Rivista di Medicina Veterinaria, vol. 46, n. 1, 2012

RIASSUNTO

Nella maggior parte delle specie animali l’attività riproduttiva è go-vernata dalle variazioni stagionali nella frequenza del concepimen-to. Il fotoperiodismo, mediante il ritmo circadiano della melatonina,registra i cambiamenti della lunghezza del giorno nel ciclo annua-le, e questo segnale viene utilizzato per sincronizzare le fluttuazio-ni stagionali della riproduzione. Alcune razze di pecore sono alta-mente stagionali in termini di capacità riproduttiva, regolata dal fo-toperiodo e dalla secrezione di melatonina. Pertanto, le variazionistagionali nella secrezione di melatonina sono state accuratamen-te studiate in questa specie, e anche se la stagionalità è meno mar-cata nei maschi che nelle femmine sono state segnalate variazionidel volume testicolare, dei profili ormonali, del comportamentosessuale e della qualità dello sperma che influenzano la performan-ce riproduttiva dei montoni. Questo studio ha lo scopo di determi-nare se l’utilizzo dell’impianto di melatonina negli arieti durante lastagione riproduttiva, possa influenzare il modello di crescita delleghiandole riproduttive accessorie. Sono stati utilizzati un totale di37 montoni di razza Sarda (1,5 - 8 anni di età), provenienti da tre di-versi allevamenti situati nel Nord della Sardegna. I montoni sonostati assegnati in modo casuale ai due gruppi sperimentali: 21montoni hanno ricevuto 3 impianti sottocutanei di 18 mg di mela-tonina ciascuno, mentre gli altri 16 montoni sono stati utilizzati co-me controlli non trattati. Il modello di crescita delle ghiandole ac-cessorie è stato valutato a 0, 26 e 46 giorni dopo il trattamento me-diante ultrasonografia transrettale. Nel corso della prova, sia laghiandola di Cowper che le ghiandole vescicolari sono aumentatesignificativamente nei montoni trattati con melatonina, raggiun-gendo volumi più elevati sia a 26 che a 46 giorni dall’inizio del trat-tamento rispetto al gruppo di controllo. Inoltre, dopo 46 giorni dal-l’inizio del trattamento i diametri testicolare e scrotale hanno rag-giunto valori maggiori nel gruppo trattato con melatonina rispettoai controlli. In conclusione, la somministrazione di melatonina neimontoni ha mostrato di migliorare i modelli di crescita sia delle go-nadi che delle ghiandole accessorie riproduttive, probabilmente acausa dell’aumento dei livelli plasmatici di testosterone.

Impianto di melatonina nell’ariete: aumento del diametro testicolare e accrescimentodelle ghiandole sessuali accessorieA. Spezzigu1, F. Berlinguer2, S. Muntoni3, D. Bizzarri3

1 Veterinario libero professionista, PhD, Perfugas (SS)2 Dipartimento di Medicina Veterinaria, Università degli studi di Sassari3 CEVA Salute Animale

SUMMARY

In most of the animal species the reproductive activity is gover-ned by seasonal variations in the frequency of conception. Photo-periodism via the circadian melatonin rhythm registers changes inthe annual cycle of day-length, and this signal is used to synchro-nize seasonal reproductive fluctuations. Certain breeds of sheepare highly seasonal in terms of reproductive capability, regulatedby photoperiod and melatonin secretion. Therefore, seasonal me-latonin variation has been thoroughly studied in this species, andalthough seasonality is less marked in males than in females chan-ges in testicular volume, hormonal profiles, sexual behavior, andsemen quality that affect the reproductive performance of ramshave been reported. Aim of this study was to determine if mela-tonin implantation to rams in the non breeding season could in-fluence the growth pattern of the reproductive accessory glands.A total of 37 Sarda rams (1.5 - 8 years of age) from three differentfarms located in North Sardinia were used. Rams were randomlyassigned to two experimental groups: 21 rams received 3 subcu-taneous implants of 18 mg of melatonin each, while 16 rams we-re used as not treated controls. The growth pattern of the acces-sory glands was assessed at 0, 26 and 46 days after treatment bytransrectal ultrasonographies. Both the Cowper’s gland and thevescicular glands increases significantly during the experimentalperiod in the melatonin treated rams reaching higher volumes atboth 26 and 46 days after treatment compared to the controlgroup. In addition, testicular and scrotal diameters reached highervalues after 46 days from treatment in the melatonin group ascompared to the control one. It was concluded that melatonin ad-ministration to rams enhanced the growth patterns of both thegonads and the reproductive accessory glands, likely by increa-sing testosterone plasma levels.

KEYWORDS

Melatonin, Ram fertility, ultrasound, bulbo urethral gland, vescicu-lar gland.

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A. Spezzigu

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INTRODUZIONE

La melatonina, molecola molto diffusa in natura, è presente nei bat-teri, negli organismi unicellulari eucarioti, nelle macroalghe, in mol-te piante e in molte specie di invertebrati e vertebrati (1). La mela-tonina trova largo impiego nella medicina cinese con più di 60 cita-zioni contenute in preparati medicinali a base di erbe indicati per lacura dell’invecchiamento (2). La molecola inoltre è presente in ele-vate quantità in diverse piante dell’area alpina e mediterranea chesono esposte ad alti livelli di raggi UV. La melatonina svolge diverseazioni fisiologiche segnalando all’organismo non solo il momentodel giorno e dell’anno, ma sviluppando anche un’azione citoprotet-tiva come antiossidante, svolge inoltre azioni antioncotica, immu-nomodulatrice, ipnotica e antidepressiva, interviene sul metaboli-smo osseo e nelle affezioni cardiovascolari e infine sulla maturazio-ne sessuale e sulla regolazione dell’attività riproduttiva.Precursore endogeno della melatonina è la serotonina o 5-idrossi-triptamina (5-HT): negli animali superiori la biosintesi della 5-HT en-dogena avviene a partire dall’amminoacido essenziale L-triptofanoattraverso due reazioni enzimatiche sequenziali: a) idrossilazione a5-idrossitriptofano ad opera della triptofano-5-idrossilasi, b) decar-bossilazione del 5-idrossitriptofano a 5-HT per intervento di unadecarbossilasi. La serotonina, che ha implicazioni sull’attività degliindividui e sulla riproduzione, viene quindi trasformata in acetil-se-rotonina, che rappresenta la molecola limitante la sintesi della me-latonina, e infine, in seguito all’azione di una idrossi-indolemetil-transferasi, convertita a melatonina. La sintesi avviene a livello del-la ghiandola pineale mediante un’attività ritmica circadiana con unalto livello durante la notte e un basso livello diurno (3). Tuttavia, lacapacità di sintesi dell’ormone è presente anche in altri distretti, efra questi il tratto gastro-intestinale ha un ruolo di primo piano mo-strando livelli centinaia di volte superiori alla ghiandola pineale.La regolazione biosintetica della melatonina da parte della pineale,viene mediata dal tratto retino-ipotalamico che proietta gli impul-si provenienti dalla retina al nucleo soprachiasmatico. Speciali foto-recettori retinici contengono la melapsina e sono coinvolti in que-sta proiezione. Attraverso il nucleo paraventricolare, le fibre passa-no dal SNC e mediante una serie di tappe intermedie arrivano allefibre simpatiche pregangliari del ganglio cervicale superiore. Le fi-bre del ganglio cervicale superiore terminano successivamente suipinealociti dell’epifisi e regolano, mediante la liberazione di nor-adrenalina, la liberazione della melatonina. Il rilascio della nor-adre-nalina avviene durante la notte, la nor-adrenalina si lega ad un re-cettore beta adrenergico che attivando l’adenilciclasi innesca lareazione a cascata nella cellula mediante un sistema delle Gs pro-teine. Durante il giorno l’attività elettrica del SNC è elevata ed inqueste condizioni il rilascio della nor-adrenalina è limitato.Il successo riproduttivo di molte specie animali è garantito dall’an-damento sincrono tra attività sessuale e le variazioni climatiche sta-

gionali. Tale andamento dei processi riproduttivi fa sì che il parto ela crescita dei piccoli avvenga in un periodo dell’anno, solitamentein primavera, quando le temperature ambientali e la disponibilitàdel cibo sono ottimali sia per la vita del neonato che per la produ-zione lattea della madre (4).Il fattore ambientale maggiormente coinvolto in questo controllo èil fotoperiodo, in quanto, a latitudini temperate (tra 30° e 60° di lati-tudine Nord), è il segnale più attendibile delle variazioni stagionali.La Sardegna si trova nella parte bassa della zona temperata borealeed è compresa tra i 38° 51’ 52” e i 41° 15’ 42” di latitudine Nord e tragli 8° 8’ 10” e 9° 50’ 8” di longitudine Est. Nelle differenti specie, il fo-toperiodo agisce in modo diverso nel regolare l’attività riproduttiva.Una delle principali caratteristiche della riproduzione ovi-caprina èla stagionalità, infatti, la pecora e la capra sono delle specie polie-strali stagionali che alternano periodi di anaestro a quelli di attivitàsessuale. Nelle regioni temperate, come già asserito, la stagionalitàè regolata dal fotoperiodo, ossia dalla durata delle ore di luce nel-l’ambito della giornata. Riducendo le ore di luce si stimola l’attivitàsessuale mentre aumentando le ore di luce, si induce l’anaestro. Ipiccoli ruminanti vengono quindi definiti come specie a fotoperio-do decrescente oppure col termine anglosassone di short daybree-ders. Ovviamente la stagionalità riproduttiva non è prerogativa solodei piccoli ruminanti ma anche degli equidi e dei roditori, con la dif-ferenza che questi ultimi sono dei long daybreeders ossia iniziano laloro stagione riproduttiva in concomitanza dell’aumento delle oredi luce giornaliere, hanno cioè un fotoperiodo crescente.

SCOPO DEL LAVORO

Ad oggi sono presenti numerosi studi relativi a diverse razze di peco-re che dimostrano l’efficacia della somministrazione esogena di mela-tonina nell’accelerare l’avvio dell’attività riproduttiva (5) (6). Sembrainoltre che le pecore trattate con melatonina presentinouna prolifici-tà maggiore e anche un miglior tasso di concepimento (7,8). Comegià dimostrato, nella capra il miglioramento delle performance ripro-duttive è dovuto all’aumento del turnover follicolare a livello ovaricoche porta a una migliore qualità degli oociti che mostrano, infatti, unacompetenza allo sviluppo embrionale decisamente superiore neglianimali con somministrazione esogena di melatonina (9).Già da tempo anche negli arieti sono stati effettuati studi e diversigruppi di lavoro hanno dimostrato che la melatonina influenza an-che nel maschio numerosi parametri, come la libido (10), la qualitàseminale (11) e anche la proporzione di pecore che ovulano in ri-sposta all’effetto maschio (10). È stata inoltre dimostrata una varia-zione stagionale fisiologica della melatonina nel plasma seminaledi arieti di razza aragonese che è strettamente correlata con la con-centrazione di testosterone e di enzimi antiossidanti (superossido-dismutasi, glutatione reduttasi, glutationeperossidasi e catalasi)(11). Durante il silenzio riproduttivo, quando si ha una durata mag-

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giore delle ore di luce, la somministrazione di melatonina induceun aumento di LH ed FSH e una riduzione della prolattina a livelloematico. Risulta ugualmente aumentata anche l’attività dell’attiva-tore del plasminogeno (12) che è presente negli spermatozoi e nelplasma seminale dell’uomo e di molte specie animali (13) (14).Questo enzima è di fondamentale importanza sia per la capacita-zione spermatica che per la reazione acrosomiale (15). È stato al-tresì dimostrato che aumenta anche la concentrazione media ditestosterone (16) (17) nonché il diametro testicolare (18) e la cir-conferenza scrotale in stagione non riproduttiva (19).Nel presente studio, condotto in arieti di razza sarda, sono stati va-lutati gli effetti della somministrazione esogena di 3 impianti di me-latonina da 18 mg a lento rilascio non solo sul diametro testicolaree sulla circonferenza scrotale, ma anche sulle dimensioni espresse insuperficie delle ghiandole sessuali accessorie, ossia le Ghiandole Bul-bo Uretrali (Cowper’s glands) e le Ghiandole Vescicolari.

GHIANDOLE SESSUALI ACCESSORIE

Tutte le ghiandole sessuali accessorie, compresa la prostata, derivanodal dotto di Wolff o dal seno uro-genitale. Nell’ariete la prostata nonpresenta la parte conglomerata (corpo) ed essendo disseminata, ri-sulta di difficile evidenziazione tramite ultrasonografia a meno di pro-cessi infiammatori in atto. Le ghiandole bulbo uretrali e le ghiandolevescicolari sono in numero pari, posizionate sui due lati del piano sa-gittale mediano dell’animale. Le prime sono collocate a cavallo dellaparte iniziale dell’uretra pelvica e sono ricoperte da muscolatura stria-ta (muscolo bulbo-spongioso) e l’estremità medio-caudale dellaghiandola arriva a contatto con la ghiandola controlaterale unendosiin un unico condotto escretore che attraversa obliquamente la pare-te dell’uretra. Il loro secreto è di fondamentale importanza nei rumi-nanti poiché in queste specie viene prodotto nelle prime fasi dell’ec-citazione sessuale e concorre sia alla detersione che all’ottimizzazionedel pH del canale uretrale prima dell’eiaculazione. Le seconde sonoposte a lato del collo della vescica e sono formate da lobuli netta-mente distinti sulla sua superficie. Ogni lobulo è costituito da uno odue tubuli flessuosi, dilatati a formare larghi alveoli che sono drenatida un segmento escretore, che sbocca in un collettore centrale cheunendosi a quello contro laterale va a costituire un unico condottoescretore che attraversa la parete dell’uretra per sboccare nell’ostioeiaculatore. Nel suo insieme, la ghiandola è disposta in modo tale chela sua parte caudale si incurva verso il piano mediano e si addossa aquella della ghiandola del lato opposto, dorsalmente oppure ventral-mente ai dotti deferenti a seconda dei soggetti. Le componenti ca-ratteristiche del secreto delle ghiandole vescicolari sono costituite dafruttosio b (di derivazione ematica),acido citrico, enzimi, proteine emuco. Granuli di lipofuscina danno a questa frazione spermatica uncolore giallognolo. Tale secreto è indispensabile per la fornitura del-l’energia necessaria per garantire la motilità agli spermatozoi.

MATERIALI E METODI

Per la sperimentazione sono stati utilizzati 37 arieti di razza sarda pro-venienti da tre diversi allevamenti del nord Sardegna posizionati tut-ti e tre alla stessa latitudine (circa 40° Nord). Tali allevamenti presen-tavano un buono e moderno management aziendale ed erano tuttiiscritti al libro genealogico di razza mostrando ottime produzioni.Gli arieti avevano un’età compresa tra 1,5 e 8 anni. Una parte diquesti arieti (21 capi) sono stati trattati con 3 impianti sottocutaneidi melatonina a lento rilascio da 18 mg (MELOVINE, Ceva SaluteAnimale) mentre la restante parte (16 capi) non ha subito alcuntrattamento (controlli). La selezione degli arieti è stata effettuatadopo un iniziale screening ecografico volto a valutare l’integrità del-l’apparato genitale maschile e delle relative ghiandole accessorie,in modo da inserire nei due gruppi solo animali privi di patologie.Gli arieti erano separati dalle femmine da oltre un mese e non vi eranessuna comunicazione visiva, olfattiva o uditiva tra i due sessi. In2 aziende su 3, gli arieti si trovavano ad almeno 1 km di distanza,mentre nella terza azienda erano nel medesimo corpo aziendalema in una stalla appositamente separata e fuori dalla direzione deiventi dominanti che investono la parte dell’azienda in cui si trova-no le pecore in mungitura.Il protocollo di studio prevedeva l’esecuzione di tre controlli eco-grafici degli arieti: il primo controllo è stato effettuato il giorno del-l’impianto di melatonina, il secondo controllo a metà del tratta-mento (in media a 26 giorni dall’impianto), il terzo e ultimo con-trollo ecografico il giorno dell’inserimento degli arieti nel gregge(ossia in media a 46 giorni dall’inizio del trattamento).Nel corso di ognuna delle tre visite effettuate sugli arieti i parametripresi in considerazione durante l’esame ultrasonografico sono stati:– diametro testicolare;– area delle ghiandole bulbo-uretrali;– area delle vescichette seminali.Allo stesso tempo, utilizzando un metro morbido, è stata misuratala circonferenza scrotale.L’ultrasonografia dello scroto è stata descritta per la prima volta nel1974 (20). Da allora gli ultrasuoni sono stati ampiamente utilizzatinell’uomo come metodo di prima scelta per la valutazione scrota-le e testicolare. L’uso dell’ecografia B-mode come metodo non in-vasivo affidabile e ripetibile per la valutazione di scroto e testicoli èstato successivamente descritto nel verro (21), nell’ariete (22), neltoro (23) e in altri mammiferi (24).L’esame ecografico degli arieti oggetto della sperimentazione è sta-to effettuato con un ecografo Aloka SSD-500 munito di sonda li-neare da 7.5 MHz utilizzata per l’esame della prostata nell’uomo. Tut-ti gli esami ecografici sono stati effettuati con gli animali in stazionequadrupedale. La contenzione avveniva manualmente e solo per ladurata dell’esame stesso, che non superava mai i 7-8 minuti in mo-do da ridurre al minimo lo stress per gli animali. Il diametro testico-

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lare è stato verificato per ciascun testicolo con la sonda lineare po-sta perpendicolarmente all’asse longitudinale del testicolo e pog-giata sul lato laterale del testicolo, facendo ricorsoa un gel per ultra-suoni per migliorare l’aderenza ed eliminare l’aria tra cute e trasdut-tore, senza effettuare pressioni eccessive che avrebbero potuto al-terare il diametro testicolare. Percorrendo la superficie del testicolodall’alto verso il basso si scansionavano le varie sezioni di testicolosino a raggiungere quella che presentava la dimensione maggiore.La misurazione è stata effettuata utilizzando la scala graduata postasullo schermo dell’ecografo con una sensibilità di 0.25 cm.Utilizzando sempre il gel per ultrasuoni si è proceduto all’esameecografico transrettale. Appena introdotta la sonda nel retto giàdopo 4-5 cm è possibile apprezzare ecograficamente a destra e asinistra dell’uretra le ghiandole bulbo uretrali che presentano unaforma circolare. Le ghiandole sono state misurate congelando l’im-

magine del loro diametro maggiore e utilizzando la funzione “ellis-se” dell’ecografo per misurarne la superficie. Proseguendo cranial-mente con la sonda si è seguito tutto il percorso dell’uretra pelvicasino ad arrivare al collo della vescica all’altezza del quale si trovanole due ghiandole vescicolari. Dopo aver congelato l’immagine sul-la loro dimensione maggiore è stata misurata la superficie utiliz-zando la funzione ”traccia”, vista l’irregolarità della superficie ghian-dolare (Figura I, II).

RISULTATI

Per elaborare tutti i dati raccolti i 37 arieti sono stati raggruppati intre classi di età ed ovviamente suddivisi in due gruppi, il gruppotrattato con melatonina (MEL, n=21) e il gruppo controllo non trat-tato (CTR, n=16) (Tabella 1).

Figura I - Ghiandole bulbo-uretrali. Figura II - Vescichette seminali.

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La suddivisione in classi di età ha inoltre consentito di valutaretutti i parametri considerati (dimensioni testicolari e ghiandoleaccessorie) in relazione proprio dell’età al giorno zero del tratta-mento. Si è osservato, infatti, che gli arieti più giovani presenta-vano nel complesso dimensioni testicolari significativamenteinferiori (diametro testicolare medio 4,4 cm e circonferenzascrotale 30,9 cm) rispetto alle classi di arieti adulti (arieti tra 2,5-3,5 anni: diametro testicolare medio 5,4 cm; circonferenza scro-tale 35,6 cm; arieti maggiori di 4 anni: diametro testicolare me-dio 5,6 cm; circonferenza scrotale 37 cm; p<0.001) i quali ultimipresentavano invece delle dimensioni non significativamentedifferenti. Riguardo alla superficie delle ghiandole accessorie invece, sonostate registrate differenze significative tra tutte le classi di età presein considerazione. Infatti, le dimensioni di queste ghiandole sonorisultate positivamente correlate all’età degli arieti, essendo quindimaggiori negli animali più anziani.Le ghiandole bulbo uretrali presentavano una superficie media di1,21 cm2 negli arieti di 1-2 anni, di 1,44 cm2 negli arieti di 2,5-3,5 an-ni e di 1,7 cm2 negli arieti di 4 anni (p<0.01).Le vescichette seminali, come le precedenti, presentavano una su-perficie media che differiva significativamente tra le varie classi dietà, essendo di 2,70 cm2 negli arieti più giovani, di 3,41 cm2 negliarieti di età intermedia e di 3,95 cm2 negli arieti con età maggioredi 4 anni (p<0.05).La valutazione dei diversi parametri presi in considerazione in rela-zione all’età potrà permettere una migliore interpretazione dei ri-

sultati ottenuti al termine della sperimentazione, ossia al momen-to dell’introduzione degli arieti nel gregge. I dati conseguiti durante i tre controlli ecografici effettuati a inizio(giorno 0), metà (giorno 26) e fine trattamento (giorno 46) sono de-scritti nella Tabella 2 (Grafici 1 e 2).

DISCUSSIONE

Sulla base dei risultati ottenuti risulta evidente che i soggetti trat-tati con i tre impianti di melatonina hanno presentato un incre-mento decisamente maggiore di tutti i parametri considerati nellapresente sperimentazione. È interessante considerare che, nono-stante il gruppo di arieti trattati partisse da dimensioni inferiori algiorno 0, a fine trattamento, ossia al momento dell’introduzionedegli arieti nel gregge, questi presentavano dimensioni significati-vamente maggiori rispetto al gruppo degli arieti CTR. Il fatto che gliarieti MEL partissero da dimensioni inferiori è spiegato dal fatto chenella scelta “ad random” degli arieti da attribuire a ciascun grupposi è verificato che nel gruppo MEL fossero inseriti più arieti giovani.Grazie a questa lieve disomogeneità tra i due gruppi è stato possi-bile mettere ancor più in evidenza come la somministrazione eso-gena di melatonina porti a un incremento notevole delle dimen-sioni di testicoli e ghiandole sessuali accessorie in modo decisa-mente importante negli arieti di giovane età.

CONCLUSIONE

Lo studio ha confermato l’efficacia della somministrazione esogenadi melatonina sulle dimensioni testicolari e ha evidenziato comeanche le ghiandole sessuali accessorie, le ghiandole bulbo-uretralie le vescichette seminali rispondano in maniera positiva alla mela-tonina,aumentando in maniera significativa la propria dimensione,probabilmente contribuendo al miglioramento della quantità edella qualità del liquido seminale. Inoltre le misurazioni ecografichedi queste ghiandole interne hanno fornito dati anatomici impor-tanti per gli arieti di razza sarda e non solo, visto che le sole misu-razioni finora conosciute derivano da osservazioni effettuate in fa-se di dissezione delle carcasse.

TABELLA 1Distribuzione degli arieti nei 2 gruppi sperimentali (MEL e CTR) a secondadell’età.

GruppoEtà

CTR MEL

1-2 aa 7 9

2,5-3,5 aa 5 12

> 4 aa 4 0

Totale 16 21

TABELLA 2Media delle misurazioni di circonferenza scrotale, diametro testicolare e superficie delle ghiandole bulbo uretrali e delle vescichette seminali degli arieti nontrattati (CTR) e trattati (MEL) con n° 3 impianti sottocutanei di melatonina al giorno 0 (data dell’impianto), al giorno 26 (metà trattamento) e al giorno 46 (in-serimento arieti nel gregge).

Circonferenza scrotale (cm) Testicoli (cm) Area Gh Bulbo U. (cm2) Area Vescichette s (cm2)gg

CTR MEL CTR MEL CTR MEL CTR MEL

0 34,3125 33,3333 5,10781 4,92476 1,36688 1,36929 3,34563 3,02286

26 34,2188 34,4048 5,20313 5,21786 1,47875 1,58595 3,65375 3,74333

46 35,3125 36,0238 5,48438 5,625 1,61344 1,81595 4,09187 4,45429

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Grafico I - Variazioni nelle dimensioni delle gonadi e delle ghiandole accessorie in arieti in relazione all’età al giorno 0 del trattamento.

Grafico II - Variazioni nelle dimensioni delle gonadi e delle ghiandole accessorie in arieti controllo (CTR) e trattati con un impianto sottocutaneo di melato-nina (MEL). Giorno 0 = inserimento impianto.

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Le misurazioni ottenute possono quindi rappresentare un validopunto di riferimento per la valutazione ecografica delle ghiandoleaccessorie in modo tale che eventuali variazione significative dalledimensioni medie possano essere indicativi di patologia.

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