Separazione e determinazione della vitamina D...

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Separazione e determinazione della vitamina D m presenza degli esteri della vitamina A Al REI.I(l MAH I Ai\1 F: CONCETTA MA HL\'\ l VI CA HI l.almralori tli lliolo;.:iu Riassunto. - Vit>nr dc· sc ritto UJI metodo di srpara1.i01w df'lla min a D da gli rs t t>ri th· ll a vitamina A JWr c rom a to g raf-ia su a llumin a al IO 0 0 di acqua . La vitamina D \ i1 •n f' ad so rbit a pu ò f' Ssc•n· poi t> lui ta quantita· t ivamc•ntl' e detPrmin a la con il mf't odo al tridururo di a ntimoni o. TI procedime nt o dc•sc ritto è sta to a ppl icato a divC'rSI' fornw farmaePu - t ic hr co ntcn ent i l due· v it amine• in varie proporzioni ; vengono dc •sc ritte lc · o1wrazioni JHf'liminari di t• s trazinn f' c· purifi cazimw c• si riportano in ta lwl11· ri su ltati ott Pnut i. Summary (Sc• parati on and dPterminatiun of 1;itamin J) in th1uf vitumin A Psters). - A rm·t hod for tlw st> paration of v it arnin D from itarnin A (•stc•rs us ing c hromatography on alumina co lurnn i!' desc riiJ ed . In given conditio ns and using s uitabl r so l vcots only vita min D is (ixf'Ù on ti H' co lurnn and is th t·n t·lutf'CI quantitati vely und df't1·rmint'(l b) lllf'an" of th1· a nlinwn y c ldurid f' mf'th od . Tlw pro cc·dure wa s applit>d lo sr·vf'ral pharma r1· uti cal eontai ning both v itamins in dill'erenl ra lio s. Ext ra c tion and / or purifìc ation prt'viou s to c hromatn g raph y a rf' I I('Cf'!'Sar y for tlw prod uct undf'r examination. T lw y va ry accunl ing lo the n at un · of tlw s ub stance and tltf' kind of itarniu u s NL ProcedurC's are d cscrib cd in df'tai l Ps pc·cially for tlH· ana lysis nf solid pharrna ce uti cal pn ' para tion s in whi ch vita min s are e mplnyeù as oily con- ce ntratc s, as cr ys t a ls or as protc·ct c>d gra nul t" s. a nd for t lw analy sis of l iquid pharma ce uti ca l prPparat ions in which v itarnin s an· di ssoh-ed in oil o r di - s prrs!• d in wate r. Tlw rrs ult s ohtain t>d both on sy nt lwti ca l mixturc>s a mi prudu cts of con un crcc are s ummarizrd in Tab lf' s l and 2. Limitations and advantages of thf' mr thod prnposr ù an· also di sc usse d. A1111. / 11! . .'iul)(r. Su nilu 4. !111 - )UII .

Transcript of Separazione e determinazione della vitamina D...

Separazione e determinazione della vitamina D m presenza degli esteri della vitamina A

Al REI.I(l MAH I Ai\1 F: CONCETTA MA HL\'\ l VI CA HI

l .almralori tli lliolo;.:iu

Riassunto. - V it>nr dc·scritto UJI metodo di srpara1.i01w df'lla vit<~·

min a D dagli rst t>ri th·ll a vitamina A JWr croma tog raf-ia su a llumin a a l IO 0 0

di acqua . La vitamina D \ i1•n f' adsorbit a c· può f'Ssc•n· poi t>lui ta quantita·

t ivamc•ntl' e detPrmina la con il mf'todo al tridururo di a ntimonio .

TI procedimento dc•scritto è s t a to appl icato a divC'rSI' fornw farmaePu ­t ichr contcnent i le· due· v itamine• in varie proporzioni ; vengono dc•scritte lc · o1wrazioni JHf'liminari di t•s trazinnf' c· purifi cazimw c• si riportano in ta lwl11·

risultati ottPnut i.

Summary (Sc•paration and dPterminatiun of 1;itamin J) in th1• prr.~Pttff'

uf vitumin A Psters). - A rm·thod for tlw st>paration of v itarn in D from , ·itarnin A (•stc•rs using chromatography on alumina colurnn i!' descriiJed .

In given conditions and using suitablr solvcots only vita min D is (ixf'Ù on t iH' colurnn and is th t·n t·lutf'CI quantitati vely und df't1·rmint'(l b) lllf'an" of th1· anlinwn y c lduridf' mf'thod .

Tlw procc·dure was applit>d lo sr·vf' ral pharmar1·utical formu lation~

eontain ing both v itamins in dill'erenl r a lios.

Extraction and/or purifìcation prt'vious to chromatngraphy a rf' II('Cf'!'Sary for tlw prod uc t undf'r examination. T lw y var y accunling lo the natun· of

tlw subst ance and tltf' kind of , ·itarniu usNL

ProcedurC's are d cscribcd in df'tai l Pspc·cially for tlH· analysis nf solid pharrnaceutica l pn' para tions in which vi ta mins are emplnyeù as oily con­centratcs, as cryst a ls or as protc·ct c>d g ranul t"s. and for t lw analysis of liquid

pharmaceutical prPparat ions in w hich v itarnins an· dissoh-ed in oil o r di­

s prrs!•d in water. Tlw rrsults ohtaint>d both on syntlwti cal mixturc>s ami pruduc ts of

conuncrcc a re summarizrd in Tablf's l and 2. Limitations and advantages

of thf' mr thod prnposrù an· a lso discussed.

A1111. / 11! . .'iul)(r. Sunilu ( 19G~) 4 . !111- )UII .

! l

MARIANI E MARIANI VICARI 91

1:-.ITRODUZIONE

La determinazione per v ia chimica o chimico-fisica della v ita mina D associata alla vi tamina A in preparazioni farmaceutiche è ancora un problema analitico di attualità, anche se in letteratura sono descritti numerosi proce­dim<>nti suggeriti per la sua risoluzione (EwiNG, Sc n LABACII & PowELL, 1954; ScnMAIL et al., 1958; WILKIE, ] ONES & KLINE, 1958; TIIEJVAGT & CAMPBELL, 1959; STROHECKER & HENNI c, 1963; SuuE, 1965; MuLOER, DE VRtES & KEUNI NG, 1965 ; USP XVII). La principale difficoltà da sormon­tare consiste nell'isolamento della vitamina D dalla itamina A, poich è quest'ultima interferisce nella determinazione della prima con tutti i metodi noti. Nelle pubblicazioni finora apparse vengono proposti procedimenti cromatografici di adsorbimento o di ripartizione che presuppongono una preventi va suponificazione del materiale in esame; noi stessi ci siamo varie volte interessa ti dell' argomento (MARIANI & CAVINA, 1953; 1955; MARIANI & VICA RI, 1963) e recentemente, allo scopo di accentuare le differenze nel comportamento cromatografico delle due sostanze da separare abbiamo anche proposto di trasformare in anidrovitantina la vitamina A alcool, presentf' insieme alla vitamina D2 nell ' insaponificahile, prima di effettuare una cro­matografia su colonna di ossido di alluminio (MAIUANI et al., 1967). Il metodo da noi suggerito ha contribuito a migliorare i risultati ottenibili ma presenta alcuni punti delicati ; richiede infa tti la saponificazione del materiale in esame, è applicabile fincbè il rapporto Vitamina A/Vitamina D f'spresso in un1ta internazionali non superi 8 : l , la sua esecuzione richiede circa 4 ore oltre il tempo necessario per la saponificazione.

Allo scopo di rendere più rapidi e più facilmente eseguibili da personale non specializzato i controlli di routine, e di evitare contemporaneamente le cause di errore insite nel procedimento di saporuficazione, abbiamo studiato un procedimento di separazione della vitamina D dagli es teri della vitamina A, dato che nella preparazione delle specialità m edicinali si impiega normal­mente come materia prima v itamina A esterificata.

La presenza del radicale acido nella molecola degli est eri della vitamina -\. determina in essi un comportamento cromatografico notevolmente diverso da quello della vitamina A alcool facilita ndone la separazione dalla vita­mina D. Il problema è però complicato dal fatto che nei prodotti farmaceu­tici la vitamina A es terificata e la v itamina D si trovano disciolte in olio o grassi o idrodisperse per mezzo di tensioattivi o in granuli protetti. Quindi il nostro lavoro è tato articolato in due fasi :

L) studio del comportamento cromatografico ' U colonna clelia vita­mina D e degli esteri de lla vitamina A al fine di poter scegliere l' adsor­ltt>nte e i mezzi so lventi più idonei a ll a loro separazionf';

r ""· /st. S " Jl" · srmita ( l !Jil8) 4 . !J0- 1 110. 7

·n ; <:NICIH l, METOIW LOGil

2) ri cerca dcllt· ctwdizioni più opportunf' per applican• il proredimf'nt o di separazioni' a ll i' varif' fonn f' farmaccutichf'. e prf'c isamf'ntr :

a) a prodotti che rontcngono Il' vitamitH' discioltt· in olio o gra!<;.i (gocct•. fial l'. suppost f') :

b) a prodotti che contengono lt· vitamint• 111 forma iclrodisp!· r~a

(gocce. sciroppi , fiale) :

c) a prodotti che contengono l1' v itamint· sotto fonua di granul i protetti.

PAHTE SPERIM E 'TALE

In pref'!'d enti esperienze a vevamo notato ci11• la v itamina D sciolta ID ctf'TI' di pf' t rolio o e tere di petrolio : h r nzolo 90 : J O. si fis a su allumina Brockman al IO 0/ 0 di acyua c 11011 vicnt• f' luita lavando la colonna co11 100-150 mi dello s tr so solvente ; abbiamo quindi eseguito cromatografit·. su colonna di aUumina al 1 O % di acqua, di v itamina A palmitato e acl'ta lo t' ahbiamo potuto constatarf' cht> quest t• formt· vengono fissa te labilnw nto· sulla colonn a e vengono facilmentt' cluite da'l solvente di lavaggio .

Cromatografando soluzioni in e ten · di pf'trolio dellt· du1• vitamine i· quindi possibile eliminare con il solvente di lavaggio (et eri' di petrolio) la v itamina A esterificata, mentre sulla colonna rimanf' la vitamina D che vient• poi eluita con e tere di pe trolio-etere etilico 90: 1 O e può essere determinata con il metodo colorimetrico al tricloruro di antimonio.

Stabilite quest e premesse, abbiamo consid erato la possibilità Ji appli ­care il metodo di separaziont' descritto alle preparazioni farmacf'uticl~t·.

Esso è applicabile senza alcuna difficoltà tutte l t· volti' che per es t raziotll' di­r etta del materiali' si possono ottenere la v itamina D f' la vitamina A f'S t l'­rificata discioltr· in ctert' d i petrolio ; ciò si verificu nel caso di pol veri, confetti, comprt>sse, nella eui preparazioni' sono st a ti impiegati concentrati oleosi di vitumina A e v itamina D cristallinu. Anche nel caso di s uppostt• o pomatt', in cui comf' eccipirnte sia stata impiegata una m assa idrofi la non grassa, è possibili' procedere all'es trazione delle v itamine con e tt•re di petro­lio, in cui la massa è insolubile, e sottoporre poi la soluzione, SI' necessario dopo concentrazione, alla sqJarazione croma tografìca.

II problema si complica nel casu di analisi di form e farmaceutiche li ­quide, comf' soluzioni iniettabili, gocci', sciroppi ecc. Pf'r qucstt· formf' si possono essenzialmente distinguere due casi : l) k vitamiuc sono discioltt• in olii ; 2) lf' vi tamine sono idrodisper sc cou tensioattivi.

P er applicare il procedimento alle soluzioni olt>osr si f' ra pensato dap­prima alla possibilità di isolare le v itamine dall'oJjo m ediante estrazioni con solventi selettivi, ma tutti i tentativi con diverse combina1.ioni di solventi non hanno dato buoni risultati , poichè non è stato possibile isolare quanti-

A"'' · /st . .'iuper. Sa11ilù (lllll8) 4 , !Jtl ·IOII.

)lARIANI E MARIAN I VICARI 93

tativamente la vitamina D dall'olio. Abbiamo quindi pensato di eseguire la cromatografia su colonna direttamente sulla soluzione ottenuta scioglien­do in etere ùi petrolio il prodotto oleoso, dato anche che diversi Autori (Cr­

;\IA, LEVORATO & MANTOVAN, 1964 ; BoLLICER & KoNrc, 1965; CAVINA,

osservazioni personali) hanno impiegato procedimenti di cromatografia su strato sottile di soluzioni di vitamine liposolubili in presenza di olio.

Per vedere se e fino a che punto la presenza di olio poteva influire sul­l'andamento deUa cromatogralia, abbiamo eseguito prove su colonna di allumina al 10 % di acqua con vitamina D + quantità crescenti ùi olio di oliva; 'itamina D + quantità variabili di es teri della vitamina A + olio, e con solo olio. Ne è risultato che, nelle condizioni s tabilite, l'olio passa rapi­damente già nelle prime frazioni del liquido di lava~gio e non ha alcuna influenza sul comportamento cromatografico delle due vitamine che pos­

sono quindi essere separate.

el caso in cui il prodotto da analizzare contenga le due vi tamine in forma idrodispersa, la cromat ografia su allumina deve essere preceduta da p roceùiuwnti di estrazione idonei ad isolare le vitamine liposol ubili dal 'eicolo acquoso, uai tcnsioattivi e da altre sostanze idrosolubili, in modo da potcrne poi preparare una soluzione in etere di p etrolio.

Tra i procedimenti in uso noi abbiamo preferito l'adsorbimento su Fio­risi! seguito da estrazione selettiva e l'estrazione diretta con solventi non miscihili ; ciò verrà descritto in dettaglio.

Una considerazione a parte meritano ancora le preparazioni farmaceu­tiche in cui vengono utilizzate le vitamine A e D allo stato di granuli pro­tetti ; si tratta in genere d i granulati, polveri, compresse ecc. ; in questo caso è necessario anzitutto procedere alla liberazione delle vitamine dalle sostanze protettive che ne impediscono l'estrazione con solventi apolari.

Concludendo, in tutti i casi considerati, la fase preliminare dell'analisi consis te in procedimenti diversi a seconda della natura del prodotto ma tutti aventi come scopo comune la preparazione di una soluzione in etere di petrolio delle due v itamine, il più possibile esente da prodotti interferenti, che possa essere sottopost a al procedimento cromatografico descritto ap­presso.

Cromatografia su ossido rli alluminio

Rt>attivi :

- Colonna cromato~,rrafica in vetro di cliametro interno l4 mm; lunghcz:~.a 20 cm con giunti a smeriglio.

- Ossiùo di alluminio per cromatografia standardizzato sec. Brockman.

- Ossido di alluminio con lO % di acqua (grado [V di attività) : l'ossido di alluminio standardizzato viene tenuto in rnuffola a 600° C per

lnn. l sl. Super . Sanità ( IU68) 4, 00· 100 .

'!l TI·:C:l' lt :ln, E METOI>OLOGII

4 on•: 1- i la~ci a raflrc·ddan· in Pssiccaton•. ln u11 a beuta con t appo a s nu·n­

glio 50 g dc lrallumin a vengono agitati encrgicam l'ntt• C'OH 5 mi di al·qua dis tillata: s i Ò f' \ , . i111piegan· dopo a lmPno 24 on· d a lla pn·parazioHt ·.

Ett·n· di p1·Lrolio p .p.a . em1 p.t·. 40-70°C.

Etcrt· cti lico I'St' lltt' da perossidi : l'rtf' rt ' f•tili('o p.p.a . 'wnt• la­vato per agitazionP con soluzimw di solfato f<'rroso all ' l 0

0 (og11i l;n ·aggio ron ) /]O dt·l volum" dt•lrf•tcrc·) ti11o a clw qtws(ultinw rirnarw iHcoloro:

si lava poi 3 volte con acqu a distillata bollita di rPrentt·. ;;i filtra !' li ~>olfatto

di sodi o ani d m c s i c•on!<t•n ·a in frigorifero in ho t tiglif' di 't'l ro seu ro s u S iJ.. ­

kon .

Procedim Pnto. - g 8 di allumiua al 10 °/0 d i arqua vcngorw messi nell a colonna cromatografica sul cui fondo f. s tato posto un fioreo di ovatla ;

s i copn• cou uu secondo fiocco di ovatta f' s i la va la colonna co11 20 rnl di Ctf'rt' di prtrolio. ()uando a l di sopra d1·lla col onn a rimane solo l rrn cirPa di solventi', s i ve r;;ano quantitati varncntt• 5 mi rlriJa soluziont• dcii .. vita rnin t·

i11 C'tf'rt' di prtrolio. i 1 ~1\·a quindi la colonna con e te re di pPtrolio ( l 00-1 50 mi a S(•conda df'Jia qua ntit à di vitamin a A presente).

Si scarta il liquido di la,·aggio c· s i cluisc<• la v iwmina D con circa 100 nd

di etere di petrolio : etere ••tilico 90: lO. Si raccoglie l'eluato in palltHit' t u­rato da 100 mi t· s i porta a v olunH· con lo s t•:sso solvente.

Su una porzione di questa soluzioni' , contenente d a 5 a 15 microgrammi

di vitamina D , si esegut: la d ctcrrninaziont· colorimetri ca con t ricloruro di an­

timonio come già dt•scritto (MA RI ANJ Pl al.. 1967).

PreparazionP d1>lla soluzion i' da rronwtog rafan• .

Prodoui solidi in cui fp vitamine .~ono stati' impiegati' allo stato di co/1-cPntrali olt•osi o allo .~taio cristallino. - Una quantità pesata di'l prodotto.

SP rwccssario ridotta in polvt>rt', vient· trattata con un sol v<•nte adatto, g• ·­neralmentt· Ptcrc etilico csent1· da perossidi o cloroform io od l'11·re di pPtrolio.

l't:ntrifugando o filtrando per separare la parte insoluhiiP. Si riprtf' più vnltc· il procedimento di c·strazione ; si riuniscono gl1

r stratti c si portano a volume. Una a liquota della sol uzion t' vit·n<· evaporata. r iprt'Sa COli 5 rnl di l' tf·rt· •li pPtrolio r sottopos ta a l procedirnrnto c roma ­

tografico .

Prodolli so/i.di roniPnP111i le v ilaminl' in forma pro/l'Ila . - P er diminuin·

l'alteraziont' dt>llt• vitamiru• col tempo ed impedin• in t e razioni co11 altri

compoucnt i, nella falJLri caz ionc• di alcuni' spPcialità medicinali soli d P ven­gono impiq;ate, conw materie primP, forrn f' protette delle due vitamine ot ­

tenutt· inglobando le vitaminl' in microsft:rt' di gelatina plas tieizzata o altn· sos tanzt· e h<' nr facilitano la dispe rsioni' . In questi casi non è possibilt ·

\!ARIANI E MARIANl VICA III 95

t•st rarre le vi tamine con olventi organici se non dopo avere separato le vitamine dalle sostanze protettive.

Il prodotto polverizzato v iene m gene re disp(•rso in poca acqua calda (2-5 mi) a cui si aggiungono 2 o 3 gocce rli a mmoniaca al lO % : dopo 2-3 minuti si diluiscf' con 30 mi di acqua e 30 mi di alcool etilico e si trasferisce la sospensione ottenuta in un separatore. Si shatte enf' rgicamente con 50 mi di etere e tilico esente tlu pero sidi ; se dopo r1ualche minuto non si formano due fa i si aggiunge ultra acqua fino a che non si ottiene la separazione dello ,.; trato etereo che viene trasferito in altro separatore. Si ripete l'f'strazione ancora due volte con 50 mi di e te re eti lico, riunendo gli estratti a l primo. S i lava l'etere pPr Jue volte con acqua, si filtra su solfato di sodio anidro e si por ta a volume. U na alifJuota della soluzione viene !'vaporata con cautela, ripn·sa con 5 mi di Pterc di petro lio e sottoposta a l procedimento cromato­g rafico.

Soluzioni olt>OSP. - ~i pr!'para una diluizione del prodotto in f"tPre di pe l rol io in modo che 5 mi contf'ngano non più di 0,5 mi di nlio t• si sottopon<' dir!'ttamcnte alla cromatografia.

fclrodisp ersioni. - Per estrarre le vitamine liposolubili dalle idrodi­''persioni V<'ngono usati principalmente Jue metodi .

fL) Adsorbimento su Florisq seguito da estrazione con solvPnti apo lari (f.AV INA, 1957). - [l F lorisil , un silieato sinte tico di m agnesio, ha la proprietà di trattenf're notevoli 11uantità di acqua, pur conservando l'aspetto di pol­Vf're secca ; quando su di esso si fanno adsorbire idrodispersioni di vi tamine liposolubili ottenu te con l' uso d i tf'nsioattivi è possibile, percolando con adatto solvente la polvere posta in colonna, t•strarre le vitamine, mentre !' ulla colonna, insieme all'acf!ua, rimane la magg ior parte dci tensioattivi insieme ai componenti idrosolubili .

In pratica, 6 g di Florisil vengono pesati in un largo tubo con tappo a smeriglio ; vi si aggiungono goccia a goccia 2 mi della idrodispersione si sbatte !'nergicamente fino a scomparsa d!'i g rumi ; i trasferisce poi quanti­t ativamPnte la polvt>re in una colonna cromatografica del diametro di !'m 1,4 t' della lunghezza di cm 20 sul cui fondo sia sta to posto un fiocco d 'ovatta. Si ricopre <'O il ultra O\ atta, si enmprimc leggermente con una hacchetta di 't>tro c s i pt>rco la con l 00 mi del solvente, fac<'ndolo gocciolare ad una ve­locità di circa 60 gocce al minuto. ~ i porta a volume l'cluato; una alilluota o la lotalità. a ~eco nda dr-l cont!'nuto in 'itamine, vengono t•vaporatc in ~"' aporatore rotantf' a bassa temperatura; il r!'siduo viene riprt'SO con 5 rul di t' tf'r!' eli pNrnlio t' sottopos to a cromatografi a su a llumina . secondo il me­todo prcct•d Pnt!' JHcnte descritto .

Come solvente per l'clu"zione dal f' lor is il noi prt·feriamo usart• il llf'n· t.enc ; possono t·ssere usati anche l' t·te rf' C'tilico o il c loroformio, ma con

11111. / :-41. Sll JJl' r . 8uuila .. (lHfi~) 4, HO · IIIU .

TEC ' ICII F. t . M Jo:TOilOLO(, II

questi du1' solvl'nti si puo mcorrr>rf' facilnrt>nt1· in pt>rdi11· sia duranti' la t>lu i­zione in colonna clw nella sucCI'Ssiva fase di cvaporazion1·.

()uesto metodo di estrazioni' , che Vil'nC impi<>~ato COn SUCCI'SSU per !"ana­lisi di prodotti in fiale, j!OCCI', e sciroppi. ha come principali' limitazionf' il fatto che si possono trattare soltanto :! ml di prodotto, p l'r cui non è in pra­tica applicabili' quando si abbiano da analizza re p rodo ti i cont()llf'nti piccol i' quantità di vitamine .

b) Estrazione daHc idrodispersioni con solvl'nti apolari. - Si prcferiSIT usare questo m etodo quando il prodotto conti!'n !' Il' vitamine in piccola qu an­tità o quando insieme ad essi' siano presenti prodotti add ensanti o di ll JH'r­dcnti come alginati, carbossimcti l-ccllulosa , l'tc.

Il metodo è basato sull'osscr\'azionc cbe, diluendo tal i dispersioni <·o r• alcool etilico in modo che il rapporto acqua-alcool sia l : 2, è possihil!' estrarn· i componenti liposolubili con etere di petrolio, etere etilico, cloroformio. Si ripete più volte l'estrazione, si riuniscono gli estratti, si lavano con acqua. si disidratano e si portano a volume . Una aliquota viene evaporata . il residuo si riprende con etere di petrolio c si sottopone al procedimento di separazioni' cromatografica .

HISULTATI E DISCUSSIO E

Abbiamo applicato i procedimenti descritti sia a miscele da nor pn' pa­rate, sia a prodotti farmaceutici del commercio. I risultati da noi ottcnul i sono riportati nelle Tab. l e 2 .

TAU E LLA l .

Mescolanze artificiali

('omJ)oslzione doUu m escola nza crouu\tog•·alh·n

Vltam inn U fJ.!(

200

100

200

200

140

140

140

140

140

14()

-~ \'ltnmlue A l eet.ere l' . l.

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20.000

30.000

10 .000

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99

196

210

139 136

136

133 14<~

161

191! ,7- llJIJ ,:Z

90 ,8- 99,2

191,6 200,4

200,8- 219, 2

13ti, 7- 141, 3

J:l3 ,4- 13B, h

132,2 139,8

B0, 2- 135 ,11

140,8- 147, 2

150, 5-171, 5

A1111. 1st . Stt]l(!r. So11il à ( 1968) 4, 90- JOU.

)!ARIAN I E MA RIAN I VICA RI 97

TABELLA 2.

Prodotti del commercio

JW II MA F Afl MA<J I!:UTI<JA j,; ()Q)lPOS!UONE

Fiale oleo&e :

Vitamina A U.I. :10.000 Vitamina D mg IO Olio di oliva q. b. n 2 mi

li'inle oleo&e : Vi tamina A pnlmita to U.l. l 0.000 \' ita minn D f.Lg 250 Olio di oliva q . b. a l rnl

Gocce oiPo&e : Vita mina A palmitato U.I.

100.000 Vit amina D mg 12,5 Olio di oliva q . b. u 10 mi

' ciroppo : Vitamina A palmitato U.I.

100.000 Vitamina D mg 5 Sali di Ca, Mg ecc. Sciroppo q. b. a g 100

Gocce: Vitamina A aceta to U. l. 83.300 Vitamina D mcg 400 + Vit E ,

0 1, B2, B8, PP , C, pautote· nato di Ca, edulcoranti, agen· ti disperdenti + H10 q. b. a IO mi

Fiale liojìli::ate : Vitamina A palmita to U. I. 2.000 Vi t amina D f.LID 300 + vita·

mina B11 latta to di calcio, polisorbato 80 mannite, mer· tiolato ecc.

Prodotte &olido : Vitamina A palmituto U. l. 42.000 Vitamina D mg 1,05 Vitamina C mg 100 l .attosio, zucchero, in tappo con·

lenitore per sciroppo Vi ta mine sotto fo rma di granuli

1•rotetti idrodispers ibi li.

l Procodlmento di cstr~ono

Vitamina. O tro,·a~ -,

con Il metodo l desoritto _::_:•·ltro mototlo

Diluizione in t> t cre di p e· t rolio

Diluizione in et ere di p e· rolio

Dilu izione in etere di p e· trolio

Adsorbimento su Florisil

mg 10,20

f.Lg 245

mg 12,6

mg 5

Adsorbimento fJ.g '~20 su Florisil

Dispersione ed f.Lg 290 estrazione con solven ti

Dispersione ed ) mg 1,07 est razione . 1 •·o n e tere e tt· 1

li co

mg 9,5 (")

f.Lg 200 (")

rng 12,2 (")

mg 3,5 (") (probubili per·

d ite durante la saponifi· cnzione e la estrazione)

( 0 ) aponilicuziune e separazione cromatografica su Filtro! ~ec. \1 ARIAN I & C AVI NA

( 1955). ( 0 0 ) Risu ltati non attendibili ~e o ttenu ti l'On altri metodi a l'ausa delle difficoltà

incont ra te nella saponificazione. ( 0 00 ) Dispersione, ~aponificazione e separazione n u ma togratica ~ec. lJ.S. P. XV L

l""· / .• t. Stt11er. Sanità ( UHl8) 4, UU· lUU.

911 1 L l.N I C.IIh h ~II 'TOHII Lltl;ll

Il proePdinH'll tu anali l i co da noi f•laboral n cunsPJII c·. 1wr la s ua se·n•pl•­citù, di ril'etluan• la d1•1c·nninazione d1· lla \ilamina D in prodotti in eui t•ssa

s ia associala alla v itamina A in un tempo notp\·olmentP infPriore a quPIIu impiegato JH'r i pru<'edimrnl i normalnw nlc· usai i clw richie·duno tra l' ali ro la pr<'liminar<' saponificazion•· d P! prodol'l o. I n du1•-tno o n• al massi mo. a l't'·

conda d ei casi, è possibili' cseguirr l'int<' ra analisi . SP vengono impiq~al i !'O l­venti ad alto grado di pHr<'zza r si proct·d1· con rura aJrr, aporazione. è pos~<i­

hill' co vitan· o ridurre al minimo lr causi' fii 1wrd i1c·.

La eliminazione dr·! procedimf'nto di saponit-icazion<' è forse• il 'antagl!i"

più sf'n sibile, poi ehè, com<' è nol o. qu<'sta io l' opt'raziom• più dP!ieata ne ll"ana­lisi dci prodotti Yitamin ici : infa tti . anehr se· eseguila con la maggior r ura poRI'i­IJil P, può CSSf'r<' causa di Sf'n sihili 1wrdil f'.

Le limitaz ioni sono dovul f'. romP prr a ltri mf'todi . soprattutlo alla llf'·

ccssità di dovf'r impiegan· 1w r la tktc rminaziont• dPIIa v itami11a D il mf'torl n colorim<'lrico al l r icloruro fii antimonio. La r<'azionf' non (• sHffic ic·ntempnte·

spC'cifiea P non SC'mprr è possihil1· aumentare la sp<'cific it:\ con l' uso di llll

hianco f'fl.Pttuato in presenza di inibitorl' ('\VrLKIE . .I ONES & KLI NE, 195H). <'i casi piì1 favor('voli , quando c ioè n<'l campionf' da analizzar e la vi tamina D

è associata a quantità no11 troppo cif'Yatf' di vitam ina A. quf's ta r.on In cro­

matografia 'icnf' r liminata totalmcnlt' r· le IPtturc di'i bian chi che si ol ten­gono sono v icine allo O cosicchè la prccis ion t> dd risultato è c iC\·a ta. ()uando

invccf' è nf'cessario c romatografar<' soluzioni contcn<'nti quantità notevoli di vi tamin a A, o quando siano presenti in forli' quantità prodotti di altera­zioru· di questa. l' cluat o da lla colonna contien<', accanto alla vitami na D . tracr.r di sos tanzr elw rc•agiscono cou il n•aui vo al triclorurn di antimonio ,. sono andw in pa rtt· inihitr· d a ll ' anidridi' at•t•tica (MAJUA 1 et al .. 19(l7);

in quf'Sti casi s i Oltl'llgono pe r la \'il amina l) \'al ori liCH'IlH' Il l (' SUJH'riori a

quelli rea l i. Il proecdimcnto d a noi dt·scritto si è flimostrato util <' r prc·ssocchè inso­

s tituibiiP soprattutto nell a d<'tf'rrninazion<" d ell a v itamina D in pri'SI'nza d1·lla vi tamin :~ A in preparazioni sciropposf• (lo zucchero prc rnll· in ques te· n·ndc· diffici le se non impossibil <' una sapouifìcazionc a lcalina. nu•ntrf' non distu rba

l'estrazion i' dc iii' , ·itami nl' liposoluiJili per adsorbinwnto su Florisil) l' in preparazioni contf'nr nti notr voli quantità di dispt'rdcnti o addensanti . Es!'o è comodo l ' rapido anchf' p<·r l'analisi di prodotti oleosi, poichè basta pn·pa­

rarc una soluzionf' di quf's ti in ctPTl' di 1wtroli o c procrd<'rc poi alla crom a to­g rafia su allumina ; la possibilità di applic·an· il m<'todo a prodotti di qul'slo è !imita la I'SsrnzialmPnte dalla composiziorw dd prodouo P, in parti r.olan·.

dal r apporto in cui si trovano vi tamina A, Yitamina D c· olio. La pre enza di ofio non ha a lcuna influenza sull'antlam cnto della cromatografia : è tuttavi a

da te11cre pn·scntc che sulla colonn a pos~ono fi ssarsi sostanzf' (spt•cialm enl e

di natura stcroidc) prrscnti nel prodotto come s uoi compon<"nti o come costi-

. 11111. 1~1 . 8 11/ ll'r. & wi/ù ( 1968) 4, !lti · I OU.

" ARIA NI .E MARIANI VI CA RI 99

tuenti dell'olio s tessu ; esse vengono poi cluite insieme alla vitamina D c reagiscono con tricloruro di antimonio dando colorazioni diverse ma che inter­feriscono con quella che si ottiene con la vitamina ; l ' impiego di un bianco in presenza di inibitore non permette sempre di eliminare completamente 11ueste interferenze.

Non abbiamo potuto a pplicare il procedimento così com e descritto a prodotti contenenti accanto alla vitamina D il coles terolo, che su colonna si comport a esattamente come la vitamina stessa e reagisce con tricloruro di antimonio dando una colorazione che viene inibita claJla presenza di anidride acetica. P er quel che riguarda s teroli o altre sostanze presenti nell'olio, ab­biamo potuto cons tatare che si hanno interferenze sensibili solo quando si passano su colonna quantità notevoli di olio e soprattutto quando l'olio, per invecchiamento, ha su1lito processi di ossiclazione; quest ' ultimo caso s i os­serva raramente in quanto per la prf'parazione dci prodotti farmaceutici vf'ngono impit>gati olii ra ffinati e a basso indice di acidità.

Concludendo, le quantità che noi a bbiamo potuto determinare cun suc­cesso sono state di 100 (.Lg di vitamina D in presenza di non ultrf' 25 .000 U.I. di v itamina A estere c d i g 0 ,5 di olio ; tali limiti e rapporti tra le due vita­mina non sono in pratica mai superati nelle preparazioni farmaceutiche con­tenenti le due vitamine in soluzioni oleose.

Riteniamo infine che il procedimento da noi descritto possa esst>re di utilità nei casi in cui, essendo il rapporto vitamina A: vitamina D molto Plevato, quest ' ultima non può essere isolata con nessuno rlei procedimenti finora conosciuti ; applicando la separazione cromatografica su allumina a ll'estratto delle due vita mine è possibile ottenere un elua to contenente la totalità della v itamina D in presenza di quantità di v itamina A molto infe­riori che non nel prodotto di partenza. Esso può quindi essere sottoposto acl uno qua lunque dei metodi di separazione già noti come se si partisse da un materiale contenente fJUantità delle due vitamine in un rapporto molto più favo revole per la loro separazione.

i ringrazia il Sig. Franco Civiero, ospite del nost ro Laboratorio, per la collaborazione tecnica.

() marzo 1968.

UlBLIOGHAFIA

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