeOH 9:1) ottenendo

Z-360-NH-Ex-NH-Peg-Fmoc (0.2 g, resa 36%).

Parte Sperimentale

80

1H-NMR (CDCl3): 7.78-7.72 (d, J=7.55, 2H, Ar-H x 2); 7.67-7.52 (m, 3H,

Ar-H x 3); 7.42-7.33 (t, 2H, Ar-H x 2); 7.33-7.26 (t, 2H, Ar-H x 2); 7.25-7.19

(m, 2H, Ar-H x 2); 7.17-7.01 (m, 4H, Ar-H x 4); 6.98-6.93 (m, 1H, 6-H); 5.28-

2.19 (d, J=17.94, 1H, 1’-Ha); 4.80-4.78 (m, 1H, 3-H); 4.46-4.32 (m, 2H, 13””-

CH2); 4.24-4.16 (m, 1H, 14””-H); 4.16-4.06 (d, J=17.94, 1H, 1’-Hb); 3.66-

3.10 (m, 23H, H-alifatici); 2.54-2.40 (m, 4H, 1””-CH2 e 2””-CH2); 2.10-2.00

(m, 2H, 4””-CH2); 1.88-1.26 (m, 20H, H-alifatici); 1.18-1.12 s, 9H, COtBu).


1'

2''

3

4

5''

6

7

8

9

4''

6''

1'''

2'''

3'''

4'''

5'''

6'''

N

NO

O

HN

O

HN

O NH

HN

O

O

NH

OO

O NH

O

O

1''''

2''''

3''''

4''''

5'''' 6''''

7'''' 8''''

9'''' 10''''

11''''

12'''' 13''''

14''''

15''''16''''

17''''

18''''

19''''

20''''21''''

22''''

Parte Sperimentale

81

5.3.3.2 Sintesi convergente su Z-360

Sintesi di Boc-NH-Ex-NH-Peg-Fmoc (sintesi convergente)

Ad una soluzione di N-Fmoc-N″-succinil-4,7,10-triossa-1,13-

tridecandiammina (0.5 g, 1.0 mmoli) in acetonitrile (32 mL) è stato aggiunto

CDI (0.2 g, 1.5 mmoli). La miscela è stata posta sotto agitazione a reflusso

con pipa di calcio per 1 ora. Dopo raffreddamento un’aliquota della miscela


CHCl3/MeOH 9:1).

Alla miscela è stata aggiunta TEA (0.2 g, 1.5 mmoli) e,a distanza di 10 minuti,

una soluzione di N-Boc-1,6-esandiammina (0.3g, 1.2 mmoli) in acetonitrile

(20 mL) goccia a goccia nell’arco di 15 minuti. La miscela è rimasta in

agitazione a temperatura ambiente con pipa di calcio per 2 ore (TLC

CHCl3/MeOH 9:1).






colonna cromatografica (CHCl3/MeOH 95:5) ottenendo Boc-NH-Ex-NH-

Peg-Fmoc (0.3 g, resa 46%).

HO

O HN

O

OHN

Fmoc


Trietilammina, AcetonitrileH2N

HN

Boc

3

HN

O

NH

O

O NH

Fmoc

3NH

Boc

Parte Sperimentale

82

O NH

HN

NH

OO

O NH

O

O

O

O O1

2

3

4

5 1'

2'

3'

4'

5' 6'

7' 8'

9' 10'

11'

12' 13'

14'

15'16'

17'

18'

19'

20'21'

22'

6

1H-NMR (CDCl3): 7.78-7.73 (d, J=7.55, 2H, Ar-H x 2); 7.62-7.57 (d, J=7.55,

2H, Ar-H x 2); 7.43-7.35 (t, J=7.55, 2H, Ar-H x 2); 7.33-7.27 (t, J=7.55, 2H,

Ar-H x 2); 6.70-6.63 (s all, 1H, NH); 6.44-6.36 (s all, 1H, NH); 5.67-5.59 (m,

1H, NH); 4.66-4.57 (s all, 1H, NH); 4.45-4.35 (m, 2H, 13’-CH2); 4.24-4.17

(m, 1H, 14’-CH2); 3.65-3.49 (m, 12H, H-alifatici PEG); 3.35-3.25 (m, 4H, H-

alifatici); 3.22-3.14 (m, 2H; 1-CH2); 3.12-3.02 (m, 2H, 12’-CH2); 2.49-2.44

(s, 4H, 1’-CH2 e 2’-CH2); 1.83-1.68 (m, 4H, H-alifatici);1.50-1.44 (m, 4H, H-

alifatici); 1.44-1.40 (s, 9H, COOtBu); 1.34-1.26 (m, 4H, 3-CH2 e 4-CH2).

Parte Sperimentale

83

Sintesi di NH2-Ex-NH-Peg-Fmoc (sintesi convergente)

Una soluzione di Boc-NH-Ex-NH-Peg-Fmoc (0.3 g, 0.5 mmoli) in DCM (3.5


di 0 °C.

Alla soluzione è stato aggiunto TFA (1 mL) goccia a goccia. La miscela di


CHCl3/MeOH 9:1).

La soluzione è stata concentrata a secchezza ottenendo NH2-Ex-NH-Peg-

Fmoc (0.2 g, resa quantitativa).

H2N

HN

NH

OO

O NH

O

O

O O1

2

3

4

5 1'

2'

3'

4'

5' 6'

7' 8'

9' 10'

11'

12' 13'

14'

15'16'

17'

18'

19'

20'21'

22'

6

1H-NMR (CDCl3): 7.79-7.74 (d, J=7.55, 2H, Ar-H x 2); 7.58-7.574(d, J=7.55,

2H, Ar-H x 2); 7.44-7.37 (t, J=7.55, 2H, Ar-H x 2); 7.34-7.28 (t, J=7.55, 2H,

Ar-H x 2); 4.56-4.36 (m, 2H, 13’-CH2); 4.26-4.16 (m, 1H, 14’-H); 3.66-3.44

(m, 12H, H-alifatici PEG); 3.36-3.16 (m, 6H, H-alifatici); 3.08-2.94 (m, 2H,

12’-CH2); 2.68-2.58 (s, 4H, 1’-CH2 e 2’-CH2); 1.82-1.60 (m, 6H, H-alifatici);

1.54-1.24 (m, 6H, H-alifatici).

Acido Trifluoriacetico 30%,

Diclorometano

HN

ONH

O

O NH

Fmoc3

NH

Boc

HN

ONH

O

O NH

Fmoc3

H2N

Parte Sperimentale

84

Sintesi di Z-360-NH-Ex-NH-Peg-Fmoc (sintesi convergente)

HN

ONH

O

O NH

Fmoc3NH2



O

NH

O

O NH

N

N

O HN

O

HN

O

NH

O

HN

Fmoc

N

N

OO

HN

HN

O

OHO

3

Ad una sospensione di Z-360 (0.2 g, 0.3 mmoli) in acetonitrile (10 mL) è stato

aggiunto CDI (68.0 mg, 0.4 mmoli). La miscela è stata posta sotto agitazione

a reflusso con pipa di calcio per 1 ora. Dopo raffreddamento un’aliquota della

miscela di reazione è stata diluita in MeOH ed analizzata mediante TLC (TLC

CHCl3/MeOH 95:5).


minuti, una soluzione di NH2-Ex-NH-Peg-Fmoc (0.2 g, 0.3 mmoli) in

acetonitrile (10 mL) goccia a goccia nell’arco di 15 minuti. La miscela è

rimasta in agitazione a temperatura ambiente con pipa di calcio per 1 ora (TLC

CHCl3/MeOH 9:1).






colonna cromatografica (EtOAc/EtOH 95:5 e CHCl3/MeOH 95:5) ottenendo

Z-360-NH-Ex-NH-Peg-Fmoc (0.1 g, resa 32%).

Parte Sperimentale

85

1H-NMR (CDCl3): 7.78-7.72 (d, J=7.55, 2H, Ar-H x 2); 7.67-7.52 (m, 3H,

Ar-H x 3); 7.42-7.33 (t, 2H, Ar-H x 2); 7.33-7.26 (t, 2H, Ar-H x 2); 7.25-7.19

(m, 2H, Ar-H x 2); 7.17-7.01 (m, 4H, Ar-H x 4); 6.98-6.93 (m, 1H, 6-H); 5.28-

2.19 (d, J=17.94, 1H, 1’-Ha); 4.80-4.78 (m, 1H, 3-H); 4.46-4.32 (m, 2H, 13””-

CH2); 4.24-4.16 (m, 1H, 14””-H); 4.16-4.06 (d, J=17.94, 1H, 1’-Hb); 3.66-

3.10 (m, 23H, H-alifatici); 2.54-2.40 (m, 4H, 1””-CH2 e 2””-CH2); 2.10-2.00

(m, 2H, 4””-CH2); 1.88-1.26 (m, 20H, H-alifatici); 1.18-1.12 (s, 9H, COtBu).


1'

2''

3

4

5''

6

7

8

9

4''

6''

1'''

2'''

3'''

4'''

5'''

6'''

N

NO

O

HN

O

HN

O NH

HN

O

O

NH

OO

O NH

O

O

1''''

2''''

3''''

4''''

5'''' 6''''

7'''' 8''''

9'''' 10''''

11''''

12'''' 13''''

14''''

15''''16''''

17''''

18''''

19''''

20''''21''''

22''''

Parte Sperimentale

86

Sintesi di Z-360-NH-Ex-NH-Peg-NH2 (sintesi convergente)

METODO A

Ad una soluzione di Z-360-NH-Ex-Peg-NH-Fmoc (11.0 mg, 10.0 µmoli) in

DMF (1 mL) è stata aggiunta piperidina (0.2 mL) sotto costante agitazione.

La miscela è stata lasciata in agitazione per 15 minuti (TLC: CHCl3/MeOH

9:1).

La miscela di reazione è stata ripresa con EtOAc (10 mL) e sottoposta a

lavaggi con una soluzione acquosa satura di NH4Cl (5 mL x 2). La fase

organica è stata anidrificata e il solvente allontanato a vuoto. Il residuo è stato

purificato mediante colonna cromatografica (CHCl3/MeOH 9:1) ottenendo

così Z-360-NH-Ex-NH-Peg-NH2.

A causa della formazione di sottoprodotti questa metodica è stata

abbandonata.

METODO B

Una soluzione di Z-360-NH-Ex-Peg-NH-Fmoc (70.0 mg, 60.0 µmoli) in DMF

(5 mL) è stata posta sotto agitazione in bagno di ghiaccio per 15 minuti. Alla

miscela, costantemente mantenuta in bagno di ghiaccio, è stata aggiunta

piperidina (0.2 mL) sotto costante agitazione. La miscela è stata lasciata in

agitazione per 15 minuti (TLC: CHCl3/MeOH 9:1). La miscela di reazione è

stata ripresa con EtOAc (20 mL) e sottoposta a lavaggi con una soluzione

acquosa satura di NH4Cl (10 mL x 2). La fase organica è stata anidrificata e il

ONH

O

O NH

N

N

OHN

O

HN

O

NH

O

HN

Fmoc3

O

NH

O

O NH2

N

N

OHN

O

HN

O

NH

O

HN

3

Parte Sperimentale

87

solvente allontanato a vuoto. Il residuo è stato purificato mediante colonna

cromatografica (CHCl3/MeOH 9:1) ottenendo così Z-360-NH-Ex-NH-Peg-

NH2 (11.0 mg, resa 20%).

METODO C

Una soluzione di Z-360-NH-Ex-Peg-NH-Fmoc (0.1 g, 0.1 mmoli) in DMF (2

mL) è stata posta sotto agitazione in bagno di ghiaccio per 10 minuti. Alla

miscela, costantemente mantenuta in bagno di ghiaccio, è stata aggiunta

morfolina (2 mL) sotto costante agitazione. La miscela è stata lasciata in

agitazione per 1,5 ore a temperatura ambiente (TLC: CHCl3/MeOH 9:1).

Il solvente di reazione è stato concentrato a secchezza (azeotropo toluene). Il

residuo è stato purificato mediante colonna cromatografica (CHCl3/MeOH

9:1) ottenendo così Z-360-NH-Ex-NH-Peg-NH2 (0.1 g, resa 97%).

1'

2''

3

4

5''

6

7

8

9

4''

6''

1'''

2'''

3'''

4'''

5'''

6'''

N

NO

O

HN

O

HN

O NH

HN

O

O

NH

OO

O NH2

1''''

2''''

3''''

4''''

5'''' 6''''

7'''' 8''''

9'''' 10''''

11''''

12''''

1H-NMR (MeOD-d4): 7.76-7.73 (m, 1H, Ar-H); 7.48-7.43 (m, 1H, Ar-H);

7.40-7.35 (m, 1H, Ar-H); 7.34-7.25 (m, 3H, Ar-H x 3); 7.11-7.03 (m, 2H, Ar-

H x 2); 5.23-5.15 (d, J=17.94, 1H, 1’-Ha); 4.61-4.53 (dd, J=6.98, 1H, 3-H);

4.44-4.35 (d, J=17.94, 1H, 1’-Hb); 3.65-3.34 (m, 18H, H-alifatici); 3.25-3.18

(m, 3H, H-alifatici); 3.10-3.05 (m, 2H, 12”” CH2); 2.47-2.44 (s, 4H, 1””-CH2

e 2””-CH2); 2.12-2.02 (m, 1H, H-alifatico); 1.95-1.26 (m, 21H, H-

alifatici),1.26-1.20 (s, 9H, COtBu).


Parte Sperimentale

88

5.3.3.3 Sintesi di IP2

Sintesi di IP2-tris(tert-butil estere)

METODO A


acetonitrile (1 mL) è stato aggiunto CDI (12.0 mg, 70.0 µmoli). La miscela è

stata posta sotto agitazione a reflusso con pipa di calcio per 3 ore. Dopo

raffreddamento un’aliquota della miscela di reazione è stata diluita in MeOH

ed analizzata mediante TLC (TLC CHCl3/MeOH 9:1).


minuti, una soluzione di Z-360-NH-Ex-NH-Peg-NH2 (52.0 mg, 57.0 µmoli)

in acetonitrile (3 mL). La miscela è rimasta in agitazione a temperatura

ambiente con pipa di calcio per 1 ora (TLC CHCl3/MeOH 9:1).

Poiché è stata ottenuta una miscela complessa di prodotti questa metodica è

stata abbandonata.

METODO B


DMF (2 mL) sono state aggiunti BOP (35.0 mg, 80.0 µmoli) e TEA (16.0 mg,

0.2 mmoli) rispettivamente. La miscela è stata mantenuta in agitazione per 10

N N

N N

O

O O O

O

OHO O

ONH

O

O NH

N

N

O HN

O

HN

O

NH

O

HN

N

N

N

N

OO

O

O

OO

O

ONH

O

O NH2

N

N

O HN

O

HN

O

NH

O

HN

3

3

Parte Sperimentale

89

minuti trascorsi i quali è stata aggiunta una soluzione di Z-360-NH-Ex-NH-

Peg-NH2 (74.0 mg, 80.0 µmoli) in DMF (2 mL). La miscela di reazione è stata

mantenuta in agitazione per 24 ore a temperatura ambiente (TLC:

CHCl3/MeOH 9:1).

La miscela è stata concentrata a secchezza, ripresa con EtOAc (10 mL) e

successivamente sottoposta a lavaggi con una soluzione acquosa satura di

NH4Cl (5 mL x 2). La fase organica è stata anidrificata e concentrata a

secchezza. Il residuo ottenuto è stato purificato con colonna cromatografica

(CHCl3/MeOH 9:1) ottenendo così IP2-tris(tert-butil estere). (30.7 mg, resa

30%)

O

NH

O

OO

O NH

N

N

OHN

O

HN

O

NH

O

HN

N

N

N

N

OO

O

O

OO

O

9

8

7 6

4

3

1' 4"5"

6"2"

1'''

2'''

3'''

4'''

5'''

6'''

1''''

2''''

3''''

4''''

5'''' 6''''

7'''' 8''''

9'''' 10''''

11''''

12''''

1H-NMR (CDCl3): 8.10-8.04 (s all, 1H, Ar-H); 7.68-7.56 (m, 2H, Ar-H x 2);

7.40-7.28 (m, 2H, Ar-H x 2); 7.24-7.18 (m, 3H, Ar-H x 3); 6.84-6.78 (m, 1H,

NH); 6.60-6.52 (m, 1H, NH); 5.30-5.20 (d, J=17.94, 1H, 1’-Ha); 4.78-4.66

(m, 1H, 3-H); 4.18-4.08 (d, J=17.94, 1H, 1’-Hb); 3.64-3.12 (m, 35H, H-

alifatici); 2.68-2.42 (m, 16H, H-DOTA); 2.10-2.00 (m, 2H, H-alifatici); 1.88-

1.50 (m, 16H, H-alifatici); 1.46-1.42 (m, 27H, COOtBu-DOTA x 3); 1.37-1.33

(m, 4H, 3”’-CH2 e 4”’-CH2); 1.18-1.16 (s, 9H, COtBu).

HRMS per C77H127N12016 (M+H+): 1475.9493 (teorico); 1475.9584 (trovato)

Parte Sperimentale

90

Sintesi di IP2

ONH

O

O NH

N

N

O HN

OHN

O

NH

O

HN

N

N

N

N

OO

O

O

OO

O


Diclorometano

3

ONH

O

O NH

N

N

O HN

OHN

O

NH

O

HN

N

N

N

N

OOH

O

OH

OHO

O

3

Una soluzione di IP2-tris(tert-butil estere) (30.7 mg, 21.0 µmoli) in DCM (2


di 0 °C.


reazione è stata lasciata in agitazione per tutta la notte a temperatura ambiente

(TLC: CHCl3/MeOH 9:1).

La soluzione è stata concentrata a secchezza ottenendo IP2 (27.0 mg, resa

quantitativa).

Parte Sperimentale

91

O

NH

O

OO

O NH

N

N

OHN

O

HN

O

NH

O

HN

N

N

N

N

OOH

O

OH

OHO

O

9

8

7 6

4

3

1' 4"5"

6"2"

1'''

2'''

3'''

4'''

5'''

6'''

1''''

2''''

3''''

4''''

5'''' 6''''

7'''' 8''''

9'''' 10''''

11''''

12''''

1H-NMR (MeOD-d4): 7.91-7.86 (d, J=8.12, 1H, Ar-H); 7.77-7.72 (d, J=8.12,

1H, Ar-H); 7.60-7.53 (m, 1H, Ar-H); 7.52-7.46 (m, 1H, Ar-H); 7.44-7.25 (m,

3H, Ar-H x 3); 7.15-7.02 (m, 1H, Ar-H); 5.24-5.16 (d, J=17.94, 1H, 1’-Ha);

4.60-4.46 (m, 1H, 3-H); 4.43-4.34 (d, J=17.94, 1H, 1’-Hb); 3.65-3.45 (m, 14H,

H-alifatici); 3.40-3.15 (m, 16H, H-alifatici); 2.47-2-44 (s, 4H, 1””-CH2 e 2””-

CH2); 2.12-2.03 (m, 1H, H-cicloesano); 1.80-160 (m, 4H, H-alifatici); 1.64-

1.56 (m, 4H, H-alifatici); 1.54-1.44 (m, 4H, H-alifatici); 1.40-1.30 (m, 10H,

H-alifatici); 1.26-1.22 (s, 9H, COtBu).


Parte Sperimentale

92

5.3.4. TENTATIVO DI SINTESI DEL LINKER

IDROFILICO POLIMERICO

Sintesi Propargil-Maleimide

O OONH2

AcetoneN

O

O

Una soluzione di anidride maleica (2.0 g, 20.0 mmoli) in acetone (10 mL) è

stata posta a reflusso. Alla soluzione è stata aggiunta propargilmaleimide (1.0

g, 18.2 mmoli). La miscela è stata mantenuta sotto agitazione a reflusso per 2

ore.

La miscela è stata concentrata a secchezza. Il crudo ottenuto e stato purificato

mediante ricristallizzazione (Etere dietilico/MeOH 4:1).

Il precipitato è stato recuperato per filtrazione e lavato con Etere dietilico

ottenendo così la Propargil maleimide (0.4 g, resa 15%).

N

O

O

1

23

4

1H-NMR (CDCl3): 6.42 (d, J=12.7, 1H, CH=CH); 6.23 (d, J=12.7, 1H,

CH=CH); 4.19 (q, J=2.7, 2H, CH2); 2.36-2.33 (t, J=2.7, 1H, CH).

Parte Sperimentale

93

Sintesi di N-Boc-N’-RAFT-esan-1,6-diammina

NH2

HN

Boc

O

HOS

NC

S

S

NH

HN

Boc

O

S

NC S

S

EDCl, N-Idrosuccinimmide,

Diclorometano

Una soluzione di N-Boc-1,6-esandiammina (76.0 mg, 0.4 mmoli) e RAFT

(58.0 mg, 0.2 mmoli) in DCM (25 mL) è stata posta in agitazione in bagno di

ghiaccio con pipa di calcio fino al raggiungimento di 0°C.

Alla soluzione è stata aggiunta NHS (54.0 mg, 0.4 mmoli). La miscela di

reazione è stata posta in agitazione in atmosfera di N2 per 10 minuti trascorsi

i quali è stato aggiunto EDCl (84.0 mg, 0.4 mmoli). Dopo aver ripristinato

l’atmosfera di N2 la miscela è rimasta in agitazione per 24 ore (TLC:

CHCl3/MeOH 9:1).

La miscela di reazione è stata concentrata a secchezza e ottenuto purificato

con colonna cromatografica (CHCl3/MeOH 9:1) ottenendo così N-Boc-N’-

RAFT-esan-1,6-diammina (70.0 mg, resa 68%).

HN

NH

O

S

NC S

SO

O1

2

3

4

5

6

1'

2'

3'

4'

5'

1H-NMR (CDCl3): 3.38-3.31 (q, 2H, 1-CH2); 3.28-3.21 (q, 2H, 6-CH2); 3.15-

3.07 (m, 2H, 4’-CH2); 2.56-2.44 (m, 3H, H-alifatici); 2.42-2.34 (m, 1H,H-

alifatico); 1.90-1.88 (s, 3H, 3’-CH3); 1.54-1.46 (m, 4H, 2-CH2 e 5-CH2); 1.45-

1.42 (s, 9H, COOtBu); 1.38-1.30 (m, 7H, 3-CH2, 4-CH2, 5’-CH2).

Parte Sperimentale

94

Polimerizzazione con N-Boc-N’-RAFT-esan-1,6-diammina

NH

HN

Boc

O

S

NC S

S

O

HOHO

HOOH

ONH

O

NH

O

OH

VA-044, Acqua, Diossano

NH

HN

Boc

O

NCS S

S

HN

O

HNO

OHOOHO

OH

HO OH

m n

Ad una soluzione di N-(2-mannosil)-etil acrilammide (57.0 mg, 0.2 mmoli) e

N-(2-idrossi)-etil acrilammide (23.5 mg, 0.2 mmoli) in acqua (70 µL) è stata

aggiunta una soluzione di N-Boc-N’-RAFT-esan-1,6-diammina (18.8 mg,

40.0 µmoli) in diossano (60 µL) e una soluzione acquosa di VA-044 (50 µL)

avente una concentrazione di 5.6 mg/mL. La miscela è stata degasata con N2

per 30 minuti in bagno di ghiaccio e successivamente posta in agitazione in

bagno d’olio (60 °C) per tutta la notte.

La miscela di reazione è stata precipitata in THF. Il precipitato ottenuto è stato

sottoposto a lavaggi con THF ottenendo così il polimero d’interesse.

A causa dell’eccessivo peso molecolare del polimero ottenuto questa metodica

è stata successivamente abbandonata.

Parte Sperimentale

95

Tentativo di addizione della propargil-maleimide al polimero

NH

HNBoc

O

NCS S

S

HNO

HNO

OHOOHO

OH

HO OH

5 5

N

O

O

Trietilammina, N,N-Dimetilformammide

Esilammina

NH

HN

Boc

O

NCS

HNO

HNO

OHOOHO

OH

HO OH

5 5

N

O

O

Una miscela di polimero (110.0 mg, 40.0 µmoli) e propargil-maleimide (32.0

mg, 90.0 µmoli) in DMF (2 mL) è stata degasata con N2 per 30 minuti. Alla

miscela è stata aggiunta esilammina (89.0 mg, 0.9 mmoli) e TEA (13.4 mg,

0.1 mmoli). La miscela di reazione è stata posta in agitazione in atmosfera di

N2 per 6 ore trascorse le quali è stata precipitata in THF. Non essendo riusciti

a caratterizzare con certezza il prodotto ottenuto questa metodica è stata

successivamente abbandonata.

Parte Sperimentale

96

Tentativo di deprotezione del gruppo amminico terminale

NH

HN

Boc

O

NCS

HNO

HNO

OHOOHO

OH

HO OH

m n


Diclorometano

N

O

O

NH

H2NO

NCS

HNO

HNO

OHOOHO

OH

HO OH

m n

N

O

O

Una soluzione di Polimero-NH-Boc (1.4 g, 0.6 µmoli) in DCM (0.5 mL) è

stata posta in bagno di ghiaccio per 20 minuti fino al raggiungimento di 0 °C.


reazione è stata lasciata in agitazione per 1 ora a temperatura ambiente.

La soluzione è stata concentrata a secchezza.

Il residuo ottenuto è stato analizzato mediante spettroscopia 1H-NMR e

mediante analisi TNBS seguendo la metodica “ANALISI TNBS” ma non

essendo riusciti a caratterizzare con certezza il prodotto ottenuto questa

metodica è stata successivamente abbandonata.

Parte Sperimentale

97

Polimerizzazione con RAFT agent

HO

O

S

NC S

S

O

HOHO

HOOH

ONH

O

NH

O

OH

VA-044, Acqua, Diossano

HO

O

NCS S

S

HNO

HNO

OHOOHO

OH

HO OH

5 5

Ad una soluzione di N-(2-mannosil)-etil acrilammide (210.5 mg, 0.8 mmoli)

e N-(2-idrossi)-etil acrilammide (87.5 mg, 0.8 mmoli) in acqua (149 µL) è

stata aggiunta una soluzione di RAFT agent (40.0 mg, 0.2 mmoli) in diossano

(37.3 µL) e una soluzione di VA-044 (34.6 µL) avente una concentrazione di

28 mg/mL. La miscela è stata degasata con N2 per 30 minuti in bagno di

ghiaccio e successivamente posta in agitazione in bagno d’olio (60 °C) per

tutta la notte.

La miscela di reazione è stata precipitata in THF. Il precipitato ottenuto è stato

sottoposto a lavaggi con THF ottenendo così il polimero d’interesse. (resa 92

%)

HO

O

NCS S

S

HN

O

HN

O

OHOOHO

OH

HO OH

a

b

a'

b'

5 5

c c'

1H-NMR (DMSO): 7.90-7.30 (m, 2H, NH [c, cʹ]); 4.90-4.40 (m, 5H,

OHmannosio); 2.00-1.70 (m, 2H, CH backbone polimero [b, bʹ]); 1.60-1.20 (m,

20H, CH2 backbone polimero, [a, aʹ]).

Parte Sperimentale

98

Tentativo di addizione della propargil-maleimide al polimero

Una miscela di polimero (100.0 mg, 40.0 µmoli) e propargil-maleimide (14.9

mg, 80.0 µmoli) in DMF (2 mL) è stata degasata con N2 per 30 minuti. Alla

miscela è stata aggiunta esilammina (40.5 mg, 0.4 mmoli) e TEA (40.5 mg,

0.4 mmoli). La miscela di reazione è stata posta in agitazione in atmosfera di

N2 per 6 ore trascorse le quali è stata precipitata in THF. Non essendo riusciti

a caratterizzare con certezza il prodotto ottenuto questa metodica è stata

successivamente abbandonata.

HO

O

NCS S

S

HNO

HNO

OHOOHO

OH

HO OH

5 5

N

O

O

Trietilammina, N,N-Dimetilformammide,Esilammina

HO

O

NCS

HNO

HNO

OHOOHO

OH

HO OH

5 5

N

O

O

Parte Sperimentale

99

Tentativo di cicloaddizione di Huisgen azide-alchino

HO

O

NCS

HNO

HNO

OHOOHO

OH

HO OH

5 5

N

O

O

N3 NH

ONH2

HO

O

NCS

HNO

HNO

OHOOHO

OH

HO OH

5 5

N

O

ON N

N

HN

O

NH2

Tert-butil alcol, CuSO4,Sodio ascorbato

Una sospensione di polimero (58.0 mg, 20.0 µmoli) e azide (2.6 mg, 20.0

µmoli) in Tert-butil alcol sono stati posti sotto flusso di azoto per 10 minuti in

vial chiusa. Alla sospensione è stata successivamente addizionata una

soluzione di ascorbato di sodio 1M (23 µL) e una soluzione di CuSO4 1M (23

µL).

La reazione è stata condotta in microonde alla temperatura di 80°C alla

potenza di 100 W per 1 minuto.

La miscela di reazione è stata successivamente precipitata in THF.

Non essendo riusciti a caratterizzare con certezza il prodotto ottenuto e avendo

riscontrato delle notevoli difficoltà nel rimuovere i sali di rame formatisi nel

corso della reazione, questa metodica è stata successivamente abbandonata.

Parte Sperimentale

100

5.3.5 ANALISI TNBS: IDENTIFICAZIONE DI GRUPPI

AMMINICI PRIMARI

Preparazione della retta di taratura con Gly-Gly:

Una soluzione 10 mg/mL di Gly-Gly in acqua milliQ è stata diluita fino

all’ottenimento di una concentrazione 0,4 mM.

La soluzione acquosa di TNBS 5M a disposizione è stata diluita 1:30 per

eseguire il test.

Una soluzione di Borato 0.1 M a pH 9.3 è stata impiegata come tampone

durante il test.

I campioni (saggio eseguito in doppio) per la retta di taratura sono stati

preparati come segue.

Gly-Gly

(µL)

Tampone

(µL)

TNBS

(µL)

µmol/mL

NH2

ABS 1 ABS 2 ABS

media

1

(Bianco)

0 970 30 0 0 0 0

2 15 955 30 0.006 0.036 0.090 0.063

3 50 920 30 0.02 0.126 0.139 0.133

4 70 900 30 0.028 0.281 0.297 0.289

5 150 820 30 0.06 0.684 0.710 0.697

6 200 770 30 0.08 0.937 0.938 0.938

Tabella 3. Dati relativi al volume dei campioni e loro assorbanza impiegati

per la costruzione della retta di taratura.

In seguito all’aggiunta del TNBS i campioni a concentrazione nota sono stati

posti al buio per 30 minuti e successivamente è stata eseguita una lettura

spettrofotometrica a 420 nm ottenendo così i valori relativi a ABS 1 e ABS 2

i quali hanno permesso di delineare una retta di taratura.

Parte Sperimentale

101

Figura 19. Retta di taratura utilizzata per l’analisi TNBS

Preparazione del campione incognito:

NH

NH2

O

CNS

NHO

NHO

HO OOHO

OH

HOOH

nm

N

O

O

Figura 20. Polimero analizzato mediante saggio TNBS

Pesando un’esatta quantità di polimero (1.4 mg) è stata preparata una

soluzione madre in acqua milli Q (0.9 mL) avente la concentrazione di 1.6

mg/mL.

Dalla soluzione madre sono stati prelevati 200 µL i quali sono stati

successivamente diluiti con 870 µL di soluzione tampone. Alla soluzione così

ottenuta sono stati aggiunti 30 µL della soluzione di TNBS precedentemente

preparata.

Il campione incognito è stato posto al buio per 30 minuti e successivamente è

stata eseguita una lettura spettrofotometrica a 420 nm.

y = 12,012x - 0,0352R² = 0,9895

-0,2

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1

AB

S 4

20

nm

µmoli/mL NH2

Retta taratura gly-gly

Parte Sperimentale

102

ABS 1 ABS 2 Media µmoli/mL NH2

Campione incognito 0.057 0.063 0.06 7.93*10-3

Tabella 4. Valori di assorbanza del campione incognito e concentrazione dei

gruppi amminici presenti.

Inserendo i valori relativi all’assorbanza del campione incognito nella retta di

taratura è stata ricavata la concentrazione relativa ai gruppi amminici primari

presenti nel polimero (7.93*10-3 µmoli/mL).

Essendo questi in rapporto 1:1 con il polimero è stato possibile risalire al suo

peso molecolare (18500 Da).

103

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