Sede Amministrativa: Università degli Studi di Padova

Dipartimento di PEDIATRIA

SCUOLA DI DOTTORATO DI RICERCA IN

MEDICINA DELLO SVILUPPO E SCIENZE DELLA PROGRAMMAZI ONE

INDIRIZZO: EMATOONCOLOGIA, IMMUNOLOGIA E GENETICA

XXIV CICLO

RILEVANZA BIOLOGICA E PRE-CLINICA DEL RECETTORE TIR OSIN

CHINASICO ALK NEL RABDOMIOSARCOMA

Direttore della Scuola : Ch.mo Prof. Giuseppe Basso

Coordinatore d’indirizzo: Ch.mo Prof. Giuseppe Basso

Supervisore: Prof. Angelo Rosolen

Dottorando : D.ssa Marica Peron

SOMMARIO RIASSUNTO_______________________________________________________ 1

SUMMARY ________________________________________________________ 3

1.INTRODUZIONE _________________________________________________ 5

1.1 Il Rabdomiosarcoma _________________________________________________ 5

1.2 Caratterizzazione isto-patologica _______________________________________ 5

1.3 Alterazioni cromosomiche _____________________________________________ 7

1.4 ALK (Anaplastic Lymphoma Kinase) ___________________________________ 9

1.5 Struttura di ALK ___________________________________________________ 10

1.6 Funzione di ALK____________________________________________________ 13

1.7 Espressione di ALK nei tumori ________________________________________ 15

1.8 Proteine di fusione __________________________________________________ 16

1.9 Mutazioni di ALK___________________________________________________ 17

2. SCOPO DELLA TESI ____________________________________________ 22

3.MATERIALI E METODI __________________________________________ 23

3.1 Colture cellulari ____________________________________________________ 23

3.2 Reagenti ed anticorpi ________________________________________________ 23

3.3 Saggio di citotossicità con MTT________________________________________ 24

3.4. Immunoblotting ____________________________________________________ 25

3.5 Immunoprecipitazione _______________________________________________ 26

3.6 Analisi dei cicli cellulari mediante citometria a flusso _____________________ 26

3.7 Saggi di invasività e migrazione _______________________________________ 27

3.8 Saggio “Wound Healing”_____________________________________________ 28

3.9 PCR, Polymerase Chain Reaction______________________________________ 28

3.10 RT-qPCR_________________________________________________________ 29

4. RISULTATI_____________________________________________________ 31

4.1 Espressione di ALK nelle linee cellulari di RMS. _________________________ 31

4.2 Attivazione di ALK__________________________________________________ 35

4.3 Ruolo di ALK nel RMS ______________________________________________ 39

4.4 Inibizione di ALK ___________________________________________________ 44

5. Discussione _____________________________________________________ 49

BIBLIOGRAFIA___________________________________________________ 55

1

RIASSUNTO Il rabdomiosarcoma (RMS) è il più comune sarcoma pediatrico dei tessuti molli

che si sviluppa come conseguenza dell’alterazione dei pathways che controllano

la crescita e la differenziazione dei precursori del tessuto muscolare striato.

Il RMS presenta due principali sottotipi istologici: il rabdomiosarcoma alveolare

(ARMS) ed embrionale (ERMS). Il RMS alveolare è associato ad una più spiccata

tendenza alla disseminazione, necessita di un regime terapeutico più aggressivo e

presenta una prognosi sfavorevole. Comprende circa il 20% dei casi ed è

caratterizzato da traslocazioni cromosomiche specifiche, t(2;13)(q35;q14) e

t(1;13)(p36;q14), le quali danno origine alle proteine di fusione PAX3/FKHR e

PAX7/FKHR, rispettivamente. A differenza degli ARMS, i RMS embrionali

costituiscono l’80% dei casi, sono più frequenti nei bambini più piccoli, sono

associati a perdita di eterozigosi al locus 11p15.5, ma hanno una prognosi

migliore.

Attualmente, l’analisi di alterazioni genetiche è usata per una corretta e rapida

diagnosi dei RMS, anche se non sono ancora stati trovati fattori e biomarkers

prognostici che possano essere utilizzati per incrementare la sopravvivenza dei

pazienti. Recentemente è stata descritta l’espressione delle chinasi ALK nei RMS,

ma il suo ruolo rimane sconosciuto. ALK è un recettore tirosin-chinasico (RTK)

descritto come proteina di fusione costitutivamente attiva NPM-ALK nei linfomi

anaplastici (ALCL) e come proteina di membrana è espressa nei neuroni del

sistema nervoso centrale e periferico durante lo sviluppo embrionale.

Recentemente ALK è stato descritto anche in diversi tumori maligni, come nel

glioblastoma e nel neuroblastoma frequentemente associato ad aberrazioni

geniche quali amplificazioni o mutazioni puntiformi. ALK è costituito da una

regione extracellulare in cui si legano i substrati, un dominio trans-membrana e un

dominio chinasico catalitico. Come per altri RTK, l’attivazione di ALK necessita

di una dimerizzazione ligando-dipendente, in cui i domini chinasici si fosforilano

a vicenda e attivano vie di segnale critiche per la proliferazione e sopravvivenza

cellulare, come MAPK ERK1/2 e PI3K AKT. I fattori di crescita che determinano

la dimerizzazione e l’attivazione di ALK sono ancora sconosciuti, anche se

recentemente sono stati proposti pleiotropina (PTN) e midkine (MK) come

possibili ligandi.

2

In questo studio, abbiamo valutato la rilevanza biologica e pre-clinica di ALK nei

RMS, dal momento che è stato descritto per la prima volta in linee cellulari di

RMS, ma la sua funzione non è mai stata studiata. L’espressione di ALK è stata

valutata in 9 linee cellulari di RMS, 4 ERMS e 5 ARMS, mediante Real Time

PCR e western blotting, osservando che ALK è maggiormente espresso nelle linee

di RMS alveolare che esprimono l’oncogene PAX-FKHR. Tuttavia, ALK risulta

inattivo nelle cellule di RMS, a differenza di NPM-ALK negli ALCL o di EML4-

ALK in NSCLC, e per la sua attivazione necessita di una dimerizzazione ligando-

dipendente. I risultati ottenuti nel nostro laboratorio indicano però che PTN e MK

non sono in grado di attivare ALK nelle linee cellulari di rabdomiosarcoma

suggerendo meccanismi di regolazione diversi da quelli finora descritti. Infatti

non si osservano né la fosforilazione a livello delle tirosine presenti nel sito

chinasico né l’attivazione delle vie di segnale. Per capire il ruolo di ALK, è stato

quindi utilizzato un anticorpo monoclonale agonista (mAb16-39) in grado di

legarsi al dominio extracellulare di ALK e stimolarne la dimerizzazione. In queste

condizioni, è stato possibile osservare un aumento della fosforilazione di ALK e

di proteine implicate nei fenomeni di proliferazione e sopravvivenza cellulare

tumorale (MAPK; PI3K/AKT).

L’inibizione di ALK determina una diminuzione della fosforilazione di ALK, e

della trasduzione del segnale che risulta in un aumento della morte cellulare

programmata (apoptosi).

In conclusione il ruolo di ALK nei RMS rimane ancora largamente sconosciuto,

anche se i nostri dati sembrano suggerire un ruolo importante di ALK nella

tumorigenesi del RMS.

3

SUMMARY Rhabdomyosarcoma (RMS) is the most common pediatric soft-tissue sarcoma in

childhood and arises as a consequence of regulatory disruption of the growth and

differentiation pathways of myogenic precursor cells.

RMS are divided in two main subgroups on the basis of histology: alveolar

(ARMS) and embryonal (ERMS). ARMS, which is associated with a relatively

high frequency of metastatic disease and needs an intensive therapeutic regimen,

is the rhabdomyosarcoma subtype that carries the poorest prognosis. It comprises

the 20% of patients and is characterized by specific chromosomal translocations,

t(2;13)(q35;q14) and t(1;13)(p36;q14), that originate abnormally regulated fusion

protein PAX3- and PAX7-FKHR, respectively. In contrast to ARMS, ERMS

occurs at younger age, has a better prognosis and it is associated with an 11p15.5

loss of heterozygosity (LOH) and it comprises 80% of all RMS.

Nowadays, the detection of genetic imbalances is used for a correct and rapid

diagnosis of RMS subtypes, but prognostic biomarkers and factors that increase

patient’s survival are not known. Recently, expression of Anaplastic Lymphoma

Kinase (ALK) has been observed in RMS, but its role has not been investigated.

ALK is a receptor tyrosine kinase (RTK) described as the constitutively active

fusion protein in different tumors and, as membrane protein, in neurons of the

central and peripheral nervous system at late embryonic stages. Recently ALK

was also found in other malignant cancers, such as glioblastomas and

neuroblastomas, associated to genetic aberrations, such as amplifications or point

mutations. ALK has an extracellular ligand-binding region, a transmembrane-

spanning domain and a kinase catalytic region. ALK is known to be activated

through autoactivation in vitro, as the other RTK, in which ligands induce

dimerization that results from conformational changes in the active site and lead

to autophosphorylation with activated downstream signalling pathways, critical

for cell proliferation and survival. However, the growth factor to enforce ALK

dimerization and activation is still unknown, althought recently pleiotrophin

(PTN) and midkine (MK) were proposed to be the physiological ligands.

In this study we evaluated the biological and preclinical relevance of ALK in

RMS, given that ALK has been originally described in RMS cell lines, but its

function has not been studied. ALK expression was evaluated in 9 RMS cell lines,

4 ERMS and 5 ARMS, by Real Time PCR and western blotting, and we found

4

that ALK expression level is higher in alveolar RMS cells having PAX-FKHR

gene. Furthermore no basal self-activation of ALK was detected, suggesting that

ALK is constitutively inactive differently from the fusion protein NPM-ALK in

ALCL or EML4-ALK in NSCLC, therefore its dimerization is ligand-dependent.

Our data suggest that PTN and MK failed to activate ALK in RMS cell lines,

indicating different regulatory mechanisms. In fact we do not observe neither

tyrosine phosphorylation in kinasic domain of ALK or activation of the signalling

pathways downstream of the receptor. To elucidate the role of ALK in RMS, we

used an agonist monoclonal antibody (mAb16-39) against the extracellular

domain to induce dimerization. Stimulation of RMS cells markedly induces the

phosphorylation of ALK and of proteins involved in cell proliferation and survival

(MAPK; PI3K/AKT).

ALK inhibition decreased tyrosine phosphorylation of ALK and of signalling

pathways, which increased programmed cell death (apoptosis) and cell cycle

arrest.

In conclusion, ALK function is still unknown in RMS, althought our data suggest

an important role in RMS tumorigenesis.

5

1.INTRODUZIONE

1.1 Il Rabdomiosarcoma I sarcomi dei tessuti molli costituiscono un gruppo eterogeneo di neoplasie

maligne, le quali insorgono da cellule mesenchimali primordiali che normalmente

danno origine al tessuto muscolare, osseo, cartilagineo e fibroso. Questi tumori

hanno un’incidenza pari a 11 casi/anno/1.000.000 di soggetti in età pediatrica e

costituiscono la quinta neoplasia più comune, con una frequenza del 6,2% dopo le

leucemie acute, i tumori del sistema nervoso centrale, i linfomi ed il

neuroblastoma [1]. Oltre il 60% dei sarcomi dei tessuti molli è rappresentato dal

rabdomiosarcoma (RMS) che costituisce, quindi, il più frequente sarcoma dei

soggetti sotto i 15 anni d’età e rappresenta il 3-5% delle neoplasie in età

pediatrica, e circa l’1.2% dei sarcomi in età adulta [1]. Esso prende origine dal

tessuto muscolare striato, ma talora può insorgere in tessuti mesenchimali in cui le

fibre striate sono assenti, come ad esempio la parete vescicale. Esistono due picchi

di incidenza, uno tra i 2 e i 5 anni d’età ed un altro, tra gli 11 e i 15 anni di età. Il

sesso maschile appare modestamente più colpito dalla neoplasia (rapporto

maschi:femmine 1,4:1) [2]. Le localizzazioni principali sono il distretto testa-collo

(35-40% dei casi), seguite dal tratto genito-urinario (20% dei casi) e meno

frequente dal tronco e dagli arti (16% dei casi) [3].

La sede d’insorgenza del tumore, la sua disseminazione e la presenza di metastasi

determinano le caratteristiche di presentazione clinica dei RMS. La tumefazione,

anche se non dolente, è il segno più comune in questo tipo di neoplasia. Circa il

20-30% dei casi presenta metastasi alla diagnosi e le sedi di maggior frequenza

sono polmoni e sistema nervoso centrale (37%), linfonodi (35%), ossa (25%),

fegato (16%), tessuti molli (95) e midollo osseo (7%) [2]. La precisa stadiazione

dei RMS risulta molto importante e si avvale di tecniche di diagnostica per

immagine, come TAC, RMN e scintigrafia ossea, e di analisi eseguite sui

campioni operatori [4].

1.2 Caratterizzazione isto-patologica

Il rabdomiosarcoma venne descritto per la prima volta nel 1854, ma i vari sottotipi

istologici furono riconosciuti più tardi. La classificazione attualmente in uso è

6

quella dell’ Intergroup Rhabdomyosarcoma Study Group (IRSG), gruppo

statunitense, che considera i vari istotipi di RMS in 4 gruppi prognostici [5, 6]:

- Prognosi favorevole: RMS botroide e a cellule fusate;

- Prognosi intermedia: RMS embrionale (ERMS);

- Prognosi sfavorevole: RMS alveolare (ARMS) e sarcoma indifferenziato;

- Prognosi incerta: RMS con caratteristiche rabdoidi.

I RMS embrionali rappresentano circa il 60-70% dei casi e sono caratterizzati da

una morfologia simile al muscolo fetale con un lasso stroma mixoide e cellule a

diverso stadio di differenziamento. Si osservano, infatti, un numero variabile di

rabdomioblasti frammisti a cellule mesenchimali indifferenziate, a cellule con

citoplasma allungato e nucleo eccentrico e a cellule con forma poligonale. Gli

ERMS insorgono soprattutto nella regione genito-urinaria e nel tratto testa-collo e

si manifestano con due diversi picchi di età: nel bambino di età inferiore ai 5 anni

e nell’adolescente [7].

I RMS alveolari costituiscono il 20% dei casi e sono così chiamati in quanto

presentano una morfologia simile agli alveoli polmonari. Infatti si possono

osservare setti connettivali fibrovascolari che separano gruppi di cellule

neoplastiche che generalmente aderiscono al connettivo verso la periferia degli

alveoli ed appaiono disgregate verso il centro. Esiste una variante morfologica

chiamata solido-alveolare che appare costituita da aree solide e risulta sprovvista

dei tipici aspetti alveolari. In questo caso la diagnosi si basa sullo studio di aspetti

citologici (nuclei ipercromici, nucleoli evidenti e scarso citoplasma).

Generalmente gli ARMS colpiscono adolescenti e giovani adulti e si localizzano

maggiormente nel tronco e alle estremità [1] .

Per quanto riguarda le varianti con minor frequenza (10%), si possono ritrovare

quelle botrioidi, considerate un sottogruppo degli ERMS, e pleomorfiche che

colpiscono gli adulti [1, 7].

Oggi i tumori con aspetti misti alveolari ed embrionali vengono classificati come

ARMS se presentano anche una minima morfologia alveolare, mentre in passato

venivano classificati in base alle aree quantitativamente predominanti [4].

L’istologia, lo stadio ed il sito d’insorgenza del tumore sono stati identificati come

gli indicatori prognostici che influenzano più significativamente la sopravvivenza

[3, 8]. In merito alla sede primaria, i siti con prognosi più favorevole sono testa e

collo (escluse sedi parameningee), il tratto genito-urinario (esclusi vescica e

7

prostata) e il dotto biliare; tutte le altre sedi sono considerate a prognosi

sfavorevole.

La sopravvivenza a 5 anni è di circa il 73% per gli ERMS e il 48% per gli ARMS

[7]; per gli ARMS metastatici si aggira attorno al 10-30% mentre per gli ERMS

localizzati è di oltre il 95% [3, 7-10]. L’ARMS si presenta spesso già

metastatizzato alla diagnosi ed è caratterizzato da un andamento più aggressivo

rispetto all’embrionale con scarsa risposta alla terapia e con una prognosi

peggiore [10].

1.3 Alterazioni cromosomiche

Negli ultimi anni, analisi molecolari e tecniche di citogenetica hanno dimostrato la

presenza di alterazioni cromosomiche nei vari sottotipi di RMS. In particolare, gli

ARMS sono caratterizzati in circa il 70-80% dei casi da specifiche traslocazioni

cromosomiche reciproche [9, 11, 12] che coinvolgono il braccio lungo del

cromosoma 13 ed il braccio lungo del cromosoma 2, t(2;13)(q35;q14), o il braccio

corto del cromosoma 1, t(1;13)(p36;q14), che codificano per proteine chimeriche

PAX3-FKHR (PAX3-FOXO1) e PAX7-FKHR (PAX7-FOXO1), rispettivamente

(figura 1). Circa il 20-30% degli ARMS non presenta traslocazioni. L’espressione

della proteina di fusione PAX3-FKHR è associata ad una prognosi sfavorevole,

soprattutto nei pazienti con metastasi. Infatti la sopravvivenza a 4 anni si aggira

attorno all’8% rispetto al 75% dei tumori positivi per PAX7-FKHR [9].

Figura 1. Proteina di fusione PAX-FKHR. PAX è costituito da tre domini funzionali: il Paired Domain, Homeo-Domain e Transactivation Domain. La regione C-terminale è ricca in glicine, serine e treonine. FKHR presenta il dominio ForkHead per il legame al DNA, il dominio Transactivation e la regione C-terminale ricca in proline. La proteina di fusione PAX-FKHR (837 aminoacidi) presenta il dominio ForkHead tronco fuso con i domini Paired e Homeo- di PAX3.

8

I geni PAX3 e PAX7, appartengono alla famiglia dei geni regolatori PAX, e si

trovano, rispettivamente, sui cromosomi 2 ed 1; sono caratterizzati da un dominio

di legame al DNA, costituito da un Paired Domain e da un Homeodomain, ed un

dominio di transattivazione (Transactivation Domain). Si ritiene che questi geni

abbiano un ruolo sia nel controllo dello sviluppo embrionale che nel

mantenimento dell’espressione di geni tessuto specifici negli adulti. Il gene FKHR

si trova sul cromosoma 13 ed appartiene alla famiglia dei fattori di trascrizione

Forkhead. Esso presenta, come i geni PAX, un dominio di legame al DNA

(Forkhead Domain) e un dominio di transattivazione. I punti di rottura di

PAX3/PAX7 avvengono generalmente sul dominio di transattivazione, mentre

quelli di FKHR avvengono nel dominio di legame al DNA [13]. La proteina di

fusione PAX3/PAX7-FKHR contiene il Paired e l’Homeo Domain derivanti da

PAX3/7 ed il dominio di transattivazione di FKHR. In alcuni casi di

rabdomiosarcoma alveolare sono state identificate altre proteine di fusione, le

quali coinvolgono sempre PAX3, come ad esempio PAX3-NCOA1 [14, 15].

Le proteine di fusione PAX-FKHR sono fattori di trascrizione molto più potenti

delle rispettive proteine wild-type, di circa 10-100 volte [16]. Questo sembrerebbe

dovuto ad un sito di attivazione ricco di proline presente all’estremità

carbossiterminale di FKHR che ne aumenterebbe l’affinità di legame al gene

causandone l’over-espressione o la repressione [17]. Inoltre l’attività oncogenica

di PAX3-FKHR sembra dovuta, oltre ad un’alterata regolazione dei geni target di

PAX3, anche al legame a nuovi geni target [18, 19]. Tra i geni regolati da PAX-

FKHR troviamo MYCN, MYOD1, FOXF1, KCNN3, IGFBP3, GADD45A, i quali

sono implicati nello sviluppo del sistema nervoso, muscolare e nella regolazione

della trascrizione [20, 21]. Inoltre questa famiglia di proteine risulta coinvolta

nella proliferazione e nella sopravvivenza cellulare, nell’angiogenesi e

nell’attivazione di molti altri segnali [22].

Nei RMS sono state descritte altre traslocazioni cromosomiche meno frequenti,

come t(2;8)(q37;q13), t(2;2)(q35;p23) da cui si originano le proteine di fusione

PAX3-NCOA2 e PAX3-NCOA1, rispettivamente [14, 23, 24].

Circa il 94% degli ERMS presentano una regione di almeno 15 mb con perdita di

eterozigosità (LOH, Loss Of Heterozigosity), il cui grado dipende strettamente dal

sottotipo istologico [25]. Infatti i rabdomiosarcomi embrionali mostrano un

cariotipo più complesso della controparte alveolare che risulta dalla forte

9

instabilità genomica che li caratterizza [26]. Le regioni più frequenti di LOH sono

situate nel cromosoma 11, sia sul braccio lungo che corto. A lungo si è

considerato la perdità di eterozigosità al 11p15.5 come marker per la diagnosi

degli ERMS [27-29], sebbene, recenti studi abbiano ormai evidenziato che questo

sito di LOH sia presente anche nel 77% degli ARMS non traslocati e nel 24% di

quelli traslocati [25]. Tale regione include i geni H19, IGF2 e CDKN1C e gli

ERMS, infatti, presentano frequentemente la perdita dell’allele materno di IGF2

(per silenziamento), e duplicazione di quello paterno in quella che è conosciuta

come disomia uniparentale [29, 30]. IGF2 viene sovraespresso quindi per la

perdita di imprinting (LOI, Loss Of Imprinting) che risulta dall’espressione

biallelica paterna del gene [31, 32]. Sono state trovate altre regioni di LOH nei

RMS, come ad esempio: il locus 9q22 che include il gene PTCH1 nel 30% degli

ERMS, la regione 4q soprattutto nei rabdomiosarcomi alveolari con traslocazione

t(2;13), e la regione 8q in quelli non traslocati [25].

Inoltre, nei RMS alveolari ed embrionali risulta frequente l’amplificazione della

regione 2p24. Questo comporta la sovra-espressione dell’oncogene MYCN, che è

un marcatore prognostico sfavorevole soprattutto negli ARMS [33, 34]. Infine

anche la regione 12q13 può essere interessata da amplificazione dei geni SAS,

CDK4 e GLI [35, 36], così come sono state riscontrate mutazioni puntiformi degli

oncogeni K-RAS ed N-RAS e la sovraespressione di MET [22, 37].

1.4 ALK (Anaplastic Lymphoma Kinase)

ALK (Anaplastic Lymphoma Kinase) è un recettore tirosin chinasico (RTK)

ampiamente descritto nei linfomi anaplastici a grandi cellule (ALCL) come

proteina di fusione (NPM-ALK), ed è espresso nel sistema nervoso centrale

durante lo sviluppo embrionale [38]. La sua espressione nei tessuti umani

diminuisce durante la gestazione ed alla nascita risulta debolmente espresso solo

nelle cellule nervose ed endoteliali, nelle quali forse ha un ruolo nello sviluppo e

differenziazione cellulare [39]. Evidenze per il suo ruolo essenziale nello sviluppo

del mesoderma e del sistema nervoso sono state riportate anche in Drosophila

(DAlk) [40]. Recentemente è stato dimostrata la sua espressione in numerosi

tumori solidi come neuroblastoma e glioblastoma e, come altri recettori ad attività

chinasica, esso può andare incontro a traslocazioni cromosomiche reciproche. Le

10

più studiate sono la traslocazione t(2;5)(p23;q35) negli ALCL da cui origina la

proteina di fusione NPM-ALK [41, 42], le traslocazioni t(1;2)(q25;p23),

t(2;3)(p23;q21) e le inversioni cromosomiche inv(2)(p21;p23) e inv(2)(p23;q35),

che danno origine rispettivamente ai prodotti di fusione TPM3-ALK, TFG-ALK,

ATIC-ALK e EML4-ALK [43, 44].

1.5 Struttura di ALK

ALK è un recettore tirosin-chinasico appartenente alla super famiglia dei recettori

chinasici insulino simili (IRK), codificato da un locus che si trova nel cromosoma

2p23 [45] (figura 2). Esiste un’omologia dell’85% tra ALK umano e ALK murino

e del 34% tra quello umano e DAlk, indicando che i recettori tirosin-chinasici

sono altamente conservati tra le specie.

Figura 2. Localizzazione di ALK nel cromosoma 2. Il gene che codifica ALK è localizzato sul locus p23 del cromosoma 2 ed è costituito da 6226bp.

La proteina è costituita da una regione extracellulare che comprende il sito di

legame per i fattori di crescita, una regione transmembrana, e una regione

intracitoplasmatica con sito catalitico. Il dominio extracellulare presenta forte

omologia con il recettore LTK (Leukocyte Tyrosin Kinase) [46] e per questo

viene inserito nella superfamiglia IRK, la quale comprende anche IGF-1R (Insulin

Growth-1 Receptor), MET, cROS e i recettori neurotrofici [47-49]. Come per

alcuni RTK, l’attivazione di ALK necessita una dimerizzazione ligando-

dipendente e di una fosforilazione in trans dei due monomeri (cross-

fosforilazione), per stimolare la trasduzione del segnale dal citoplasma al nucleo

(figura 3).

11

Figura 3. Schema dell’attivazione dei recettori tirosin-chinasici (RTK). L’interazione del ligando con il recettore determina la dimerizzazione e la fosforilazione dei domini chinasici (cross-fosforilazione). In questo modo le proteine intracellulari si legano e vengono fosforilate dal recettore stesso. Il gene ALK è costituito da 6226bp e codifica per una proteina di 177kDa, la

quale, in seguito a N-glicosilazione, diventa di circa 200kDa [42, 50].

Il recettore ALK è costituito da 1620 aminoacidi, di cui 1030 formano il dominio

extracellulare, 28 il dominio transmembrana, 64 quello juxtamembrana, e 562

aminoacidi costituiscono la porzione intracitoplasmatica (figura 4). In particolare,

il dominio extracellulare presenta:

- 26 aminoacidi idrofobici all’N-terminale;

- il sito di legame per le molecole che attivano ALK (regione 391-401);

- 16 siti di N-glicosilazione (Asn-X-Ser/Thr);

- un dominio LDL-A (lipoproteine a bassa densità di classe A) la cui funzione è

ignota;

- un dominio MAM (Meprin, A5, Mu) che media le interazioni tra cellule;

- una regione ricca in glicine.

Figura 4. Struttura proteica di ALK. La regione extracellulare all’estremità N-terminale presenta 2 domini MAM (aminoacidi 264-427 e 480-626), un dominio LDL (aminoacidi 453-471) ed un dominio ricco in glicine (aminoacidi 816-940). Il dominio transmembrana TM (aminoacidi 1030-1058) connette i domini extra- ed intra- cellulari. Il dominio intracitoplasmatico contiene un dominio juxtamembrana (aminoacidi 1058-1122) ed il dominio catalitico tirosin-chinasico (aminoacidi 1122-1376). (Rif. Azarova A.M. et al. Emerging importance of ALK in neuroblastoma. Seminars in Cancer Biology (2011) 21: 267-75).

12

Il dominio catalitico tirosin-chinasico (aminoacidi 1122-1376) presenta una

regione conservata di 3 tirosine YXXXYY (A-loop: sito di attivazione, che

presenta Tyr1278, Tyr1282, Tyr1283) che regola l’attività catalitica [51], e molti

altri siti di fosforilazione localizzati sia nel dominio juxtamembrana (aminoacidi

1093-1096) che all’interno del dominio citoplasmatico (aminoacidi 1504-1507),

che consentono il legame di fattori coinvolti nella trasmissione del segnale, come

IRS-1 (Insulin Receptor Substrate-1) e SHC (Src homology domain) [51].

Recentemente la struttura della tasca chinasica di ALK è stata studiata mediante

cristallografia a raggi X [52, 53] ed è emerso che esso possiede caratteristiche

tipiche delle tirosin-chinasi (figura 5A). Infatti è costituito da un lobo NT (N-

terminale) connesso tramite una regione a cerniera al lobo CT (C-terminale). Il

primo lobo è ricco in foglietti β antiparalleli, mentre il secondo è caratterizzato da

8 eliche e due foglietti β. Il sito catalitico (residui 1247-1254) è posizionato tra

l’elica αE ed il primo foglietto β del lobo CT.

ALK e IGF1RK/IRK presentano una elevata omologia di sequenza nel sito di

attivazione (A-loop) e la loro attività catalitica è correlata al grado di

fosforilazione dei residui tirosinici [54]. I recenti studi di cristallografia [52, 53],

hanno dimostrato che ALK, a differenza degli altri RTK, presenta una specificità

di legame per una determinata sequenza dei ligandi [55] e che la tirosina in

posizione 1278 risulta essere il sito preferenziale di fosforilazione, nonché il sito

critico per la sua attivazione e attività trasformante [56]. Per l’attivazione di

IGF1RK/IRK, invece, sono necessarie la fosforilazione della seconda e terza

tirosina della regione YXXXYY (Tyr 1135 e 1136 rispettivamente). Quindi la

fosforilazione delle Tyr 1135 e 1278 risulta critica proprio perché tali residui sono

implicati nei meccanismi che regolano l’attivazione dei recettori.

13

A

B

Figura 5. Struttura tridimensionale di ALK e sito catalitico. A, struttura tridimensionale di ALK in due orientamenti ortogonali. In blu è riportato il lobo CT, in giallo la regione a cerniera, il loop di attivazione in rosso, in porpora l’elica αC, in arancione 5 foglietti-β anti-paralleli, NT: estremità N-terminale, CT: estermità C-terminale. B, allineamento della regione catalitica di IGF1RK/IRK e ALK. (Rif. Lee C.C. et al. Crystal structure of the ALK catalytic domain. Biochem Journal (2010) 430, 425-37.)

1.6 Funzione di ALK

Recenti studi hanno dimostrato che la maggior espressione di ALK è nel sistema

nervoso centrale e periferico [51, 57] durante la gestazione, mentre i livelli di

trascritto (mRNA) e quelli proteici sono quasi nulli durante la crescita e lo

sviluppo post-natale [57, 58]. Studi di espressione in Drosophila e topo hanno

confermato la maggior localizzazione di ALK nel sistema nervoso, in particolare

nel talamo, ipotalamo e bulbo olfattivo [57, 58]. Più recentemente è stato

dimostrato che ALK è espresso anche a livello del nervo ottico, retina, lingua,

testicoli e ovaio di topo, così come a livello del mesoderma e muscolatura del

tratto digestivo in Drosophila [40, 59, 60].

Sulla base di queste osservazioni, è stato ipotizzato un ruolo nello sviluppo e nella

funzionalità del sistema nervoso, anche se topi knockout per ALK non hanno

evidenziato particolari alterazioni durante lo sviluppo di questo sistema [61].

Questa ipotesi, però, risulta ancora controversa, visti i recenti studi che

dimostrano un ruolo inibitorio di ALK nella differenziazione neuronale in

14

C.elegans [62]. La mancata alterazione nello sviluppo dei neuroni di topi

knockout per ALK, hanno fatto ipotizzare che ALK possa essere un recettore

“dipendente” [63], e che quindi la sua attivazione richieda la presenza di specifici

ligandi: nello stato inattivo, ALK sarebbe in grado di indurre apoptosi mediante

clivaggio caspasi-dipendente dell’acido aspartico presente in posizione 1160,

mentre in presenza dei ligandi, e quindi nello stato attivo, sarebbe in grado di

inibirla [64]. Ulteriori studi devono essere fatti per capire sia i meccanismi che

regolano questo tipo di attivazione sia le conseguenze a livello fisiologico e a

livello dello sviluppo embrionale.

Le ipotesi relative all’attivazione di ALK sono molteplici, dal momento che è

stato riportato che possa essere un recettore per i fattori neurotrofici [49] o che

possa fungere da ligando per se stesso, vista la presenza di un motivo simile a

quello presente nel fattore di crescita epiteliale (EGF) nel proprio dominio

extracellulare. Recentemente, sono stati eseguiti una serie di studi su pleiotropina

(PTN) e midkine (MK), dal momento che la loro espressione risulta concomitante

e delimitata nelle stesse regioni di ALK durante lo sviluppo embrionale [65, 66].

PTN e MK sono fattori di crescita che legano l’eparina (heparin-binding growth

factors) e sono coinvolte sia nello sviluppo dei neuroni che nell’induzione

dell’angiogenesi e mitosi in diverse modelli cellulari [67-70]. Tramite studi di

marcatura con 32[P], è stato dimostrato, infatti, che PTN e MK sono in grado di

legare la stessa regione del dominio extracellulare di ALK, causandone la

fosforilazione e l’attivazione [66, 69]. Le due molecole, inoltre, sono in grado di

attivare diversi segnali intracellulari, portando così alla conclusione che NPM-

ALK svolga, un’importante attività anti-apoptotica e trasformante, coinvolgendo

l’attivazione di STAT3, PI3K/AKT, RAS/ERK (figura 6) [71-73]. Questi

pathways sono generalmente up-regolati in linee cellulari trasformate [74] e uno

studio recente ha dimostrato come l’inibizione selettiva dell’espressione di

STAT3 in linee cellulari di ALCL ALK-positive induca rapidamente l’apoptosi e

l’arresto del ciclo cellulare, con concomitante riduzione dell’espressione di

proteine anti-apoptotiche come Bcl-2, Bcl-xl e mcl-1, evidenziando così l’attività

anti-apoptotica di ALK [75].

Nonostante recenti evidenze del legame di PTN e MK ad ALK, esistono molti

dubbi sulla capacità di attivare direttamente questo recettore, in quanto studi

successivi hanno riportato la mancata attivazione di ALK dopo stimolazione con

15

PTN in diverse linee cellulari [76, 77] sottolineando, così, l’esigenza di ulteriori

approfondimenti a riguardo. Nel 2007 infatti è stato proposto un meccanismo

indiretto di attivazione di ALK tramite PTN, che andrebbe a coinvolgere il

recettore RPTPβ/ζ (receptor protein tyrosine phosphatase ζ), il quale normalmente

determina la defosforilazione dei siti di attivazione di ALK. Il legame di PTN a

questo recettore inibirebbe la defosforilazione di ALK causandone, quindi,

l’attivazione [78].

Figura 6. Pathways attivati da ALK. Le vie di segnale possono essere attivate dal legame con specifiche molecole, amplificazione genica o mutazioni. PTN:pleiotropina; MK: midkine; RPTPβ/ζ: receptor protein tyrosine phosphatase ζ. (Rif. Azarova A.M. et al. Emerging importance of ALK in neuroblastoma. Seminars in Cancer Biology (2011) 21: 267-75).

1.7 Espressione di ALK nei tumori

ALK è stato descritto per la prima volta nella linea cellulare di ARMS, RH30 [41,

42, 57] e successivamente la sua espressione è stata riportata in diversi istotipi

tumorali [79, 80], compreso neuroblastoma [50, 76], glioblastoma [81, 82],

melanoma e carcinoma mammario [76, 77]. Lamant et al. nel 2000 hanno

osservato l’espressione di ALK in circa il 92% di casi di neuroblastoma, senza

però poter correlare l’espressione proteica con la prognosi della malattia [50].

Studi successivi hanno supportato queste osservazioni senza però capirne il

significato [76]. Negli ultimi anni, tuttavia, l’importanza del ruolo di ALK nello

sviluppo tumorale, è stata dimostrata nel glioblastoma e nel medulloblastoma in

cui ALK è sensibile alla stimolazione con PTN e MK e la sua inibizione causa

arresto del ciclo cellulare ed apoptosi [66, 81].

16

Più recentemente è stata riportata l’espressione di CLTC–ALK in un gruppo di

linfomi non Hodgkin (NHL) con prognosi infausta [83]. Il suo ruolo non è ancora

chiaro, nonostante negli ALCL, un gruppo di NHL, sia stata largamente descritta

la proteina di fusione NPM-ALK in circa l’85% dei casi.

1.8 Proteine di fusione

Molti recettori tirosin-chinasici sono implicati nell’oncogenesi di neoplasie, in

quanto soggetti a diverse alterazioni genetiche, come amplificazioni, traslocazioni

reciproche o mutazioni puntiformi, che causano una deregolazione dei siti

catalitici e l’attivazione di una serie di segnali legati all’induzione della

trasformazione e proliferazione cellulare e alla resistenza alla terapia [84]. Le

traslocazioni cromosomiche che coinvolgono ALK portano alla formazione di

proteine di fusione che presentano il dominio intracitoplasmatico di ALK

(aminoacidi 1058-1620), incluso il sito catalitico, e condividono alcune

caratteristiche comuni (figura 7):

- la proteina di fusione all’N-terminale presenta un dominio di

oligomerizzazione;

- il partner genico all’N-terminale controlla l’espressione costitutiva della

proteina chimerica.

Figura 7. Proteine di fusione che coinvolgono ALK. Sono riportate alcune traslocazioni cromosomiche che generano proteine di fusione, le loro frequenze nei linfomi anaplastici a grandi cellule (ALCL) e nei tumori miofibroblastici infiammatori (IMT) e la loro localizzazione subcellulare basata su saggi di immunoistochimica. N: localizzazione nucleare, C: localizzazione citoplasmatica, NM: membrana nucleare. (Rif. Li R. et al. Development of Anaplastic Lymphoma Kinase small-molecule inhibitors for cancer therapy. Medinal Research Reviews. 2008, 28(3):372-412.

17

La proteina di fusione maggiormente descritta è NPM-ALK, espressa in circa

l’85% dei linfomi ALCL ALK+. Esso origina dalla traslocazione t(2;5)(p23;q35)

ed il clonaggio dei punti di rottura dei due cromosomi ha permesso di identificare

i due geni coinvolti in tale riarrangiamento cromosomico: NPM (nucleophosmin o

B23) sul cromosoma 5, ed ALK sul cromosoma 2. Il gene di fusione risultante

esprime una proteina di circa 80 kDa, ad attività tirosin-chinasica (NPM-

ALK/p80) e a localizzazione citoplasmatica e nucleare [41, 42]. Nel restante 15%

degli ALCL ALK-positivi la proteina di fusione e’ localizzata esclusivamente nel

citoplasma. Analisi citogenetiche più approfondite hanno però rivelato in questi

restanti casi la presenza di aberrazioni cromosomiche differenti dalla t(2;5).

Quelle più frequenti e meglio caratterizzate molecolarmente, quali

t(1;2)(q25;p23), t(2;3)(p23;q21) e inv(2)(p23q35), danno origine rispettivamente

ai prodotti di fusione TPM3-ALK, TFG-ALK ed ATIC-ALK [43, 44, 85]. TPM3-

ALK è associato anche ai tumori miofibroblastici infiammatori (IMT,

Inflammatory Myofibroblast Tumor), i quali possono presentare altre proteine di

fusione come CARS-ALK e CLCT-ALK. Questi tumori presentano un origine

mesenchimale, hanno tendenza a metastatizzare con scarsa risposta alla chemio- o

radioterapia [86].

Recentemente nei tumori ai polmoni NSCLC (Non Small Cell Lung Cancer) è

stata identificata una nuova proteina di fusione, EML4-ALK, la cui frequenza è di

circa il 3% nei pazienti affetti da questo tipo di neoplasia. La capacità

trasformante di questa proteina chimerica è stata dimostrata sia in vitro che in

modelli murini, mentre la sua inibizione induce blocco del ciclo cellulare ed

apoptosi [87]. E’ stato dimostrato che pazienti con NSCLC ALK+ rispondono a

Crizotinib, inibitore specifico di ALK, e mostrano una sopravvivenza libera da

malattia a 6 mesi del 72% rispetto a pazienti con NSCLC ALK- (33%) [88].

Crizotinib si trova in fase II di sperimentazione clinica ed in letteratura si trovano

diversi articoli riguardo la sua efficacia in vitro in altri istotipi tumorali [89].

1.9 Mutazioni di ALK

L’espressione di ALK è stata riportata in diverse linee cellulari di neuroblastoma

[50] e lo studio delle mutazioni somatiche ed ereditarie o delle amplificazioni in

questo tipo di tumore, è importante per lo sviluppo di terapie mirate. E’ stato

18

riportato che in circa il 50% dei casi di neuroblastoma ereditario, ALK presenta

mutazioni nel dominio catalitico. Mediante sequenziamento sono state individuate

3 mutazioni in ALK: R1275Q, R1192P, G1128A. La prima mutazione risulta

essere la più frequente [90, 91] e si trova in una regione fortemente associata a

mutazioni attivanti osservate in diverse proteine oncogene, come BRAF [92].

Analogamente, mutazioni somatiche sono state identificate all’interno del

dominio catalitico in campioni di neuroblastoma primario, e quelle più frequenti

sono risultate essere R1275Q e F1174L. In presenza di queste mutazioni,

l’attivazione di ALK non richiede la dimerizzazione del recettore, che viene

fosforilato in maniera autonoma. La capacità trasformante dei mutanti di ALK è

stata dimostrata sia in topi nudi che in linee cellulari [93, 94], e come atteso il

silenziamento di ALK causa l’inibizione della proliferazione cellulare ed apoptosi

[93, 95]. In particolare, ALK F1174L è caratterizzato da una maggior capacità

trasformante rispetto ad ALK R1275Q [77], e frequentemente è espresso in tumori

che presentano anche amplificazione del gene MYCN. L’associazione di queste

due alterazioni genetiche risulta fortemente correlata ad una prognosi infausta,

come recentemente riportato [77]. Inoltre ALK-F1174L è associato a

chemioresistenza in pazienti con neuroblastoma, e ciò fa ipotizzare un ruolo

critico di tale mutazione nell’oncogenesi del tumore [96].

Studi recenti hanno dimostrato che l’amplificazione, o l’aumento del numero di

copie del gene di ALK sono nella maggior parte dei casi associati

all’amplificazione del gene MYCN [77, 97] e a prognosi infausta, anche se il

significato funzionale di tale anomalia rimane ancora ignoto [77].

Passoni et al. hanno descritto una sovraespressione di ALK wild-type, in linee

cellulari ed in campioni di neuroblastoma, che sembra indipendente da

amplificazioni geniche o da mutazioni del dominio chinasico [98]. L’espressione

di ALK sembra correlare, inoltre, al suo stato di attivazione nelle linee cellulari

IMR32 che presentano alti livelli del recettore, ma non nelle linee NB5 che non

esprimono ALK. I trattamenti con inibitori dell’attività chinasica di ALK, CEP-

14083 e CEP-14513, determinano una inibizione della proliferazione dose-

dipendente ed un aumento della morte cellulare, in linee che sovraesprimono

ALK. Il fatto che le mutazioni di ALK abbiano un ruolo nei neuroblastomi

ereditari e sporadici, pone questo recettore come un futuro target per nuove t

19

1.10 Inibitori di ALK

Negli ultimi anni sono state sviluppate diverse molecole in grado di bloccare la

proliferazione tumorale dipendente dall’attivazione costitutiva di ALK,

concentrando gli sforzi sull’inibizione dell’attività chinasica ed in particolare del

sito di legame dell’ATP nel dominio catalitico.

Il primo inibitore di ALK ad entrare nei trial clinici è il Crizotinib (PF-2341066,

Pfizer), un derivato della 2,4-pirimidindiammina in grado di competere con

l’ATP, nel sito di legame di ALK e c-MET [99] (figura 8). E’ stata dimostrata la

sua potente attività antiproliferativa in linee cellulari ALCL (Karpas-299, SU-

DHL-1, IC50 32 e 43nM rispettivamente), la quale risulta correlata all’inibizione

della fosforilazione di NPM-ALK. In cellule di ALCL, Crizotinib induce un

blocco del ciclo cellulare e causa morte cellulare in seguito all’inibizione di NPM-

ALK [89]. La sua efficacia è stata dimostrata anche in topi SCID in cui sono state

inoculate cellule di ALCL umano, determinando una diminuzione della

proliferazione cellulare ed una completa regressione del tumore entro i primi 15

giorni di trattamento (100mg/kg/giorno) [89]. Il Crizotinib, inoltre, è in grado di

inibire la crescita in linee cellulari di neuroblastoma e NSCLC, in particolare,

nelle cellule che presentano amplificazione del gene di ALK o la mutazione

R1275Q [100]. I tumori che presentano la mutazione F1174L risultano, invece,

resistenti al Crizotinib, ma rispondono meglio al TAE684 (5-cloro-2,4

diamminofenilpirimidina) [101]. Gli effetti indesiderati nel trattamento con

Crizotinib comprendono nausea, vomito, diarrea e disturbi alla vista, mentre quelli

più severi, come alti livelli di transaminasi, sono poco frequenti e reversibili [88].

20

Figura 8. Strutture chimiche di alcuni inibitori di ALK . (Rif. Ardini E. et al., Anaplastic lymphoma kinase: role in specific tumors, and development of small molecule inhibitors for cancer therapy. Cancer Letters 2010). Un altro inibitore di uso clinico è NVP-TAE684 (Novartis Pharma) (figura 8), il

quale inibisce sia la proliferazione nelle linee cellulari di ALCL (Karpas-299 e

SU-DHL-1 con IC50 di 2-5 nM) che la fosforilazione di NPM-ALK in modo dose-

dipendente [102]. Questa molecola è stata testata in oltre 602 linee cellulari

tumorali e si è dimostrata efficace anche in quelle di neuroblastoma e NSCLC che

esprimono la proteina ALK o le varianti tronche di essa [100].

GSK1838705A è un potente inibitore competitivo di ALK e IGF-1R che presenta

una IC50 di 0.5 e 1.6nM, rispettivamente (figura 8). E’ in grado di inibire la

crescita tumorale in diversi modelli cellulari, come SUP-M2, SU-DHL-1, Karpas-

299, SR-786, L-82 (linee cellulari ALCL) e in NCI-H2228 (linee cellulari

NSCLC) ed, inoltre, è stata dimostrata la completa regressione tumorale in topi

SCID in circa 21 giorni di trattamento con una dose di 60mg/kg/giorno [103].

Attualmente sono in studio inibitori di ALK di seconda generazione, come i

derivati della tetraidropirido-pirazina, che presentano un’alta selettività per ALK

ed una IC50 compresa tra 10 e 15nM [104, 105]. Tra questi, CMPD 13, derivato

della 2,4-diarilamminopirimidina, inibisce totalmente l’attività di NPM-ALK sia

in vitro che in vivo, ed induce tossicità nelle linee cellulari EML4-ALK+ di

NSCLC e nelle linee NB-1 di neuroblastoma che presentano amplificazione del

recettore ALK [106].

21

Tuttavia, recentemente sono stati riportati casi di farmaco-resistenza agli inibitori

di ALK, a causa dell’insorgenza di mutazioni secondarie durante la terapia [107,

108]. Queste mutazioni sono state riscontrate sia in pazienti affetti da NSCLC

EML4-ALK + sia in pazienti con tumore miofibroblastico di tipo infiammatorio

(IMT) con traslocazione t(2;2)(p23;q11-13) [108].

22

2. SCOPO DELLA TESI

Scopo della tesi è l’analisi dello stato di espressione ed attività del recettore

tirosin-chinasico ALK in linee cellulari di rabdomiosarcoma pediatrico,

analogamente a quanto già osservato in altri tumori pediatrici (neuroblastoma,

glioblastoma e melanoma) [61]. I pochi dati finora disponibili suggeriscono che

ALK è espresso in cellule di rabdomiosarcoma, più frequentemente nel sottotipo

alveolare che in quello embrionale, ma la sua rilevanza biologica e i meccanismi

che regolano la sua attivazione e attività non sono ancora noti. Lo studio si

propone quindi di analizzare, unitamente all’espressione ed all’attività di ALK, i

meccanismi di attivazione, mediante l’uso di specifiche molecole attivanti o

inibitorie. Tali molecole sembrano implicate nella proliferazione e sopravvivenza

cellulare dei modelli tumorali che esprimono ALK, attraverso la stimolazione o

l’inibizione dell’attività chinasica del recettore. Nel nostro studio, abbiamo

utilizzato pleiotropina (PTN) e midkine (MK), quali ligandi putativi di ALK, whi-

p-154, inibitore di ALK, e mAb16-39, un’anticorpo monoclonale agonista in

grado di stimolare l’auto-fosforilazione del recettore ALK e la trasduzione di

segnali critici per la sopravvivenza e proliferazione della cellula trasformata [65,

66, 109, 110].

Particolare attenzione è stata posta all’individuazione di molecole in grado di

bloccare la proliferazione delle cellule di rabdomiosarcoma attraverso l’inibizione

specifica del recettore ALK, per poter sviluppare strategie terapeutiche in grado di

migliorare la sopravvivenza dei pazienti affetti da rabdomiosarcoma pediatrico.

23

3.MATERIALI E METODI

3.1 Colture cellulari

In questo studio sono state utilizzate 5 linee cellulari umane di rabdomiosarcoma

alveolare (RH30, RH28, RH18, RH4, RC2), 4 linee di rabdomiosarcoma

embrionale (RD, CCA, SMS-CTR e RH36), 2 linee di neuroblastoma (LAN5,

IMR32), 1 di linfoma anaplastico a grandi cellule (Karpas-299), 3 linee di

leucemia (K562, DG75, CEM). Le cellule sono state mantenute in coltura con

RPMI 1640 (Gibco, Invitrogen, UK) addizionato di glutammina (2mM),

penicillina (100U/ml) e streptomicina (100ug/ml), 10% FCS inattivato, a 37°C e

5% di CO2.

3.2 Reagenti ed anticorpi

Il sale di tetrazolio MTT, 3,(4,4-dimetiltiazolo)-2,5 difenil-tetrazolo bromuro, è

stato acquistato da SIGMA (Sigma-Aldrich, USA). I reagenti per la

quantificazione proteica (BCATM protein quantitation assay) sono stati acquistati

da Pierce (Pierce Chemical Co., USA), come la soluzione chemiluminescente

impiegata per la determinazione delle proteine sulle membrane di nitrocellulosa e

PVDF, le quali sono state acquistate da Schleicher & Schuell.

Gli anticorpi anti-ALK sono stati acquistati da Invitrogen (Invitrogen Corp., USA)

o forniti gentilmente dal Prof. Falini dell’Università di Perugia; gli anticorpi anti-

phosphoALK, anti-ERK1/2, anti-phosphoERK1/2, anti-phosphoStat3 (Y705),

anti-AKT, anti-phosphoAKT, anti-JNK, anti-PARP, anti-ciclina D3 sono stati

acquistati da Cell Signaling (Cell Signaling Technology Inc., USA). L’anticorpo

anti-β-actina, anti-Bcl2 sono stati acquistati da Santa Cruz (Santa Cruz

Biotechnology, USA), mentre anti-HSP90 (clone 9D2) e anti-HSP70 da Stressgen

(Stressgen, USA). Gli anticorpi secondari perossidati sheep anti-mouse e donkey

anti-rabbit sono stati acquistati da GE Healthcare (GE Healthcare Bio-Sciences

AB, Svezia), così come protein G-Sepharose Fast FlowTM.

La pleiotropina (0.5 mg/ml in PBS 1x), midkine (0.5 mg/ml in PBS 1x) e 17-

DMAG (20 mM in DMSO) sono stati acquistati da Alexis (Alexis, AXXORA

Life Science, USA); whi-p-154 (25mM in DMSO) da Calbiochem (Calbiochem,

Merck, Germania), mentre l’anticorpo monoclonale mAb16-39 (0.1 mg/ml in

acqua distillata) è stato concesso gentilmente dal Dr. Yamamoto dell’Università di

Tokio.

24

Tutti gli altri reagenti sono stati acquistati da Sigma (Sigma-Aldrich, USA).

3.3 Saggio di citotossicità con MTT

Il saggio con MTT, 3,(4,4-dimetiltiazolo)-2,5 difenil-tetrazolo bromuro, ha lo

scopo di valutare la capacità da parte delle cellule vitali di convertire, nella sua

forma ridotta, il sale di tetrazolio giallo in un precipitato viola insolubile di

formazano.

La reazione di riduzione è attribuita all’attività glicolitica mitocondriale ed è un

processo dipendente dalla presenza di NADH e NADPH. Nelle cellule in attiva

proliferazione la conversione di MTT nella sua forma ridotta è rilevabile tramite

lettura spettrofotometrica ad una lunghezza d’onda di 540nm. Questo saggio è

impiegato per la valutazione del tasso di proliferazione cellulare, visto che la

quantità di formazano che si forma in seguito alla reazione mitocondriale è

proporzionale al numero di cellule sane e vitali nella popolazione esaminata.

Per valutare la riduzione mitocondriale dell’MTT, le cellule sono state seminate in

piastre a 96 pozzetti ad una concentrazione opportuna in volume di 100µl, a cui

sono stati aggiunti 100µl di una soluzione di whi-p-154 a concentrazione 1, 5, 20

o 50µM finali o una soluzione di mAb16-39 a concentrazioni di 0.1, 0.25, 0.5,

1µg/ml. Le cellule di controllo sono state mantenute in presenza di DMSO per

escludere ogni possibile tossicità attribuibile al solvente. Le piastre sono state

incubate a 37°C, e ad intervalli di 24 ore è stato aggiunto ad ogni pozzetto un

volume pari a 20µl di una soluzione di 5 mg/ml MTT. Le piastre sono state

incubate per 4 h a 37°C, per permettere l’incorporazione e la riduzione del sale di

tetrazolio, centrifugate per 5 min. a 1200 rpm e risospese in 150µl di DMSO, per

favorire la solubilizzazione dei cristalli di formazano. Le piastre sono state quindi

lasciate agitare per 30 minuti e quindi lette ad una lunghezza d’onda di 540nm

(Victor3 Multilabel Counter, PerkinElmer).

Nei grafici vengono riportati i valori medi di assorbanza di tre diversi esperimenti

o i rapporti tra i valori di assorbanza delle cellule mantenute in presenza ed in

assenza di whi-p-154 (A/A0: [A]/[A]ctr) che corrispondono alle medie di tre

esperimenti indipendenti.

25

3.4. Immunoblotting

Le cellule sono state seminate ad una opportuna concentrazione su piastre Petri da

60 o 100mm e successivamente trattate, con 17-DMAG (1µM), pleiotropina (5-

100ng/ml), midkine(1-100ng/ml), mAb16-39 (0.1-1µg/ml) e whi-p-154 (5-

50µM). Le cellule sono state lisate dopo abbondante lavaggio in PBS 1x e

risospese in 300-600µl di buffer di lisi (Tris-HCl 10mM, pH 7.5; NaCl 130mM;

1% TritonX-100; EDTA 5mM; BSA 1mg/ml; sodio fosfato 20mM, pH 7.5; sodio

pirofosfato 10mM, pH 7.0; glicerofosfato 25mM; sodio ortovanadato 1mM; sodio

molibdato 10mM; aprotinina 20µg/ml; leupeptina 20µg/ml; PMSF 1mM) ed

incubate in ghiaccio per 20 minuti. I lisati cellulari sono stati poi purificati

mediante centrifugazione a 4°C (14.000rpm per 30 min). Il surnatante rappresenta

il pool proteico cellulare rappresentativo sia della frazione citosolica che di quella

nucleare solubile. La concentrazione proteica è stata determinata mediante saggio

colorimetrico con BCA (acido bicinconinico), lettura spettrofotometrica a 540nm,

utilizzando l’albumina sierica bovina (2 mg/ml BSA) come standard di

riferimento. Una volta determinate le concentrazioni proteiche dei campioni, i

lisati proteici (la quantità di lisato proteico è indicato nelle figure), diluiti in

soluzione riducente RLB (Reducing Loading Buffer: DTT 77µg/ml; 1g/ml SDS;

50% glicerolo; 40% Tris-HCl 1M pH 6.8), sono stati separati su gel di

poliacrilamide (8-12% SDS-PAGE). In condizioni denaturanti riducenti infatti, le

proteine contenute negli estratti si separano lungo il gel esclusivamente in base al

loro peso molecolare, indipendentemente dalla loro carica o conformazione, e

proprio grazie a questo possono essere identificate.

Le proteine sono state poi trasferite over-night su membrana di nitrocellulosa

mantenendo all’interno della camera di trasferimento temperatura (4°C) e

voltaggio (50V) costanti. Le proteine cariche negativamente, per migrazione in

presenza di un campo elettrico, vengono trasferite su una membrana di

nitrocellulosa o PVDF, successivamente saturata in una soluzione bloccante di

latte deidratato privo di grassi al 5% (2 h) per evitare il legame aspecifico

dell’anticorpo con la superficie porosa della membrana. La membrana è stata

quindi lasciata ibridare con l’anticorpo specifico diretto contro la proteina di

interesse, diluito opportunamente in una soluzione di latte deidratato (Antibody

Solution costituita da 2.5% latte deidratato privo di grassi), per 1 h e 30 min.

seguita da abbondanti lavaggi in TNE 1x, per eliminare l’eccesso di anticorpo non

26

legatosi con la proteina. Per l’individuazione della proteina è stato poi impiegato

il metodo della chemiluminescenza. Questa metodologia si basa sull’utilizzo di

una perossidasi associata ad un anticorpo secondario che riconosce il frammento

cristallizzabile (Fc) della specie biologica dalla quale deriva l’anticorpo primario.

In presenza di perossido di idrogeno, la perossidasi catalizza l’ossidazione di un

diacil-idrazide ciclico creando un intermedio instabile che decade con l’emissione

di luce. Questa luminescenza può essere rilevata tramite l’esposizione di una

lastra per raggi-X poi processata con liquidi di sviluppo fotografico (reagenti di

fissaggio e sviluppo).

3.5 Immunoprecipitazione

Le cellule sono state seminate ad una opportuna concentrazione su piastre Petri da

60 o 100mm e successivamente trattate con 17-DMAG 1µM. Le cellule sono state

lisate come descritto nel paragrafo 3.4. L’immunoprecipitazione è stata eseguita

come riportato da Bonvini et al. nel 2002 [111]. Brevemente le proteine ottenute

vengono quantificate mediante saggio BCA e vengono immunoprecipitati 1 mg di

lisati proteici over-night a 4°C con 4µg di anticorpi specifici. Gli

immunocomplessi sono stati poi assorbiti con 30µl di protein G-Sepharose Fast

FlowTM per 2 h a 4°C e poi risospesi in RLB 1x (Reducing Loading Buffer) e

separati mediante SDS-PAGE. Successivamente è stato eseguito il western blot

utilizzando specifici anticorpi primari.

3.6 Analisi dei cicli cellulari mediante citometria a flusso

Per l’analisi del ciclo cellulare mediante citometria a flusso, le cellule sono state

seminate su piastre Petri da 60 o 100mm. Al termine di ogni trattamento, le cellule

sono state tripsinizzate, centrifugate (5 min.) a 1200 rpm, lavate per due volte in

PBS 1x e fissate in 1 ml di etanolo al 70% in H2O ultrapura. Dopo due lavaggi in

PBS 1x, le cellule sono state risospese in 500µl di PBS 1 x con 50 µg/ml di

propidio ioduro. L’analisi è stata effettuata al citofluorimetro FACS Calibur

(Becton Dickinson, USA).

Lo ioduro di propidio è un colorante di natura fenantridinica, che quando si

intercala al DNA a doppia elica, forma un complesso che emette una fluorescenza

rossa (Abs/Em, 560/680nm) se colpito da un fascio laser di eccitazione (laser ad

Argon, 488nm). Le cellule marcate con ioduro di propidio attraversano il fascio

27

laser e quando colpite dal laser emettono un segnale di luce diffusa ed un segnale

di fluorescenza rossa che viene raccolto dallo strumento e riportato in una scala

arbitraria di intensità di fluorescenza. Il citofluorimetro acquisisce all’interno del

campione un numero elevato di cellule marcate, dell’ordine di 1x106, garantendo

un’elevata validità statistica. Il risultato è una distribuzione del numero di cellule

rispetto all’intensità di fluorescenza che è direttamente proporzionale al loro

contenuto di DNA (“istogramma di DNA”). L’istogramma di DNA consente una

quantificazione della percentuale di cellule in una data fase del ciclo cellulare,

sfruttando il diverso contenuto di DNA delle cellule nelle fasi G1, S, G2/M.

L’analisi viene effettuata con l’ausilio di un software che permette di dividere

l’insieme dei segnali in tre parti fondamentali: due gaussiane, G1 e G2/M, e una

intermedia, costituente la fase S, fornendo le percentuali di cellule nelle diverse

fasi (%G1, %S, %G2 /M).

3.7 Saggi di invasività e migrazione

La capacità di invasione delle linee cellulari in studio è stata valutata seminando le

cellule alle seguenti densità: 1x105 RH30, 2x106 LAN5, in terreno privo di FCS

in piccoli inserti il cui fondo era costituito da una membrana semipermeabile

coattata sul lato interno con MatrigelTM (Becton Dickinson FalconTM, Belgio).

Tale membrana è stata prima reidratata per 2h a 37°C con terreno puro. Questi

cestelli sono stati posizionati in piastre da 24 pozzetti in cui era stato messo

terreno senza siero o addizionato con FCS 10% con/senza mAb16-39 0.5µg/mL

per 16h a 37°C in atmosfera umidificata con CO2 al 5%. Le cellule in grado di

invadere il Matrigel vengono attratte per chemiotassi nel pozzetto sottostante e

possono essere fissate in glutaraldeide 2,5% in acqua ultrapura per 20 min..

Successivamente vengono colorate con cristallo di violetto 0.2% in metanolo 20%

per 20 min., lavate con PBS 1x ed asciugate. Alla fine sono state osservate con il

microscopio a contrasto di fase DM IRB (Leica, Germania) ed è stata eseguita la

conta delle cellule migrate.

Per il saggio di migrazione, le cellule sono state seminate alle stesse densità sopra

riportate in terreno privo di FCS su inserti il cui fondo era costituito da una

membrana semipermeabile con pori di 8µm (Becton Dickinson FalconTM, Belgio).

I cestelli sono stati posizionati in piastre da 24 pozzetti in cui era stato messo

terreno senza siero o addizionato con FCS 10% con/senza mAb16-39 0.5µg/mL

28

per 16h a 37°C in atmosfera umidificata con CO2 al 5%. Le cellule migrate

vengono fissate, colorate e visualizzate come per il saggio dell’invasività.

3.8 Saggio “Wound Healing”

Le cellule sono state seminate in piastre da 6 pozzetti e lasciate crescere per 48h.

Quando confluenti, le cellule sono state incubate per 24h con terreno privo di FCS

e successivamente grattate con un puntale eppendorf da 1000 al centro del

pozzetto. Sono stati eseguiti una serie di lavaggi con terreno senza siero per

eliminare le cellule che si sono staccate. Sono stati eseguiti i trattamenti con

mAb16-39 (0-100ng/ml), HGF (0-100ng/ml) e whi-p-154 (0-50µM) con/senza

10% di siero e quindi le cellule sono state fotografate al tempo 0, e poi a 24, 48 e

72h.

3.9 PCR, Polymerase Chain Reaction

Il DNA delle linee cellulari è stato estratto mediante TRIzol (Invitrogen)

seguendo il protocollo fornito dalla ditta. L’amplificazione della regione

extracellulare (esoni 1-3, 154bp, ALK-1) e della porzione intracitoplasmatica

(esoni 20-22, 146bp, ALK-2) è stata eseguita secondo quanto riportato

precedentemente [112]. In particolare, i primers utilizzati sono:

- ALK-1 reverse: 5’-GGAAGTCAAAGCTGCACTCC-3’;

- ALK-1 forward: 5’-TTCGGGACTGGTCATAGCTC-3’;

- ALK-2 reverse: 5’-TCGTCCTGTTCAGAGCACAC-3’;

- ALK-2 forward: 5’-CGGAAAAACATCACCCTCAT-3’.

Il programma di amplificazione è il seguente:

1. 95°C 10 min

2. 94°C 30 sec

3. 60°C 30 sec

4. 72°C 30 sec

5. 72°C 10 min

I passaggi 2,3 e 4 sono stati ripetuti per 40 cicli.

I prodotti di reazione della PCR sono stati separati su gel di agarosio al 2% e la

loro dimensione viene determinata attraverso la comparazione con il Marker VI

(Roche, Milano, Italia).

29

3.10 RT-qPCR

La Real Time PCR quantitativa permette di quantificare i prodotti di

amplificazione durante ogni ciclo di reazione a catena della polimerasi, che sono

direttamente proporzionali alla quantità di templato iniziali.

L’espressione totale di ALK è stata analizzata utilizzando la real-time PCR

(ViiA7, Applied Biosystems, USA) con metodica di rilevazione dell’amplificato

che si basa sull’utilizzo del Sybr Green (Applied Biosystems). Questo metodo si

basa sul legame di questa molecola sul solco minore del DNA. L’aumento della

fluorescenza durante l’elongazione è proporzionale all’aumento del numero di

copie degli ampliconi. Come gene di riferimento per la normalizzazione dei dati è

stato utilizzato il gene GAPDH e la reazione di amplificazione per ogni campione

è stata effettuata in triplicato. I primers utilizzati sono riportati in Tabella 1. Le

sonde per ALK sono state designate tra l’esone 20 e 22 della regione

intracitoplasmatica.

GAPDH Primer forward: 5’-TCCTCTGACTTCAACAGCGA-3’

Primer reverse: 5’-GGGTCTTACTCCTTGGAGGC-3’

ALK-2 Primer forward: 5’-CGGAAAAACATCACCCTCAT-3’

Primer reverse: 5’-GGAAGTCAAAGCTGCACTCC-3’

Tabella 1. Sequenze dei primers utilizzati in PCR quantitativa.

La reazione di amplificazione è stata ottenuta mediante una miscela costituita da:

2X Master Mix; 900nM primer forward; 900nM primer reverse; 50ng cDNA e

acqua ultrapura. Totale volume di reazione 25µl.

Il ciclo di amplificazione è il seguente:

1. 50°C 2 min

2. 95°C 10 sec

3. 95°C 15 sec

4. 60°C 1 min

I passaggi 3 e 4 vengono ripetuti per 40 cicli.

Al termine dei 40 cicli è stato effettuato il protocollo di dissociazione che rivela la

presenza di amplificati aspecifici come eventuali contaminazioni di DNA o dimeri

di primers (95°C per 15 sec; 60°C per 1 min; 95°C per 15 sec).

30

Il software presente nello strumento traccia l’amplification plot, cioè un grafico in

cui in ascissa si trova il numero dei cicli ed in ordinata il segnale di fluorescenza.

Nei primi cicli di PCR si assiste ad un piccolo cambiamento nel segnale di

fluorescenza e ciò definisce la baseline dell’amplification plot. L’aumento della

fluorescenza che si ottiene oltre la baseline dipende dalla quantità di prodotti di

PCR che si sono accumulati. Un parametro importante in questo tipo di analisi è il

ciclo soglia Ct (threshold Cycle), che corrisponde al numero di cicli in cui

l’intensità di fluorescenza supera il valore soglia. Un valore di Ct piccolo indica

un precoce incremento della fluorescenza e che la sequenza bersaglio è

abbondante. Per poter poi associare ad un valore di Ct una determinata quantità di

target è necessario creare una curva standard in modo che a quantità note di target,

venga fatto corrispondere un particolare valore di Ct.

In questo studio, è stata adottata la quantificazione relativa dei geni target (ALK

in linee cellulari tumorali) rispetto ai campioni di riferimento (muscolo scheletrico

fetale) normalizzando i valori di amplificazione per un gene costitutivamente

espresso (GAPDH). Per poi ottenere il rapporto di espressione dei campioni target

rispetto al campione di riferimento si è utilizzato il modello matematico

comparativo del ∆∆CT. Brevemente:

Cttarget gene-Ctcontrollo endogeno=∆Ct

∆Ct- ∆Ctcalibratore=∆∆Ct

FC=2-∆∆Ct

Dove: Cttarget gene indica threshold Cycle o ciclo soglia del gene target, ossia di

ALK2; Ctcontrollo endogeno indica ciclo soglia di GAPDH; ∆Ctcalibratore: ciclo soglia del

controllo non trattato; FC: Fold Change, variazione di espressione del gene target

rispetto al calibratore.

31

4. RISULTATI

4.1 Espressione di ALK nelle linee cellulari di RMS.

Per valutare l’espressione del recettore ALK in cellule di rabdomiosarcoma [113],

sono state utilizzate 9 linee cellulari di RMS, 5 alveolari (RH30, RH28, RH4,

RC2, RH18) e 4 embrionali (RD, CCA, SMS-CTR, RH36), la quale è stata

successivamente confrontata con l’espressione di ALK nelle linee cellulari di

neuroblastoma (LAN5, IMR32), medulloblastoma (DAOY), sarcoma di Ewing

(TC32, TC106), linfoma ALCL (Karpas-299) e leucemia (CEM, DG75, K652).

Per valutare l’espressione del gene ALK e di eventuali varianti tronche, derivanti

da riarrangiamenti cromosomici, è stata eseguita l’amplificazione sia di regioni

codificanti la porzione extracellulare che del dominio chinasico intracellulare

usando primers in grado di amplificare gli esoni 1-3 e 20-22, rispettivamente.

Tutte le linee cellulari di RMS mostrano espressione del trascritto di ALK, sia

della porzione extra- che intracellulare, indipendentemente dal sottotipo istologico

e dalla presenza della proteina di fusione PAX3/7-FKHR (figura 9A). Il trascritto

di ALK risulta espresso anche in linee di neuroblastoma, di medulloblastoma e di

linfoma ALCL, mentre le cellule di linfoma ALCL (Karpas-299) sono le uniche a

presentare amplificazione solo della regione citoplasmatica vista l’espressione

della proteina NPM-ALK. Per quantificare il livello di trascritto di ALK, è stata

quindi eseguita una RT-qPCR quantitativa nelle stesse linee cellulari (figura 9B),

che ha dimostrato come le cellule di RMS che esprimono PAX-FKHR presentano

livelli di espressione di ALK maggiori rispetto alle cellule PAX-FKHR- ed in

come riportato nel grafico della figura 9C e confermata dall’analisi statistica

(Mann-Whitney test, p=0.032).

32

A

ALK-1

ALK-2

β2-microglobulina

Kar

pas-

299

RH

30R

H4

RC

2R

H28

RD

SM

S-C

TR

CC

AR

H36

RH

18

LAN

5IM

R32

TC

32T

C10

6D

AO

Yk5

62D

G75

CE

M

ALC

L

RMS+ RMS- NB MS

F

EWS MB LC

0

1000

2000

3000

4000

RMS+ RMS- MSF ALTRO

espr

essi

one

rela

tiva

ALK

Cp=0.036

p=0.032

p=0.057

RH

30

RH

4

RH

28

RC

2

RH

18 RD

RH

36

CC

A

SM

S-C

TR

LAN

5

IMR

32

DA

OY

TC

32

TC

106

K56

2

DG

75

CE

M

KA

RP

AS

MS

F

espr

essi

one

rela

tiva

ALK

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000B

ARMS NB MBERMS EWS LC ALCLA/N

A

ALK-1

ALK-2

β2-microglobulina

Kar

pas-

299

RH

30R

H4

RC

2R

H28

RD

SM

S-C

TR

CC

AR

H36

RH

18

LAN

5IM

R32

TC

32T

C10

6D

AO

Yk5

62D

G75

CE

M

ALC

L

RMS+ RMS- NB MS

F

EWS MB LC

0

1000

2000

3000

4000

RMS+ RMS- MSF ALTRO

espr

essi

one

rela

tiva

ALK

Cp=0.036

p=0.032

p=0.057

RH

30

RH

4

RH

28

RC

2

RH

18 RD

RH

36

CC

A

SM

S-C

TR

LAN

5

IMR

32

DA

OY

TC

32

TC

106

K56

2

DG

75

CE

M

KA

RP

AS

MS

F

espr

essi

one

rela

tiva

ALK

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000B

ARMS NB MBERMS EWS LC ALCLA/N

Figura 9. Espressione di ALK in linee cellulari di RMS. A: l’espressione di ALK è stata valutata usando primers che amplificano la regione extracellulare (ALK-1) e la regione citoplasmatica (ALK-2) del gene ALK. E’ stato scelto come gene housekeeping β2-microglobulina. B: espressione relativa di ALK misurata tramite RT-qPCR normalizzata al GAPDH. C: medie delle espressioni relative di ALK. I valori dei P sono stati calcolati mediante il test Mann-Whitney. ARMS: rabdomiosarcoma alveolare; ERMS: rabdomiosarcoma embrionale; ALCL: anaplastic large cell lymphoma; A/N: non ARMS; RMS+: RMS PAX-FKHR positivi, RMS-: RMS PAX-FKHR negativi; NB: neuroblastoma; MSF: muscolo scheletrico fetale; LC: leucemia; EWS: sarcoma di Ewing; MB: medulloblastoma. Sono stati quindi valutati i livelli di espressione proteica di ALK mediante

western blotting, utilizzando anticorpi diretti contro la porzione intracellulare del

recettore. Come riportato in figura 10, le linee cellulare di RMS alveolare che

esprimono PAX-FKHR presentano una banda di maggiore intensità rispetto alle

linee di RMS alveolare non traslocate e a quelle di RMS embrionali. In

particolare, RH30 e RH28 mostrano livelli di espressione proteica particolarmente

elevati, in accordo con quanto osservato a livello trascrizionale (figura 9B).

33

RH

30

RH

4

RC

2

RH

28

RD

SM

S-C

TR

CC

A

RH

36

RH

18

αALKc

αALK 1359-1466

β-actina

RH

30

RH

4

RC

2

RH

28

RD

SM

S-C

TR

CC

A

RH

36

RH

18

αALKc

αALK 1359-1466

β-actina

Figura 10. Espressione proteica di ALK in linee cellulari di RMS. Western blotting per valutare l’espressione proteica di ALK. Le proteine (60µg) sono state separate in condizioni denaturanti mediante SDS-PAGE e trasferite su membrana di nitrocellulosa. ALK è stato visualizzato mediante immunoblotting usando due anticorpi specifici per la porzione intracitoplasmatica del recettore. Come controllo del caricamento è stata utilizzata β-actina. ALK, quando espresso nei RMS, non risulta costitutivamente attivo, a differenza

di NPM-ALK negli ALCL [41, 42], dato che la sua attivazione necessita di una

dimerizzazione ligando-dipendente. A tal scopo abbiamo valutato il grado di

fosforilazione di ALK, mediante immunoprecipitazione e western blotting, con

anticorpi specifici per la forma fosforilata del recettore e dimostrando che ALK

non risulta fosforilato nelle cellule di RMS (p-ALK). Ciò suggerisce l’esistenza di

meccanismi diversi da mutazioni puntiformi attivanti o loop autocrino che

possono regolare la sua attivazione in questo tumore (figura 11).

ALK

NPM-ALK

p-ALK

p-NPM-ALK

KA

RP

AS

-299

LAN

5

RH

30

RD

RH

4

RH

36

SM

S-C

TR

CC

A

LAN

5 *

IP: ALK

ALK

NPM-ALK

p-ALK

p-NPM-ALK

KA

RP

AS

-299

LAN

5

RH

30

RD

RH

4

RH

36

SM

S-C

TR

CC

A

LAN

5 *

IP: ALK

Figura 11. Attivazione di ALK in linee di RMS. Per valutare lo stato di attivazione di ALK vengono immunoprecipitati 1 mg di lisati proteici over-night a 4°C con 4 µg di anticorpo anti-ALK. Le membrane di nitrocellulosa vengono successivamente incubate con anticorpi specifici per la forma totale (pannello superiore) e per la forma fosforilata (pannello inferiore) di ALK. LAN5*: lisato proteico totale, non sottoposto ad immunoprecipitazione.

34

Successivamente è stata valutato se l’espressione del recettore potesse dipendere

dall’interazione con le proteine Heat Shock 90 e 70 (HSP90 e HSP70), le quali

appartengono alla famiglia delle proteine chaperone e svolgono un importante

ruolo nella stabilizzazione e degradazione di diverse chinasi, come NPM-ALK e

EML4-ALK [111]. Come riportato in letteratura, l’inibizione di HSP90 nei

linfomi ALCL, mediata da 17-allylamino,17-demetossigeldanamicina (17-AAG),

determina una diminuzione dell’espressione di NPM-ALK che è associata ad una

rapida degradazione proteosomica della proteina stessa [111] [114]. In questo

studio abbiamo quindi valutato l’attività di 17-DMAG, un derivato più solubile di

17-AAG, sulle linee di RMS per verificare l’effetto sull’espressione della proteina

ALK. Come si può osservare in figura 12, ALK è associato ad HSP90 in

condizioni normali, mentre in presenza di 17-DMAG l’interazione tra le due

proteine viene inibita dal farmaco ed ALK si associa ad HSP70 prima della sua

degradazione proteosomale (figura 12B). Inoltre il pre-trattamento con 17-DMAG

determina la degradazione di ALK ed un aumento di HSP70, come visibile in

figura 12C. Tutto ciò conferma che ALK è una proteina che dipende da HSP90

per una corretta maturazione ed espressione, e, la degradazione del recettore

indotta da 17-DMAG, è conseguenza dell’inibizione di HSP90 nelle medesime

condizioni sperimentali [111, 114].

35

IP: HSP90

WB: ALK

RH30ct

r

17-d

g

ctr

ctr

LAN5 Karpas-299

Kar

pas-

299

*

A

17-d

g

17-d

g

17-d

gB

Karpas-299 LAN5 RH30

ctr

ctr

ctr

RH

30 *

17-d

g

IP: HSP70

WB: ALK

17-d

g

ALK

NPM-ALK

ALK

NPM-ALK

ALK

ctr

17-d

g

HSP70

ctr

17-d

g

RH30 LAN5

β-actina

C

Figura 12. Effetti del 17-DMAG sullo stato di ALK. A,B: Per valutare lo stato di attivazione di ALK vengono immunoprecipitati 1 mg di lisati proteici over-night a 4°C con 4 µg di anticorpo anti-HSP90 (A) o anti-HSP70 (B). Le membrane di nitrocellulosa vengono successivamente marcate con anticorpi specifici per la forma totale di ALK. C: western blotting per valutare l’espressione di ALK e HSP70 dopo trattamento con 17-DMAG 1µM per 16 ore. Come controllo del caricamento è stata utilizzata β-actina. Ctr: controllo; 17-dg: 17-DMAG; 9D2: clone 9D2 dell’anticorpo anti-HSP90; RH30*, Karpas-299*: lisato proteico totale, non sottoposto ad immunoprecipitazione.

4.2 Attivazione di ALK

La dimerizzazione ligando-dipendente è uno dei requisiti fondamentali per

l’attivazione di recettori tirosin-chinasici, anche se studi recenti hanno dimostrato

che alterazioni cromosomiche, come mutazioni puntiformi o amplificazioni

geniche, possono determinarne l’attivazione prescindendo dall’interazione con i

ligandi [77, 90].

Abbiamo quindi valutato se l’attivazione di ALK nelle cellule di RMS potesse

dipendere dalla somministrazione di pleiotropina (PTN) e midkine (MK), come

riportato recentemente in altri modelli cellulari tumorali [65, 66](figura 13).

36

CT

R

5 10 50

100

1 10

100

PTN MK

ng/mL

p-ALK

ALK

RH4

AKT

p-AKT

RH30

CT

R

5 10

50 100

1 10 100

PTN MK

ng/mL

p-ALK

ALK

AKT

p-AKT

β-actinaβ-actina

A B

p-ALK

ALK

AKT

p-AKT

β-actina

CT

R

5 10 50 100

1 10

PTN MK

ng/mLLAN5

C10

0

CT

R

5 10 50

100

1 10

100

PTN MK

ng/mL

p-ALK

ALK

RH4

AKT

p-AKT

RH30

CT

R

5 10

50 100

1 10 100

PTN MK

ng/mL

p-ALK

ALK

AKT

p-AKT

β-actinaβ-actina

A B

p-ALK

ALK

AKT

p-AKT

β-actina

CT

R

5 10 50 100

1 10

PTN MK

ng/mLLAN5

C10

0

Figura 13. Stimolazione di ALK mediante pleiotropina e midkine. Le linee cellulari RH4, RH30 e LAN5 sono state esposte 30 minuti a dosi crescenti di PTN (5-100 ng/ml) e di MK (1-100 ng/mL). Sono stati caricati 50µg di lisati proteici. Sono riportati gli immunoblotting per p-ALK, ALK, p-AKT, AKT. Come controllo di caricamento è stato utilizzata β-actina. Come si può vedere dalla figura 13, pleiotropina e midkine non sono in grado di

stimolare l’attivazione di ALK e le vie di segnale ad esso associate. Infatti non si

notano né la fosforilazione del recettore (p-ALK) né quella di AKT. Queste

osservazioni sono in linea con quanto già riportato in letteratura, dove si dimostra

come PTN e MK attivino ALK non per un diretto legame col recettore, ma previa

inibizione della protein-tirosina fosfatasi β/ζ (RPTP β/ζ) che in condizioni normali

mantiene ALK nella sua forma inattiva defosforilata [78]. In alternativa la

stimolazione di ALK può essere ottenuta mediante anticorpi monoclonali agonisti,

come dimostrato in cellule di neuroblastoma [110]. Come si evince dalla figura

14, l’anticorpo mAb16-39 induce, nelle cellule di rabdomiosarcoma (RH30) e di

neuroblastoma (LAN5), la fosforilazione di ALK ed ERK, una serin-treonin

chinasi critica per la proliferazione di diversi istotipi tumorali. Tuttavia le deboli

bande che si osservano in assenza di mAb16-39 suggeriscono uno stato basale di

fosforilazione che potrebbe dipendere da altri meccanismi che coinvolgono altri

37

ligandi. In cellule di RMS embrionale che presentano una minor espressione del

recettore, invece, non si osserva l’attivazione di ERK, a conferma della specificità

dell’anticorpo per il recettore ALK.

RH30 RD LAN5

CT

R

PT

N 2

.5

CT

R

CT

R

PT

N 5

mA

b0.

1

mA

b1

PT

N 2

.5

PT

N 5

mA

b0.

1

mA

b1

mA

b1

mA

b0.

1

PT

N 5

PT

N 2

.5

p-ALK

p-ERK

β-actina

Figura 14. Confronto della stimolazione di ALK mediante PTN e mAb16-39. Le linee cellulari RD (0.35x106), RH30 (0.35x106) e LAN5 (1.2x106) sono state mantenute per 48h in terreno privo di FCS; sono state esposte per 30 minuti a PTN (2.5 e 5 ng/ml) e a mAb16-39 (0.1 e 1 µg/mL). Sono stati caricati 50µg di lisati proteici. Sono riportati gli immunoblotting per p-ALK, p-ERK. Come controllo di caricamento è stato utilizzata β-actina.

L’espressione e l’attivazione del recettore ALK sono state quindi valutate in

presenza di concentrazioni crescenti di mAb-16-39 e correlate con l’espressione e

l’attività di proteine critiche per la sopravvivenza delle cellule tumorali. Come si

osserva in figura 15A, l’attivazione di AKT (p-AKT) e di ERK (p-ERK) è

strettamente associata all’attivazione di ALK in presenza dell’anticorpo agonista

mAb16-39 in cellule che esprimono livelli alti o abbastanza alti di recettore

(LAN5 e RH30), ma non nelle cellule in cui l’espressione di ALK è bassa (RH4)

o nulla (RD). Inoltre la stimolazione di ALK risulta estremamente rapida (figura

15B), come per ERK e AKT. Nello specifico si raggiunge un massimo

dell’attività di ALK appena dopo 15-30 minuti dall’aggiunta dell’anticorpo

agonista e tale effetto è visibile con la più bassa concentrazione di mAb16-39

(0.1µg/ml). In conclusione la stimolazione di ALK con questo anticorpo ha

confermato che le principali vie di segnale sono ERK1/2 e AKT, come dimostrato

nel neuroblastoma [110], e data l’attività svolta da queste molecole si potrebbe

ipotizzare che ALK abbia un ruolo nella proliferazione e sopravvivenza cellulare

anche in questo tipo di tumori.

38

p-AKT

β-actina

p-ERK

0 5’ 15

’

30’

60’

6h 24h

LAN5

0 5’ 15

’

30’

60’

6h 24h

RH30

ERK

AKT

ALK

p-ALK

A

ALK

p-ALK

p-AKT

AKT

p-ERK

ERK

β-actina

0 0.1

0.25

0.5

1

LAN5

B

0 0.1

0.25

0.5

1

RH30

0 0.1

0.5

0.25

1

RH4

p-ALK

p-ERK

β-actina

p-AKT

ALK

µg/ml

0 30’

60’

6h 24h

RH4

mAb16-39 1 µg/ml

p-ALK

p-AKT

p-ERK

β-actina

ALK

0 0.1

1

RD

µg/mlµg/mlµg/ml

Figura 15. Stimolazione di ALK mediante mAb16-39 dose e tempo dipendente. Le linee cellulari RD (0.35x106), RH30 (0.35x106), RH4 (0.5x106) e LAN5 (1.2x106) sono state mantenute per 48h in terreno privo di FCS. Le cellule sono state trattate con dosi crescenti di anticorpo monoclonale (0.1-1µg/ml) (A) o per tempi diversi 0.1µg/ml (5 minuti-24 ore) (B). Sono riportati gli immunoblotting per p-ALK/ALK, p-ERK/ERK, p-AKT/AKT. Come controllo di caricamento è stata utilizzata β-actina. Infine, per verificare se l’attivazione del recettore fosse associata ad un aumento

della sua trascrizione, i livelli di mRNA di ALK sono stati quantificati mediante

real-time PCR quantitativa in presenza o assenza di mAb16-39. Come si può

osservare dalla figura 16, la somministrazione dell’anticorpo agonista non

determina un aumento della trascrizione di ALK indipendentemente dalla

presenza o assenza di siero, in accordo con lo stato stazionario della proteina nelle

medesime condizioni sperimentali (figura 15A). Quindi si evince che la

stimolazione mediata di ALK determina effetti diretti sulla fosforilazione della

chinasi e delle sue molecole segnale, ma non determina aumento della sua

trascrizione.

39

RH30

0

200

400

600

800

1000

1200

no FCS 10% FCS MSF

espr

essi

one

rela

tiva

ALK

ctr

mAb16-39

LAN5

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

no FCS 10% FCS MSF

espr

essi

one

rela

tiva

ALK

ctr

mAb16-39

RH30

0

200

400

600

800

1000

1200

no FCS 10% FCS MSF

espr

essi

one

rela

tiva

ALK

ctr

mAb16-39

LAN5

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

no FCS 10% FCS MSF

espr

essi

one

rela

tiva

ALK

ctr

mAb16-39

Figura 16. Induzione di ALK dopo stimolazione con mAb16-39. Espressione di ALK mRNA in RH30 (ARMS) e LAN5 (neuroblastoma) misurata mediante RT-qPCR dopo stimolazione con mAb16-39 0.5µg/ml per 15 min. MSF: muscolo scheletrico fetale usato come gene housekeeping.

4.3 Ruolo di ALK nel RMS

Al fine di valutare l’attività mitogena di ALK, le linee cellulari RH30 e LAN5, le

quali si sono dimostrate più sensibili al trattamento con mAb16-39, sono state

utilizzate in saggi di proliferazione in assenza o presenza dell’anticorpo agonista.

Le cellule, mantenute in condizioni standard di coltura ed in fase di crescita

esponenziale, son